CN101302561A - 半滑舌鳎遗传性别及ww超雌鱼鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种半滑舌鳎遗传性别及WW超雌鱼鉴定方法，可以解决半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究中不能鉴定ZW雌鱼和WW超雌鱼的问题。所采用的技术方案是：一种半滑舌鳎遗传性别鉴定方法，包括如下步骤：1)半滑舌鳎血液样品的制备；2)半滑舌鳎细胞DNA含量的测定；3)半滑舌鳎遗传性别的鉴定。本发明建立了用流式细胞仪测定半滑舌鳎雌、雄鱼DNA含量，根据雌雄DNA含量差异鉴定半滑舌鳎ZZ雄鱼、ZW雌鱼以及WW超雌鱼的技术方法，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种的生产提供了可靠的技术手段。本方法可以在半滑舌鳎性别控制和全雌苗种生产中推广应用，也可以在其他鱼类性别控制中进行应用。

Description

半滑舌鳎遗传性别及WW超雌鱼鉴定方法

技术领域

本发明涉及水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别和超雌鱼鉴定方法，具体地说是半滑舌鳎遗传性别及WW超雌鱼鉴定方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种近海温水性大型底层鱼类，其肉质细嫩、营养丰富，深受消费者喜爱，是当前重点开发的海水鱼类养殖品种之一。而半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异大，雌性比雄性生长快2-4倍。这降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成。开展半滑舌鳎遗传性别检测和性别控制研究，大力发展半滑舌鳎全雌苗种生产是半滑舌鳎养殖业健康、持续、快速发展的关键。

半滑舌鳎雌性性染色体异型(ZW)，雄性性染色体同型(ZZ)(周丽青等，2005)。采用高温处理或雄激素浸泡等手段可以诱导半滑舌鳎雌性鱼苗性逆转为雄性鱼苗，从而获得人工性逆转的伪雄鱼(ZW)(邓思平等，2007)。而这些伪雄鱼则可用于生产半滑舌鳎全雌苗种。而性逆转伪雄鱼的鉴定成为开展此类研究工作的前提。有关鱼类性别鉴定方法的研究，目前只在少数几种鱼类上进行过，如加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；陈松林等(2007)筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP标记。这些方法都是通过AFLP、微卫星等技术扫描基因组，找到与性别决定位点紧密连锁的特异标记。由于这些标记具有种的特异性，因此应用范围较窄。

由于鱼类性别分化较为原始，雌雄性染色体差异小，因而其遗传性别的鉴定较为困难。虽然采用鱼类的性别特异分子标记可以鉴定出少数鱼类的遗传性别，但要采用这种标记鉴定ZW雌性个体和WW超雌个体则非常困难。迄今，国内外尚未见有关半滑舌鳎WW超雌个体鉴定的文献报道。因此，探索能够鉴定出半滑舌鳎ZW正常雌性个体和WW超雌个体的技术方法，对于筛选和大量培育半滑舌鳎WW超雌个体，进而培育半滑舌鳎全雌苗种，具有重要意义和应用价值。流式细胞术可以通过测定不同细胞DNA含量，从而根据DNA含量的差异将不同细胞鉴定出来。采用流式细胞技术在牛羊等哺乳动物上进行了XY精子的分析和鉴定。但有关流式细胞术在鱼类遗传性别检测和鉴定方面的研究，迄今在国内外均未见报道。

为此，本发明建立了一种采用流式细胞技术鉴定鱼类遗传性别以及WW超雌鱼的技术方法。

发明内容

本发明提供了一种半滑舌鳎遗传性别及WW超雌鱼鉴定方法，可以解决半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究中不能鉴定ZW雌鱼和WW超雌鱼的问题。

本发明提供了用流式细胞仪测定半滑舌鳎雌、雄鱼细胞DNA含量，根据雌雄鱼细胞DNA含量差异鉴定半滑舌鳎遗传性别的技术方法的可行性，从而建立了采用流式细胞仪鉴定半滑舌鳎ZZ雄鱼、ZW雌鱼以及WW超雌鱼的技术方法。为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种的生产提供了可靠的技术手段。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种半滑舌鳎遗传性别鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1)半滑舌鳎血液样品的制备

用肝素钠溶液润湿过的注射器抽取半滑舌鳎血液，取0.1-0.2ml血液，离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中；取49-51μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定；随后用磷酸缓冲液(PBS)清洗固定的血细胞2遍，用血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml；

2)半滑舌鳎细胞DNA含量的测定

取步骤1)中的调节好浓度的血样1ml，碘化丙啶PI染色液染色30min，用流式细胞仪测定对血样中的细胞DNA含量进行测定，用Cellquest软件分析，同时取鸡血作为对照进行分析，鸡血DNA含量为2.5pg/2c，测定结果以DNA含量直方图的形式显示；

3)半滑舌鳎遗传性别的鉴定

用计算机软件对雌、雄半滑舌鳎鱼细胞核DNA含量直方图进行比对，结果显示雌、雄半滑舌鳎细胞DNA含量有明显差异，并以鸡血DNA含量为参照计算出雌雄半滑舌鳎的平均DNA含量，半滑舌鳎正常雄鱼即ZZ染色体类型鱼血细胞的DNA含量为1.672±0.026pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在41.54-42.42之间；半滑舌鳎正常雌鱼即ZW染色体类型鱼血细胞的DNA含量为1.766±0.031pg，比雄鱼血细胞的DNA含量多5.62％，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，因此，通过测定半滑舌鳎血细胞的DNA含量可鉴定半滑舌鳎遗传性别。

在本发明的技术方案中，还具有以下技术特征：乙醇固定后的样品用磷酸缓冲液(PBS)清洗后，在PBS中的适宜储存时间为0.5-1h，而用酒精固定好的血样可在4℃下保存3-6小时。

一种半滑舌鳎WW超雌鱼鉴定方法，包括如下步骤：

1)半滑舌鳎血液样品的制备

用肝素钠溶液润湿过的注射器抽取半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗或雌核发育鱼苗的血液，取0.1-0.2ml血液，离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中；取49-51μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定；随后用磷酸缓冲液(PBS)清洗固定的血细胞2遍，用血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml；

2)半滑舌鳎细胞DNA含量的测定

取步骤1)中的调节好浓度的血样1ml，碘化丙啶PI染色液染色30min，用流式细胞仪对血样中的细胞DNA含量进行测定，用Cellquest软件分析，同时取鸡血作为对照，以便计算伪雄鱼后代鱼苗的DN A含量，鸡血DNA含量为2.5pg/2c，测定结果以DNA含量直方图的形式显示；

3)半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定

用WinMDI 2.9软件分析后发现伪雄鱼后代鱼苗和雌核发育鱼苗中除和正常雌、雄鱼细胞DNA含量相同的鱼苗外，还有一部分鱼苗细胞DNA含量平均为1.857±0.033，比正常雌鱼的DNA含量多5.2％左右，DNA含量直方图主峰的横坐标在50.86-51.75之间，这些鱼苗即为半滑舌鳎WW超雌鱼，因此，通过测定鱼苗血细胞DNA含量可快速鉴定半滑舌鳎WW超雌鱼。

在本发明的技术方案中，还具有以下技术特征：乙醇固定后的样品用磷酸缓冲液(PBS)清洗后，在PBS中的适宜储存时间为0.5-1h，而用酒精固定好的血样可在4℃下保存3-6小时。

研究发现，半滑舌鳎的雌性个体产生Z型和W型两种卵子，而雄性个体只产生一种Z型精子。采用人工雌核发育技术进行半滑舌鳎的雌核发育诱导，理论上将产生50％的WW超雌鱼苗和50％的ZZ雄性鱼苗；或者对半滑舌鳎普通鱼苗进行雄激素处理，那么就可以将遗传上的雌鱼苗(ZW型)诱导为生理上的雄鱼苗，这种遗传上为雌性、生理上为雄性的伪雄鱼将产生Z型和W型2种精子，这种伪雄鱼(遗传上为ZW型)与正常雌鱼(ZW型)交配后就会产生25％的ZZ型雄鱼，50％的ZW雌鱼以及25％的WW型超雌鱼三种类型。而从上述鱼苗中筛选出WW超雌鱼苗，则是进行半滑舌鳎全雌苗种生产的关键环节。

因此本发明的基本构思就是采用流式细胞技术，通过测定ZZ雄鱼和ZW雌鱼血细胞的DNA含量，找出雌、雄鱼DNA含量的差异，建立半滑舌鳎雌、雄鱼鉴定的流式细胞测定方法；其次，采用流式细胞术对半滑舌鳎人工雌核发育鱼苗或伪雄鱼后代鱼苗进行分析，找出雌、雄鱼以及WW超雌鱼DNA含量的差异，建立ZZ雄鱼、ZW雌鱼和WW超雌鱼的血细胞DNA含量参数及其峰值图，从而建立半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定方法。

一、半滑舌鳎遗传性别鉴定的流式细胞方法

1.半滑舌鳎生理性别的鉴定：

1)对于半滑舌鳎性腺未成熟个体来说，通过性腺外部形态差异鉴定生理性别：在鱼苗长到12厘米以上时，采用强光照射半滑舌鳎腹部性腺部位可以鉴别出半滑舌鳎的生理性别。半滑舌鳎精巢和卵巢外形和外部颜色差异显著，卵巢呈长条形，外表为乳白色；而精巢前端较粗，向后急剧变小，形成锥形形状，颜色较暗，外表为浅黑色。

2)对于达性成熟的半滑舌鳎来说，雌性个体一般在750克以上，在繁殖季节，雌性个体腹部卵巢部位明显隆起；而雄性个体一般在100-250克，腹部没有隆起。在半滑舌鳎繁殖季节，轻压舌鳎鱼腹部，能挤出精液者为生理雄鱼，能挤出卵者为生理雌鱼。

2.半滑舌鳎血细胞DNA含量的测定：用肝素钠溶液(500U/mL)润湿过的注射器抽取半滑舌鳎血液，取0.1-0.2ml血液，离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中。取49-51μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定。固定后的样品可较长时间放置。流式细胞术测定前，用磷酸缓冲液(PBS，NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂PO₄ 1.44g/L，KH₂PO₄ 0.24g/L，pH7.4)清洗固定的血细胞2遍，用血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml，用PI染色液(内含碘化丙啶PI 100μg/ml和RNA酶20U/ml)染色30min，采用美国BD FASC VantageSE流式细胞仪对血细胞DNA含量进行分析。同时取鸡血作为对照，以便计算雌雄半滑舌鳎DNA含量(鸡血DNA含量为2.5pg/2c)。测定结果以DNA含量直方图的形式显示。用WinMDI 2.9软件对雌、雄半滑舌鳎核DNA含量直方图进行比对，结果显示雌、雄半滑舌鳎DNA含量有明显差异。并以鸡血DNA含量为参照计算出雌雄半滑舌鳎的平均DNA含量。结果发现，半滑舌鳎正常雄鱼(ZZ染色体类型)血细胞的DNA含量为1.672±0.026pg，半滑舌鳎正常雌鱼(ZW染色体类型)血细胞的DNA含量为1.766±0.031pg，比雄鱼血细胞的DNA含量多5.62％。

3.半滑舌鳎ZZ雄鱼和ZW雌鱼的鉴定：

对于性别未知的半滑舌鳎鱼苗、鱼种或成鱼，抽取血液，按照上述方法测定血细胞的DNA含量，如果血细胞的DNA含量为1.672±0.026pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在41.54-42.42之间，可确定为ZZ雄性个体；如果DNA含量为1.766±0.031pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，则为ZW雌性个体。因此，通过测定半滑舌鳎血细胞的DNA含量可快速、准确地鉴定半滑舌鳎遗传性别。

二、流式细胞术快速鉴定“WW”超雌鱼。

1.WW超雌鱼的制备：按照我们以前建立的方法，制备半滑舌鳎雌核发育鱼苗(陈松林等，2007a中国发明专利申请号：200710114301.7)和伪雄鱼后代鱼苗(陈松林等；2007b：发明专利申请号：200710115084.3)，这些鱼苗中含有WW超雌个体，将这些鱼苗培养至12厘米以上后，即可用于超雌个体鉴定。

2.半滑舌鳎血细胞DN A含量的测定：抽取鱼苗的血液，按上述方法制备样品，PI溶液染色30min，美国BD FASC Vantage流式细胞仪检测。同时取鸡血用于分析，以便计算伪雄鱼后代鱼苗的DNA含量(鸡血DNA含量为2.5pg/2c)。用WinMDI 2.9软件分析后发现伪雄鱼后代鱼苗和雌核发育鱼苗中除和正常雌、雄鱼苗细胞DNA含量相同的外，还有一部分鱼苗细胞DNA含量平均为1.857±0.033，比正常雌鱼(DNA含量为1.766±0.031pg)的DNA含量多5.2％左右，可以认为这些鱼苗即为半滑舌鳎“WW”超雌鱼。

3.半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定：

对于性别未知的半滑舌鳎鱼苗、鱼种或成鱼，抽取血液，按照上述方法测定血细胞的DNA含量，如果血细胞的DNA含量为1.766±0.031pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，则为ZW雌性个体，如果血细胞的DNA含量为1.857±0.033pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在50.86-51.75之间，则可确定为WW超雌个体。因此，通过测定半滑舌鳎血细胞的DNA含量可鉴定出半滑舌鳎WW超雌个体。

4.半滑舌鳎WW超雌鱼的染色体证明

对于采用流式细胞仪鉴定出的半滑舌鳎超雌个体，我们采用染色体分析方法进行了验证。因为超雌个体含有2个W染色体，因此，我们采用常规方法制备了超雌个体的染色体，对染色体进行了核型分析，发现检测出的超雌个体都含有2个异常大的WW染色体，从而证明本发明方法鉴定超雌个体的可靠性和有效性。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：流式细胞术快速鉴定半滑舌鳎“WW”超雌鱼的方法为半滑舌鳎全雌苗种生产提供了强有力支持，为国内外首次报道。本发明根据雌、雄半滑舌鳎DNA含量的差异鉴定半滑舌鳎遗传性别，不仅具有快速、准确的优点，而且还可应用于其他鱼类。利用流式细胞术鉴定半滑舌鳎遗传性别的方法，对于鉴定温度和激素诱导处理后的半滑舌鳎伪雄鱼和从伪雄鱼后代鱼苗以及雌核发育鱼苗中挑选“WW”超雌鱼，培育半滑舌鳎全雌苗种，进行全雌半滑舌鳎养殖，提高养殖产量和经济效益，推动半滑舌鳎养殖产业的健康、持续、快速发展，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。

附图说明

图1是6尾半滑舌鳎(3雌鱼和3雄鱼)细胞DNA含量分析直方图；

图2是半滑舌鳎雄鱼、雌鱼和“WW”超雌鱼细胞DNA含量分析直方图；

图3是半滑舌鳎超雌个体的细胞染色体中期分裂相图(D)，箭头所指为W染色体；

图4是半滑舌鳎超雌个体的细胞染色体核型图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

1、半滑舌鳎血液流式细胞样品处理方法

用肝素钠溶液(500U/mL)润湿过的注射器抽取半滑舌鳎血液，取0.1ml血液，在1000rpm离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中。取50μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定。用酒精固定好的血细胞样品可在4℃保存5小时。固定的血样在上到流式细胞仪测定前，1200rpm离心8min，用PBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂PO₄ 1.44g/L，KH₂PO₄0.24g/L，pH 7.4)。清洗两遍后悬于1ml PBS中，血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml，取1ml转移到流式细胞仪样品室中进行分析，酒精固定后的血细胞在PBS清洗后，需要在1小时内进行测定分析。

2、流式细胞术鉴定半滑舌鳎ZZ雄鱼和ZW雌鱼

半滑舌鳎ZZ雄鱼、ZW雌鱼的鉴定：分别取10雌和10雄半滑舌鳎鱼苗血液，按上述方法制备样品。同时取鸡血用于分析，以便计算雌、雄半滑舌鳎DNA含量(鸡血DNA含量为2.5pg/2c)。取1ml制备的样品于1200rpm离心，去掉上清，加入200μl PI染液，内含碘化丙啶PI(100μg/ml)和RNA酶(20U/ml)，染色30min后，用美国BD FASC Vantage流式细胞仪检测。流式细胞仪测定方法如下：流式细胞仪开机后，打开Cellquest软件，并开启Detectors，Acquisition control，counters和Threshold四个窗口。用鸡血红细胞标准样对流式细胞仪进行标定。鸡血红细胞标准样制作过程如下：取肝素抗凝的鸡血，经PBS清洗三次后，用PBS等体积重悬鸡红细胞，接着加等量0.2％戊二醛，室温下震荡醛化24h，最后经PBS再清洗、计数使细胞浓度为2×10⁷/ml，储存于4度冰箱中备用。标定时，通过调节Y轴，excitation beamfocus，Fluorescence channelheight adjust wheel，Fluorescence focus control knob使直方图中信号峰的荧光强度达到最大，CV值小于5％。流式细胞仪测定时各参数值如下：SSC-H电压：349伏特；FL1-H电压：650伏特；FL2-H电压：862伏特，并在测定过程中维持恒定。测定结果以DNA含量直方图的形式显示。用WinMDI 2.9软件对雌、雄半滑舌鳎DNA含量直方图、鸡DNA含量直方图进行比对，结果发现10尾半滑舌鳎雌性个体DNA含量一致，平均为1.766±0.031pg；10尾半滑舌鳎雄性个体DNA含量一致，平均为1.672±0.026pg，且雌、雄半滑舌鳎DNA含量有明显差异，相差5.4％。3雌和3雄半滑舌鳎DNA含量直方图比对结果见图1。因此，用本方法可快速、准确地鉴定半滑舌鳎遗传性别。

对于性别未知的半滑舌鳎鱼苗、鱼种或成鱼，抽取血液，按照上述方法测定血细胞的DNA含量，如果血细胞的DNA含量为1.672±0.026pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在41.54-42.42之间，可确定为Z Z雄性个体；如果DNA含量为1.766±0.031pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，则为ZW雌性个体。

实施例2

流式细胞术鉴定半滑舌鳎WW超雌鱼

1.半滑舌鳎WW超雌鱼的制备：

1.1半滑舌鳎人工雌核发育鱼苗的制备：按照我们以前建立的方法，制备半滑舌鳎雌核发育鱼苗(陈松林等，2007a中国发明专利申请号：200710114301.7)，其主要步骤包括：按照常规方法获取半滑舌鳎成熟卵，采用花鲈精子诱导半滑舌鳎卵子进行雌核发育。首先将100μL新鲜或冷冻-解冻的花鲈精液用1mL MPRS(NaCl 60.35mM，KCl 5.23mM，NaHCO₃ 3.0mM，D-Glucose 55.5mM，NaH₂PO₄ 1.8mM，CaCl₂·6H₂O1.13mM，MgCl₂·6H₂O 1.13mM)溶液稀释后，用90-110mJ/cm²紫外线照射灭活，然后与半滑舌鳎卵子授精，授精后在22-23℃海水中培育，培育2-6分钟后，将上述受精卵转移至3-6℃的海水浴中进行冷休克处理，冷休克处理时间为20-30min，冷休克处理完毕后将卵移入22-23℃海水中进行孵化和培养；孵化出的鱼苗即为雌核发育鱼苗，将这些雌核发育鱼苗培养至12厘米以上，即可用于WW超雌鱼的检测。

1.2半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗的制备：按照我们以前建立的方法，制备半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗(陈松林等；2007b：发明专利申请号：200710115084.3)，其主要步骤包括：1)在半滑舌鳎鱼苗孵化后25-30天，将鱼苗从常规养殖水温(18-23℃)转移至28-32℃水温的海水中进行养殖，在此温度下养殖50-60天；待鱼苗生长至10厘米以上时，剪取小指甲大鳍条，按照常规方法提DNA，然后进行PC R分析，采用半滑舌鳎雌性特异引物鉴定遗传上雌性、生理上雄性的伪雄鱼，鱼苗的生理性别采用上述方法鉴别。PCR引物为CseF305N1和CseF305C1，其序列分别为5’-CTCCCCTGACCTTCCTTT-3’和5’-CGGCAGCACAATTATTACA-3’。PCR反应体系为：DNA模板100ng；上下游引物浓度均为0.4μM；dNTP浓度为0.2mM；1×PCRbuffer；MgCl2浓度为1.5mM；TaqDNA聚合酶0.75unit；PCR反应程序为：94℃预变性4min，之后94℃ 50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环；再于72℃延伸7min。用此对引物可以从雌性个体基因组中扩增出160bp的特异DNA片段，而从雄性个体基因组中则扩增不出这样的特异DNA片段。如果生理性别为雄性，又从其基因组中扩增出160bp的DNA片段，这样的雄鱼即为伪雄鱼。按照生产上用的常规方法对这些伪雄鱼进行养殖，1-2年后可达性成熟，采集伪雄鱼的精液，与普通半滑舌鳎卵子进行授精，即可生产出伪雄鱼后代鱼苗，按照常规方法将伪雄鱼后代鱼苗培养至12厘米以上，即可用于WW超雌鱼筛选。

2.半滑舌鳎血液DNA含量的测定：取55尾半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗的血液，并量其体长。同时取鸡血用于分析，以便计算各鱼苗的DNA含量(鸡血DNA含量为2.5pg/2c)。按上述方法制备样品，取1ml于1200rpm离心，去掉上清，加入200μl PI染液，内含碘化丙啶PI(100μg/ml)和RNA酶(20U/ml)，染色30min后，美国BDFASCVantage流式细胞仪检测。测定方法和参数同前。用WinMDI 2.9软件将伪雄鱼后代鱼苗核DNA含量直方图同鸡血DNA含量直方图比对。结果发现，25尾鱼苗DNA含量与正常雌鱼DNA含量一致，23尾鱼苗DNA含量与正常雄鱼DNA含量一致，有7尾鱼苗DNA含量比雌鱼的大，平均为1.857±0.033，可以认定这7尾鱼苗为超雌鱼。7雌、7雄和7超雌半滑舌鳎DNA含量和体长见表1。因此，通过测定伪雄鱼后代鱼苗的DNA含量可快速鉴定半滑舌鳎遗传性别。

表1：半滑舌鳎雄鱼、雌鱼和超雌鱼核DNA含量和体长

3.半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定：

对于性别未知的半滑舌鳎鱼苗、鱼种或成鱼，抽取血液，按照上述方法测定血细胞的DNA含量，如果血细胞的DNA含量为1.766±0.031pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，则为ZW雌性个体，如果血细胞的DNA含量为1.857±0.033pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在50.86-51.75之间，则可确定为WW超雌个体，如图2所示。因此，通过测定半滑舌鳎血细胞的DNA含量可鉴定出半滑舌鳎WW超雌个体。

4.半滑舌鳎WW超雌鱼的染色体证明

对于采用流式细胞仪鉴定出的半滑舌鳎超雌个体，我们采用染色体分析方法进行了验证。因为超雌个体含有2个W染色体，因此，我们采用常规方法制备了超雌个体的染色体，对染色体进行了核型分析。简言之，该染色体制备方法为：将鱼苗置于0.02％的秋水仙素中，室温处理6个小时。然后剪取鱼苗的鳍条，放入0.075mol·L^-1的KCl中低渗处理30分钟。用新配制的卡诺氏液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)连续固定3次，每次20分钟。再将鳍条放入50％的冰醋酸中，用尖镊子撕碎鳍条，使细胞游离；采用热滴片法滴片，10％吉姆萨染液染色20-30分钟，然后在1000倍显微镜下镜检。结果表明采用流式细胞仪检测出的超雌个体都含有2个异常大的WW染色体，如图3和图4所示，证明这些个体确为WW超雌个体。从而充分证明本发明方法鉴定超雌个体的可靠性和有效性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可以利用上述建立的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (4)

1、一种半滑舌鳎遗传性别鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：

1)半滑舌鳎血液样品的制备

用肝素钠溶液润湿过的注射器抽取半滑舌鳎血液，取0.1-0.2ml血液，离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中；取49-51μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定；随后用磷酸缓冲液PBS清洗固定的血细胞2遍，用血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml；

2)半滑舌鳎细胞DNA含量的测定

取步骤1)中的调节好浓度的血样1ml，碘化丙啶PI染色液染色30min，用流式细胞仪对血样中的细胞DNA含量进行测定，用Cellquest软件分析，同时取鸡血作为对照，鸡血DNA含量为2.5pg/2c，测定结果以DNA含量直方图的形式显示；

3)半滑舌鳎遗传性别的鉴定

用计算机软件对雌、雄半滑舌鳎细胞核DNA含量直方图进行比对，结果显示雌、雄半滑舌鳎细胞DNA含量有明显差异，并以鸡血DNA含量为参照计算出雌雄半滑舌鳎的平均DNA含量，半滑舌鳎正常雄鱼即ZZ染色体类型鱼血细胞的DNA含量为1.672±0.026pg，DNA含量直方图主峰的横坐标在41.54-42.42之间；半滑舌鳎正常雌鱼即ZW染色体类型鱼血细胞的DNA含量为1.766±0.031pg，比雄鱼血细胞的DNA含量多5.62％，DNA含量直方图主峰的横坐标在45.31-47.53之间，因此，通过测定半滑舌鳎血细胞的DNA含量可鉴定半滑舌鳎遗传性别。

2、根据权利要求1所述的半滑舌鳎遗传性别鉴定方法，其特征在于：乙醇固定后的样品用磷酸缓冲液PBS清洗后，在PBS中的适宜储存时间为0.5-1h，而用酒精固定好的血样则可在4℃下保存3-6小时。

3、一种半滑舌鳎WW超雌鱼鉴定方法，包括如下步骤：

1)半滑舌鳎血液样品的制备

用肝素钠溶液润湿过的注射器抽取半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗或雌核发育鱼苗的血液，取0.1-0.2ml血液，离心后取血细胞沉淀重悬于1ml 0.9％NaCl溶液中；取49-51μl重悬的血细胞置于含5ml 0.9％NaCl的50ml离心管中，逐滴加入15ml冰冷的95％乙醇，边加边摇以防血细胞聚集成团，从而对血细胞进行固定；随后用磷酸缓冲液PBS清洗固定的血细胞2遍，用血球计数板计数血细胞浓度，将血细胞浓度调至10⁵-10⁶个/ml；

2)半滑舌鳎细胞DNA含量的测定

取步骤1)中的调节好浓度的血样1ml，碘化丙啶PI染色液染色30min，用流式细胞仪对血样中的细胞DNA含量进行测定，用Cellquest软件分析，同时取鸡血作为对照，以便计算伪雄鱼后代鱼苗的DNA含量，鸡血DNA含量为2.5pg/2c，测定结果以DNA含量直方图的形式显示；

3)半滑舌鳎WW超雌鱼的鉴定

用WinMDI 2.9软件分析后发现伪雄鱼后代鱼苗和雌核发育鱼苗中除和正常雌、雄鱼细胞DNA含量相同的鱼苗外，还有一部分鱼苗的细胞DNA含量平均为1.857±0.033，比正常雌鱼的DNA含量多5.2％左右，DNA含量直方图主峰的横坐标在50.86-51.75之间，这些鱼苗即为半滑舌鳎WW超雌鱼，因此通过测定鱼苗血细胞DNA含量可鉴定半滑舌鳎WW超雌鱼。

4、根据权利要求3所述的半滑舌鳎WW超雌鱼鉴定方法，其特征在于：乙醇固定后的样品用磷酸缓冲液PBS清洗后，在PBS中的适宜储存时间为0.5-1h，而用酒精固定好的血样则可在4℃下保存3-6小时。

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