CN117007570A - 海洋生物体内微塑料的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于荧光染色技术量化海洋生物体摄入微塑料的方法，首先提取待测海洋生物组织内的微塑料，采用尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液对其进行染色，然后进行荧光检测并计数，获得微塑料含量。本发明采用先碱法消解再氧化法消解的方式，条件温和，消解充分，避免破坏海洋生物体内微塑料，提高检测结果的准确性；同时以尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液作为染色剂，对微塑料进行染色，染色方法简单，染色效果好，可以特异性地将微塑料染色，在荧光显微镜下呈现较强的荧光效果，可高效检出微塑料颗粒，避免了样品中非塑料物质干扰，实现对海洋生物体内的微颗粒的准确定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体是一种海洋生物体内微塑料的检测方法。
背景技术
陆源产生的塑料一部分沉降在土壤环境中，大部分在风力和水力的作用下，随着陆地径流汇入海洋环境中。塑料在海水中经过长时间的风化、光辐射和生物降解后，会破碎成更微小的塑料碎片，当其直径小于5mm时定义为微塑料。微塑料容易被海洋生物当作食物而误食，且能在食物链中迁移和积累，当在生物体内积累到一定量时会引起生物毒理效应，如对生长发育、组织病变、炎症反应、生殖、代谢、基因表达等方面产生负面影响。因此研究微塑料在海洋生物体内的富集和分布对微塑料环境行为和生态风险评估有重要意义。
目前针对微塑料对海洋生物的毒理实验所用塑料多为规则的、成分单一的荧光塑料，或者先将微塑料荧光染色后再进行暴露，然后通过计算荧光强度来定量微塑料；或者是用较大粒径的微塑料或有颜色的微塑料暴露后，通过目视法在显微镜直接计数微塑料等方法。这些毒理学实验所用的规则、成分单一的微塑料很难代表真实环境中的微塑料，其中涉及到的一部分微塑料定量方法无法直接用于环境样品中微塑料的鉴定，另一部分方法虽可用于环境微塑料鉴定，但其存在着主观性强、偏差大、耗时长等缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种海洋生物体内微塑料的检测方法，该方法可以定量检测海洋生物体内的微塑料含量，操作简便、准确性好、灵敏度高、成本较低。
本申请提供了一种海洋生物体内微塑料的检测方法，包括以下步骤：
步骤a）
将待测海洋生物组织在碱液中进行第一次消解，然后在氧化剂溶液中进行第二次消解；所述碱液选自氢氧化钾溶液，所述氢氧化钾溶液的浓度为5wt%~15wt%；所述第一次消解的温度为50~80℃；所述氧化剂溶液为过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液的浓度为20wt%~40wt%；所述第二次消解的温度为50~80℃；
步骤b）对所述步骤a）得到的样品消解液进行真空抽滤，得到微塑料；
步骤c）采用尼罗红染色液对步骤b）得到的微塑料进行染色，所述尼罗红染色液包括尼罗红和90%以上的甲醇溶液；所述尼罗红的质量浓度为10~200μg/mL；
步骤d）对所述步骤c）得到的染色微塑料进行荧光检测并计数，获得微塑料含量。
本申请首先对海洋生物组织进行消解，提取待测海洋生物组织内的微塑料，采用尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液对其进行染色，然后进行荧光检测并计数，获得海洋生物组织内微塑料含量。本发明采用先碱法消解再氧化法消解的方式，条件温和，消解充分，避免破坏海洋生物体内微塑料，能够提高检测结果的准确性。本申请以尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液作为染色剂，对提取自海洋生物组织内的微塑料进行染色，可以特异性地将微塑料染色，在荧光显微镜下呈现较强的荧光效果，可高效检出微塑料颗粒，同时避免了样品中非塑料物质干扰，从而实现对海洋生物体内的微颗粒的准确定量分析。
本申请以海洋生物为检测对象，所述海洋生物优选为双壳贝类，例如蛤类，包括但不限于菲律宾蛤仔、波纹巴非蛤、文蛤等；或者牡蛎类等。
本发明直接采集待测海洋生物的组织，包括但不限于鳃组织、消化腺组织等，将其进行消解。在采集组织之前，本申请优选采用含有微塑料颗粒的海水饲养待测海洋生物，使待测海洋生物暴露在微塑料环境中。
在一些具体的实现方式中，所述海水中微塑料颗粒含量为0.01~5mg/L，优选为0.1~3mg/L，更优选为0.5~2mg/L。在一些具体的实现方式中，所述微塑料选自聚乙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇中的一种或多种。在一些具体的实现方式中，所述微塑料的粒径为5~40μm，优选为10~20μm。
在一些具体的实现方式中，根据受试海洋生物的最佳生存条件设置适宜的海水理化参数，包括pH、温度、盐度、溶解氧等，例如，海水中，盐度为21±1‰，温度25±1℃，pH8.05±0.01，溶解氧6.94.±0.14 mg/L，连续充气。在饲养过程中，每日更换海水，保持实验水质稳定，避免海水溶液中微塑料浓度衰减。在一些具体的实现方式中，所述饲养的时间为1~7天，优选为2~3天。
暴露完毕后，采集待测海洋生物的目标组织，将其进行消解。在一些具体的实现方式中，所述消解具体为：
将待测海洋生物组织在碱液中进行第一次消解，然后在氧化剂溶液中进行第二次消解。
本发明采用先碱法消解再氧化法消解的方式，条件温和，消解充分，避免破坏海洋生物体内微塑料，能够提高检测结果的准确性。在一些具体的实现方式中，所述碱液选自氢氧化钾溶液，所述氢氧化钾溶液的浓度为5wt%~15wt%，优选为10wt%；所述第一次消解的温度为50~80℃，优选为60~70℃；时间为10~15h，优选为12h；转速为50~150rpm，优选为100rpm。在一些具体的实现方式中，所述氧化剂溶液为过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液的浓度为20wt%~40wt%，优选为30wt%；所述第二次消解的温度为50~80℃，优选为60~70℃；时间为10~15h，优选为12h；转速为50~150rpm，优选为100rpm。
具体而言，本申请首先将待测海洋生物组织在碱液中进行第一次消解，然后再加入氧化剂溶液进行第二次消解。在一些具体的实现方式中，所述碱溶液的浓度为5wt%~15wt%，所述待测海洋生物组织与碱液的质量体积比为0.1g：5~20mL，优选为0.1g：5~16mL；所述氧化剂溶液的浓度为20wt%~40wt%，所述待测海洋生物组织与氧化剂溶液的质量体积比为0.1g：1~8mL，优选为0.1g：2~6mL。
消解完毕后，对得到的消解液进行真空抽滤处理，提取得到微塑料。本申请对所述真空抽滤处理的工艺参数没有特殊限制，本领域技术人员熟知的条件即可。在具体的实现方式中，所述真空抽滤的滤膜为尼龙膜。本申请采用普通有机尼龙微孔滤膜代替昂贵的Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯滤膜，观察效果一致，但是能够显著降低成本。本申请优选对消解液趁热过滤，防止滤膜堵塞。
将微塑料分离后，将载有微塑料的滤膜固定、干燥后，采用尼罗红染色液对其进行染色，所述尼罗红染色液包括尼罗红和90%以上的甲醇水溶液，优选包括95%以上的甲醇水溶液，更优选包括99%的甲醇水溶液。在一些具体的实现方式中，所述尼罗红的质量浓度为10~200μg/mL，优选为30~150μg/mL，更优选为50~100μg/mL。在一些具体的实现方式中，所述染色的条件为避光静置0.5~3h，优选为静置1~2h。
待滤膜自然干燥后，通过荧光显微镜对染色的微塑料进行观测并计数，并定量计算微塑料含量。在一些具体的实现方式中，在激发/发射波长460 nm/525 nm下检测荧光微塑料颗粒并计数。在一些具体的实现方式中，按照以下公式计算单位质量组织中微塑料的含量：
微塑料含量=n/m，
其中n为微塑料数量（个），m为组织湿重（g）。
本发明提供了一种基于荧光染色技术量化海洋生物体摄入微塑料的方法，该方法首先提取待测海洋生物组织内的微塑料，采用尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液对其进行染色，然后进行荧光检测并计数，获得海洋生物组织内微塑料含量。本发明采用先碱法消解再氧化法消解的方式，条件温和，消解充分，避免破坏海洋生物体内微塑料，能够提高检测结果的准确性。本申请以尼罗红和90%以上的甲醇水溶液组成的尼罗红染色液作为染色剂，对提取自海洋生物组织内的微塑料进行染色，染色方法简单，染色效果好，可以特异性地将微塑料染色，在荧光显微镜下呈现较强的荧光效果，可高效检出微塑料颗粒，同时避免了样品中非塑料物质干扰，从而实现对海洋生物体内的微颗粒的准确定量分析。进一步的，该方法采用普通有机尼龙微孔滤膜代替昂贵的Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯滤膜，观察效果一致，显著降低成本。本发明能够直接对生物样品中所含微塑料进行荧光标记，从而揭示环境微塑料在海洋生物体内的富集和分布情况，为了解真实环境中微塑料对海洋生物的影响及微塑料污染监管防控提供依据。
附图说明
图1为利用改良的染色方法染色聚乙烯（PE）微塑料标准品的荧光显微图；
图2为利用改良的染色方法检测到文蛤体内微塑料的显微图，其中，图2（A）是在明场下的显微图，图2（B）是在荧光下的（4×）显微图；
图3为在文蛤体内提取的微塑料在不同膜上的荧光显微图，其中，图3（A）是在Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯膜上的荧光显微图，图3（B）是在尼龙膜上的荧光显微图；
图4为不同微塑料在文蛤不同组织中的观测效果；
图2~图4中，箭头指向的是绿色荧光微塑料颗粒。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明提供的海洋生物体内微塑料的检测方法进行进一步说明。
实施例
1.双壳贝类体消解和微塑料提取方法探究
1.1受试动物
菲律宾蛤仔、波纹巴非蛤、文蛤均从海鲜市场获取，清洗后解剖贝类，将软组织适当剪碎，并用吸水纸吸干水分，用电子天平称重组织重量并记录。
1.2三种不同消解法的实验条件探究
针对上述多种海洋双壳贝类，分别采用酸消解法、碱消解法、氧化消解法探究双壳贝类体的最优消解条件，其实验条件如表1所示。
表1 不同消解方法的实验条件
1.2.1 酸消解法
将处理后的单个贝类软组织置于含20mL 69% HNO3消解液的锥形瓶中，并用铝箔纸覆盖锥形瓶口，将锥形瓶置于恒温振荡仪中分别以40℃、50℃和60℃和转速100 rpm的条件消解12h、24h和36h，得到对应的生物样品消解液。以上实验条件共9个实验组，每个实验组设置3个平行对照。消解结束后，将消解液趁热真空抽滤至尼龙微孔滤膜，烘干滤膜，并称重滤膜上剩余组织重量，采用以下公式计算组织消解率。
消解率（%）=
其中W i 为生物软组织的重量，W a 为生物消解液过滤后所得干滤膜的重量，W b =洁净干滤膜的重量。
实验1-9结果显示，酸消解法所得消解液均较澄清，最优消解条件为采用69% HNO3消解液在60℃的条件下振荡消解24 h，其组织消解率为99.95％（RSD = 0.02%，n=3）。
1.2.2 碱消解法
将处理后的单个贝类软组织置于含20mL 10% KOH消解液的锥形瓶中，并用铝箔纸覆盖锥形瓶口，将锥形瓶置于恒温振荡仪中分别以50℃、60℃和70℃和转速100 rpm的条件消解12h、24h和36h，得到对应的生物样品消解液。以上实验条件共9个实验组，每个实验组设置3个平行对照。实验10-18结果表明，碱消解法所得消解液略浑浊，最优消解条件为采用10% KOH消解液在60℃的条件下振荡消解12 h，其消解率为98.40%（RSD = 0.90%，n=3）。
1.2.3 氧化消解法
将处理后的单个贝类软组织置于含20mL 30% H2O2消解液的锥形瓶中，并用铝箔纸覆盖锥形瓶口，将锥形瓶置于恒温振荡仪中以40℃、50℃和60℃和转速100 rpm的条件分别消解12h、24h和36h，得到对应的生物样品消解液。以上实验条件共9个实验组，每个实验组设置3个平行对照。实验19-27结果表明，采用30% H2O2消解液的氧化消解法在60℃的条件下振荡消解12 h或24 h，其消解率均可达到98.20%，但消解过程中产生不少泡沫，在仪器中振荡时泡沫易冒出锥形瓶口，可能导致微塑料损失。
1.2.4 回收率
采用上述1.2.1, 1.2.2和1.2.3中最优消解方法，对双壳贝类进行加标回收率实验。每组实验取0.5g贝类组织，并加入0.1g对应微塑料标准品进行消解。设置五组加标回收率实验，每个实验组设置3个平行对照。消解结束后，将消解液趁热真空抽滤至尼龙微孔滤膜，烘干滤膜，并称重滤膜上回收的微塑料重量，计算回收率。结果显示，氧化消解法的平均回收率最高，达98.40%，其次为碱消解法，平均回收率为98.18%，酸消解法的平均回收率最低，为96.49%。结果表明，酸消解法的消解情况虽最佳，但其对微塑料的影响较大，可能造成塑料结构破坏和损耗。
1.2.5 复合消解法的验证
综合以上各消解方法的消解情况及回收率结果，选择采用碱消解法和氧化消解法结合的复合消解法对双壳贝类进行消解，即先采用10% KOH消解液在60℃的条件下振荡消解12 h，再采用30% H2O2消解液的氧化消解法在60℃的条件下振荡消解12 h。所得消解液澄清度佳，消解率达99.33%（RSD = 0.02%，n=5）。加标回收率实验显示，该方法的平均回收率达98.86%。
2.微塑料染色及检测方法探究
生物样品消解液经配备Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯微孔滤膜的真空抽滤装置过滤后，用胶带将微孔滤膜固定在载玻片上，置于干净的培养皿中，在室温下干燥24 h，进行下一步微塑料的染色。
本申请采用尼罗红一步染色法对微孔滤膜上的微塑料进行染色。尼罗红可以作为荧光标记微塑料的优良染色剂，且在一定程度上能避免非塑料物质的干扰，具有快捷、经济、染色效果佳的优点。以往的方法一般将尼罗红溶解在丙酮溶剂中做染色剂，但实验过程中发现该方法会出现部分微塑料不吸附染料的问题，对后续的观察计数有一定的影响。因此，改良为将尼罗红染色剂溶解在99%的甲醇溶液中，配制成浓度为100 μg/mL的尼罗红工作液，4 ℃保存备用。结果参见图1和图2，图1为利用改良的染色方法染色聚乙烯（PE）微塑料标准品的荧光显微图。图2为利用改良的染色方法检测到文蛤体内微塑料的显微图，其中，图2（A）是在明场下的显微图，图2（B）是在荧光下的（4×）显微图。结果显示，本发明方法染色效果好，可以特异性地将微塑料染色，在荧光显微镜下呈现较强的荧光效果。
3.微塑料提取检测的微孔滤膜选择
3.1 微塑料暴露实验
在室内进行微塑料暴露实验，配制含聚乙烯（PE）微塑料颗粒（尺寸约为13 μm）的海水溶液饲养文蛤，暴露浓度为1 mg/L，暴露天数3 d。所用海水溶液为水族专用海盐配制的盐度为21 ± 1 ‰，温度25 ± 1 ℃，pH 8.05 ± 0.01，溶解氧6.94.±0.14 mg/L，连续充气。期间每天更换海水，并配制微塑料溶液，以保持暴露浓度一致。
3.2 生物样品的采集和消解
暴露结束后解剖文蛤，以得到消化腺组织。随后将生物样品置于含10%氢氧化钾溶液的锥形瓶中，并用铝箔纸覆盖锥形瓶口以防止污染。再将锥形瓶置于恒温振荡仪中以60℃和转速100 rpm的条件消解12 h，继续加入30%过氧化氢溶液于锥形瓶中，在同样条件下消解12 h，得到生物样品消解液。其中10%氢氧化钾溶液的用量为组织重量（g）：试剂体积（mL）=0.1：8的比例，30%过氧化氢溶液用量为组织重量（g）：试剂体积（mL）=0.1：2的比例。
3.3 微塑料的提取
利用真空抽滤装置对3.2中得到的生物样品消解液趁热过滤，分别采用Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯膜和普通尼龙微孔滤膜探究过滤效果。过滤完成后，用胶带将微孔滤膜固定在载玻片上，再置于干净的培养皿中，在室温下干燥24 h。
3.4 尼罗红工作液配制
将尼罗红染色剂溶解在99%的甲醇溶液中，配制成浓度为100 μg/mL的尼罗红工作液，4 ℃保存备用。
3.5 微塑料的染色
将3.4中制备的尼罗红工作液滴加适量在3.3中的微孔滤膜上，对滤膜上的微塑料颗粒进行充分染色，避光静置1h。
3.6 微塑料的检测
待滤膜自然干燥后，利用荧光显微镜在激发/发射波长460 nm/525 nm的条件下对滤膜上的绿色荧光微塑料颗粒进行观测并计数。结果参见图3，图3为在文蛤体内提取的微塑料在不同膜上的荧光显微图，其中，图3（A）是在Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯膜上的荧光显微图，图3（B）是在尼龙膜上的荧光显微图。从图3结果可以看出，采用此检测方法，普通尼龙膜与Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯膜的观察效果一致。因此，后续实验中将采用普通有机尼龙微孔滤膜代替昂贵的Whatman黑色径迹蚀刻聚碳酸酯滤膜，这将显著降低大批量实验的成本，提高检测方法的经济性。
4.探究不同类型微塑料在文蛤体内的富集和分布
4.1 微塑料暴露实验
在室内进行微塑料暴露实验，分别配制含聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）和聚对苯二甲酸乙二醇（PET）微塑料颗粒（尺寸约为13 μm）的海水溶液饲养海洋生物体，暴露浓度为100 μg/L，暴露天数为7 d。所用海水溶液为水族专用海盐配制的盐度为21 ± 1 ‰，温度25 ± 1℃，pH 8.05 ± 0.01，溶解氧6.9 ± 0.1 mg/L，连续充气。期间每天更换海水，并配制微塑料溶液，以保持暴露浓度一致。
4.2 生物样品的采集和消解
暴露结束后解剖文蛤，得到其鳃和消化腺组织，称重后记录组织重量。随后将生物样品置于含10%氢氧化钾溶液的锥形瓶中，并用铝箔纸覆盖锥形瓶口以防止污染。再将锥形瓶置于恒温振荡仪中以60℃和转速100 rpm的条件消解12 h，继续加入30%过氧化氢溶液于锥形瓶中，在同样条件下消解12 h，得到生物样品消解液。
4.3 微塑料的提取
利用配备普通尼龙微孔滤膜（直径25 mm，孔径5 μm，德滤科技）的真空抽滤装置对4.2中得到的生物样品消解液趁热过滤。过滤完成后，用胶带将微孔滤膜固定在载玻片上，再置于干净的培养皿中，在室温下干燥24 h。
4.4 尼罗红工作液配制：
将尼罗红染色剂加入99%的甲醇溶液中，配制成浓度为100 μg/mL的尼罗红工作液，4 ℃保存备用。
4.5 微塑料的染色
将步骤4.4中制备的尼罗红工作液滴加适量在步骤4.3中的微孔滤膜上，对滤膜上的微塑料颗粒进行充分染色，避光静置1h。
4.6 微塑料的检测
待滤膜自然干燥后，利用荧光显微镜在激发/发射波长460 nm/525 nm的条件下对滤膜上的绿色荧光微塑料颗粒进行观测并计数。结果参见图4，图4为不同微塑料在文蛤不同组织中的观测效果。
4.7微塑料的定量
根据4.2中记录的组织重量和4.6中检测到的对应组织样品的微塑料数量，换算为单位质量中海洋生物体内的微塑料含量，计算公式如下：
微塑料含量=n/m，其中n为微塑料数量（个），m为组织湿重（g）；
例：一文蛤样品的鳃和消化腺组织重量分别为m1=0.2601g，m2=0.0833g，暴露于PS微塑料后，测得其鳃和消化腺中微塑料数量分别为n1=4，n2=12，即可得：
鳃组织中PS微塑料含量=4/0.2601=15.38 个/g；
消化腺组织PS微塑料含量=12/0.0833=144.06 个/g。
本发明方法能够经济、快捷地对海洋生物体内微塑料进行定量检测，不仅操作简单，还能避免大量非塑料物质的干扰，实现准确探究微塑料在海洋生物体内的富集和分布的目的，为环境微塑料监测提供了有益的参考方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种海洋生物体内微塑料的检测方法，包括以下步骤：
步骤a）
将待测海洋生物组织在碱液中进行第一次消解，然后在氧化剂溶液中进行第二次消解；所述碱液选自氢氧化钾溶液，所述氢氧化钾溶液的浓度为5wt%~15wt%；所述第一次消解的温度为50~80℃；所述氧化剂溶液为过氧化氢溶液，所述过氧化氢溶液的浓度为20wt%~40wt%；所述第二次消解的温度为50~80℃；
步骤b）对所述步骤a）得到的样品消解液进行真空抽滤，得到微塑料；
步骤c）采用尼罗红染色液对步骤b）得到的微塑料进行染色，所述尼罗红染色液包括尼罗红和90%以上的甲醇水溶液；所述尼罗红的质量浓度为10~200μg/mL；
步骤d）对所述步骤c）得到的染色微塑料进行荧光检测并计数，获得微塑料含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤a）之前还包括：
采用含有微塑料颗粒的海水饲养待测海洋生物。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述海水中微塑料颗粒含量为0.01~5mg/L，饲养时间为1~7天；
所述微塑料选自聚乙烯、聚苯乙烯和聚对苯二甲酸乙二醇中的一种或多种；所述微塑料的粒径为5~40μm。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第一次消解的时间为10~15h，转速为50~150rpm。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述第二次消解的时间为10~15h，转速为50~150rpm。
6.根据权利要求4或5所述的检测方法，其特征在于，所述待测海洋生物组织与碱液的质量体积比为0.1g：5~20mL；所述待测海洋生物组织与氧化剂溶液的质量体积比为0.1g：1~8mL。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述真空抽滤的滤膜为尼龙膜。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述尼罗红染色液包括尼罗红和95%以上的甲醇水溶液。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述尼罗红染色液包括尼罗红和99%的甲醇水溶液。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述染色的条件为避光静置0.5~3h。
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