JP2004500366A - C型肝炎ウイルス(hcv)について特異的な抗体を誘発すること - Google Patents
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Abstract
Description
(発明の技術分野)
本発明は、C型肝炎ウイルス(HCV)に対する抗体および結合中和(neutralizing of binding)抗体の誘発に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物において抗E2抗体および抗E2結合中和抗体を誘発するための、HCV E1E2およびHCV E2のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用に関する。
【0002】
(背景)
C型肝炎ウイルス(HCV)は、重大な健康問題であり、世界人口の約1%がこのウイルスに感染している。急性感染した個体の75%以上は、最終的に、肝硬変、肝不全および肝細胞癌を生じ得る、慢性キャリア状態に進行する。非常にわずかな割合の慢性的に感染した患者は、HCVを自然にクリアし、そして慢性肝炎を解消する。例えば、Alterら(1992)N.Engl.J.Med.327;1899−1905;ResnickおよびKoff(1993)Arch.Intem.Med.153:1672−1677;Seeff(1995)Gastrointest.Dis.6:20−27;Tongら(1995)N.Engl.J.Med.332:1463−1466を参照のこと。
【0003】
HCVによる感染の過程中においてHCV特異的中和抗体が存在する証拠が、存在する。Ishiiら(1998)Hepatology 28:1117−1120を参照のこと。さらに、この慢性HCV感染の過程における抗E2結合中和(NOB)抗体の高い血清力価の出現および維持が、HCV感染からの防御、HCVのクリアランスおよびHCV肝臓疾患の臨床的解決と相関付けられている。Ishiiら、(1998);Rosaら、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1759。しかし、今日まで、アミノ酸715で短縮化された精製HCV E2ポリペプチドのみが、抗E2 NOBを誘導することが動物研究において示されている。Fournillierら、(1999) J.Virology 73:7497−75504。従って、抗E2 NOB抗体力価を誘発する効果的な方法に対する必要性が依然存在する。
【0004】
(要旨)
E2抗原およびE1E2抗原に対する免疫応答(詳細には、体液性免疫応答)を誘発する(例えば、結合中和(NOB)抗体を誘発する)方法を、本明細書中に記載する。この方法は、これらの抗原の1以上をコードするポリヌクレオチドを投与することによる。さらに、炭水化物部分は、ヒト細胞へのE2結合に必要ではなく、そしてモノマーの非凝集画分のみがCD81に結合し得る。好ましい実施形態において、タンパク質および/またはDNAでの免疫は、細胞内画分から精製した、哺乳動物細胞によって発現されたモノマーE2タンパク質を使用して達成される。従って、抗E2抗体および細胞へのE2の結合を中和する抗E2抗体を誘発するための方法および試薬を提供することが、本発明の目的である。
【0005】
従って、1つの局面において、本発明は、C型肝炎(HCV)E2および/またはE1E2抗原(例えば、これらの抗原をコードする、1以上の精製ポリヌクレオチド)に対する免疫応答を誘発する方法を包含し、この方法は、E2抗原および/またはE1E2抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを、被験体に投与する工程(a)を包含する。これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、非分泌性であり、そしてさらには、全長のE2をコードする、HCV E2および/またはE1E2ポリペプチドをコードする。好ましい実施形態において、この免疫応答は、体液性の免疫応答(例えば、少なくとも1つの結合中和(NOB)抗体を生成する応答)である。特定の実施形態において、異なるE2またはE1E2抗原をコードする1より多いポリヌクレオチドを投与する。種々の実施形態において、これらのポリヌクレオチドによってコードされる全長(すなわち、非短縮型)E2抗原は、HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜746;HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜749;HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜809;またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、これらのポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、E1およびE2を含む(例えば、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜746、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜809、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜749をコードする構築物)。従って、これらのポリヌクレオチドは、1以上の全長E2および1以上のE1E2抗原をコードし得る。さらなる実施形態において、これらの抗原は、細胞内産生(例えば、分泌されない)される、短縮型E2(例えば、HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜715;HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜661;HCVポリタンパク質のアミノ酸340〜674)である。これらのポリヌクレオチドは、例えば、DNA、プラスミドDNAまたは他の発現ベクターであり得る。本明細書中に記載の任意の方法において、被験体は、HCVの1以上の株に感染しているか、または感染してない。さらに、種々の実施形態において、これらの方法は、その哺乳動物にアジュバント(例えば、心臓毒(cardiotoxin))を投与する工程を包含する。
【0006】
本明細書中に記載の任意の方法において、被験体は、哺乳動物(例えば、ウマ、ウサギ、モルモット、サル、ヒヒ、チンパンジーおよびヒト)であり得る。HCVをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な送達機構(例えば、微粒子銃送達技術、PLGマイクロカプセルなど)によって送達され得る。これらのポリヌクレオチドは、筋内、皮下、腹腔内、粘膜、鼻内、経口および経皮などで送達され得る。
【0007】
他の実施形態において、これらの方法は、結合中和抗体を検出する工程をさらに包含する。さらに、特定の実施形態において、この結合中和抗体は、その同族のレセプターへのE2ポリペプチドの結合を、この結合中和抗体の非存在下でのその同族のレセプターに対するE2ポリペプチドの結合よりも高い量で阻害する。この結合中和抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:少なくとも1:70の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体;少なくとも1:140の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体;少なくとも1:300の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体;少なくとも1:600の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体;少なくとも1:800の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体;および少なくとも1:300の希釈度で、E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する結合中和抗体。
【0008】
従って、本発明は、抗E2抗体および抗E2 NOB抗体を誘発するための方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬は、強力な抗E2抗体応答および抗E2 NOB抗体応答の生成に関連するHCV E2ポリペプチドまたはHCV E1E2ポリペプチドのエピトープの同定、およびHCVに対する動物(ヒトを含む)の免疫に、特に有利である。
【0009】
これらおよび他の実施形態は、本明細書中の教示を鑑みれば当業者に容易に理解される。
【0010】
本発明の実施は、他に記載がない限り、化学、生化学、組換えDNA、および免疫学の従来技法を用い、このような技術は以下の文献で十分説明されている(例えば、Sambrook Molecular Cloning:A Laboratory Manual 第2版;Methods in Enzymology(S.ColowickおよびN.Kaplan編、Academic Press, Inc.);DNA Cloning,第I巻および第II巻(D.N Glover編);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編);Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編);Animal Cell Culture(R.I.Freshney編);B.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning。
【0011】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「a」、「an」および「the」は、その内容が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「1つの抗原(an antigen)」は、2つ以上の抗原などの混合物を含む。
【0012】
(I.定義)
本発明の記載において、以下の用語は、以下に示されるように用いられ、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【0013】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最小の長さの産物に規定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾(例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など)を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望される活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する修飾(例えば、欠失、付加、および置換(一般に性質は保存される))を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的変異誘発を介して意図され得るか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはPCR増幅に起因するエラーを介するように、偶然であり得る。
【0014】
HCVポリペプチドは、上記のようなポリペプチドであり、HCVポリタンパク質から誘導される。ポリペプチドは、HCVから物理的に誘導される必要はなく、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、様々なHCV株(例えば、HCVの株1、2、3または4)のいずれかから誘導され得る。多数の保存された領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、一般的に、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高い程度の配列相同性(例えば、2つの配列が整列された場合、本明細書中に記載される方法を用いて決定されるような、分子の規定された長さにわたる参照配列に対して、少なくとも約30%−40%の配列同一性、好ましくは、少なくとも約40%−60%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約60%−70%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約70%−75%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約80%−82%の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約85%−90%の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約92%の配列同一性、なおさら好ましくは95%の配列同一性、および最も好ましくは98%の配列同一性、のアミノ酸配列相同性)を有する。従って、例えば、用語[E2」ポリペプチドとは、様々なHCV株のいずれか由来のネイティブのE2、ならびに以下でさらに定義されるような、E2のアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。
【0015】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、以下で定義されるような所望の活性(例えば、細胞媒介免疫応答および/または体液性免疫を刺激する能力)を保持する参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはそのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブの分子に関して、1つ以上のアミノ酸付加、置換(一般的に、特徴は保存的である)、および/または欠失を有するネイティブのポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、国際公報WO91/04282に記載されるような、1つ以上のペプチド模倣物(「ペプトイド」)を有するペプチドをいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、ネイティブの分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下でさらに記載される。
【0016】
特に好ましいアナログは、本質的に保存的な置換(すなわち、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内に生じる置換)を含む。詳細には、アミノ酸は一般に、4つのファミリーに分割される:(1)酸性−アスパラギン酸、およびグルタミン酸;(2)塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン;(3)非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの孤立置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との孤立置換、トレオニンのセリンとの孤立置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換が、生物学的活性に主要な効果を有さない。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約5〜10までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または約15〜25までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換でさえ、または5〜25の間の任意の整数を含み得る。当業者は、当該分野で周知のHopp/WoodsおよびKyte−Doolittleプロットを参照することにより、変化に耐え得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【0017】
「フラグメント」によって、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなる、ポリペプチドが意図される。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのC末端欠失および/またはN末端欠失を含み得る。特定のHCVタンパク質の「免疫原性フラグメント」または「抗原性フラグメント」は、全長分子の少なくとも約5〜10個連続するアミノ酸残基、好ましくは、全長分子の少なくとも約15〜25個連続するアミノ酸残基、そして最も好ましくは全長分子の少なくとも約20〜50個以上連続するアミノ酸残基を一般に包含し、このアミノ酸残基は、本明細書中に記載のアッセイにより測定した場合に、そのフラグメントが免疫原性活性または抗原性活性を保持する場合に、エピトープ(または5アミノ酸と全長配列との間の任意の整数)を規定する。種々のHCVエピトープの記載については、例えば、Chienら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:10011〜10015;Chienら、J.Gastroent.Hepatol.(1993)8:S33〜39;Chienら、国際公開番号WO93/00365;Chien,D.Y.、国際公開番号WO94/01778;共有に係る特許査定された米国特許出願第08/403,590号および同第08/444,818号を参照のこと。
【0018】
用語「エピトープ」は本明細書中で使用される場合、少なくとも約3〜5アミノ酸、好ましくは約5〜10または15アミノ酸、そして約1,000アミノ酸以下(または3と1000との間の任意の整数)の配列をいい、この配列は、単独でかまたはより大きな配列の一部として、そのような配列に応答して生じる抗体に結合する配列を規定する。このフラグメントの長さに対する臨界的上限は存在せず、この長さは、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、またはHCVポリタンパク質由来の2つ以上のエピトープを含む融合タンパク質さえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、それが由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、不断の変化状態にあり、そして単離株間で比較的高い程度の変動性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブ配列と同一の配列、ならびにそのネイティブ配列に対する改変(例えば、欠失、付加および置換(一般に本質的に保存的である))を包含する。
【0019】
エピトープを含む所定のポリペプチド領域は、当該分野で周知の、かなり多数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols、Methods in Molecular Biology、第66巻(Glenn E.Morris編、1996)、Humana Press、Totowa、New Jersey。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上に、タンパク質分子の一部に対応する多数のペプチドを同時合成すること、およびそのペプチドを依然としてその支持体上に付着させつつ、そのペプチドを抗体を反応させることによって、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、かつ、例えば、米国特許第4,708,871号;Geysenら(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:3998〜4002;Geysenら(1986)Molec.Immunol.23:709〜715を参照のこと。同様に、構造(conformational)エピトープは、アミノ酸の空間立体配座を、例えば、X線結晶学および2次元核磁気共鳴によって決定することによって、決定され得る。例えば、前出の、Epitope Mapping Protocolsを参照のこと。タンパク質の抗原性領域もまた、標準的抗原性プロットおよびヒドロパシープロット(例えば、Oxford Molecular Groupから入手可能なOmigaバージョン1.0ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロット)を使用して同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにHopp/Woods法(Hoppら、Proc.Natl.Acad.Sci USA(1981)78:3824〜3828を使用し、そしてヒドロパシープロットのためにKyte−Doolittle技術(Kyteら、J.Mol.Biol.(1982)157:105〜132)を使用する。
【0020】
本明細書中に使用される場合、用語「構造エピトープ」は、全長タンパク質またはそのアナログもしくはムテインの一部であって、天然の全長タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列にネイティブな(native to)構造的特徴を有するものをいう。ネイティブな構造的特徴とは、グリコシル化および3次元構造を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、構造エピトープは、組換え産生され、そしてその所望の構造的特徴を保存する条件下で(例えば、そのエピトープの変性を伴わずに)その構造エピトープが抽出可能である細胞中で発現される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。HCVポリタンパク質からの組換え構造エピトープの発現および単離が、例えば、国際公開番号WO96/04301、WO94/01778、WO95/33053、WO92/08734に記載される。
【0021】
HCV抗原(ポリペプチドと、インビボで発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの両方を包含する)または組成物に対する「免疫原性応答」は、目的の組成物中に存在する分子対する体液性免疫応答および/または細胞性免疫応答が被験体中で発生することである。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方「細胞性免疫応答」は、Tリンパ球および/または他の白血球により媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の1つの重要な局面は、細胞傷害性(cytolytic)T細胞(「CTL」)による抗原特異的応答を包含する。CTLは、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)によりコードされるタンパク質とともに提示され、そして細胞表面上に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。CTLは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を、誘導および促進することを補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーT細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーT細胞は、ペプチド抗原をMHC分子とともにその表面上に提示する細胞に対する、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激しそしてその活性を集中させるのを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、活性化T細胞および/または他の白血球により産生される(CD4+T細胞およびCD8+T細胞に由来するものを含む)サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子の産生をいう。
【0022】
細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、細胞表面上でのMHC分子を伴う抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように作用し得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面に抗原を提示する細胞に対するかまたはその細胞近辺に対する。さらに、抗原特異的Tリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可能にするように生成され得る。
【0023】
用語「抗原」は、免疫応答を惹起し得る組成物をいい、そして例えば、ポリペプチドかまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多数のアッセイ(例えば、リンパ増殖(リンパ球活性化)アッセイ、CTL細胞傷害性細胞アッセイ)によってか、感作された被験体における抗原に特異的なTリンパ球についてアッセイすることによって、決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ericksonら、J.Immunol.(1993)151:4189〜4199;Doeら、Eur.J.Immunol.(1994)24:2369〜2376;および下記の実施例を参照のこと。「抗原決定基」は、特定の抗体分子または特定の細胞表面レセプターが結合する、抗原またはハプテン上の部位をいう。
【0024】
従って、免疫学的応答は、本明細書中で使用される場合、CTLの生成および/またはヘルパーT細胞の生成もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答、例えば、結合中和(neutralization of binding)(NOB)抗体を、惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの1つ以上を包含し得る:B細胞による抗体の産生;および/または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原を特異的に指向する、サプレッサーT細胞および/もしくはγδT細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして/または抗体−補体依存性細胞傷害もしくは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介して、免疫された宿主に対する症状の防御もしくは軽減を提供するように、作用し得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して、決定され得る。
【0025】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下におかれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写(DNAの場合)および翻訳(mRNAの場合)される核酸分子である。このコード配列の境界は、5’(アミノ)末端における開始コドンおよび3’(カルボキシ)末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終止配列は、コード配列に対して3’に位置し得る。
【0026】
「核酸」分子または「ポリオヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖の両方の配列を含み得るが、ウイルス、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、ウイルス性DNA(例えば、DNAウイルスおよびレトロウイルス)または原核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および特に合成DNA配列に限定されない。この用語はまた、DNAおよびRNAの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列を含む。
【0027】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された成分がそれらの所望の機能を行うように構成されたエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、プロモーター転写因子などが存在する場合、このコード配列の発現に影響し得る。プロモーターは、それらの発現を指向するように機能する限り、このコード配列と接近している必要はない。従って、例えば、介在非翻訳、転写配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、転写イントロンが存在し得、そしてプロモーター配列はさらに、コード配列に「作動可能に連結された」と考えられ得る。
【0028】
本明細書中で核酸分子を記載するために使用する場合、「組換え体」は、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成または合成由来(これはこの起源または操作によって、天然で関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合しない)のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合、用語「組換え体」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローン化され、次いで、以下にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を産生する異種遺伝子を発現する。
【0029】
「制御エレメント」とは、連結されたコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上方制御ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域(5’−UTRおよび3’−UTRを含む)、および適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーを含み、これは集合的に宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を提供する。
【0030】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてRNAポリメラーゼに結合し得、そしてそれらに作動可能に連結されたコード配列の下流(3’方向)の転写を開始し得る。本発明の目的のため、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで、目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位ならびにRNAポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)が存在する。真核生物のプロモーターは、常にではないが、しばしば、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含む。
【0031】
制御配列は、RNAポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をmRNAに転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指向」し、これは次いで、このコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【0032】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント(例えば、目的の配列または遺伝子に(その転写を指向するよう)作動可能に連結されたプロモーター)を含み、しばしば同様にポリアデニル配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中で記載される発現カセットは、プラスミド構築物中に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、1つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一本鎖DNAとして存在させ得るシグナル(例えば、M13の複製起点)、少なくとも1つの多クローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点(例えば、SV40またはアデノウイルスの複製起点)を含み得る。
【0033】
本明細書中で使用する場合、「形質転換」とは、挿入に使用される方法:例えば、直接取込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換とは関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。トランスフェクションの特定の方法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター(例えば、エピトープ)として保持され得るか、あるいは宿主ゲノムに統合され得る。
【0034】
「宿主細胞」は、形質転換された細胞であるか、または外因性DNA配列によって形質転換され得る。
【0035】
「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、生物全体から分離され個別にされていることを意味する。ここでは、この分子は、天然に見出されるかまたは同じタイプの他の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、以下の全体または一部が全くない、核酸分子である:そのポリヌクレオチドに天然に通常関連する配列;または配列が天然に存在する場合は、それに関連する異種配列を有する配列;または染色体から分離した分子。
【0036】
本明細書中で使用する場合、用語「精製された」とは、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは、少なくとも85重量%、さらにより好ましくは、少なくとも95重量%、最も好ましくは、少なくとも98重量%の同じ型の生物学的高分子が存在することを意味する。
【0037】
「相同性」とは、2つのポリヌクレオチドの間、または2つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントをいう。2つのDNA、または2つのポリペプチド配列は、この配列がこの分子の規定された長さにわたって、少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約80%〜85%、好ましくは少なくとも約90%、そして最も好ましくは、少なくとも約95%〜98%以上の配列同一性を示す場合、互いに対して「実質的に相同」である。本明細書において用いる場合、実質的に相同とは、また、特定のDNAまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【0038】
一般に、「同一性」とは、それぞれ、2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、ヌクレオチド間またはアミノ酸間の正確な一致をいう。同一性パーセントは、配列の整列、整列された2つの配列間の一致する正確な数の計数、より短い配列の長さによる徐算、そしてこの結果に100を掛算することによる、2つの分子の間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。容易に利用可能なコンピュータプログラム(例えば、ALIGN,Dayhoff,M.O.、Atlas of Protein Sequence and Structure M.O.Dayhoff編、5、補遺3:353−358,National biomedical Research Foundation,Washington,DC)は、分析における援助のために使用され得、このプログラムは、ペプチド分析のためのSmithおよびWatermanのAdvances in Appl.Math.2:482−489,1981の局所相同性アルゴリズムに適応する。ヌクレオチドの配列同一性を決定するためのプログラムは、Wisconsin配列分析パッケージ、バージョン8(Genetics Computer Group,Madison,WIから入手可能)、例えば、BESTFIT、FASTAおよびGAPプログラム(これらはまた、SmithおよびWatermanのアルゴリズムに依存する)において利用可能である。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、そして上記のWisconsin配列分析パッケージに記載されるデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、デフォルトスコアリングテーブルおよび6ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いるSmithおよびWatermanの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【0039】
本発明の状況において、同一性パーセントを確立する別の方法は、John F.CollinsおよびShane S.Sturrokによって開発され、そしてIntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)によって配給される、著作権University of EdinburghのMPSRCHパッケージプログラムを使用することである。このパッケージのスートから、Smith Watermanアルゴリズムが利用され得、ここでデフォルトパラメータが、スコアリングテーブルのために使用される(例えば、12のgap open penalty、1のgap extension penalty、および6のgap)。このデータから作製された「一致」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または相同性のパーセントを算出する他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータで使用されるBLASTである。例えば、BLASTNおよびBLASTPは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用され得る:genetic code=standard;filter=none;strand=both;cutoff=60;expect=10;Matrix=BLOSUM62;Descriptions=50配列;sort by=HIGH SCORE;Databases=non−redundant,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る:http://www.ncbi.nlm.gov/cgi−bin/BLAST。
【0040】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて単鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なDNA配列は、例えば、特定の系のために規定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業者の範囲内である。例えば、Sambrookら,前出;DNA Cloning,前出;Nucleic Acid Hybridization,前出を参照のこと。
【0041】
「核酸免疫化」とは、抗原のインビボ発現のために、1つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。核酸分子は、例えば、注入、吸引、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエントの被験体に直接導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り除かれた細胞に導入され得る。後者の場合において、形質転換された細胞は、免疫応答がこの核酸分子によってコードされる抗原に対してマウントされ得る被験体に再導入される。
【0042】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、以下のいずれかをいう:(i)伝統的なワクチンのように、感染または再感染の予防、(ii)症状の低減または排除、および(iii)問題の病原の実質的または完全な排除。処置は、予防的に(感染の前)または治療的に(感染後)になされ得る。
【0043】
用語「微粒子」は、本明細書中で使用される場合、約100nm〜約150nmの直径、より好ましくは約200nm〜約30μmの直径、そして最も好ましくは、約500nm〜約10μmの直径の粒子をいう。好ましくは、微粒子は、針およびキャピラリーを閉塞することなく、非経口投与を可能にする直径である。微粒子サイズは、光子相関(photon correlation)分光計、レーザー回折法および/または走査電子顕微鏡のような、当該分野で周知の技術によって容易に決定される。
【0044】
「脊椎動物被験体」によって、心臓型亜門(subphylum cordata)の任意のメンバーが意味され、以下が挙げられるがこれらに限定されない:ヒトおよび他の霊長類(チンパンジーならびに他の無尾猿(ape)およびサル種のような非ヒト霊長類を含む);ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜;イヌおよびネコのような家畜;マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物;ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽のトリ、アヒル、ガチョウのような家禽、野生のトリおよび狩猟鳥を含むトリなど。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体および新生仔の両方の個体を網羅するように意図される。本明細書中に記載される本発明は、上記の脊椎動物種のいずれかにおける使用のために意図される。なぜなら、これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に作用するためである。
【0045】
(概観)
HCV抗エンベロープ−2糖タンパク質(E2)抗体力価および結合中和(NOB)抗体力価が、HCV E2ポリペプチド(E2ポリペプチドの全長形態および短縮形態を含む)、およびHCV E1E2ポリペプチドによって、そしてE2ポリペプチドおよびE1E2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって誘発され得ることが、本発明の発見である。さらに、適切なアジュバントをともなう、HCV E1E2ポリペプチドまたはHCV E2ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ヘルパーT細胞(CD4+)応答および傷害性T細胞リンパ球(CD8+)応答のような細胞性免疫応答を誘発する。
【0046】
E1E2およびE2のポリヌクレオチドおよびポリペプチドによるHCV特異的抗体の惹起は、特に、強力な抗E2抗体力価および強力な抗E2 NOB抗体力価の惹起と関連したHCV E2ポリペプチドエピトープおよびHCV E1E2ポリペプチドエピトープを同定するために、HCVワクチンの開発のためのインビトロモデル系とインビボモデル系との両方を提供する。E1E2およびE2のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、治療目的または予防目的のいずれかのために、哺乳動物におけるHCVに対する免疫応答(特に、抗E2抗体応答および抗E2 NOB抗体応答)を生成するために使用され得る。
【0047】
(E1E2およびE2ポリペプチド)
C型肝炎ウイルスのゲノムは、典型的に、約9,600ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、このオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質に転写される。HCVポリタンパク質は、少なくとも10個の異なる生成物を、NH2−コア−E1−E2−p7−NS2−NS3−NS4a−NS4b−NS5a−NS5b−COOHの順序で形成するように切断される。HCV E1ポリペプチドは、糖タンパク質であり、アミノ酸およそ192からアミノ酸383(HCV−1に関して番号付けした)まで伸長する。Chooら、(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2451〜2455を参照のこと。HCV E2ポリペプチドは、糖ペプチドであり、そしてアミノ酸およそ384からアミノ酸746(HCV−1に関して番号付けした)まで伸長する。Chooらを参照のこと。従って、本明細書中で使用する場合、用語「全長E2」または「非短縮型E2」とは、HCVポリタンパク質の少なくともアミノ酸384からアミノ酸746まで(HCV−1に関して番号付けした)を含むポリペプチド(およびそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)をいう。この開示から明らかなように、全長E2ポリペプチドは、アミノ酸384および746の上流および/または下流のさらなるアミノ酸(例えば、アミノ酸747〜749または747〜809)を含み得る。非限定的な例の全長E2ポリペプチドは、アミノ酸384〜746;384〜749および384〜809(ならびにそれらのポリペプチドをコードする構築物)を含む。
【0048】
典型的には、C末端ドメインにおいて欠失を有するE2ポリペプチドは、細胞から分泌され、一方、全長E2ポリペプチドは、細胞内に保持される。Fornsら(1999)Vaccine 17:1992〜2002;Spaeteら、Virology(1992)188:819〜830;Ralstonら、J.Virol.(1993)67:6753〜6761。E1およびE2タンパク質は、通常、これらの発現系において膜結合型であり、研究者は以前に、さらなる用途のためにタンパク質の精製を容易にする分泌形態を生成することが望ましいと考えた。例えば、アミノ酸661において短縮型であり、そして哺乳動物細胞から分泌されるHCV E2分子が記載されている。Spaeteら、Virology(1992)188:819〜830。短縮型の分泌HCV E1およびE2分子の生成はまた、国際公開番号WO 96/04301(1996年2月15日公開)および米国特許第6,121,020号に開示される。Inudohら、Vaccine(1996)14:1590〜1596は、C末端疎水性ドメインを欠くHCV E2分子の生成を記載する。このタンパク質は、培養培地中に分泌され、そして細胞内で産生された対応物よりも抗原性であることが見出された。
【0049】
結合中和(NOB)抗体を誘発し得るE2ポリペプチド(およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド)、特に非分泌E2およびE1E2ポリペプチドの使用が、本明細書中に記載される。本発明のE2ポリペプチドは、全長E2ポリペプチド、E2ポリペプチドのフラグメント、またはE2ポリペプチドの短縮型セグメントのいずれかであり得る。例えば、E2ポリペプチドのフラグメントは、E2ポリペプチドの6、10、25、50、75、100、150、200、250、300または350のアミノ酸を含み得る。短縮型E2ポリペプチドは、HCVポリタンパク質のアミノ酸550、575、600、625、650、661、675、700、715、725または735または746において、切断され得る。本発明の目的のために、通常は宿主細胞から分泌される短縮型E2およびE1E2ポリペプチドは、好ましくは、C末端におけるKDEL配列を使用して、宿主細胞の小胞体に固定される。必要に応じて、E2ポリペプチドは、さらなるアミノ酸(例えば、HCVポリタンパク質のアミノ酸747〜749,またはHCVポリタンパク質のアミノ酸747〜809)を含み得る。好ましくは、E2ポリペプチドは、HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜661、384〜746、384〜749、384〜715、または384〜809を含む。
【0050】
本発明のE2ポリペプチドは、E1E2ポリペプチドを形成するために、短縮型E1ポリペプチド、E1ポリペプチドのフラグメント、または全長E1ポリペプチドと合わせられるか、またはこれらを用いて合成され得る。例えば、E1ポリペプチドのフラグメントは、E1ポリペプチドの6、10、25、50、75、100、125、150または175のアミノ酸を含み得る。好ましくは、E1E2ポリペプチドは、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜746、192〜749、340〜674、または192〜809(HCV−1に関する番号付け)を含む。E1およびE2ポリペプチドは、同じかまたは異なるHCV株由来であり得る。E2およびE1E2ポリペプチドは、米国特許第6,121,020号に記載されるような構築物から組み替え的に産生され得る。
【0051】
E1E2およびE2ポリペプチドは、抗E2抗体または抗E2 NOB抗体により認識される少なくとも1つのエピトープを含む。E2内のエピトープは、いくつかの方法によって同定され得る。例えば、E2ポリペプチドは、E2のモノクローナル抗体を使用する免疫親和性精製のような方法によって単離され得る。次いで、単離されたポリペプチド配列はスクリーニングされ得る。ポリペプチド配列全体を一緒に架橋する一連の短ペプチドは、蛋白質分解的切断により調製され得る。例えば、100マーのポリペプチドフラグメントを用いて開始することによって、各フラグメントは、抗E2 NOB抗体アッセイまたは抗E2酵素結合免疫ソルベントアッセイ(ELISA)で認識されるエピトープの存在について試験され得る。次第に小さくなる重複したフラグメントは、次いで、同定された100マーから試験されて、目的のエピトープをマッピングし得る。NOB抗体アッセイは、実施例1およびRosaら(1996)に記載される。ELISAアッセイは、実施例3に記載される。
【0052】
HCVの様々な株および単離体が生じ、そしてこれらの株および単離体のいずれかのE1E2またはE2ポリペプチドは、本発明において使用され得る。HCV E1およびE2遺伝子およびポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野において公知である。例えば、単離体のHCV J1.1は、Kuboら(1989)、Japan.Nucl.Acids Res.17:10367〜10372;Takeuchiら(1990)Gene 91:287〜291;Takeuchiら(1990)J.Gen.Virol.71:3027〜2033;およびTakeuchiら(1990)Nucl.Acids Res.18:4626に記載される。2つの独立した単離体である、HCV−JおよびBKの完全コード配列は、それぞれ、Katoら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:9524〜9528およびTakamizawaら(1991)J.Virol.65:1105〜1113により記載される。
【0053】
HCV−1単離体を記載する刊行物としては、Chooら(1990)Brit.Med.Bull.46:423−441;Chooら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2451−2455およびHan ら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1711−1715が挙げられる。HCV単離体HC−J1およびHC−J4は、Okamotoら(1991)Japan J.Exp.Med 60.167−177に記載されている。HCV単離体(HCT18〜、HCT23,Th、HCT27、EC1およびEC10)は、Weinerら(1991)Virol.180:842−848に記載される。HCV単離体(Pt−1、HCV−K10およびHCV−K2)は、Enomotoら(1990)Biochem.Biophys.Res.Commun.170:1021〜1025に記載される。HCV単離体A,C,D & Eは、Tsukiyama−Koharaら(1991)Virus Genes 5:243−254に記載されている。
【0054】
好ましくは、E1E2またはE2ポリペプチドは、例えば、インビトロまたはインビボにおいて、組換え的に産生される。E1E2またはE2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知(以下で記載される)の技術を使用して、適切な発現系において発現され得る発現ベクターに導入され得る。様々な細菌、酵母、植物、哺乳動物および昆虫発現系が、当該分野で利用され得、そしてこのような任意の発現系が使用され得る。必要に応じて、E1E2またはE2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞を含まない翻訳系において翻訳され得る。
【0055】
所望ならば、E1E2またはE2ポリペプチドは、融合タンパク質として産生され得、これはまた、他のアミノ酸配列(例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列)、ならびにタンパク質精製において有用なリガンド(例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質A)を含み得る。1つ以上のE1E2またはE2ポリペプチドが、融合タンパク質中に存在し得る。所望ならば、異なるHCV株または単離体由来のE1E2およびE2ポリペプチドの様々な組み合わせが、融合タンパク質に含まれ得る。
【0056】
(E1E2およびE2ポリヌクレオチド)
E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、HCVゲノム全体より小さいゲノムを含み、そしてRNA、または一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAであり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、他の成分(例えば、タンパク質および脂質)を含まないように精製される。E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、上記のE1E2およびE2ポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、他のヌクレオチド配列(例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、異種シグナル配列、TMR終止転移配列、膜貫通ドメイン、またはタンパク質精製において有用なリガンド(例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質A))を含み得る。
【0057】
E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、例えば、HCVに感染した個体の血漿、血清または肝臓に存在する核酸配列由来のゲノムライブラリーから単離され得る。E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、例えば、自動合成機を使用して、研究室で合成され得る。PCRのような増幅方法は、HCVゲノムRNAまたはE1E2またはE2ポリペプチドをコードするcDNAのいずれかからポリヌクレオチドを増幅するために使用され得る。
【0058】
E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、天然に存在するE1E2またはE2ポリペプチドのコード配列を含み得るか、または天然に存在しない変化されたE1E2またはE2配列をコードし得る。所望ならば、E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、発現ベクターにクローン化され、そして例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞に形質転換され、その結果、本発明のポリペプチドは、細胞培地で発現され、そして単離され得る。E1E2およびE2ポリヌクレオチドは、プラスミド(例えば、pBR322、pUCまたはColE1)、またはアデノウイルスベクター(例えば、アデノウイルス2型ベクターまたは5型ベクター)内に含まれ得る。必要に応じて、他のベクターが使用され得、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない:シンドビスウイルス、シミアンウイルス40、アルファウイルスベクター、ならびにサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター(例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス)。細菌ベクター(例えば、Salmonella ssp.、Yersinia enterocolitica、Shigella spp.、Vibrio cholerae、Mycobacterium株BCG、およびListeria monocytogenesが使用され得る。ミニ染色体(例えば、MCおよびMC1)、バクテリオファージ、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド(ファージλcos部位が挿入されたプラスミド)、およびレプリコン(細胞におけるこれら固有の制御下で増幅し得る遺伝エレメント)が使用され得る。
【0059】
ポリペプチドは、HCVゲノム全体より小さいゲノムを含み、そしてRNA、または一本鎖もしくは二本鎖DNAであり得る。そしてRNA、または一本鎖DNAもしくは二本鎖DNAであり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、他の成分(例えば、タンパク質および脂質)を含まないように単離される。本発明のポリヌクレオチドはまた、他のヌクレオチド配列(例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、またはタンパク質精製において有用なリガンド(例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ、およびブドウ球菌タンパク質A))を含み得る。
【0060】
本発明の発現構築物は、核酸免疫化のために使用され、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用してHCV特異的T細胞を活性化し得る。遺伝子送達のための方法が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第5,399,346号、同5,580,859号、同5,589,466号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは被験体由来の細胞およびこの被験体に再移植された細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、この構築物は、例えば、プラスミド(例えば、pBR322、pUCまたはColE1)内に含まれるプラスミドDNAとして送達され得る。
【0061】
さらに、発現構築物は、細胞に送達される前に、リポソームにパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に、核酸に安定に結合するか、または核酸を捕捉して保持し得るリポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する濃縮DNAの割合は、変動し得るが、一般的に、脂質の約1:1(mgDNA:μmol脂質)であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためにキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、HugおよびSleight、Biochim.Biophys.Acta.(1991)1097:1−17;Straubingerら、Methods of Enzymology(1983)第101巻、512〜527ページを参照のこと。
【0062】
本発明と共に使用するためリポソーム調製物としては、カチオン性(正に荷電した)リポソーム、アニオン性(負に荷電した)リポソーム、および中性の調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、N[1−(2,3−ジオレイルオキシ)プロピル]−N,N,N−トリエチルアンモニウム(DOTMA)リポソームは、商品名Lipofectinで、GIBCO BRL(Grand Island,N.Y.から入手可能である(Felgnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:7413〜7416もまた参照のこと)。他の市販の脂質としては、トランスフェクテース(transfectace)(DDAB/DOPE)およびDOTAP/DOPE(Boerhinger)が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、DOTAP(1,2−ビス(オレオイルオキシ)−3−(トリメチルアンモニオ)プロパン)リポソームの合成の記載について、Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:4194−4198;PCT公開公報WO 90/11092を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野において公知の方法を使用して調製される。例えば、Straubingerら、METHODS OF IMMUNOLOGY(1983),Vol.101,pp.512−527;Szokaら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:4194−4198;Papahadjopoulosら、Biochim.Biophys.Acta(1975)394:483;Wilsonら、Cell(1979)17:77);DeamerおよびBangham,Biochim.Biophys.Acta(1976)443:629;Ostroら、Biochem.Biophys.Res.Commun.(1977)76:836;Fraleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:3348);EnochおよびStrittmatter,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:145);Fraleyら、J.Biol.Chem.(1980)255:10431;SzokaおよびPapahadjopoulos,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75:145;ならびにSchaefer−Ridderら、Science(1982)215:166を参照のこと。
【0063】
DNAもまた、Papahadjopoulosら、Biochem.Biophys.Acta.(1975)394:483−491に記載される脂質組成物と類似の渦巻形の脂質組成物中で、送達され得る。米国特許第4,663,161号および同4,871,488号もまた、参照のこと。
【0064】
多くのウイルスを基礎にした系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットホームを提供し、これには、マウスザルコーマウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、マウスモロニー白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどがある。選択された遺伝子が、ベクター中に挿入され、そして当該分野で公知の技法を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が記載されている(米国特許第5,219,740号;MillerおよびRosman、BioTechniques(1989)7:980−990);Miller、A.D.、Human Gene Therapy(1990)1:5−14;Scarpaら、Virology(1991)180:849−852;Burnsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:8033−8037;およびBoris−LawrieおよびTemin、Cur.Opin.Genet.Develop.(1993)3:102−109)。簡単に述べれば、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、B、C、およびD型レトロウイルス、およびFIV、HIV、HIV−1、HIV−2およびSIVのようなスプマウイルスおよびレンチウイルス(RNA Tumor Viruses、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、1985を参照のこと)を含む広範な種々のレトロウイルスから容易に構築され得る。このようなレトロウイルスは、American Type Culture Collection(「ATCC」;1081 University Blvd.Manassas、VA 20110−2209)のような寄託またはコレクションから容易に得られ得るか、一般に利用可能な技法を用いて既知の供給源から単離され得る。
【0065】
2型および5型アデノウイルスベクターのような、多くのアデノウイルスベクターもまた記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に維持され、それ故、挿入変異誘発にともなうリスクを最小にする(Haj−AhmadおよびGraham、J.Virol.(1986)57:267−274;Bettら、J.Virol.(1993)67:5911−5921;Mitterederら、Human Gene Therapy(1994)5:717−729;Sethら、J.Virol.(1994)68:933−940;Barrら、Gene Therapy(1994)1:51−58;Berkner、K.L.BioTechniques(1988)6:616−629;およびRichら、Human Gene Therapy(1993)4:461−476)。
【0066】
Michaelら、J.Biol.Chem.(1993)268:6866−6869およびWagnerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:6099−6103に記載のアデノウイルスキメラベクターのような分子複合体ベクターもまた、遺伝子送達に用いられ得る。
【0067】
制限されないで、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス、VEE由来のベクターのような、アルファウイルス属のメンバーもまた、目的の遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての使用を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来のベクターの記載については、Dubenskyら、J.Virol.(1996)70:508−519;および国際公開番号WO95/07995およびWO96/17072を参照のこと。
【0068】
使用され得るその他のベクターは、制限されないで、シミアンウイルス40、サイトメガロウイルスを含む。Salmonella ssp.Yersinia enterocolitica、Shigella spp、Vibrio cholerae、Mycobacterium株BCG、およびListeria monocytogenesのような細菌ベクターもまた用いられ得る。MCおよびMC1のようなミニ染色体、細菌ファージ、コスミド(λファージcos部位が挿入されているプラスミド)およびレプリコン(細胞中でそれら自身の制御下で複製し得る遺伝子エレメント)もまた使用され得る。
【0069】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド(例えば、発現構築物)はまた、粒子状キャリア(例えば、微小粒子)にカプセル化されるか、吸着されるか、またはそれに結合され得る。これらのキャリアは、選択された分子の多コピーを免疫系に提示し、そして局所リンパ節における分子の捕捉および保持を促進する。これら粒子は、マクロファージによって貧食され、そしてサイトカイン放出によって抗原提示を増大し得る。本明細書中に記載される使用のための微粒子は、代表的には滅菌可能、非毒性および生分解性である物質から形成される。このような物質としては、制限することなく、ポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリチオエステル、ポリアンヒドライドが挙げられる。好ましくは、本発明を用いる使用のための微粒子は、ポリ(α−ヒドロキシ酸)由来であり、特にポリ(ラクチド)(「PLA」)またはD,L−ラクチドおよびグリコシドまたはグリコシル酸(例えば、ポリ(D,L−ラクチド−co−グリコシド)(「PLG」または「PLGA」))、あるいはD,L−ラクシドおよびカプロラクトンのコポリマー)由来である。微粒子は、種々の分子量を有する任意の種々の重合開始物質に由来し得、PLGのようなコポリマーの場合、種々のラクチド:グリコライド比率、ほとんど選りすぐりの物質の選択であり得、同時投与された抗原に一部依存する。粒子状キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、およびPLGとして知られるポリ(ラクチド)およびポリ(ラクチド−co−グリコリド)由来の微粒子が挙げられる。例えば、Jefferyら、Pharm.Res.(1993)10:362−368;およびMcGeeら、J.Microencap.(1996)を参照のこと。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であるが、PLG粒子は、正常な代謝経路に沿って排出される乳酸およびグリコール酸へのエステル結合のランダムな非酵素学的加水分解によって生物分解される。
【0070】
最近の研究によって、包括された抗原を用いるPLG微粒子は、細胞媒介免疫を誘発可能であることを示す。例えば、マイクロカプセルに入れられたヒト免疫不全ウイルス(HIV)gp120は、マウスにおいて、HIV特異的CD4+およびCD8+T細胞反応を誘導することを示してきた(Mooreら、Vaccine(1995)13:1741−1749)。同様に、微粒子カプセルに包まれた卵白アルブミンは、インビボで細胞性免疫応答を初回刺激可能であることが示されており、そして、経口投与される場合に粘膜のIgA応答を誘導し得る(O’Haganら、Vaccine(1993)11:149−154)。さらに、抗体およびT細胞応答の両方は、PLGを包括したMycobacterium tuberoculosis抗原を用いて、ワクチン接種したマウスで誘導された(Vordermeierら、Vaccine(1995)13:1576−1582)。抗原特異的CTL応答はまた、Plasmodium bergheiの周囲のスポロゾイトタンパク質由来の微粒子カプセルに包まれた短い合成ペプチドを使用して、マウスにおいて誘導される。従って、特定の実施形態において、E2ポリペプチドおよびE1E2ポリペプチドならびに/またはE2ポリヌクレオチドおよびE1E2ポリヌクレオチドは、PLG微粒子を用いて送達される(例えば、実施例4を参照のこと)。
【0071】
広範な種類のその他の方法もまた、細胞に発現構築物を送達するために用いられ得る。このような方法は、DEAEデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジン−またはポリオルニチン媒介トランスフェクション、またはリン酸ストロンチウム、(ベントナイトおよびカオリンを含む)ケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどのようなその他の不溶性無機塩を用いる沈殿を含む。その他の有用なトランスフェクションの方法は、エレクトロポーレーション、ソノポーレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションを含む。例えば、目的の細胞を形質転換する技法の論議については、Sambrookら、前述、;そして遺伝子移入に有用な送達系の総説には、Felgner、P.L.、Advanced Drug Delivery Reviews(1990)5:163−187を参照のこと。エレクトロポーレーションを用いてDNAを送達する1つの特に有効な方法は、国際公開番号WO/0045823に記載されている。
【0072】
さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを採用する微粒子銃送達系は、本発明の発現構築物を送達するために特に有用である。これらの粒子は、送達されるべき構築物でコートされ、そして「遺伝子銃」から放出される銃粉末を用い、一般に減圧雰囲気下で、高速度まで加速される。そのために有用な技法、および装置の記載については、例えば、米国特許第4,945,050号;第5,036,006号;第5,100,792号;第5,179,022号;第5,371,015号;および第5,478,744号を参照のこと。
【0073】
(E1E2ポリペプチドおよびE2ポリペプチドまたはE1E2ポリヌクレオチドおよびE2ポリヌクレオチドを含む組成物)
本発明はまた、E1E2ポリペプチドおよびE2ポリペプチドまたはE1E2ポリヌクレオチドおよびE2ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このキャリアは、それ自身、宿主に有害な抗体の産生を誘導すべきではない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。このようなキャリアは、制限されないで、タンパク質、(ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような)多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、(ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような)ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ペプトイド、リプトイド、および不活性化ウイルス粒子のような、大きな、ゆっくりと代謝される高分子である。
【0074】
薬学的に受容可能な塩もまた、本発明の組成物中で用いられ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸の塩がある。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリムペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知のその他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなどのような液体または賦形剤を単独または組合わせて、および湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームもまた、本発明の組成物のためにキャリアとして用いられ得、このようなリポソームは上記に記載される。
【0075】
所望であれば、B7−1またはB7−2、またはGM−CFS、IL−2、およびIL−12のようなサイトカインなどのリンパ球に対する免疫原性の提示を改良する同時刺激分子が、本発明の組成物中に含まれ得る。必要に応じて、アジュバントもまた、組成物中に含められ得る。用いられ得るアジュバントは、制限されないで:(1)水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩(ミョウバン);(2)(ムラミルペプチド(以下を参照のこと)または細菌壁成分のようなその他の特異的免疫刺激剤ありまたはなしの)水中油型エマルジョン処方物、例えば、(a)5%スクァレン、0.5%Tween80、および0.5%Span85を含み(必要に応じて種々の量のMTP−PEを含む)、Model 110Yマイクロフルイダイザー(Microfluidics、Newton、MA)のようなマイクロフルイダイザーを用いてミクロン以下の粒子に処方される、MF59(PCT公開番号WO90/14837)、(b)10%スクァレン、0.4%Tween80、5%プルロニック−ブロックポリマーL121、およびthr−MDP(以下を参照のこと)を含み、ミクロン以下に微小流動化されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成するためにボルテックスにかけられたSAF、および(c)RibiTMアジュバント系(RAS)、(Ribi Immunochem、Hamilton、MT)、これは、2%スクァレン、0.2%Tween80、および以下からなる群から選択される細菌壁の1つ以上の成分を含む:モノホスホリリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)、および細胞壁スケルトン(CWS)を含み、好ましくは、MPL+CWS(DetoxTM)である;(3)StimulonTM(Cambridge Bioscience、Worcester、MA)のようなサポニンアジュバント、またはISCOMのようなそれから生成された粒子もまた用いられ得る(免疫刺激複合体);(4)フロイント完全アジュバント(CFA)およびフロイント不完全アジュバント(IFA);(5)インターロイキン(例えば、IL−1、IL−2、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−12など)のようなサイトカイン、インターフェロン(例えば、γインターフェロン)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、腫瘍壊死因子(TNF)、など;(6)コレラトキシン(CT)、百日咳毒素(PT)、またはE.coli熱不安定性トキシン(LT)のような細菌ADPリボシル化トキシンの弱毒化変異体、特に、LT−K63、LT−R72、CT−S109、PT−K9/G129;例えば、WO93/13302およびWO92/19265を参照のこと;(7)組成物の有効性を増大するための免疫刺激薬剤として作用するその他の物質;および(8)例えば、WO00/06123およびWO00/50006において記載されるような吸着された高分子を有する微粒子。ミョウバンおよびMF59が好適である。PLGのような微粒子が、上記により詳細に記載される。
【0076】
上記のように、ムラミルペプチドは、制限されないで、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、−アセチル−ノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP11637、nor−MDPと称される)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP 19835A、MTP−PEとも称される)などを含む。
【0077】
必要に応じて、E1E2ポリヌクレオチドまたはE2ポリヌクレオチドの送達の効率は、E1E2ポリヌクレオチドまたはE2ポリヌクレオチド注射の約1週間前に、心臓毒(Naja nigricollisの毒液から精製される)の注射によって改善され得る。薬学的に受容可能なビヒクル(例えば、0.9%NaCl)中に溶解された約0.1〜20μMの心臓毒を使用して注射された。
【0078】
従って、このような組換えまたは合成HCVポリペプチドE2およびE1/E2およびポリヌクレオチドE2およびE1/E2は、ワクチン中および診断薬として用いられ得る。さらに、以下に詳細に記載されるように、これらのポリペプチドに対して惹起された抗体はまた、診断薬として、または受動的免疫治療のために用いられ得る。さらに、これらポリペプチドに対する抗体は、HCV粒子を単離および同定するために有用である。
【0079】
(抗体)
本発明のE1E2またはE2ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗E2抗体および/または抗E2NOB抗体を誘発するために使用され得る。抗E2および/または抗E2 NOB抗体の誘発は、特に、HCVに対する抗E2および/または抗E2 NOB抗体応答を最適化するためのモデル系を提供するため、およびHCV感染に対する予防的処置または治療的処置を提供するために、使用され得る。
【0080】
ポリクローナル抗体は、哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマ)にこの融合タンパク質を投与することによって生成され得る。この免疫された動物由来の血清を集め、そしてこの抗体は、例えば、硫酸アンモニウムでの沈澱、続いてクロマトグラフィー(好ましくはアフィニティークロマトグラフィー)によって血漿から精製される。ポリクローナル抗血清を生成およびプロセシングするための技術は、当該分野で公知である。
【0081】
この融合タンパク質中に存在するHCV特異的エピトープに対して指向されたモノクローナル抗体はまた、容易に生成され得る。例えば、E1E2またはE2ポリペプチドで免疫された哺乳動物(例えば、マウス)由来の正常なB細胞は、例えば、例えば、HAT感受性マウス骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマを生成し得る。HCV特異的抗体を産生するハイブリドーマは、RIAまたはELISAを使用して同定され、そして半固体寒天中でのクローニングまたは限界希釈によって単離され得る。HCV特異的抗体を産生するクローンは、スクリーニングの別のラウンドによって単離される。
【0082】
HCVエピトープに対して指向された抗体(モノクローナルおよびポリクローナルのいずれか)は、サンプル(例えば、HCVに感染したヒト由来の血清サンプル)中のHCVまたはHCV抗原の存在の検出のために特に有用である。HCV抗原についてのイムノアッセイは、1つの抗体またはいくつかの抗体を用い得る。HCV抗原についてのイムノアッセイは、例えば、HCVエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体、1つのHCVポリペプチドのエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるHCVポリペプチドのエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体、同じHCV抗原に対して指向されたポリクローナル抗体、異なるHCV抗原に対して指向されたポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せを使用し得る。イムノアッセイプロトコルは、例えば、標識された抗体を使用する、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。この標識は、例えば、蛍光、化学発光、または放射活性であり得る。
【0083】
このポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫親和性カラムによってHCVの粒子または抗原を単離するために、さらに使用され得る。この抗体は、この抗体がその免疫選択活性を保持するように、例えば吸着または共有結合によって固体支持体に結合され得る。必要に応じて、この抗体の抗原結合部位が接近しやすいままであるように、スペーサー基が含まれ得る。次いで、この固定された抗体は、生物学的サンプル(例えば、血液または血漿)からHCVの粒子または抗原を結合するために使用され得る。この結合したHCVの粒子または抗原は、例えば、pHにおける変化によってカラムマトリックスから除去される。
【0084】
(抗E2 NOB抗体)
HCV E1E2およびE2ポリペプチドは、同族のレセプター(例えば、ヒトCD81)を発現する細胞の表面に特異的に結合する、Flintら(1999)J.Virol.73:6235。この結合は、潜在的に、宿主細胞のHCV結合および引き続く感染の原因である。Rosaら(1996)。HCV 抗E2 NOB抗体は、HCV E2のその同族レセプターへの結合を、少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90または100%阻害(「中和」)する。
【0085】
E2の少なくとも2つのエピトープが存在し、これらは抗E2 NOB抗体応答を誘発し得る。HCV型1b、2a、および2bに感染した患者由来の抗E2 NOB抗体は、HCV型1a由来のE2ポリペプチドの哺乳動物細胞への結合を中和し得る。したがって、抗E2 NOB抗体応答の誘発の原因である少なくとも1つのエピトープは、HCVゲノムにおいておそらく保存性である。さらに、HCV E2超可変領域1(HVR1)(アミノ酸384〜414)に対するモノクローナル抗体は、E2の哺乳動物細胞に対する結合を部分的に中和し得、これはHVR1中のエピトープの存在を示唆する。したがって、結合エピトープの少なくとも2つの中和(そのうちの1つが超可変である)が、E2ポリペプチドに存在する。
【0086】
HCV 抗E2 NOB抗体は、WO96/05513;Ishiiら(1998);およびRosaら(1996)に記載される抗E2 NOB抗体アッセイを使用して、検出および/または数量化され得る。この抗E2 NOB抗体アッセイは、HCV E2ポリペプチドについてのレセプターを含む細胞または溶解性CD81へのE2ポリペプチドの結合の阻害を検出する。アッセイのために、E2ポリペプチドは、例えば、HCVに感染した哺乳動物および/あるいはHCV感染についてワクチン接種したかまたは処置された哺乳動物由来の血清の段階希釈物と混合される。この哺乳動物は、例えば、マウス、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトであり得る。この血清およびE2ポリペプチドはインキュベートされる。細胞(例えば、ヒトT細胞リンパ腫株 Molt−4、悪性ヘパトーム細胞株、またはB細胞)は、この混合物に添加され、そしてインキュベートされる。必要に応じて、ヒトCD81でトランスフェクトされた細胞が使用され得る。洗浄後、E2のこの細胞への結合の中和が評価される。この細胞に結合したE2の存在または量は、この細胞を同じ種の哺乳動物(血清の中和を受けたが、このアッセイで使用した特定のE2ポリペプチドで免疫した)由来の血清とインキュベートすることによって決定される。次いで、この細胞は、蛍光性標識化合物(例えば、フルオレセインイソチソシアネート、フィコエリトリン、ローダミン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o−フタルアルデヒド、またはフルオレサミン)を使用して標識される。好ましい実施形態において、IgGに対するフルオレセインイソチオシアネート結合体化抗血清は、検出可能な標識として使用される。E2ポリペプチドのこの細胞への結合は、好ましくは、フローサイトメトリーのような方法を使用して間接的に検出される。抗E2 NOB抗体の力価は、その同族レセプターへのE2の結合の少なくとも10〜90%、そして好ましくは少なくとも50%の中和を生じる血清希釈として規定される。
【0087】
(抗E2抗体)
抗E2抗体は、HCV E2ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的かつ安定に結合する抗体分子である。HCV 抗E2抗体は、例えば、直接的結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)またはELISAアッセイ)を使用して検出および/または数量化され得る。例えば、ELISAアッセイにおいて、E2ポリペプチドは、固体支持体(例えば、プラスチックの複数ウェルプレートのウェル)に連結される。抗体の集団は標識され、この固体支持体に加えられ、そして非特異的吸着がブロックされる条件下で非標識E2抗原に結合され、そして他のタンパク質が洗い流される。抗体結合は、無色の基質を有色の反応生成物へと転換する反応によって検出される。
【0088】
抗E2 NOB抗体の力価の生成とHCV感染からの保護の間に、直接的な相関性が存在する。Rosaら(1991);Ishiiら(1998)。通常、HCVによる感染は、持続性の高レベルの抗E2 NOB抗体力価を誘発しない。しかし、自発的にHCV感染から回復する、慢性的にHCVに感染した個体のうちの数パーセントは、持続性の、高レベルの抗E2 NOB抗体力価を有する。したがって、慢性HCV感染の過程における抗E2 NOB抗体の高い血清力価の出現および維持は、HCV感染のクリアランスおよび臨床的回復と関連する。抗E2抗体応答の生成は、HCVによる感染に対するワクチン接種の提供において重要であることが見出された。Chooら(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911294−1298。さらに、抗E1力価の生成は、HCV感染からの保護およびクリアランスにおいて重要であり得る。
【0089】
E1E2またはE2のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの送達後の、抗E2抗体力価または抗E2 NOB抗体力価の検出および/または数量化は、抗E2抗体力価および/または抗E2 NOB抗体力価の誘発に特に有効なE2エピトープの同定のために使用され得る。HCVに対する強力な抗E2抗体および/または抗E2 NOB抗体の応答の原因であるE1E2またはE2エピトープは、異なる長さ(例えば、アミノ酸661,715,746,749,または809でのHCVポリペプチドの終端、あるいはHCVポリペプチドのアミノ末端からのアミノ酸の除去)のE1E2またはE2ポリペプチドに対して指向された抗E2抗体および/または抗E2 NOB抗体の誘発によって同定され得る。次いで、特定のE2ポリペプチドエピトープによって誘発された抗E2および抗E2 NOB抗体は、どのポリペプチドが強力な応答の生成において最も有効なエピトープを含むかを決定するために、抗E2 ELISAアッセイまたは抗E2 NOB抗体アッセイを使用して試験され得る。次いで、これらのエピトープまたはこのエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むE1E2またはE2のポリペプチドまたは融合タンパク質が構築され、そして強力な抗E2抗体応答および/または強力な抗E2 NOB抗体応答を誘発するために使用され得る。
【0090】
(送達)
E1E2もしくE2のポリペプチドまたはE1E2もしくはE2のポリヌクレオチドは、抗E2または抗E2 NOB抗体をインビボで誘発するために、哺乳動物(例えば、マウス(例えば、CB6/F1もしくはC57B1/6マウス)、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト)に投与され得る。E1E2またはE2ポリヌクレオチドの注入は好ましい。構築および改変における単純さの実用的な利点に加えて、E1E2またはE2ポリヌクレオチドの注入は、宿主細胞におけるE1E2またはE2ポリペプチドの合成を生じる。したがって、このE1E2またはE2ポリペプチドは、ネイティブの翻訳後の改変、構造、および構成で宿主の免疫系に提供される。E1E2またはE2ポリヌクレオチドは、好ましくは、「裸のDNA」として送達される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与は、筋肉内注入、皮内注入、腹腔内注入、または皮下注入(生物学的な衝撃銃(「遺伝子銃」)を使用する注入を含む)を含む、当該分野で公知の任意の手段によるものであり得る。投与はまた、鼻腔内または経口的であり得る。さらに、投与は、エレクトロポレーションによって達成され得る。Mishimura(2000)Vaccine 18:675を参照のこと。好ましくは、E1E2またはE2のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、経口投与のためのタンパク質キャリアに付随する。投与方法の組み合わせはまた、抗E2および/または抗E2 NOBの抗体応答を誘発するために使用され得る。
【0091】
E1E2もしくはE2ポリペプチドまたはE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドの投与は、この哺乳動物において、少なくとも1週間、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、6ヶ月、1年またはそれより長く持続する抗E2抗体力価および/または抗E2 NOB抗体力価を誘発し得る。必要に応じて、最初の注入後1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年、またはそれ以上で、E1E2もしくはE2ポリペプチドまたはE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドの1回以上のブースター注入物を提供することによって、抗E2または抗E2 NOBの抗体力価は哺乳動物中で維持され得る。
【0092】
好ましくは、E1E2もしくはE2ポリペプチドまたはE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドは、少なくとも1:25、1:50、1:65、1:70、1:73、1:75、1:100、1:140、1:200、1:300、1:375、1:400、1:420、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1,000、1:3,000、1:4,000またはそれ以上の抗E2 NOB抗体力価を誘発する。
【0093】
好ましくは、E1E2もしくはE2ポリペプチドまたはE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドは、少なくとも 100、150、175、200、300、400、500、750、1,000、1,500、2,000、3,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000(幾何学的平均力価)またはそれ以上の抗E2抗体力価を誘発する。
【0094】
E1E2もしくはE2ポリペプチド、E1E2もしくはE2ポリヌクレオチド、またはその組み合わせを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合性の様式で、そして上記のような抗E2 NOBアッセイによって検出される抗E2 NOB抗体力価、またはELISAによって検出される抗E2抗体力価を誘発するために有効な量で投与される。E1E2またはE2ポリヌクレオチドは、好ましくは、大型哺乳動物(例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト)に、1ng/kg、10ng/kg、100ng/kg、1000ng/kg、0.001mg/kg、0.1mg/kg、または0.5mg/kgの用量で筋肉内注入される。E1E2またはE2ポリペプチドは、好ましくは、ヒトのような大型哺乳動物に0.01、0.05、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5、5または10mg/kgの用量で筋肉内注入される。E1E2もしくはE2ポリペプチドおよび/またはE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドは、HCVに感染していない哺乳動物に投与され得るか、またはHCVに感染した哺乳動物に投与され得るかのいずれかでる。組成物中のE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドまたはE1E2もしくはE2ポリペプチドの特定の用量は、この組成物が投与される哺乳動物の種、年齢、および全身的状態、ならびにこの組成物の投与形態が挙げられるがこれらに限定されない多くの要因に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験法のみを用いて容易に決定され得る。上記のインビトロおよびインビボモデルは、適切な用量を同定するために用いられ得る。以下の実施例において使用されるE1E2もしくはE2ポリヌクレオチドまたはE1E2もしくはE2ポリペプチドの量は、一般的な手引きを与え、これは抗E2および/または抗E2 NOB抗体の誘発を最適化するために使用され得る。所望される場合、同時刺激性分子またはアジュバントがまた、E1E2またはE2の組成物の前、後、または一緒に提供され得る。
【0095】
本発明の組成物の送達によって生成される哺乳動物の免疫応答(抗E2および抗−E2 NOB抗体の誘発を含む)は、投薬量、投与経路、またはブーストレジメンの変化によって増強され得る。本発明の組成物は、単一用量の計画、または好ましくは複数用量の計画(ここで、最初のワクチン接種の経過は1〜10の別個の用量を含む)で与えられ得、続いて、免疫応答を維持および/または再増強するために必要な時間間隔(例えば、第2用量について1〜3ヶ月、および必要に応じて第3の用量について3〜6ヶ月)後に他の用量が与えられ、そして必要な場合、数ヶ月後に続く用量が与えられる。同様に、いくつかの実施形態において、免疫応答は、プライム−ブースト計画(1回以上のDNAプライムおよび1回以上のタンパク質ブースト)を使用して誘発される。
【0096】
以下は、例示目的のみで提供され、そして上記の広い用語で記載された本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【0097】
(実施例)
(実施例1:短縮型E2ポリペプチドまたはポリヌクレオチドでの免疫化は、抗E2−NOB抗体力価を誘発する。)
(E2組成物)
アミノ酸661または715で短縮された全長HCV E2またはHCV E2をコードするポリヌクレオチドを、プラスミドベクターpnewCMVに連結した。pnewCMVは、以下のエレメントを含むpUC19ベースのクローニングベクターである:SV40複製起源、ヒトCMVエンハンサー/プロモーター、ヒトCMVイントロン、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)リーダー、およびウシ成長ホルモンポリAターミネーター。単離され、そして精製されたpnewCMVベクター(E2挿入物を含む)を、滅菌した0.9%生理食塩水緩衝液に溶解した。
【0098】
アミノ酸715で短縮されたE2ポリペプチドを、組換え産生し、そしてS−Sepharoseカラムを使用して精製した。アミノ酸661で短縮されたE2ポリペプチドは、Abbott Laboratoriesから入手可能な、組換え産生した分泌ポリペプチドである。
【0099】
Naja nigricollisの毒液から精製した心臓毒を、Latoxin(France)から入手した。この心臓毒を、0.9% NaCl中で10μMの最終濃度まで希釈した。
【0100】
(免疫)
CB6/F1マウスを、各10〜12マウスの6つのグループに分けた。グループ1のマウスに、全長E2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAの100μgを注入した(pnewCMVE2−746 DNA)。グループ2に、アミノ酸715で短縮したE2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAの100μgを注入した(pnewCMVE2−715 DNA)。グループ3に、アミノ酸661で短縮したE2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドDNAの100μgを注入した(pnewCMVE2−661 DNA)。グループ4に、アミノ酸715で短縮したE2ポリペプチドの1μgを注入した(CHO E2−715 1μg)。グループ5に、アミノ酸661で短縮したE2ポリペプチドの1μgを注入した(CHO E2−661)。グループ6に、アミノ酸715で短縮したE2ポリペプチドの5μgを注入した(CHO E2−715 5μg)。E2組成物を、表1の計画に従って投与した。
【0101】
【表1】
心臓毒(10μM溶液の0.05ml)を、各マウスの前脛骨筋に筋肉内注射した。0.9%生理食塩水中のE2プラスミド(1mg/ml)を、各マウスの前脛骨筋に筋肉内注射し(0.05mlを各筋肉に)、総量約100μgのDNAを注入した。約0.02mg/mlまたは0.1mg/mlでのE2ポリペプチドを、MF59−0アジュバントと1:1で組合せ、0.05mlを各前脛骨筋に、筋肉内注射し、総量約1μgまたは5μgのポリペプチドを注入した。群1〜5のマウスについて、0.2mlの血液を、21日目、43日目および99日目の各マウスから得た。群6のマウスについて、0.2mlの血液を、55日目および83日目の各マウスから得た。
【0102】
(抗E2 NOB力価の検出および測定)
組換えE2ポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(E2のエンベローブ領域(アミノ酸384−715)をコードするHCV 1a型相補DNA(cDNA)を発現する)から作製し、そして精製した。Molt−4細胞(ウェルあたり105)を、96ウェルU字型底マイクロプレート中に、4℃で5分間の200×gでの遠心分離によってペレット化した。異なる濃度でPBSにおいて希釈したE2ポリペプチドの20μlを、HCVで感染されたか、またはHCV組換えタンパク質で免疫したかのいずれかのマウス由来の血清の種々の希釈物と混合した。4℃で1時間のインキュベーション後、Molt−4細胞を添加し、そして4℃で1時間インキュベートした。非結合HCVタンパク質および抗体を、4℃で5分間の200×gでのPBS中での2回の遠心分離によって除去した。細胞を、引き続き、HCVエンベローブ組み換えタンパク質で免疫したマウスからの結成の1/100希釈物とともに、4℃で30分間インキュベートした。可能である場合、対応する予備免疫血清をコントロールとして使用した。これらの細胞を、PBS中で2回洗浄し、IgGに対するフルオレセインイソチオシアネート−結合体化抗血清についての適切な希釈物と共に30分間インキュベートした。細胞を4℃でPBSで洗浄し、そして100μl PBSに再懸濁した。
【0103】
細胞結合蛍光を、Becton DickinsonからのLysis IIソフトウェアプログラムを使用するFACScanフローサイトメトリー(Becton Dickinson)を用いて分析した。細胞集団の平均蛍光強度(MFI)を、計算した。MFIは、直接、細胞に結合した蛍光標識HCVの表面密度に関係する。この例において、NOB抗体力価は、E2結合の50%中和を示す血清希釈物として規定される。
【0104】
NOB力価を示すマウスの平均抗E2NOB抗体力価を表2に報告する。抗E2NOB抗体力価を示す各群のマウスの数を、平均抗NOB抗体力価の下の括弧内に示す。
【0105】
【表2】
表2は、E2をコードするプラスミドDNAおよびその短縮型での免疫化が抗E2 NOB抗体力価を誘発することを示す。抗E2 NOB抗体力価は、E2がプラスミドDNAに送達された場合でさえ、誘発された。抗E2 NOB抗体は、全長E2ポリペプチドを含むプラスミドによって誘発されることは、以前には示されていない。表2はさらに、E2ポリペプチドがアミノ酸715または661において切断された場合でさえ、E2ポリペプチドでの免疫化が、抗E2 NOB抗体力価を誘発することを示す。
【0106】
(実施例2:E1E2ポリペプチドをコードするDNAでの免疫化は抗E2−NOB抗体力価を誘発する)
(E1E2組成物)
E1E2をコードするポリヌクレオチドをプラスミドベクターpnewCMVにライゲーションした。このポリヌクレオチドは、HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜746(pnewCMVE1E2−746)、アミノ酸192〜749(pnewCMVE1E2−749)、アミノ酸192〜809(pnewCMV1E2−809)(HCV−1に関するアミノ酸の番号付け)をコードした。E1E2挿入物を含む単離および精製されたpnewCMVベクターを、0.9%滅菌生理食塩水緩衝液に溶解した。
【0107】
(免疫)
CB6/F1マウスの群に、実施例1の記載と同様に、0週、4週、および8週で心臓毒を筋肉内注射した。このマウスに、実施例1の記載と同様に、1週、5週、および9週に、100μgのプラスミドDNA(pnewCMVE1E2−746、pnewCMVE1E2−749、またはpnewCMVE1E2−809)を注射した。
【0108】
(抗E2−NOB力価の検出および測定)
各群のマウスについての平均の抗E2 NOB抗体力価を、実施例1に記載のように決定した。結果を表3に示す。抗E2 NOB抗体力価を表す各群のマウスの数を、以下の平均抗E2 NOB抗体力価のカッコ内に示す。
【0109】
【表3】
表3は、E1E2をコードするプラスミドDNAによる免疫が、抗E2 NOB抗体力価を惹起することを実証する。E1E2がプラスミドDNAによって誘導された場合でさえも、抗E2抗体力価は惹起される。抗E2 NOB抗体が、全長E1E2ポリペプチドを含むプラスミドによって惹起されることは以前に示されていない。
【0110】
(実施例3:E1E2ポリペプチドをコードするDNAまたはE2ポリペプチドをコードするDNAでの免疫によって、抗E2抗体力価が誘発される)
(E1E2およびE2組成物)
DNAプラスミドpnewCMVE2−746、pnewCMVE1E2−746、pnewCMVE1E2−749、およびpnewCMVE1E2−809を、実施例1および2に記載のように調製した。
【0111】
(免疫)
CB6/F1マウス群に、実施例1に記載のように、0、4および8週目に筋内に心臓毒を注射した。このマウスに、実施例1に記載のように、1、5および9週目に、100μgのプラスミドDNA(pnewCMVE2−746、pnewCMVE1E2−746、pnewCMVE1E2−749、またはpnewCMVE1E2−809)を注射した。
【0112】
(抗E2抗体力価の検出および測定)
抗E2抗体の検出および測定を、本質的にIshiiら(1998)Hepatology 28:1117−20およびTedeschiら(1997)Hepatology 25:459−462に記載のように、ELISAによって達成した。簡潔には、組換えCHO細胞によって産生されたHCV E2またはE1/E2抗原を、PBS中に希釈し、そしてマイクロタイタープレートのウェルにコーティングした。試験マウス血清を、サンプル希釈液中に希釈し、そして37℃で1時間、このプレートにおいてインキュベートした。このウェルを、プレート洗浄緩衝液で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化されたモノクローナルマウス抗ヒトIgG抗体を、各ウェルに添加した。O−フェニレンジアミンジヒドロクロリド(OPD)および過酸化水素を、このウェルに添加した。結果を、492/620nmで、マイクロタイタープレートリーダー(Tetertek MCC/340;Flow Laboratories)を使用して読み取った。これらの抗原のカットオフ光学密度(OD)値を、陰性サンプル(出血前(prebleed))の平均、および平均ODの標準偏差の7倍として決定した。試験されたサンプルの力価を、相対的な直線範囲のシグナルOD/カットオフOD×希釈率として決定した。相乗平均力価(GMT)を、表4に報告する。
【0113】
【表4】
表4は、E1E2またはE2をコードするプラスミドDNAでの免疫が、抗E2抗体力価を誘発することを示す。抗E2抗体力価は、たとえ全長のE1E2またはE2がプラスミドDNAにより送達されたとしても誘発された。抗E2抗体が全長のE1E2またはE2ポリペプチド(ここで、このポリペプチドはp7ポリペプチドを含まない)を含むプラスミドにより誘発されることは、以前には示されなかった。
【0114】
(実施例4:PLGで送達されるDNAでの免疫)
ポリ乳酸−コ−グリコリド(PLG)ポリマーをBoehringer Ingelheim,U.S.Aから得た。この研究に用いたPLGポリマーは、50/50のコポリマー比および65kDaの分子量(製造業者のデータ)を有するRG505であった。本質的には、Singhら(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97:811−816)に記載されるように、DNAが吸着されたカチオン性微粒子を、改変溶媒エバポレーションプロセスを用いて調製した。簡潔には、この微粒子を、塩化メチレン中の5% w/vポリマー溶液10mlをPBS 1mlと、IKAホモジナイザーを用いて高速で乳化することにより調製した。次いで、最初の乳濁液を、セチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTBA)(0.5% w/v)を含む蒸留水50mlに添加した。このことにより、w/o/w乳濁液の形成が生じ、これを室温で12時間6000rpmで攪拌して、塩化メチレンを蒸発させた。得られた微粒子を蒸留水中で2回、10,000gで遠心分離することにより洗浄し、そして凍結乾燥した。調製、洗浄および収集後、DNAを、カチオン性微粒子100mgを、DNAの1mg/ml溶液中で、4℃で6時間インキュベートすることにより、微粒子上に吸着させた。次いで、この微粒子を遠心分離により分離し、ペレットをTE緩衝液で洗浄し、そしてこの微粒子を凍結乾燥し、再懸濁し、そして動物被験体に投与した。
【0115】
抗体力価を、本明細書中に記載のようにELISAアッセイにより測定した。図1および2は、以下のDNA構築物を用いたPLG免疫の結果を示す:HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜746(E2)および192〜746(E1E2)をコードする構築物。図3および4は、HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜749(E2)および192〜749(E1E2)をコードする構築物を用いたPLG免疫の結果を示す。これらの結果により、PLG/E1E2 DNAを用いたマウスの免疫が、高い抗体力価を生じることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、10μgのE1E2/PLG DNA(左のバー);10μgのE1E2 DNA(中のバー)、および100μgのE1E2/PLG DNAを用いて免疫したマウスのELISA力価を示すグラフである。
【図2】
図2は、種々のアジュバント中のE1E2 DNAおよび/またはタンパク質を用いて免疫したマウスのELISA力価を示すグラフである。黒のバーは、2回目のブースト(追加免疫)後の力価を示し、そして白のバーは、3回目のブースト(追加免疫)後の力価を示す。
【図3】
図3は、種々のアジュバント中のE1E2 DNAおよび/またはタンパク質を用いて免疫したマウスのELISA力価を示すグラフである。黒のバーは、2回目のブースト(追加免疫)後の力価を示し、そして白のバーは、3回目のブースト(追加免疫)後の力価を示す。図3および図4は、2つの別々の実験を示す。
【図4】
図4は、種々のアジュバント中のE1E2 DNAおよび/またはタンパク質を用いて免疫したマウスのELISA力価を示すグラフである。黒のバーは、2回目のブースト(追加免疫)後の力価を示し、そして白のバーは、3回目のブースト(追加免疫)後の力価を示す。図3および図4は、2つの別々の実験を示す。
Claims (27)
- C型肝炎ウイルス(HCV)のE2抗原またはE1E2抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、(a)該E2抗原または該E1E2抗原をコードするポリヌクレオチドを被験体に投与する工程であって、該E2抗原および該E1E2抗原が分泌されずそしてE2が全長である、工程、を包含する、方法。
- 前記免疫応答が体液性免疫応答である、請求項1に記載の方法。
- 前記体液性免疫応答が、少なくとも1つの結合中和抗体(NOB)を産生する、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがE1E2ポリペプチドをコードする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド全長E2ポリペプチドをコードする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記HCV抗原が、p7ポリペプチドを含まない、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の方法であって、前記HCV抗原が、HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜746;HCVポリタンパク質のアミノ酸384〜749;HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜746;HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜809;HCVポリタンパク質のアミノ酸192〜749;およびHCVポリタンパク質のアミノ酸384〜809からなる群より選択される、方法。
- 前記ポリヌクレオチドがプラスミド中に存在する、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記被験体がHCVに感染している、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記被験体がHCVに感染していない、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記被験体に心臓毒を投与する工程をさらに包含する、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが微粒子を使用して投与される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記微粒子がPLG微粒子である、請求項12に記載の方法。
- 前記被験体が哺乳動物である、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記哺乳動物が、マウス、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、およびヒトからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが微粒子銃送達デバイスを使用して投与される、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、筋内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経口投与、および皮内投与からなる群より選択される方法によって投与される、請求項1に記載の方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記結合中和抗体が、E2ポリペプチドがその同族レセプターに結合することを、該結合中和抗体の非存在下で該E2ポリペプチドがその同族レセプターへ結合することと比較して、より大きな量阻害する、方法。
- 前記結合中和抗体を検出する工程をさらに包含する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:70の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:140の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:300の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:600の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:800の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 前記結合中和抗体が、少なくとも1:3000の希釈度で、該E2ポリペプチドの結合を少なくとも50%阻害する、請求項3に記載の方法。
- 工程(a)を反復する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
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