CN105548321A - 一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，根据中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜蛋白的特异性条带差异达到鉴别两者的目的。中蜂蜂蜜在样品处理后进行蛋白电泳，具有15.0？KDa大小蛋白条带，意蜂蜂蜜具有16.5？KDa大小蛋白条带，两者的掺和蜂蜜样品同时具有15.0？KDa和16.5？KDa两个蛋白条带。本发明通过区别不同蜂蜜的特定蛋白条带来达到鉴别目的，可以准确地鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。本发明方法中目标蛋白在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中稳定存在，不受蜜源、浓缩加工和货架期的影响。本发明方法设计合理简单，仪器常见，费用低廉，鉴别准确，也适用于一定比例意蜂蜂蜜掺入中蜂蜂蜜中的鉴定。

Description

一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法
技术领域
本发明属于蜂产品领域，主要涉及一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，是通过生物学方法鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。
技术背景
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经过在巢脾内转化、脱水、贮存至成熟的过程而成的天然甜物质。蜂蜜中蜜蜂的分泌物主要是一些蛋白质，其中包括一些消化酶和王浆主蛋白等。
意大利蜜蜂(简称意蜂)是西方蜜蜂的一个亚种，原产于意大利，产蜜能力强，生产蜂王浆的能力亦强，是蜜浆兼产的理想品种，而且也是花粉生产的理想品种，还可用于蜂胶生产。是世界范围内广泛养殖的蜜蜂品种，也是目前中国国内蜜蜂养殖的主要品种。
中华蜜蜂(简称中蜂)是东方蜜蜂的一个亚种，是中国独有的蜜蜂品种，有利用零星蜜源植物、采集力强、利用率较高、采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强，消耗饲料少等意大利蜂无法比拟的优点，非常适合中国山区定点饲养，但其蜂蜜产量较低，不生产蜂胶和蜂王浆。
中蜂蜂蜜也称“土蜂蜜”，其营养和保健功效深受消费者信赖，然而因产量较低，其市场价格是普通意蜂蜂蜜的好几倍。一些不法商贩用意蜂蜂蜜冒充或掺入中蜂蜂蜜中以赚取高额利润，给中蜂养殖者以及相关蜂产品企业造成了较大损失，同时引发了消费者的信任危机，对中蜂蜂蜜的品牌形象造成负面影响，不利于蜂产品市场的健康发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，通过如下步骤实现：
(1)蜂蜜中总蛋白的提取：分别称取10g中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，各放于50ml离心管中，各加10ml无菌水，震荡混匀，离心机4℃条件下8000g/min离心10分钟以除去蜂蜡、花粉等杂质，用移液枪小心吸取上清液至新的50ml离心管中，将上清液置于4℃冰箱预冷10分钟，加入在-20℃冰柜预冷的无水乙醇20ml，在冰水浴中温和搅拌15分钟，然后在4℃条件下以15000g/min的速度离心10分钟，弃去上清液，沉淀加1.5ml无菌水，用玻璃棒搅拌然后震荡混匀，后分装到1.5ml离心管中置于-80℃冰箱备用，来自不同蜂种的蜂蜜用不同标识标记；
(2)样品蛋白浓度测定：用蛋白浓度测定试剂盒测定；
(3)蛋白样品的处理：分别取80μl中蜂蜂蜜蛋白样品和意蜂蜂蜜蛋白样品于1.5ml离心管中，各加入20μl的蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X))，震荡混匀后95℃恒温金属浴变性10分钟；
(4)聚丙烯酰胺凝胶的制备：本实验采用的分离胶浓度为12％，浓缩胶为5％，胶条厚度1.5mm；
(5)蜂蜜蛋白样的电泳：采用蛋白电泳分离系统，两种蛋白上样量均为200μg，初始电压为90V，蛋白进入分离胶后改为150V至电泳结束，并加入蛋白Marker以指示蛋白分子量大小；
(6)胶条的处理：电泳结束后胶条放入固定液中固定1小时，中间更换一次固定液。固定完成后用考马斯亮蓝R-250染液染色3小时，然后置于脱色摇床上脱色至条带清晰；
(7)目标蛋白条带的识别：记录两种不同来源的蛋白电泳结果，根据标准蛋白Marker指示，在15.0KDa附近观察条带结果，中蜂蜂蜜样品在15.0KDa、意蜂蜂蜜样品在16.5KDa位置有特定条带，比对样品中蜂蜜蛋白条带结果，达到中蜂蜂蜜或意蜂蜂蜜鉴别目的。
本发明的另一个目的是提供所述的鉴别方法在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别中应用。
本发明提出了一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，根据中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜蛋白的特异性条带差异达到鉴别两者的目的。中蜂蜂蜜在样品处理后进行蛋白电泳，具有15.0KDa大小蛋白条带，意蜂蜂蜜具有16.5KDa大小蛋白条带，两者的掺和蜂蜜样品同时具有15.0KDa和16.5KDa两个蛋白条带。本发明通过区别不同蜂蜜的特定蛋白条带来达到鉴别目的，可以准确地鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜。
本发明是通过生物学方法，发现中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜在蛋白上的差异，以此来鉴别两种来源不同蜂种的蜂蜜，可以准确地鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，解决市场上存在意蜂蜂蜜和中蜂蜂蜜难以分辨和识别，以及意蜂蜂蜜冒充和掺入中蜂蜂蜜这一问题，在一定程度上遏制以低价意蜂蜂蜜冒充高价中蜂蜂蜜这一乱象。本发明方法中目标蛋白在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜中稳定存在，不受蜜源、浓缩加工和货架期的影响。本发明方法设计合理简单，仪器常见，费用低廉，鉴别准确，也适用于一定比例意蜂蜂蜜掺入中蜂蜂蜜中的鉴定。
附图说明
图1是中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜特异性蛋白条带图，图中从左到右依次为Marker、C1、C2、C3、中蜂王浆、Marker、M1、M2、M3、意蜂王浆、Marker。
图2是不同储存时间的中蜂商品蜜目标蛋白条带图，图中从左到右依次为Marker、中1、中2、中3、中4。
图3是不同储存时间的意蜂商品蜜目标蛋白条带图，图中从左到右依次为Marker、意1、意2、意3、意4。
图4是中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜不同比例掺和后的目标蛋白条带图，图中从左到右中蜂蜂蜜中意蜂蜂蜜的掺入比例为5％、10％、15％、25％、40％、50％、60％、70％、85％。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例一
一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，通过如下步骤实现：
(1)蜂蜜中总蛋白的提取：分别称取10g中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，各放于50ml离心管中，各加10ml无菌水，震荡混匀，离心机4℃条件下8000g/min离心10分钟以除去蜂蜡、花粉等杂质，用移液枪小心吸取上清液至新的50ml离心管中，将上清液置于4℃冰箱预冷10分钟，加入在-20℃冰柜预冷的无水乙醇20ml，在冰水浴中温和搅拌15分钟，然后在4℃条件下以15000g/min的速度离心10分钟，弃去上清液，沉淀加1.5ml无菌水，用玻璃棒搅拌然后震荡混匀，后分装到1.5ml离心管中置于-80℃冰箱备用，来自不同蜂种的蜂蜜用不同标识标记；
(2)样品蛋白浓度测定：用蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物有限公司，货号P0011)测定；
(3)蛋白样品的处理：分别取80μl中蜂蜂蜜蛋白样品和意蜂蜂蜜蛋白样品于1.5ml离心管中，各加入20μl的蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X))，震荡混匀后95℃恒温金属浴变性10分钟；
(4)聚丙烯酰胺凝胶的制备：本实验采用的分离胶浓度为12％，浓缩胶为5％，胶条厚度1.5mm；
(5)蜂蜜蛋白样的电泳：采用蛋白电泳分离系统，两种蛋白上样量均为200μg，初始电压为90V，蛋白进入分离胶后改为150V至电泳结束，并加入蛋白Marker以指示蛋白分子量大小；
(6)胶条的处理：电泳结束后胶条放入固定液中固定1小时，中间更换一次固定液。固定完成后用考马斯亮蓝R-250染液染色3小时，然后置于脱色摇床上脱色至条带清晰；
(7)目标蛋白条带的识别：记录两种不同来源的蛋白电泳结果，根据标准蛋白Marker指示，在15.0KDa附近观察条带结果。根据结果可知：中蜂蜂蜜样品在15.0KDa、意蜂蜂蜜样品在16.5KDa位置有特定条带，两者的掺和蜂蜜样品同时具有15.0KDa和16.5KDa两个条带，通过比对样品中蜂蜜蛋白条带结果，达到中蜂蜂蜜或意蜂蜂蜜鉴别目的。
实施例二
为保证实验效果，本实施例中的原蜜来自浙江省金华市的几家合作蜂场，样品信息见下表1。本实施例中的中蜂蜂王浆和意蜂蜂王浆样品来自浙江大学实验蜂场，取样时间为2015年9月23号，王浆样品放于-80℃冰箱备用。取适量王浆样品于1.5ml离心管中，用去离子水稀释至适宜浓度，后续处理与蜂蜜蛋白样品相同。
表1实验蜂蜜样品信息表
按照实施例一的方法步骤进行实验，条带结果见图1。
从图1中可以清楚地看到中蜂蜂蜜的蛋白样品在15.0KDa、意蜂蜂蜜的蛋白样品在16.5KDa有各自的特异性条带，且这种特异性条带与各自蜂王浆中的蛋白条带对应，证明其来自蜜蜂本身，排除了不同花蜜来源对鉴别的影响。
实施例三
本实施例选用中、意蜂蜂蜜的商品蜜为样品，按照实施例一的方法步骤进行实验。蛋白电泳结果表明目标条带在商品蜜中稳定存在，在商品蜜货架期内能起到良好的鉴别效果，有较好的市场效果。
本实施例中的商品蜜由某公司提供，其中意蜂蜂蜜为洋槐蜜，中蜂蜂蜜为杂花蜜，货架期为18个月，检测时间为2015年12月8日，蜂蜜的具体批号信息见下表2，条带结果见图2、图3。
表2商品蜜生产批号信息表
从图2、图3可以看出，商品蜜随着货架期的延长，其中的蛋白质成分会逐渐降解，本发明中提到的两个蛋白条带在货架期内均稳定存在，即使超出货架期一段时间也依然能够起到良好的鉴别效果。
实施例四
本实施例的中蜂蜂蜜、意蜂蜂蜜样品来自于浙江大学实验蜂场，取样时间为2015年10月12日，两种蜂蜜以不同比例进行掺和，按照实施例一的方法步骤进行实验。
随着意蜂蜂蜜掺入比例的增加，意蜂蜂蜜特有条带开始出现，且条带颜色不断加深，中蜂蜂蜜特有的条带颜色逐渐变浅，结果见图4。
本实验条件下，可以直接通过条带差异鉴定出意蜂蜂蜜25％以上比例掺入到中蜂蜂蜜中的掺假蜜，当适当增加上样量或胶条采用更为灵敏的硝酸银染色法染色，检测的灵敏度会相应的增加。
虽然上述实施例已对本发明作出了详尽的描述，但本发明的保护范围并不局限于此，还可对本发明的方案作出其不偏离中心的修改，它们都属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)蜂蜜中总蛋白的提取：分别称取中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜，各放于离心管中，各加无菌水，震荡混匀，离心机4℃条件下8000g/min离心，吸取上清液至新的离心管中，将上清液置于4℃冰箱预冷，加入无水乙醇，在冰水浴中温和搅拌，然后在4℃条件下离心，弃去上清液，沉淀加无菌水，搅拌混匀，后分装到离心管中置于-80℃冰箱备用，来自不同蜂种的蜂蜜用不同标识标记；
(2)样品蛋白浓度测定：用蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；
(3)蛋白样品的处理：分别取中蜂蜂蜜蛋白样品和意蜂蜂蜜蛋白样品于离心管中，各加入蛋白上样缓冲液，震荡混匀后95℃恒温金属浴变性10分钟；
(4)聚丙烯酰胺凝胶的制备：采用的分离胶浓度为12％，浓缩胶为5％，胶条厚度1.5mm；
(5)蜂蜜蛋白样的电泳：采用蛋白电泳分离系统，两种蛋白上样量均为200μg，初始电压为90V，蛋白进入分离胶后改为150V至电泳结束，并加入蛋白Marker以指示蛋白分子量大小；
(6)胶条的处理：电泳结束后胶条放入固定液中固定1小时，中间更换一次固定液，固定完成后用考马斯亮蓝R-250染液染色3小时，然后置于脱色摇床上脱色至条带清晰；
(7)目标蛋白条带的识别：中蜂蜂蜜蛋白在15.0KDa、意蜂蜂蜜蛋白在16.5KDa有特异性条带，根据标准蛋白Marker指示，比对蜂蜜蛋白条带结果，达到鉴别目的。
2.根据权利要求1所述的一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，其特征在于，步骤(1)中加入无水乙醇事先在-20℃冰柜预冷。
3.根据权利要求1所述的一种鉴别中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的方法，其特征在于，步骤(3)中蛋白上样缓冲液为SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X。
4.权利要求1所述的方法在中蜂蜂蜜和意蜂蜂蜜的鉴别中应用。
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