CN102276753A

CN102276753A - 一种猪苓硒多糖的制备方法

Info

Publication number: CN102276753A
Application number: CN2011102686515A
Authority: CN
Inventors: 李志洲
Original assignee: Shaanxi University of Technology
Current assignee: Shaanxi University of Technology
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2011-09-13
Publication date: 2011-12-14
Anticipated expiration: 2031-09-13
Also published as: CN102276753B

Abstract

本发明公开了一种猪苓硒多糖的制备方法，包括以下步骤：A1、猪苓多糖的提取；A2、粗多糖的制备；A3、去蛋白，得猪苓精制多糖；A4、硒化反应；A5、除去催化剂。实验结果发现当硒多糖样品浓度＞0.5mg/mL时，硒多糖的清除率＞精致多糖的，且此现象随着样品浓度增大差距也越来越大。

Description

一种猪苓硒多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪苓硒多糖的制备方法，属于化工技术领域。

背景技术

猪苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]别名猪屎苓、野猪粪，属真菌门、担子菌纲、多孔菌目、多孔菌科、猪苓(地花)属。猪苓菌核生于地下，常寄生于枫、槭、桦、柳等阔叶树根上，呈不规则块状，半木质化，个体大小不等，表面凸凹不平，皱缩呈疣状物，外被一层黑褐色表皮，有油漆光泽，切面为白色或淡黄色。我国猪苓主要分布在河北、陕西、四川、湖北、云南等地。猪苓菌核含麦角甾醇、粗蛋白、可溶性糖分、多糖及X-羟基二十四碳酸等成分；猪苓菌核在我国已有2000多年的用药历史，而现代医学证明，猪苓具有消炎、利尿、渗湿、通淋、退肿、降压、轻身耐老、抗癌、抗辐射等功效，临床上可治尿路结石、黄疸、急性肾炎、暑热水泻、全身水肿、心源性水肿、腹泻、尿急、尿频、尿道痛、肝硬化、腹水、乙型肝炎等疾病；而其主要成分猪苓多糖对肺癌、肝癌、膀胱癌、食道癌、宫颈癌及白血病均有较好的临床效果。由于猪苓具有显著药用性能，而野生猪苓被大量采挖，资源越来越少，国家已将猪苓列为濒临枯竭的保护物种。20世纪70年代末，我国学者成功地从猪苓菌核中分离出猪苓纯菌种，开始了猪苓实验室液体培养研究，从而使利用猪苓菌丝体发酵液制备猪苓多糖来替代利用生药制备猪苓多糖的可能性，利用猪苓菌丝体发酵液制备猪苓多糖的研究尚未成熟，目前对猪苓多糖的基础性研究中，以固体培养基优化培养猪苓菌丝和从菌丝中进行多糖的提取研究。

多糖是生物体内除蛋白质和核酸外又一类重要的生物大分子，具有对生命体免疫损伤或免疫缺损症和抗氧化等多方面功能和生物活性，如抗感染、免疫促进、肿瘤防治、艾滋病治疗与防治等，生物学上称其为“生物应答效应物”(biological responsemodifier，BRM)或活性多糖，而影响多糖生物学活性的结构因素较多，它包括多糖的主链性质、支链性质和多糖分子的高级结构，其中多糖主链的糖单元组成、糖苷键类型均直接决定多糖的活性，多糖支链的类型、聚合度、支链在多糖链上的分布及其取代度决定了多糖的活性大小，多糖分子的高级结构如链的柔韧性和空间构象也与多糖的活性紧密相关。为提高多糖的生物活性，多糖的分子修饰和结构改造具有重要意义。近年来，有关多糖的分子修饰研究方兴未艾，如硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、双基团衍生化等；其特点主要利用多糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团运用化学方法或生物转化法进行修饰，来提高多糖的活性，如孟运莲就对经硫酸酯化的茯苓多糖进行抗肿瘤活性研究；现今硒化多糖成为研究热点之一。

微量元素是人体所需营养成分中的重要组成部分，是生命体消化过程中能量转换和组织构成的重要因素。硒元素是生命活动的必需元素，在生命体中能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体的抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力，如人体的克山病、大骨节病、癌症、不育症、机体免疫力低下和衰老等40余种疾病均与缺硒有关；同时，硒化物能提高红细胞的携氧能力、提高人体免疫力，具有解毒、排毒、抗污染作用。大量研究证明，硒参与多种酶的组成与代谢过程，具有防癌抗癌、延缓衰老、增强机体免疫力等生理功能。

硒在自然界广泛存在，主要有两种形式：(1)无机硒，包括单质硒、硒的金属化合物、亚硒酸盐(亚硒酸钠、亚硒酸钙、亚硒酸锌等)、硒酸盐(硒酸钠等)、硒化物(硒化氢、硒化锌、硒化钠等)、硫化硒、二氧化硒、二硫化硒等；(2)有机硒，主要以含硒蛋白质和硒多糖形式存在。含硒蛋白质是指硒蛋白(Seienoprotein)和含硒蛋白(Selenium-containing protein)。硒蛋白是指那些在基因密码UGA编码下，硒以硒代半胱氨酸的形式特异进入蛋白质的那些蛋白，如谷胱甘肽过氧化酶、硒蛋白P等等。含硒蛋白质是指含硒代半胱氨酸的蛋白、含硒代蛋氨酸的蛋白，键合硒蛋白等等，其中含硒代半胱氨酸的蛋白是哺乳动物中最主要的含硒蛋白质。在人类膳食中，硒主要来源于植物性食物中的硒蛋氨酸和动物性食物中的硒蛋氨酸、硒代半胱氨酸和微量的硒甲基硒代半胱氨酸等。无机硒具有蓄积性毒性和致突变作用，使用时剂量难以控制，而有机硒的毒性低、副作用小，不但能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上比无机硒显著。目前发现硒化合物对大肠癌、消化道肿瘤、呼吸道肿瘤、皮肤癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症都有抑制作用。硒化合物对癌细胞具有极强的“靶向杀伤”特征，可以说，硒化合物抗肿瘤作用的研究，为肿瘤的治疗开辟了新的途径。

硒多糖的化学结构有别于普通多糖，形成了特殊的硒氧键；硒多糖具有多种生理活性，可通过提高相关酶的活性来拮抗重金属中毒和抗活性氧损伤的能力，可使癌细胞DNA合成受阻而抑制癌细胞生长等；且已有研究证明，硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒的其他化合物，更易于为机体吸收和利用。因此，将无机硒与多糖有机结合使之转化为有机硒化合物-硒多糖，将会使硒和多糖的生理和药理功能得到优化。

目前，多糖金属配合物的研究中，有采用化学合成法的，如铁、稀土元素与多糖的化学配位合成；也有采用微生物转化法进行的，如虫草多糖的富硒培养，甘草硒多糖的制备研究，灵芝富硒多糖的制备及其性能研究等；从合成路线上看，人工合成硒多糖主要有以下三种方式：(1)在温和条件下使用单体硒、亚硒酸或亚硒酸钠等对多糖进行化学修饰；(2)利用化学性质活泼、具有酰氯结构的SeOCl₂作为硒化试剂；(3)将含硒的功能基团接枝到多糖分子上；经查询目前，对猪苓硒多糖配合物的制备研究甚少，因此，采用化学合成法制备猪苓硒多糖配合物进行研究也就成为本课题的研究目标。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种猪苓硒多糖的制备方法。

一种猪苓硒多糖的制备方法，包括以下步骤：

A1、猪苓多糖的提取；

A2、粗多糖的制备；

用旋转蒸发仪将将以猪苓为原料的水提取多糖的上清液浓缩至原体积的1/5，加入无水乙醇使混合液乙醇浓度为85％，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得粗多糖；

A3、去蛋白，得猪苓精制多糖；

A4、硒化反应；

称取质量为1g的猪苓精制多糖加入三颈瓶中，加入质量浓度1％的HAc溶液50mL溶解，匀速搅拌，0.5h以后加入3mL的0.06g/ml的H2SeO3，0.1g的BaCl2，2h后逐滴加入质量浓度为5％的硝酸2mL，超声反应60min，反应完毕，将反应液降至室温；

A5、除去催化剂；

加入无水乙醇，使溶液中乙醇含量为85％，沉淀，静置12h，离心，得到的沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶，用透析袋(MA10)透析，直至透析液中无Ba2+离子被检出，再用无水乙醇对透析余液醇析；减压过滤，在真空度大于0.09Pa，温度30℃-60℃的真空干燥箱中烘干，得产品猪苓硒多糖，硒含量28.13mg/g。

所述的方法，所述步骤A1，猪苓经干燥、粉碎至20目，处理后，按提取时间5min、温度75℃、料液比(g/ml)1∶20、pH＝9、微波功率400W进行猪苓多糖提取；提取后离心，上清液备用。

所述的方法，所述步骤A3，将粗多糖用蒸馏水溶解，采用Sevage法将多糖液与有机溶剂混合，剧烈振荡20min，3900rpm离心30min，除去沉淀。重复此过程3-4次，直至上清液中无蛋白质检出；上清液浓缩，加入无水乙醇至溶液中乙醇含量85％，醇析，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得猪苓精制多糖。

利用邻苯三酚自氧化法产生的超氧阴离子(·O₂ ^-)和Fenton反应法产生羟基自由基(·OH)对制备的精致多糖与硒多糖进行抗氧化性对比研究，实验结果发现当硒多糖样品浓度＞0.5mg/mL时，硒多糖的清除率＞精致多糖的，且此现象随着样品浓度增大差距也越来越大。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、猪苓多糖的提取

猪苓经干燥、粉碎至20目，处理后，按提取时间5min、温度75℃、料液比(原料∶蒸馏水，g/ml)1∶20、pH＝9、微波功率400W进行猪苓多糖提取；提取后离心，上清液备用。

2、粗多糖的制备

用旋转蒸发仪将猪苓多糖上清液浓缩至原体积的1/5，加入无水乙醇使混合液乙醇浓度为85％，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得粗多糖。

3、去蛋白

将粗多糖用蒸馏水溶解(粗多糖与蒸馏水比例1∶5，单位：g/mL)，采用Sevage法将多糖液与有机溶剂(有机溶剂为氯仿和正丁醇体积比5∶1混合而成)混合，剧烈振荡20min，3900rpm离心30min，除去沉淀。重复此过程3-4次，直至上清液中无蛋白质检出；上清液浓缩，加入无水乙醇至溶液中乙醇含量85％，醇析，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得猪苓精制多糖。

4、硒化反应

称取质量为1g的猪苓精制多糖加入三颈瓶中，加入质量浓度1％的HAc溶液50mL溶解，匀速搅拌，0.5h以后加入3mL的0.06g/ml的H₂SeO₃，0.1g的BaCl₂，2h后逐滴加入质量浓度为5％的硝酸2mL，超声反应60min，反应完毕，将反应液降至室温。

5、除去催化剂

加入无水乙醇，使溶液中乙醇含量为85％，沉淀，静置12h，离心，得到的沉淀。沉淀物用蒸馏水复溶，用透析袋(MA10)透析，直至透析液中无Ba²⁺离子被检出，再用无水乙醇对透析余液醇析；减压过滤，在真空度大于0.09Pa，温度30℃-60℃的真空干燥箱中烘干，得产品猪苓硒多糖，硒含量28.13mg/g。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种猪苓硒多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1、猪苓多糖的提取；

A2、粗多糖的制备；

用旋转蒸发仪将以猪苓为原料的水提取多糖的上清液浓缩至原体积的1/5，加入无水乙醇使混合液乙醇浓度为85％，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得粗多糖；

A3、去蛋白，得猪苓精制多糖；

A4、硒化反应；

称取质量为1g的猪苓精制多糖加入三颈瓶中，加入质量浓度1％的HAc溶液50mL溶解，匀速搅拌，0.5h以后加入3mL的0.06g/ml的H₂SeO₃，0.1g的BaCl₂，2h后逐滴加入质量浓度为5％的硝酸2mL，超声反应60min，反应完毕，将反应液降至室温；

A5、除去催化剂；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1，猪苓经干燥、粉碎至20目，处理后，按提取时间5min、温度75℃、料液比(g/ml)1∶20、pH＝9、微波功率400W进行猪苓多糖提取；提取后离心，上清液备用。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A3，将粗多糖用蒸馏水溶解，采用Sevage法将多糖液与有机溶剂混合，剧烈振荡20min，3900rpm离心30min，除去沉淀。重复此过程3-4次，直至上清液中无蛋白质检出；上清液浓缩，加入无水乙醇至溶液中乙醇含量85％，醇析，沉淀，静置12h，离心，沉淀干燥，得猪苓精制多糖。