WO2019009426A1

WO2019009426A1 - 抗菌又は抗真菌ペプチド及び抗菌又は抗真菌薬

Info

Publication number: WO2019009426A1
Application number: PCT/JP2018/025798
Authority: WO
Inventors: 裕一大塚; 道明増田
Original assignee: 学校法人獨協学園獨協医科大学
Priority date: 2017-07-03
Filing date: 2018-07-02
Publication date: 2019-01-10
Also published as: JP2020152640A

Abstract

本発明は、塩濃度に左右されない強い抗菌又は抗真菌活性を有し、かつ真核細胞に対して極めて毒性が低い低分子量のぺプチド、及びそれを用いた抗菌又は抗真菌薬等を提供することができるものであり、以下の(a)、(b)又は(c)のペプチド、その誘導体又はこれらの塩である。(a)配列番号１～５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。(b)配列番号１～５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するペプチド。(c)配列番号１～５に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するぺプチド。

Description

抗菌又は抗真菌ペプチド及び抗菌又は抗真菌薬

　本発明は、抗菌又は抗真菌作用を有するペプチド及びそれを用いた抗菌又は抗真菌薬等に関する。

　薬剤耐性菌や薬剤耐性真菌の蔓延は、現代社会の大きな問題であり、その対策には新規抗菌又は抗真菌薬の開発が急務である。
　動物、植物を含めた多くの生物は、細菌の感染から逃れるために抗菌作用をもつペプチド（抗菌ペプチド）を産生する（非特許文献１）。これまでに様々な抗菌ペプチドが同定、解析されてきた。抗菌ペプチドは速やかに作用し幅広い抗菌スペクトルをもつ。抗菌ペプチドの大部分は細菌の細胞膜をターゲットにするため（非特許文献１、２）、膜の構造や組成が異なる真核細胞に対してはほとんど影響がない。さらに、細菌が抗菌ペプチドに耐性を獲得するためには、細胞膜の脂質組成を変えなくてはならないため、耐性菌の出現が極めて起こり難いと考えられる。このように、抗菌ペプチドは多くの優れた特徴を有しているが、抗菌薬へ応用するにはまだ多くの障害が存在する。天然の抗菌ペプチドは抗菌効果がそれほど強くない。また分子量が大きいため、抽出・精製や化学合成には時間や労力、費用がかかる（非特許文献３、４）。さらに、多くの抗菌ペプチドは、生理的塩濃度で活性が減弱するといった問題点がある（非特許文献５、６）。また、同様の問題点が、上記の細菌に対する抗菌ペプチドや抗菌薬においてのみならず、真菌に対する抗真菌ペプチドや抗真菌薬においても存在する。

Ｚａｓｌｏｆｆ　Ｍ．，２００２．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ　ｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｎａｔｕｒｅ　４１５：３８９−３９５．Ｍｅｌｏ　Ｍ．Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，２００９．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　ｌｉｎｋｉｎｇ　ｐａｒｔｉｔｉｏｎ，ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：２４５−２５０．Ｈａｎｃｏｃｋ　Ｒ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，２００６．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ−ｄｅｆｅｎｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　ｎｅｗ　ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１５５１−１５５７．Ｓｉｌｖａ　Ｏ．Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，２０１１．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ　ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ　ｈｏｓｔ−ｄｅｆｅｎｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ：　ｆｒｏｍ　ｎａｔｕｒａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｓ　ｔｏ　ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：１−１４．Ｔｕｒｎｅｒ　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，１９９８．Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ＬＬ−３７，ａ　ｃａｔｈｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２２０６−２２１４．Ｃｈｕ　Ｈ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，２０１３．Ｂｏｏｓｔｉｎｇ　ｓａｌｔ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｓｈｏｒｔ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５７：４０５０−４０５２．

　このような状況下において、塩濃度に左右されない強い抗菌又は抗真菌活性を有し、かつ真核細胞に対して極めて毒性が低い低分子量のペプチド、及びそれを用いた抗菌又は抗真菌薬の探索・開発が望まれていた。
　本発明は、上記状況を考慮してなされたもので、以下に示す、ペプチド（抗菌又は抗真菌ペプチド）、抗菌又は抗真菌薬、医薬組成物、並びに細菌感染症及び真菌感染症等の治療及び予防方法等を提供するものである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
　（ａ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
　（ｂ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するペプチド。
　（ｃ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するペプチド。
（２）上記（１）記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、抗菌又は抗真菌薬。
（３）グラム陽性菌に対して抗菌作用を有するか、及び／又は真菌に対して抗真菌作用を有する、上記（２）記載の抗菌又は抗真菌薬。
（４）上記（１）記載のペプチド、その誘導体若しくはこれらの塩を含む、医薬組成物。
（５）細菌感染症及び／又は真菌感染症の治療又は予防に用いられる、上記（４）記載の医薬組成物。
（６）前記細菌がグラム陽性菌である、上記（５）記載の医薬組成物。
（７）対象となる被験動物の細菌感染症及び／又は真菌感染症を治療又は予防する方法であって、上記（４）~（６）のいずれか１つに記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
（８）前記細菌がグラム陽性菌である、上記（７）記載の方法。
　発明の効果
　本発明によれば、塩濃度に左右されない強い抗菌又は抗真菌活性を有し、かつ真核細胞に対して極めて毒性が低い低分子量のペプチド、及びそれを用いた抗菌又は抗真菌薬を提供することができる。
　本発明のペプチド及び抗菌又は抗真菌薬は、例えば、細菌感染症や真菌感染症の治療又は予防に用いることができる点で、極めて有用なものである。

　図１は、ＺｏｒＯトキシン（配列番号６）の発現誘導後における大腸菌の増殖停止（図１（Ａ））と生存率の低下（図１（Ｂ），（Ｃ））の結果を示す図である。
　図２は、ＺｏｒＯトキシン（２９ａａ：配列番号６）と、その各種変異タンパク質（２５ａａ（Δ４Ｎ）、２１ａａ（Δ８Ｎ）、１６ａａ（Δ１３Ｎ）、２４ａａ（Δ５Ｃ）、１９ａａ（Δ１０Ｃ）、２４ａａ（ΔＡＬＬＲＬ））の、それぞれの毒性の有無（−は毒性なし、＋は毒性あり）の結果を示す図である。
　なお、図中、「２９ａａ」、「２５ａａ（Δ４Ｎ）」、「２１ａａ（Δ８Ｎ）」、「１６ａａ（Δ１３Ｎ）」、「２４ａａ（Δ５Ｃ）」、「１９ａａ（Δ１０Ｃ）」、「２４ａａ（ΔＡＬＬＲＬ）」の７種のペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ順に、配列番号６~１２に示す。
　図３は、黄色ブドウ球菌に対するＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加による殺菌作用（抗菌作用）の有無の結果（図３（Ａ）~（Ｃ））を示す図である。
　図４は、枯草菌に対するＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加による殺菌作用（抗菌作用）の有無の結果（図４（Ａ）~（Ｃ））を示す図である。
　図５は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対するＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加による殺菌作用（抗菌作用）の有無の結果（図５（Ａ））、及び、黄色ブドウ球菌、枯草菌、大腸菌（Ｋ−１２株、Ｏ１５７：Ｈ７株）に対するＡＬＬＲＬペプチドの添加による殺菌作用（抗菌作用）の有無の結果（図５（Ｂ））を示す図である。
　図６は、黄色ブドウ球菌に対する、ＤＭＳＯの添加（図６（Ａ））及びＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加（図６（Ｂ））による、細胞膜の損傷の有無の結果を示す図である。（Ａ），（Ｂ）とも、左上のパネルはＰＩ染色、右上のパネルはＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）染色、左下のパネルはマージ画像、右下のパネルは位相差観察の画像を示す。
　図７は、枯草菌に対する、ＤＭＳＯの添加（図７（Ａ））及びＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加（図７（Ｂ））による、細胞膜の損傷の有無の結果を示す図である。（Ａ），（Ｂ）とも、左上のパネルはＰＩ染色、右上のパネルはＤＡＰＩ染色、右下のパネルは位相差観察の画像を示し、（Ｂ）の左下のパネルはマージ画像を示す。
　図８は、動物由来の培養細胞３種類（（Ａ）はＶｅｒｏ細胞、（Ｂ）はＢＨＫ細胞、（Ｃ）はＣＨＯ細胞）に対する、ＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の細胞毒性の有無の結果を示す図である。図８（Ａ）~（Ｃ）中の「Ｎｏ」はＤＭＳＯおよびＡＬＬＲＬペプチドをいずれも加えていない細胞の値を示す。
　図９は、枯草菌に対するＡＬＬＲＬＩペプチド（配列番号２）、ＡＬＬＲペプチド（配列番号３）、ＬＬＲＬ（配列番号４）、ＬＲＬＬＡ（配列番号５）の添加による殺菌作用（抗菌作用）の有無の結果を示す図である。
　図１０は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）に対するＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加による抗真菌作用の有無の結果（図１０（Ａ））、及び、ＡＬＬＲＬＩペプチド（配列番号２）、ＡＬＬＲペプチド（配列番号３）の添加による抗真菌作用の有無の結果（図１０（Ｂ））を示す図である。
　図１１は、カンジダ・アルビカンスに対する、ＤＭＳＯの添加及びＡＬＬＲＬペプチド（配列番号１）の添加による、細胞膜の損傷の有無の結果を示す図である。左側は、ＤＭＳＯの添加、右側は、ＡＬＬＲＬペプチドの添加の画像で、上のパネルはＰＩ染色、真ん中のパネルはＤＡＰＩ染色、下のパネルは位相差観察の画像を示す。

　以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２０１７−１３０３６９号明細書（２０１７年７月３日出願）の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
　以下、本明細書において、「抗菌」との文言は、便宜上、細菌に対する「抗菌」と、真菌に対する「抗真菌」とのどちらの意味にも適宜理解し得るものとする。また、「抗菌ペプチド」や「抗菌薬」との文言についても、同様に、細菌に対する「抗菌ペプチド」及び「抗菌薬」と、真菌に対する「抗真菌ペプチド」及び「抗真菌薬」とのどちらの意味にも適宜理解し得るものとする。
１．本発明の概要
　幅広い抗菌スペクトルを持つ抗菌ペプチドは、細胞膜を標的とするため耐性菌の出現が起こり難い。しかしながら、動植物から単離される抗菌ペプチドは、高分子量、細胞毒性が高い、生理的な塩濃度では活性が減弱するといった問題点がある。また、既知のアミノ酸配列に基づいて設計・合成された抗菌ペプチドは、上述の問題点を改善するものもあるが、いずれも１０アミノ酸より大きいものである。より低分子の抗菌ペプチドを発見できれば、合成効率はもとよりコスト面においてもさらなる改善が期待できる。
　ところで、細菌が産生するトキシンには、分泌されずに細菌自身の増殖を停止させるものがある。これは、ストレス応答やバイオフィルム形成など細菌のさまざまな生理現象にかかわる。このトキシンの特徴として、その活性を抑えるアンチトキシンの遺伝子がトキシン遺伝子と並んで存在し、トキシン−アンチトキシン系（ＴＡ）を構成する。ＴＡは細菌界に広く保存されており、染色体やプラスミド上には複数のＴＡ遺伝子座が存在する。腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株のｚｏｒＯ−ｏｒｚＯ　ＴＡの場合、２９アミノ酸からなるＺｏｒＯトキシン（配列番号６）が細菌内で発現すると、細胞膜に局在して膜損傷を引き起こすと考えられており、その結果、菌の増殖が阻害され、生存率が著しく低下する（Ｆｏｚｏ　Ｅ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，２０１０．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３８：３７４３−３７５９；Ｗｅｎ　Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，２０１６．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．４５：４００６−４０２０）。
　そこで、本発明者は、低分子量であるＺｏｒＯトキシンが抗菌ペプチドとして作用し、新規抗菌薬のシーズとなり得るのではないかと考え、まず、ＺｏｒＯトキシンによる細菌の増殖阻害（増殖停止）に、ＺｏｒＯ内部の５残基のアミノ酸配列、すなわち「Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号１）（以下、ＡＬＬＲＬペプチド）が重要であることを見出した。そして、これまでの抗菌ペプチドとは異なるアミノ酸配列で、かつ残基数がさらに少ない、前記ＡＬＬＲＬペプチドが、抗菌作用を有するのではないかという着想に至った。実際に、このＡＬＬＲＬペプチドを細菌に添加して、増殖能と生存率を測定し、その形態変化を観察したところ、生理的な塩濃度下において、増殖能と生存率の低下、及び細胞膜損傷が認められた。また、ＡＬＬＲＬペプチドは、真菌に対しても増殖能の低下、及び細胞膜損傷が認められた。さらに、ＡＬＬＲＬペプチドは、動物由来の培養細胞には実質的に細胞毒性を示さないことも確認された。
　加えて、本発明者は、ＡＬＬＲＬペプチドと同様に、細菌や真菌に対する殺菌作用（抗菌作用）を有するペプチドとして、「Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ」（配列番号２）（以下、ＡＬＬＲＬＩペプチド）、「Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ」（配列番号３）（以下、ＡＬＬＲペプチド）、「Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ」（配列番号４）（以下、ＬＬＲＬペプチド）、「Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ」（配列番号５）（以下、ＬＲＬＬＡペプチド）も見出した。
　以上の知見に基づいて、本発明は完成されたものである。
２．抗菌ペプチド
　本発明のペプチド（抗菌ペプチド）は、先に述べた通り、下記（ａ）のペプチドを含むものである。
　（ａ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列（すなわち、ＡＬＬＲＬ（配列番号１）、ＡＬＬＲＬＩ（配列番号２）、ＡＬＬＲ（配列番号３）、ＬＬＲＬ（配列番号４）、ＬＲＬＬＡ（配列番号５））を含むペプチド。
　本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。また、オリゴペプチドよりも多数のアミノ酸が結合したポリペプチドも、本発明でいう上記「ペプチド」に含まれ得るものとする。
　上記（ａ）のペプチドとしては、最も好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドであるが、これに限定されるわけではない。
　また本発明のペプチドは、先に述べた通り、前記（ａ）のペプチドと機能的に同等なペプチドとして、下記（ｂ）のペプチドを含むものであってもよい。
　（ｂ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌活性を有するペプチド。
　当該（ｂ）のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号１~５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するペプチドが好ましい。
　ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１~数個、１~５個、１~４個、１~３個、１~２個、１個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされないが、当該欠失、置換又は付加の数は、一般的には小さい程好ましい。当該欠失、置換又は付加等の変異の導入は、当該変異導入前のアミノ酸配列をコードするＤＮＡに対して、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ^ＴＭ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、及びＴａＫａＲａ　Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　ｋｉｔ、Ｍｕｔａｎ（登録商標）−Ｓｕｐｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて、所望のアミノ酸変異が導入されるようにＤＮＡを改変すること等で行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
　また、前記（ａ）のペプチドと機能的に同等なペプチドとしては、例えば、下記（ｃ）のペプチドも挙げられる。
　（ｃ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列を有し、かつ、抗菌活性を有するペプチド。
　当該（ｃ）のペプチドとしては、限定はされないが、配列番号１~５に示されるアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するペプチドが好ましい。
　さらに、当該（ｃ）のペプチドとしては、配列番号１~５に示されるアミノ酸配列に対して、８５％以上、９０％以上、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し（又は当該アミノ酸配列からなり）、かつ、抗菌活性を有するペプチドも好ましく挙げられる。上記同一性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　上記（ｂ）や（ｃ）のペプチド（いわゆる変異型のペプチド）は、該ペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。
　本発明において、抗菌活性とは、細菌の増殖能や生存率を低下させる活性や、細菌の細胞膜損傷を引き起こす活性を意味する。当該活性は、例えば、増殖能や生存率の低下は、分光光度計、寒天培地、市販のキット、例えば、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（プロメガ）とルミノメーター等を用いて、細胞膜損傷の有無は、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（インビトロジェン）と蛍光顕微鏡等を用いて、測定・観察及び評価等することができる。
　本発明でいう前記（ａ）~（ｃ）のペプチドは、その構成アミノ酸の残基数は特に限定はされず、所定の活性（抗菌活性）を有する範囲内で適宜設定することができる。また、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のペプチドである場合は、動物細胞への細胞毒性等の悪影響や副作用等が少ない場合が多いため好ましい。
　天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチドやポリペプチド、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（東洋紡）、ＴＮＴ^ＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）、合成装置のＰＧ−Ｍａｔｅ^ＴＭ（東洋紡）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
　また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
　本発明においては、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドとともに、又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。当該誘導体とは、当該ペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
　また本発明においては、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、及び／又は、当該ペプチドの誘導体とともに、あるいはそれに代えて、当該ペプチド及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
　塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
３．ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体
　本発明においては、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡも包含される。当該ＤＮＡは、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡであってもよいし、あるいは、当該塩基配列を一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）を含んでなるＤＮＡであってもよく、限定はされない。なお、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、各種細菌や酵母等の微生物、ヒト等の哺乳類、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
　また本発明においては、前記（ａ）~（ｃ）のペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって、抗菌活性を有するペプチドをコードするＤＮＡも包含される。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１０~１０００ｍＭであり、温度が３７~７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が１００~２００ｍＭであり、温度が５０~６０℃での条件をいう。
　また、本発明においては、上記ＤＮＡを適当なベクターに連結（挿入）して得られる組換えベクターや、当該組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得られる形質転換体も、包含される。これら組換えベクターや形質転換体については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）等の記載を参照して適宜作製することができる。
４．抗菌薬
　本発明の抗菌薬は、前述のとおり、有効成分として、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩を含むものである。
　本発明の抗菌薬を作用させる対象となる菌（細菌）は、実際に本発明の抗菌薬が抗菌活性を発揮し得る菌であればよく、特に限定はされないが、グラム陽性菌（例えば、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、枯草菌など）が好ましく挙げられる。
　本発明の抗菌薬は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、ＰＢＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩による所定の活性（抗菌活性）が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。具体的には、上記ペプチドの溶液で用いる場合、ペプチド濃度は、特に限定はされず、例えば、１００ｎＭ以上が挙げられ、３００~５００ｎＭ、５００~１，０００ｎＭ、１，０００~２，０００ｎＭ、２，０００~５，０００ｎＭ、又は３，０００~５，０００ｎＭ以上であってもよい。
５．医薬組成物
　本発明の抗菌薬は、医薬組成物に含まれる有効成分として有用である。なお、実質的には、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩を当該有効成分ということもできる。
　本発明の医薬組成物は、限定はされないが、例えば、細菌感染症及び／又は真菌感染症等の治療又は予防に用いる医薬組成物であることが好ましい。ここで、対象となる菌（細菌）としては、実際に本発明の抗菌薬が抗菌活性を発揮し得る菌であればよく、特に限定はされないが、グラム陽性菌（例えば、黄色ブドウ球菌、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、枯草菌など）が好ましく挙げられる。また真菌としては、特に限定はされないが、例えば、酵母様真菌であるカンジダ・アルビカンスなどのカンジダ属や、クリプトコックス属などが好ましく挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗菌薬を有効成分として含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で提供され得る。
　「薬学的に許容され得る担体」とは、賦形剤、希釈剤、増量剤、崩壊剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、乳化剤、芳香剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の１種以上を用いることにより、注射剤、液剤、カプセル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調製することができる。これらの医薬組成物は、経口あるいは非経口的に投与することができる。非経口投与のためのその他の形態としては、１つ以上の活性物質を含み、常法により処方される注射剤などが含まれる。注射剤の場合には、生理食塩水又は市販の注射用蒸留水等の薬学的に許容される担体中に溶解または懸濁することにより製造することができる。
　本発明の医薬組成物の投与量は、対象となる被験動物（ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物）の年齢、性別、体重及び症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは医薬組成物に含有される本発明の表出抑制剤等の種類などにより異なっていてもよい。通常、成人一人あたり、一回につき１００μｇ~５０００ｍｇの範囲で投与することができるが、限定はされない。
　例えば注射剤により投与する場合は、ヒト患者に対し、１回の投与において１ｋｇ体重あたり、１μｇ~１００ｍｇの量を、１日平均あたり１回~数回投与することができる。投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射あるいは腹腔内注射などが挙げられるが、好ましくは静脈内注射である。また、注射剤は、場合により、非水性の希釈剤（例えばポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、エタノール等のアルコール類など）、懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもできる。そのような注射剤の無菌化は、フィルターによる濾過滅菌、殺菌剤の配合等により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として製造することができる。すなわち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。
　なお、本発明の一態様としては、細菌感染症及び／又は真菌感染症等を治療又は予防する医薬（薬剤）を製造するための、本発明の抗菌薬（又は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩）の使用も含まれる。また、本発明の他の一態様としては、本発明の抗菌薬（又は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩）の有効量を用いること（すなわち、対象としての被験動物や患者に投与すること）を特徴とする、細菌感染症及び／又は真菌感染症等の治療又は予防方法も含まれる。ここで、被験動物としては、特に限定はされないが、ヒトを含む霊長類、マウス及びラット等を含むげっ歯類、魚類、鳥類のほか、牛、犬、馬、猫、山羊、羊、及び豚等の各種哺乳動物が含まれ、感染対象によっては、上記以外の動物種にまで拡張することもできる。さらに、本発明の他の一態様としては細菌感染症及び／又は真菌感染症等を治療又は予防するための、本発明の抗菌薬（又は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩）の使用も含まれる。以上の各々の態様において、対象となる菌（細菌）としては、上記本発明の医薬組成物の説明において述べたものと同様のものが好ましく挙げられる。
６．キット
　本発明においては、構成成分として本発明の抗菌薬（又は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩）を含むことを特徴とする、抗菌用キットや、細菌感染症及び／又は真菌感染症等の治療又は予防用キットも提供される。ここで、対象となる菌（細菌）としては、前記本発明の医薬組成物の説明において述べたものと同様のものが好ましく挙げられる。
　本発明のキットは、本発明の抗菌薬（又は、前記（ａ）~（ｃ）のペプチド、その誘導体あるいはそれらの塩）の他に、各種バッファー、滅菌水、各種反応容器（エッペンドルフチューブ等）、洗浄剤、界面活性剤、各種プレート、防腐剤、各種細胞培養容器、及び実験操作マニュアル（説明書）等を含んでいてもよく、限定はされない。
　以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜材料・方法＞
１．使用した細菌と真菌
　以下の各種細菌又は真菌を、殺菌作用（抗菌作用）の有無を確認する対象とした。
　黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株：ＢＷ２５１１３またはＴＹ０８０７、Ｏ１５７：Ｈ７株：ＡＴＣＣ４３８８８）、カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）
２．使用したプラスミド
　後述するように、ＺｏｒＯトキシンの毒性に必要なアミノ酸を調べるために、アラビノース誘導性のベクタープラスミドｐＢＡＤ２４に各種タンパク質をコードするＤＮＡを挿入した、以下の各種プラスミドを構築し、使用した。
ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ４）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ８）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ１３）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＣ５）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＣ１０）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＡＬＬＲＬ）
３．使用したペプチド
　以下の各種ペプチドを、殺菌作用（抗菌作用）の有無の確認に使用した。これらのペプチドは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈに化学合成を依頼した。乾燥状態のペプチドをＤＭＳＯに溶解した。
　ＭＤＴＬＴＱＫＬＴＶＬＩＡＶＬＥＬＬＶＡＬＬＲＬＩＤＬＬＫ（配列番号６）
　ＬＥＬＬＶＡＬＬＲＬ（配列番号１３）
　ＡＬＬＲＬ（配列番号１）
　ＬＲＬＬＡ（配列番号５）
　ＶＡＬＬＲＬ（配列番号１４）
　ＡＬＬＲＬＩ（配列番号２）
　ＡＬＬＲ（配列番号３）
　ＬＬＲＬ（配列番号４）
　ＡＬＬＫＬ（配列番号１５）
　ＡＬＬＨＬ（配列番号１６）
　ＡＬＬＲＡ（配列番号１７）
　ＡＬＬＲＩ（配列番号１８）
４．細菌・真菌の増殖測定
（１）細菌
　一晩培養した細菌をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地（Ｄｉｆｃｏ^ＴＭ　ＬＢ　ｂｒｏｔｈ，Ｍｉｌｌｅｒ，２４４６２０，ＢＤ）で希釈して、小型振盪培養機（ＴＶＳ０６２ＣＡ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養した。培養開始後にＬ−アラビノース（Ａ３２５６−２５Ｇ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＭＳＯ（Ｄ−５８７９，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはペプチドを加え、さらに培養した。２０分おきにＯＤ_６６０の値を測定し、細菌の増殖能を調べた。
（２）真菌
　サブロー寒天培地（サブロー寒天培地（顆粒），０５７０１，ニッスイ）上で形成された真菌（カンジダ・アルビカンス）のコロニーを２つとり、０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ　ＮａＣｌ，２．７ｍＭ　ＫＣｌ，８ｍＭ　Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１．５ｍＭ　ＫＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．４）に懸濁した。懸濁液０．０５ｍｌを４ｍｌのサブロー液体培地（１００ｍｌあたり１ｇ　Ｇｌｕｃｏｓｅ，２ｇ　Ｐｅｐｔｏｎｅ，ｐＨ５．５）に加え、小型振盪培養機（ＴＶＳ０６２ＣＡ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、ＤＭＳＯまたはペプチドを加え、さらに培養を続けた。２０分おきにＯＤ_６６０の値を測定した。
５．コロニー形成単位（ＣＦＵ）測定
　細菌培養液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、ＬＢ寒天培地（ＬＢ液体培地中に１．５％の寒天（Ｂａｃｔｏ^ＴＭ　Ａｇａｒ，２１４０１０，ＢＤ）を含む）に塗り広げた、もしくは各希釈液をＬＢ寒天培地に５μｌ滴下した。菌液が乾燥した後、３７℃で一晩培養し、形成されたコロニー数を測定、観察した。
６．細菌の生存率測定
　細菌の生存率測定にはＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｇ８２３０，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。測定方法はキットのプロトコルに従い、発光量（ＲＬＵ）はルミノメーター（Ｌｕｍａｔ　ＬＢ９５０１，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて定量した。
７．細菌と真菌の顕微鏡観察
　一晩培養した細菌をＬＢ液体培地で１００倍希釈し、振盪培養した（例えば、黄色ブドウ球菌の場合は３７℃で２時間、枯草菌の場合は２時間４０分）。次に１ｍｌの菌液に対して、１０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに３０分間培養した。遠心（６０００ｒｐｍ，５分間，室温，ＭＲＸ−１５２，ＴＯＭＹ）により細菌を回収し、１ｍｌのＰＢＳで懸濁した。２０μｌのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（Ｐ３５６６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて室温で５分間処理した後、０．５μｌのＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）（Ｄ２１４９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、さらに室温で５分間処理した。遠心（６０００ｒｐｍ，５分間，室温）により細菌を回収して、１００μｌのＰＢＳで再懸濁した。細菌は蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００，ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて観察した。真菌（カンジダ・アルビカンス）の場合、サブロー寒天培地上で形成されたカンジダ・アルビカンスのコロニーを２つとり、０．５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。懸濁液０．０５ｍｌを４ｍｌのサブロー液体培地に加え、小型振盪培養機（ＴＶＳ０６２ＣＡ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、４０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに４０分間培養した。遠心（６０００ｒｐｍ，５分間，室温，ＭＲＸ−１５２，ＴＯＭＹ）によりカンジダ・アルビカンスを回収し、１ｍｌのＰＢＳで懸濁した。２０μｌのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（Ｐ３５６６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて室温で５分間処理した後、０．５μｌのＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ）（Ｄ２１４９０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、さらに室温で５分間処理した。遠心（６０００ｒｐｍ，５分間，室温）によりカンジダ・アルビカンスを回収して、６０μｌのＰＢＳで再懸濁した。カンジダ・アルビカンスは蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００，ＫＥＹＥＮＣＥ）を用いて観察した。
８．細胞毒性（ＭＴＴアッセイ）
　動物由来の細胞としてのＶｅｒｏ、ＢＨＫまたはＣＨＯ細胞を、ＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳを含む）で懸濁して、９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅを用いて２４時間培養した。細胞が７０~９０％コンフルエントであることを確認した後、ＭＥＭ培地（１％ＦＢＳを含む）に置換し、培地１００μｌに対して２μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００，１００，５０，２５，１２．５，６．２５μｇ／ｍｌ）を加え、さらに２４時間培養した。その後、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（Ｍ２１２８−２５０ＭＧ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で生細胞を染色し、マイクロプレートリーダー（ｉＭａｒｋ，ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いて５６０ｎｍの吸光度を測定した。
＜結果＞
１．ＺｏｒＯトキシンの毒性に必要なアミノ酸
　ＺｏｒＯトキシンの毒性を確認するために、ＺｏｒＯトキシンをアラビノース誘導性のベクタープラスミド（ｐＢＡＤ２４）にクローニングし、組換えプラスミド（ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ）を、大腸菌Ｋ−１２株（ＴＹ０８０７）に導入して形質転換した。次に、５ｍｌのＬＢ液体培地（２本）に、一晩培養した形質転換大腸菌（ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯプラスミドを持つＫ−１２株ＴＹ０８０７）を５０μｌ加えて３７℃で振盪培養を開始した。ＯＤ_６６０が約０．２に到達した時、１本の細菌培養液にＬ−アラビノース（Ｌ−ａｒａ）を最終濃度０．１％になるように加え、さらに培養を続けた。（アラビノースはＺｏｒＯの発現を誘導する。）細菌増殖は小型振盪培養機を用い、ＯＤ_６６０の値を２０分おきに測定した（図１（Ａ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。その結果、ＺｏｒＯトキシンの発現誘導後３０分以内に菌の増殖停止が観察された。
　また、一晩培養した大腸菌（ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯプラスミドを持つＫ−１２株ＴＹ０８０７）を、ＬＢ液体培地で３０倍希釈し、３７℃で振盪培養した。培養開始２時間後に培養液を２つに分け、一方にはＬ−アラビノース（Ｌ−ａｒａ）を最終濃度０．１％になるように加えた。培養開始０，１，１．５，２，２．５，３，４時間後に培養液を一部とりコロニー形成単位（ＣＦＵ）を測定した（図１（Ｂ）：横軸は培養時間、縦軸はＣＦＵ（ｘ１０^８）の値を示す。）さらに、一晩培養した大腸菌（ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯプラスミドを持つＫ−１２株ＴＹ０８０７）をＬＢ液体培地で１００倍希釈し、３７℃で２時間振盪培養した。培養液を２つに分け、一方にはＬ−アラビノース（Ａｒａ）を最終濃度０．０２％になるように加え、さらに３０分間培養した。細菌培養液をＬＢ液体培地で１０倍希釈して、生菌の割合をＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔを用いて測定した（図１（Ｃ）：縦軸は発光量（ＲＬＵ）を表し、左のカラム（ＬＢ　ｍｅｄｉｕｍ）はＬＢ液体培地のみの値を示す。）。図１（Ｂ），（Ｃ）の結果から、ＺｏｒＯトキシンの発現が顕著な生存率の低下をもたらすことがわかった。
　そこで、ＺｏｒＯトキシンの毒性に必要なアミノ酸を同定するために、図２に示すような、ＺｏｒＯトキシン（配列番号６）のＮ末側からＮ末端のメチオニン残基を除いた４、８、１３アミノ酸残基、Ｃ末側から５、１０アミノ酸残基を欠失した変異タンパク質（それぞれ順に、配列番号７~１１）を発現するプラスミド（それぞれ順に、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ４）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ８）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＮ１３）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＣ５）、ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＣ１０））を構築し、毒性の有無を図１（Ａ）と同じ方法で検討した（図２）。Ｎ末側のアミノ酸残基を欠失したタンパク質（配列番号７~９）とＣ末側の５アミノ酸残基を欠失したタンパク質（配列番号１０）は毒性を維持しているのに対し、Ｃ末側の１０アミノ酸残基を欠失したタンパク質（配列番号１１）は毒性を示さなかった。この結果は、Ｃ末側の６番目から１０番目のアミノ酸Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号１）が毒性に必要であること示唆したので、この５アミノ酸残基を欠失したタンパク質（配列番号１２）を発現するプラスミド（ｐＢＡＤ２４−ｚｏｒＯ（ΔＡＬＬＲＬ））を構築し、毒性の有無を図１（Ａ）と同じ方法で調べたところ、予想どおり毒性は認められなかった。
２．ＡＬＬＲＬペプチドの抗菌作用
　そこで、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＡＬＬＲＬ）の５アミノ酸が抗菌ペプチドとして働くのではないかと考え、ＡＬＬＲＬペプチドを化学合成し、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌への抗菌作用を調べた。詳しくは、一晩培養した黄色ブドウ球菌をＬＢ液体培地で４００倍希釈し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．２に到達した時、ＡＬＬＲＬペプチドを最終濃度０，１０，２０，４０，８０，１６０μｇ／ｍｌになるように加え、さらに培養を続けた。小型振盪培養機を用いてＯＤ_６６０の値を２０分おきに測定した（図３（Ａ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。その結果、黄色ブドウ球菌では、ＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度１６０μｇ／ｍｌ）を添加すると速やかに増殖能が低下した。８０μｇ／ｍｌの濃度でも増殖速度のわずかな遅延が見られた。
　上記において、ＡＬＬＲＬペプチドを添加して１時間後にコロニー形成単位（ＣＦＵ）を調べた。詳しくは、上記のように、ＡＬＬＲＬペプチドを最終濃度０，１０，２０，４０，８０，１６０μｇ／ｍｌになるように加えて、さらに１時間培養した。培養液を１０倍ずつＰＢＳで希釈し、ＬＢ寒天培地上に５μｌ滴下して、３７℃で一晩培養した（図３（Ｂ）：上の数字はペプチド濃度を、右の数字は希釈率を表している。）。その結果、生菌数がペプチドなしと比較して、８０μｇ／ｍｌの濃度では約１／１０に、１６０μｇ／ｍｌの濃度では１０^−４以下に低下した。
　また、ＡＴＰ産生量を指標とした細菌の生存率測定も行った。詳しくは、一晩培養した黄色ブドウ球菌をＬＢ液体培地で１００倍希釈し、３７℃で２時間振盪培養した。次に０．２ｍｌの菌液に対して、２μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００，５０または１２．５μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに３０分間培養した。ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔを用いて、生菌の割合を測定した（図３（Ｃ）：縦軸は発光量（ＲＬＵ）を表し、ＮｏはＤＭＳＯおよびＡＬＬＲＬペプチドを加えていない細菌培養液の値を示す。）。その結果、２００μｇ／ｍｌと５０μｇ／ｍｌのＡＬＬＲＬペプチドの添加量で生存率の顕著な低下が見られた。
　以上の結果より、ＡＬＬＲＬペプチドは黄色ブドウ球菌に対して抗菌作用（殺菌作用）をもつことがわかった。また、ＬＢ液体培地は１％の塩化ナトリウムを含んでいるため、ＡＬＬＲＬペプチドによる抗菌作用は、生理的塩濃度でも失われないことが分かった。
　次に、別のグラム陽性菌である枯草菌に対しても同様の実験を行ったところ、上述の黄色ブドウ球菌の場合と同じく、１６０μｇ／ｍｌのＡＬＬＲＬペプチドでは速やかな増殖停止、８０μｇ／ｍｌでも増殖速度の遅延が見られた（図４（Ａ））。なお、この実験では、ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時に様々な濃度のＡＬＬＲＬペプチドを添加した。さらに、ＣＦＵ測定やＡＴＰ産生量による生存率測定でも、黄色ブドウ球菌と同様に、ＡＬＬＲＬペプチドの添加により生菌数の著しい低下が観察された（図４（Ｂ），（Ｃ））。なお、ＡＴＰ産生量による生存率測定では、黄色ブドウ球菌の場合は３７℃で２時間振盪培養したところを、枯草菌では同温度で２時間５０分振盪培養した以外は、同様に行った。また、ＡＬＬＲＬペプチドによる枯草菌への抗菌作用は、黄色ブドウ球菌の場合と同じく、生理的塩濃度でも失われないことが分かった。
　さらに、薬剤耐性菌の１つであるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）に対する抗菌作用も調べた。詳しくは、一晩培養したメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をＬＢ液体培地で４００倍希釈し、３７℃で振盪培養を開始した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、４ｍｌの菌液に対して、２０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに培養を続けた。小型振盪培養機を用いてＯＤ_６６０の値を２０分おきに測定した（図５（Ａ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。その結果、ＡＬＬＲＬペプチドは速やかな増殖の停止をもたらした。よって、ＭＲＳＡに対しても抗菌作用を示すことがわかった。
　以上の結果より、ＡＬＬＲＬペプチドは、生理的な塩濃度下において、グラム陽性菌に対して抗菌作用を示すことが強く示唆された。
　他方、グラム陰性菌である大腸菌（Ｋ−１２株（ＢＷ２５１１３）とＯ１５７：Ｈ７株（ＡＴＣＣ４３８８８））に対しても、黄色ブドウ球菌、枯草菌と共に、ＡＬＬＲＬペプチドの抗菌作用を検討した。詳しくは、一晩培養した黄色ブドウ球菌、枯草菌、大腸菌（Ｋ−１２株、Ｏ１５７：Ｈ７株）をＬＢ液体培地で希釈し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．２に到達した時、ＡＬＬＲＬペプチドを最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加えて、さらに培養を続けた。小型振盪培養機を用いてＯＤ_６６０の値を２０分おきに測定した（図５（Ｂ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。
３．ＡＬＬＲＬペプチドによる細菌の細胞膜損傷
　これまでに同定された抗菌ペプチドの多く（例えば、ナイシン等）は、細胞膜をターゲットにして損傷を引き起こす。そこで、ＡＬＬＲＬペプチドが黄色ブドウ球菌と枯草菌の細胞膜に損傷を引き起こすかどうか検討した。詳しくは、一晩培養した黄色ブドウ球菌と枯草菌をそれぞれＬＢ液体培地で１００倍希釈し、３７℃で振盪培養（黄色ブドウ球菌は２時間、枯草菌は２時間４０分）した。次に１ｍｌの菌液に対して、１０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに３０分間培養した。その後、細菌の細胞膜損傷を検出するための試薬Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）と全ての菌を検出するための試薬ＤＡＰＩで染色して蛍光顕微鏡で観察した（図６、７）。両細菌共に、ＤＭＳＯ処理（コントロール）ではＰＩ染色による赤い蛍光を発する細菌は検出されないのに対し（図６（Ａ），図７（Ａ））、ＡＬＬＲＬペプチドで処理した場合では赤い蛍光を発する細菌が多く検出された（図６（Ｂ），図７（Ｂ））。この結果は、ＡＬＬＲＬペプチドが細菌の細胞膜に損傷を与えることを強く示唆する。
４．ＡＬＬＲＬペプチドの細胞毒性
　ＡＬＬＲＬペプチドを抗菌薬へ応用するためには、動物細胞や植物細胞に対する細胞毒性を検討する必要がある。そこで、動物由来の培養細胞３種類（Ｖｅｒｏ、ＣＨＯ、ＢＨＫ）に対するＡＬＬＲＬペプチドの細胞毒性を調べた（図８）。詳しくは、７０~９０％コンフルエントな培養細胞を、ＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００，１００，５０，２５，１２．５，６．２５μｇ／ｍｌ）で２４時間処理し、その後、ＭＴＴアッセイにより生細胞の割合を定量した（図８（Ａ）~（Ｃ））。Ｖｅｒｏ細胞（図８（Ａ））とＣＨＯ細胞（図８（Ｃ））では、ＤＭＳＯ処理（コントロール）と比較して、生菌数の割合はほとんど変化しなかった。ＢＨＫ細胞（図８（Ｂ））では、２００μｇ／ｍｌのＡＬＬＲＬペプチドで処理した場合、生菌数の割合が著しく減少したが、コントロールであるＤＭＳＯ処理でも同程度の減少がみられることから、この減少はペプチドではなく溶媒であるＤＭＳＯが原因であると考えられる。なお、本実験ではＡＬＬＲＬペプチドの濃度と同じく、溶媒であるＤＭＳＯの量も１／２ずつ段階希釈されている。以上の結果より、ＡＬＬＲＬペプチドは動物由来の培養細胞に対して強い毒性を示さないことが確認された。
５．ＡＬＬＲＬペプチドの改変による抗菌作用
　ＡＬＬＲＬペプチドを様々に改変したペプチドを化学合成して、黄色ブドウ球菌と枯草菌に対する抗菌作用を調べた。詳しくは、一晩培養した黄色ブドウ球菌と枯草菌をＬＢ液体培地で４００倍希釈し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、各ペプチド（ＭＤＴＬＴＱＫＬＴＶＬＩＡＶＬＥＬＬＶＡＬＬＲＬＩＤＬＬＫ（配列番号６）、ＬＥＬＬＶＡＬＬＲＬ（配列番号１３）、ＬＲＬＬＡ（配列番号５）、ＶＡＬＬＲＬ（配列番号１４）、ＡＬＬＲＬＩ（配列番号２）、ＡＬＬＲ（配列番号３）ＬＬＲＬ（配列番号４）、ＡＬＬＫＬ（配列番号１５）、ＡＬＬＨＬ（配列番号１６）、ＡＬＬＲＡ（配列番号１７）、ＡＬＬＲＩ（配列番号１８））を最終濃度２００μｇ／ｍｌになるように加え、さらに培養を続けた。小型振盪培養機を用いてＯＤ_６６０の値を２０分おきに測定した。ＡＬＬＲＬＩペプチドとＡＬＬＲペプチドは、黄色ブドウ球菌に対して弱い増殖阻害作用を示した。また、枯草菌に対しては、上記のＡＬＬＲＬＩペプチドとＡＬＬＲペプチドに加えて、ＬＬＲＬペプチドとＡＬＬＲＬペプチドのアミノ酸配列を逆にしたＬＲＬＬＡペプチドも阻害作用を示した（図９：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。なお、ここで見られた阻害作用はどれもＡＬＬＲＬペプチドに比べると弱い。また、これら以外のペプチドは、両細菌に対して阻害作用を示さないことも確認された。
６．真菌に対するペプチドの効果
　真菌の１種であるカンジダ・アルビカンスに対するＡＬＬＲＬペプチドの効果も調べた。詳しくは、まず、サブロー寒天培地上で形成されたカンジダ・アルビカンスのコロニーを２つとり、０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。次に、懸濁液０．０５ｍｌを４ｍｌのサブロー液体培地に加え、小型振盪培養機を用いて３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、４０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに培養した。２０分おきにＯＤ_６６０の値を測定した（図１０（Ａ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）。その結果、ＡＬＬＲＬペプチド添加後速やかに、カンジダ・アルビカンスの増殖が阻害された。よって、ＡＬＬＲＬペプチドは、細菌だけでなく真菌に対しても、増殖阻害作用を持つことが強く示唆された。また、ＡＬＬＲＬペプチドを改変した様々なペプチドの効果についても、図１０（Ａ）の実験と同様に検討したところ（図１０（Ｂ）：横軸は培養時間、縦軸はＯＤ_６６０の値を示す。）、ＡＬＬＲＬＩペプチド（配列番号２）とＡＬＬＲペプチド（配列番号３）が、ＡＬＬＲＬペプチドと同等とまではいえないが、カンジダ・アルビカンスに対して増殖阻害作用を持つことが確認された。
６．ＡＬＬＲＬペプチドによるカンジダ・アルビカンスの細胞膜損傷
　ＡＬＬＲＬペプチドがカンジダ・アルビカンスの細胞膜に損傷を引き起こすかどうか検討した。詳しくは、まず、サブロー寒天培地上で形成されたカンジダ・アルビカンスのコロニーを２つとり、０．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した。次に、懸濁液０．０５ｍｌを４ｍｌのサブロー液体培地に加え、小型振盪培養機を用いて３７℃で振盪培養した。ＯＤ_６６０が約０．１に到達した時、４０μｌのＤＭＳＯまたはＡＬＬＲＬペプチド（最終濃度２００μｇ／ｍｌ）を加えて、さらに４０分間培養した。その後、細胞膜損傷を検出するための試薬Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）と全ての菌を検出するための試薬ＤＡＰＩで染色して蛍光顕微鏡で観察した（図１１）。ＤＭＳＯ処理（コントロール）ではＰＩ染色による赤い蛍光を発するカンジダ・アルビカンスは検出されないのに対し（図１１左上のパネル）、ＡＬＬＲＬペプチドで処理した場合では赤い蛍光を発する細菌が多く検出された（図１１右上のパネル）。この結果は、ＡＬＬＲＬペプチドが、カンジダ・アルビカンスの細胞膜に損傷を与えることを強く示唆する。

　本発明によれば、塩濃度に左右されない強い抗菌又は抗真菌活性を有し、かつ真核細胞に対して極めて毒性が低い低分子量のペプチド、及びそれを用いた抗菌又は抗真菌薬を提供することができる。
　本発明のペプチド及び抗菌又は抗真菌薬は、例えば、細菌感染症や真菌感染症の治療又は予防に用いることができる点で、極めて有用なものである。

　配列番号１~５：ペプチド
　配列番号７~１８：ペプチド

Claims

以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩。
（ａ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するペプチド。
（ｃ）配列番号１~５に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、抗菌又は抗真菌活性を有するペプチド。
請求項１記載のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含む、抗菌又は抗真菌薬。
グラム陽性菌に対して抗菌作用を有するか、及び／又は真菌に対して抗真菌作用を有する、請求項２記載の抗菌又は抗真菌薬。
請求項１記載のペプチド、その誘導体若しくはこれらの塩を含む、医薬組成物。
細菌感染症及び／又は真菌感染症の治療又は予防に用いられる、請求項４記載の医薬組成物。
前記細菌がグラム陽性菌である、請求項５記載の医薬組成物。
対象となる被験動物の細菌感染症及び／又は真菌感染症を治療又は予防する方法であって、請求項４~６のいずれか１項に記載の医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記細菌がグラム陽性菌である、請求項７記載の方法。