CN113082076A - 一种含白藜芦醇的饲料添加剂、制备方法及其在蛋鸡脂肪肝防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含白藜芦醇的饲料添加剂、制备方法及其在蛋鸡脂肪肝防治中的应用，属于禽类疾病防治技术领域。饲料添加剂的原料包括：白藜芦醇、雷公藤、卷柏、鸡骨草、茺蔚子和醡浆草。首先对雷公藤、鸡骨草和茺蔚子采用煎煮方式进行提取，同时利用乙醇回流提取得到卷柏、醡浆草中的有效成分，然后将两次提取的提取液加入乙醇得到沉淀，沉淀干燥后与白藜芦醇混合，即得防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂。本发明的饲料添加剂能够起到缓解蛋鸡肝脏氧化损伤及炎性损伤的作用，实现对蛋鸡FLHS优异的防治效果，克服了现有技术中单一白藜芦醇作为饲料添加剂防治效果不理想的技术难题，在针对蛋鸡FLHS高效防治方面具有广泛的应用前景。

Description

一种含白藜芦醇的饲料添加剂、制备方法及其在蛋鸡脂肪肝 防治中的应用

技术领域

本发明涉及禽类疾病防治技术领域，特别是涉及一种含白藜芦醇的饲料添加剂、制备方法及其在蛋鸡脂肪肝防治中的应用。

背景技术

蛋鸡脂肪肝出血综合征(Fatty Liver Hemorrhagic Syndrome，FLHS)作为常见营养代谢病之一，对现代养禽业的发展造成了巨大影响，但由于FLHS发病机理尚未明确，导致目前针对FLHS难以实现高效防治。

蛋鸡脂肪肝出血综合征是由于鸡只摄入的营养物质过剩而某些微量元素的成分不足或不平衡，造成肝功能发生代谢机能障碍，使肝脏脂肪代谢平衡失调，导致肝内脂肪变性、出血，有时甚至引起鸡只急性死亡。本病主要发生于产蛋期特别是产蛋高峰期的蛋鸡，在炎热的夏季最为多发，常会造成产蛋率的下降，产蛋高峰不出现等危害。现关于FLHS的发病原因依旧不是十分明确，通过调查和研究，认为诱发该病的因素包括：营养因素、环境因素、激素因素和遗传因素。其中，营养因素是该病主要的发病原因，与肝脏脂肪代谢关系密切，因此，可通过营养因素来调控脂肪代谢，对本病进行有效防治。其主要发生于高产青年蛋鸡群，多数鸡体况良好，病初无明显临床症状，只表现为肥胖，因此只有当鸡群产蛋率下降或发现产蛋高峰到达不了时才可能被发觉。具体表现为：患鸡喜卧，精神沉郁，鸡冠及肉髯等可见黏膜苍白，继而发黄、萎缩，腹部膨大柔软而下垂，可以摸到厚实的脂肪组织。病死鸡表面一般无明显损伤，剖检时皮下、腹腔及肠系膜等可见大量脂肪沉积。输卵管末端有时有一枚完整未产出的硬壳蛋，特别是肝破裂的病死鸡。肝脏肿大且质脆易碎，呈浅黄色或土黄色，手摸有油腻感，边缘钝圆，表面有明显的出血点，有的甚至肝包膜破裂导致内出血或血肿。肝脏脂肪含量一般可以达到干重的40％以上，有的甚至超过70％。有的病死鸡心肌变性呈黄色，且放在水中不会下沉，肾脏变黄，脾脏、肠道等出现不同程度的出血。

针对FLHS的防治，有研究表明，通过遗传育种的方法选择发病率低的蛋鸡成功率并不高，而且花费大，选育时间长；通过环境和饲养管理的改善有一定作用，但效果不显著；目前通过改变日粮比例以及在饲料中添加药物添加剂的相关研究也较多，且在饲料中添加化学药物可以实现一定的防治效果，但目前的化学药物成本一般都比较高，而且易残留，导致环境污染。

白藜芦醇(Resveratrol，Res)作为天然非黄酮多酚物质，主要存在于花生、葡萄籽和虎杖等植物的种皮中，具有降脂、抗氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗衰老和抗菌等广泛的生理作用。越来越多研究表明，白芦藜醇对动物及人体健康具有多种有利生物活性，且尚未发现对畜禽及人有任何毒性或致病等副作用，可以作为一种饲料添加剂使用。目前有研究将白藜芦醇用于对蛋鸡脂肪肝的防治中，但取得的防治效果尚不够理想。

因此，目前急需一种既能有效防治FLHS，又成本低廉的绿色环保饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种含白藜芦醇的饲料添加剂、制备方法及其在蛋鸡脂肪肝防治中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，从而实现对蛋鸡FLHS的高效防治，同时具有绿色环保、成本低廉的特点。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明的目的之一是提供一种饲料添加剂，原料包括以下重量份的组份：

白藜芦醇10-25份、雷公藤8-12份、卷柏3-5份、鸡骨草1-2份、茺蔚子6-8份和醡浆草9-12份。

本发明的目的之二是提供一种上述饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将雷公藤、鸡骨草和茺蔚子粉碎后加水煎煮，过滤，将滤液加无水乙醇至含醇量达20-25％，静置，离心，弃去沉淀，得滤液A；

(2)将卷柏、醡浆草粉碎，加入乙醇回流提取，得到提取液B；

(3)将滤液A和提取液B混合，继续加无水乙醇至含醇量达70-75％，静置，抽滤，得到沉淀，将沉淀干燥，然后加入白藜芦醇，搅拌均匀，即得饲料添加剂。

进一步地，步骤(1)中煎煮时间为3-4.5h。

进一步地，步骤(2)中乙醇的体积分数为50-60％，加入量为粉碎后的卷柏、醡浆草总质量的6-15倍。

进一步地，步骤(2)中回流提取时间为2-8h，静置时间为5-8h。

进一步地，步骤(3)中采用冷冻干燥方式对沉淀进行干燥。

本发明的目的之三是提供一种上述饲料添加剂在防治蛋鸡脂肪肝的饲料中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

1.本发明针对不同种类的中草药采用特定的提取方式，首先对雷公藤、鸡骨草和茺蔚子采用煎煮方式进行提取，同时利用乙醇回流提取得到卷柏、醡浆草中的有效成分，进而高效提取得到了针对蛋鸡FLHS防治的中草药有效成分。

2.本发明将白藜芦醇与中草药进行复配，原料搭配合理，制备得到的饲料添加剂能够促进蛋鸡抗氧化基因mRNA表达、激活Nrf2-ARE信号通路及抑制NF-kB信号通路，从而起到缓解蛋鸡肝脏氧化损伤及炎性损伤的作用，实现对蛋鸡FLHS优异的防治效果，克服了现有技术中单一白藜芦醇作为饲料添加剂防治效果不理想的技术难题。

3.本发明的饲料添加剂制备方法简单，成本低廉，且不含有化学添加剂，对环境无污染，绿色环保，在针对蛋鸡FLHS高效防治方面具有广泛的应用前景。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按重量份计。

实施例1

本发明用于防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂，按照重量份数计，原料包括以下组份：

白藜芦醇10份、雷公藤8份、卷柏3份、鸡骨草2份、茺蔚子6份和醡浆草9份；

制备方法如下：

(1)将雷公藤、鸡骨草和茺蔚子混合、粉碎，过300目筛，加10、8、5倍量水文火煎煮3次，每次1小时，过滤，将滤液浓缩至1:1后，加无水乙醇至含醇量达20％，静置，离心，弃去沉淀，得滤液A；

(2)将卷柏、醡浆草混合粉碎，过300目筛，加入6倍质量的体积分数为60％的乙醇回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，回收乙醇，得到提取液B；

(3)将滤液A和提取液B混合，继续加无水乙醇至含醇量达75％，静置5h，抽滤，得到沉淀，将沉淀冷冻干燥，然后加入白藜芦醇，搅拌均匀，即得防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂。

实施例2

本发明用于防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂，按照重量份数计，原料包括以下组份：

白藜芦醇25份、雷公藤12份、卷柏4份、鸡骨草1份、茺蔚子7份和醡浆草12份；

制备方法如下：

(1)将雷公藤、鸡骨草和茺蔚子混合、粉碎，过300目筛，加10、8、5倍量水文火煎煮3次，每次1.5小时，过滤，将滤液浓缩至1:1后，加无水乙醇至含醇量达25％，静置，离心，弃去沉淀，得滤液A；

(2)将卷柏、醡浆草混合粉碎，过300目筛，加入15倍质量的体积分数为55％的乙醇回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，回收乙醇，得到提取液B；

(3)将滤液A和提取液B混合，继续加无水乙醇至含醇量达70％，静置8h，抽滤，得到沉淀，将沉淀冷冻干燥，然后加入白藜芦醇，搅拌均匀，即得防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂。

实施例3

本发明用于防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂，按照重量份数计，原料包括以下组份：

白藜芦醇20份、雷公藤10份、卷柏5份、鸡骨草2份、茺蔚子8份和醡浆草10份；

制备方法如下：

(1)将雷公藤、鸡骨草和茺蔚子混合、粉碎，过300目筛，加10、8、5倍量水文火煎煮3次，每次1.2小时，过滤，将滤液浓缩至1:1后，加无水乙醇至含醇量达22％，静置，离心，弃去沉淀，得滤液A；

(2)将卷柏、醡浆草混合粉碎，过300目筛，加入10倍质量的体积分数为50％的乙醇回流提取3次，每次提取1h，合并提取液，回收乙醇，得到提取液B；

(3)将滤液A和提取液B混合，继续加无水乙醇至含醇量达73％，静置7h，抽滤，得到沉淀，将沉淀冷冻干燥，然后加入白藜芦醇，搅拌均匀，即得防治蛋鸡脂肪肝的饲料添加剂。

本发明的饲料添加剂对于高能低蛋白日粮饲养的蛋鸡脂肪肝出血综合征具有良好的防治效果，在本发明的验证实验中，所用高能低蛋白日粮为代谢能为3200.00kcal/kg、粗蛋白11.00％的高能低蛋白饲料。

效果验证：

饲喂高能低蛋白日粮来建立脂肪肝出血综合征的病理模型，并在高能低蛋白日粮中分别添加Res和实施例1-3制备的饲料添加剂。具体即选用600羽高产罗曼褐蛋鸡随机分成6组，每组5个重复，每个重复20羽。对6组进行不同日粮饲喂；Ⅰ组为正常对照组(ControlGroup，Con)，饲喂玉米-豆粕型基础日粮；Ⅱ组为病理模型组(HELP)，饲喂高能量低蛋白日粮；Ⅲ组为HELP+Res组，饲喂含有400mg/kg白藜芦醇的高能量低蛋白日粮；Ⅳ组为HELP+实施例1饲料添加剂组，饲喂含有1521mg/kg实施例1饲料添加剂的高能低蛋白日粮；V组为HELP+实施例2饲料添加剂组，饲喂含有976mg/kg实施例2饲料添加剂的高能低蛋白日粮；VI组为HELP+实施例3饲料添加剂组，饲喂含有1099mg/kg实施例3饲料添加剂的高能低蛋白日粮(Ⅳ组、V组、VI组中所添加饲料添加剂中白藜芦醇的含量与Ⅲ组中相同)。饲养采用重叠式笼养，分为三层；自由采食及饮水。于每天7:30和16:30各饲喂一次；光照时间持续16h；实验全程记录鸡舍温湿度、精神、食欲以及发病死亡情况，并根据需要记录每组采食量、产蛋数以及总蛋重。蛋鸡于第150d日龄(每组产蛋率在94％-98％之间)开始饲喂实验日粮，记录为实验第1d，实验期为120d。

1.血脂和肝脂沉积

蛋鸡于正式实验第40d、60d、80d、100d、120d每组重复随机选取蛋鸡共16羽，禁食16h翅静脉采血于离心管中，分离血清，并分装于1.5mL离心管中，置于-20℃保存备检。另肝脏组织样品采集从实验Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、V组、VI组份别于每个重复随机选取蛋鸡2羽，翅静脉麻醉后解剖，小心剥离肝脏、腹脂并记录称重于-20℃保存。

不同实验期各组蛋鸡肝指数(肝湿重/活体重)、腹脂率(腹脂重/活重比)、肝脂率以及血清ALT活力、AST活力、TG含量、血清胆固醇(T-Ch)含量、血清高密度脂蛋白(HDL-Ch)含量平均值分别如表1-8所示。

表1肝指数(肝湿重/活重比，‰)

表2腹脂率(腹脂重/活重比，‰)

表3肝脂率(％)

表4血清谷丙转苷酶(ALT)活力

表5血清谷草转氨酶(AST)活力

表6血清甘油三酯(TG)含量

表7血清总胆固醇(T-Ch)含量

表8血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-Ch)含量

由表1-8可以看出，在肝指数、腹脂率、肝脂率以及血清ALT活力、AST活力、TG含量、血清胆固醇(T-Ch)含量、血清高密度脂蛋白(HDL-Ch)含量方面，含有本发明饲料添加剂的Ⅳ组、V组、VI组下降显著，相对于仅添加白藜芦醇的高能低蛋白组，本发明的饲料添加剂能显著降低高能低蛋白日粮致FLHS蛋鸡血脂和肝脂沉积。

2.肝抗氧化基因mRNA表达测定

肝脏组织总RNA的提取过程需严格操作，谨防RNA降解或污染。试验前，所用塑料材质耗材均需经DEPC过夜处理后高温高压灭菌；金属和玻璃材质耗材均需160℃高温灭菌2h；无菌室、超净台需提前紫外照射12h以上。具体提取步骤严格按RNA提取试剂盒说明书进行操作。后RNA质量检测、反转录、引物设计与合成，最后采用SYBR Green染料法进行RealTime PCR反应。试验分析得出结果如下：

实验期间各组蛋鸡肝脏组织中Nrf2 mRNA相对表达量见表9。

表9

实验期间各组蛋鸡肝脏组织中HO-1mRNA相对表达量见表10。

表10

实验期间各组蛋鸡肝脏组织中SOD-1mRNA相对表达量见表11。

表11

高能低蛋白饲料能使鸡肝脏促氧化物增多和抗氧化物减少，氧化应激增强，从而直接损伤肝细胞或削弱肝细胞氧化和转运脂质的能力，导致大量脂质沉积于肝脏，诱发FLSH同时，在FLSH发生过程中，大量脂质发生过氧化反应，而高能日粮和自由基使脂质过氧化进一步恶化，加剧了脂质过氧化的发生及破坏程度，出现恶性循环，最终导致FLSH的发生与发展，因此，需要提高基体镍抗氧化物质的含量，促进抗氧化基因mRNA的表达。从表9-11可以看出，本发明的饲料添加剂促进了抗氧化基因mRNA的表达，且相对于单一白藜芦醇的促进效果显著。

3.肝炎症因子mRNA表达测定

同上一步对mRNA表达测定方式相同。试验分析得出结果如下：

实验期间各组蛋鸡肝脏组织中NF-κB mRNA相对表达量变化见表12。

表12

实验期间各组蛋鸡肝脏组织中TNF-αmRNA相对表达量变化见表13。

表13

试验期间各组蛋鸡肝脏组织中IL-1βmRNA相对表达量变化见表14。

表14

试验期间各组蛋鸡肝脏组织中IL-6mRNA相对表达量变化见表15。

表15

由表9-15可以看出，实验组Ⅲ组、Ⅳ组、V组和VI组均能通过激活Nrf2-ARE信号通路及抑制NF-kB信号通路等起到缓解肝脏炎性损伤的效果，并且，添加本发明饲料添加剂的实验组Ⅳ组、V组、VI组的效果优于仅添加白藜芦醇的Ⅲ组。

本发明的饲料添加剂能通过促进抗氧化基因mRNA表达、激活Nrf2-ARE信号通路及抑制NF-kB信号通路起到缓解肝脏氧化损伤及炎性损伤的作用，对于蛋鸡脂肪肝出血症的防治效果优于白藜芦醇。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种饲料添加剂，其特征在于，原料包括以下重量份的组份：

白藜芦醇10-25份、雷公藤8-12份、卷柏3-5份、鸡骨草1-2份、茺蔚子6-8份和醡浆草9-12份。

2.一种如权利要求1所述的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将雷公藤、鸡骨草和茺蔚子粉碎后加水煎煮，过滤，将滤液加无水乙醇至含醇量达20-25％，静置，离心，弃去沉淀，得滤液A；

(2)将卷柏、醡浆草粉碎，加入乙醇回流提取，得到提取液B；

(3)将滤液A和提取液B混合，继续加无水乙醇至含醇量达70-75％，静置，抽滤，得到沉淀，将沉淀干燥，然后加入白藜芦醇，搅拌均匀，即得饲料添加剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中煎煮时间为3-4.5h。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中乙醇的体积分数为50-60％，加入量为粉碎后的卷柏、醡浆草总质量的6-15倍。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中回流提取时间为2-8h，静置时间为5-8h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中采用冷冻干燥方式对沉淀进行干燥。

7.一种如权利要求1所述的饲料添加剂在防治蛋鸡脂肪肝的饲料中的应用。