JP2023532412A - ヒト免疫グロブリンｇに対するウサギ抗体 - Google Patents

Abstract

本開示、ウサギから得られる抗ヒトＩｇＧ抗体およびその抗原結合部分ならびにその抗体および部分を使用する方法。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年６月１日に出願の米国特許出願第６３／０３３０７３号の優先権を主張し、本開示は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

配列表
本出願は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含有する。２０２１年５月２４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０２２５４８＿ＷＯ０６３＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズ８４，８１９バイトである。

治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、近年最も成長している薬物クラスの１つになっており、がんから自己免疫性疾患まで多様な徴候の処置用として承認されている。これら治療用モノクローナル抗体の前臨床薬物動態学的特徴付けを非ヒト霊長類においてしばしば実行して、臨床試験を開始する前に有効性および安全性を証明しなければならない。カニクイザルは、治療用抗体の標的と充分なレベルの交差反応性をしばしば生じるので、そのような前臨床試験用として好ましい非ヒト霊長類である（非特許文献１）。しかしながら、カニクイザルの免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンと高い配列相同性も示す。ＩｇＧのタンパク質配列の相同性レベルが高いので、血清中のヒト治療用分子をカニクイザル免疫グロブリンと区別できる高品質な試薬抗体がないことは、非ヒト霊長類の血清サンプル中にあるヒト治療用抗体の生物分析測定にとって重大な課題である（非特許文献２）。

Ｉｗａｓａｋｉら、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．（２０１９年）３４：５５～６３頁 Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．（２００９年）４９：１００３～８頁

現在のところ、前臨床試験における治療用抗体の薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）の評価は、薬物特異的抗イディオタイプ抗体を利用しており、それは、開発に多くの労力および時間を要する。各薬物候補には、それ自身の抗イディオタイプ抗体が必要となる。前臨床試験においてヒトＩｇＧに基づく全ての治療用抗体を検出できる汎用試薬の選択肢は少ない。したがって、前臨床試験の間に非ヒト霊長類においてヒトＩｇＧ由来の治療用ｍＡｂのレベルを正確に測定するには、ヒトＩｇＧに対して普遍的に特異的であるが、サルＩｇＧに結合しないモノクローナル抗体を開発する必要がある。

本開示は、ヒトＩｇＧに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、抗体または部分は、配列番号２７～３２、配列番号３３～３８、配列番号３９～４４、配列番号４５～５０、配列番号５１～５６または配列番号５７～６２をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供する。抗体は、ウサギ抗体である、またはそのような分子から修飾することができる（例えば、マウス、ラットまたはヒトのような非ウサギ種のＦｃドメインを持つキメラ抗体を含む）。

一部の実施形態において、本抗体または部分は、配列番号１３および１９、配列番号１４および２０、配列番号１５および２１、配列番号１６および２２、配列番号１７および２３、または配列番号１８および２４をそれぞれ含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。抗体は、ウサギ抗体であることができ、またはそのような分子から修飾される。

一部の実施形態において、本抗体は、配列番号２５の重鎖定常領域アミノ酸配列および／または配列番号２６の軽鎖定常領域アミノ配列を含む。さらなる実施形態において、抗体は、リーダー配列を含むもしくは含まない、配列番号６３および６９、配列番号６４および７０、配列番号６５および７１、配列番号６６および７２、配列番号６７および７３、または配列番号６８および７４のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ならびに軽鎖を含む。

特定の実施形態において、本抗体または抗原結合部分は、検出可能な標識を含む。

本開示は、水性緩衝溶液中に本モノクローナル抗体または抗原結合部分を含む組成物またはキットも提供する。

他の態様において、本開示は、本モノクローナル抗体または抗原結合部分の重鎖、軽鎖もしくは両方をコードしている単離された核酸分子を提供する。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および／または１２を含む。さらなる実施形態において、核酸分子は、配列番号１および７、配列番号２および８、配列番号３および９、配列番号４および１０、配列番号５および１１または配列番号６および１２を含む。核酸分子を含む発現構築物ならびに本モノクローナル抗体または抗原結合部分の重鎖および軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）も、本明細書に提供される。本開示は、抗体もしくは部分の重鎖および軽鎖の発現が可能な条件下で宿主細胞を培養する工程と、培養細胞または細胞培養の上清から抗体もしくは部分を単離する工程とを含む、抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法も提供する。

別の態様において、本開示は、サンプルを本明細書に記載される１つもしくはそれ以上のモノクローナル抗体または抗原結合部分と接触させる工程を含む、サンプル中のヒトＩｇＧまたはその断片を検出する方法を提供する。サンプル（例えば、血液、血清もしくは血漿サンプルのような組織サンプルまたは生検サンプル）は、例えば、ヒトＩｇＧ定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域）を含む抗体またはその断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片）を投与された動物から入手され得る。動物は、例えば、カニクイザルまたはアカゲザルのような非ヒト霊長類である。

本発明の他の特徴、目的および優位性は、以下の詳細な説明において明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態および態様を示すが、例示のためだけに与えられるものであり、限定するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲にある様々な変更および修飾は、詳細な説明から当業者に明らかになろう。

全ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）、全ヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）、ヒトＦａｂ（ｈＦａｂ）、およびカニクイザルＩｇＧ（ｃｙｎｏＩｇＧ）に対する６つのウサギ組換え抗体クローンの結合を示すＢｉａｃｏｒｅセンサグラムグラフのパネルである。 Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＫａｂａｔ付番方式を使用した６つのウサギ組換え抗体クローンの重鎖（図２Ａ）および軽鎖（図２Ｂ）アミノ酸配列の整列化をそれぞれ示す図である。ＣＤＲ（ＺｈａｎｇおよびＨｏ、ＭＡＢＳ（２０１７年）９（３）：４１９～２９頁も参照のこと）に、下線を引き、太字にする。示した通り、リーダー配列、可変ドメインの始まりおよび定常領域の始まりに印をつける。 Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａおよびＫａｂａｔ付番方式を使用した６つのウサギ組換え抗体クローンの重鎖（図２Ａ）および軽鎖（図２Ｂ）アミノ酸配列の整列化をそれぞれ示す図である。ＣＤＲ（ＺｈａｎｇおよびＨｏ、ＭＡＢＳ（２０１７年）９（３）：４１９～２９頁も参照のこと）に、下線を引き、太字にする。示した通り、リーダー配列、可変ドメインの始まりおよび定常領域の始まりに印をつける。 ６つのウサギ抗体クローンのＶＨおよびＶＬ配列の系統樹を示す図である。 Ｂｉａｃｏｒｅ競合アッセイ（図３Ａ）およびＢｉａｃｏｒｅ動態アッセイセンサグラム（図３Ｂ）による６つのウサギ抗ｈＩｇＧクローンのエピトープ決定を示す図である。抗体ＭＣＡ５７４８Ｇ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１９Ｂ１、１１Ｆ９およびマウス抗ｈＩｇＧ ｍＡｂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号９０４２－０１）を最初にビオチン化し、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ上に５００～６００ＲＵで捕捉した。１：２段階希釈を８回した（８０～０ｎＭ）ｈＩｇＧ１抗体（イサツキシマブ；「ｉｓａ」）を、競合抗体（２４０ｎＭ）のそれぞれと使用前に混合した。予め混合した競合抗体が、チップ表面上に捕捉されている抗体と同じ部位でｈＩｇＧ１に結合する場合、ｈＩｇＧ１は捕捉されている抗体に結合することができない。 Ｂｉａｃｏｒｅ競合アッセイ（図３Ａ）およびＢｉａｃｏｒｅ動態アッセイセンサグラム（図３Ｂ）による６つのウサギ抗ｈＩｇＧクローンのエピトープ決定を示す図である。抗体ＭＣＡ５７４８Ｇ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、１９Ｂ１、１１Ｆ９およびマウス抗ｈＩｇＧ ｍＡｂ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号９０４２－０１）を最初にビオチン化し、Ｂｉａｃｏｒｅ ＳＡチップ上に５００～６００ＲＵで捕捉した。１：２段階希釈を８回した（８０～０ｎＭ）ｈＩｇＧ１抗体（イサツキシマブ；「ｉｓａ」）を、競合抗体（２４０ｎＭ）のそれぞれと使用前に混合した。予め混合した競合抗体が、チップ表面上に捕捉されている抗体と同じ部位でｈＩｇＧ１に結合する場合、ｈＩｇＧ１は捕捉されている抗体に結合することができない。 捕捉試薬としてクローン１６Ｆ５を使用するＧｙｒｏｌａｂ（商標）免疫アッセイ、ならびに０％、４％、１０％および２５％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の重層グラフを示す図である（図４Ａ）；４％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の標準曲線グラフを示す図である（図４Ｂ）；４％カニクイザル血清を含有する同じアッセイマトリックスにおける品質管理を示す図である（図４Ｃ）。クローン１６Ｆ５がビオチン化され、捕捉試薬として使用された。アッセイ標準としての機能を果たすヒトＩｇＧ４抗体（ｈＩｇＧ４）を、１２００～０．３０ｎｇ／ｍＬの範囲で１：４希釈した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを、検出に使用した。 捕捉試薬としてクローン１６Ｆ５を使用するＧｙｒｏｌａｂ（商標）免疫アッセイ、ならびに０％、４％、１０％および２５％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の重層グラフを示す図である（図４Ａ）；４％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の標準曲線グラフを示す図である（図４Ｂ）；４％カニクイザル血清を含有する同じアッセイマトリックスにおける品質管理を示す図である（図４Ｃ）。クローン１６Ｆ５がビオチン化され、捕捉試薬として使用された。アッセイ標準としての機能を果たすヒトＩｇＧ４抗体（ｈＩｇＧ４）を、１２００～０．３０ｎｇ／ｍＬの範囲で１：４希釈した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを、検出に使用した。 捕捉試薬としてクローン１６Ｆ５を使用するＧｙｒｏｌａｂ（商標）免疫アッセイ、ならびに０％、４％、１０％および２５％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の重層グラフを示す図である（図４Ａ）；４％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスにおけるｈＩｇＧ４の標準曲線グラフを示す図である（図４Ｂ）；４％カニクイザル血清を含有する同じアッセイマトリックスにおける品質管理を示す図である（図４Ｃ）。クローン１６Ｆ５がビオチン化され、捕捉試薬として使用された。アッセイ標準としての機能を果たすヒトＩｇＧ４抗体（ｈＩｇＧ４）を、１２００～０．３０ｎｇ／ｍＬの範囲で１：４希釈した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７コンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧを、検出に使用した。 ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂの検出のために捕捉試薬として使用した異なるクローンの比較を示す図である。図５Ａは、ｈＩｇＧ４の検出のための、６つ全てのウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂクローン、ならびにＧｙｒｏｌａｂ（商標）およびＭＣＡ５７４８Ｇ補足薬剤の標準曲線を示す図である。図５Ｂは、ｈＩｇＧ Ｆａｂの検出のために使用した同じ組の捕捉試薬を示す図である。ｈＦａｂは、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）補足薬剤によってまたはＭＣＡ５７４８Ｇ補足薬剤によって検出できないことに注意すべきである。 ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂの検出のために捕捉試薬として使用した異なるクローンの比較を示す図である。図５Ａは、ｈＩｇＧ４の検出のための、６つ全てのウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂクローン、ならびにＧｙｒｏｌａｂ（商標）およびＭＣＡ５７４８Ｇ補足薬剤の標準曲線を示す図である。図５Ｂは、ｈＩｇＧ Ｆａｂの検出のために使用した同じ組の捕捉試薬を示す図である。ｈＦａｂは、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）補足薬剤によってまたはＭＣＡ５７４８Ｇ補足薬剤によって検出できないことに注意すべきである。 沈殿および酸解離（ＰａｎｄＡ）アッセイに使用した４つの抗体の比較を示す図である。２つのウサギ抗ヒトＩｇＧクローン、２Ｃ５および１１Ｇ５のダイナミックレンジならびに感度を、市販のマウス抗Ｆｃ ｍＡｂ、クローンＪＤＣ－１０（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号９０４０－０１）と比較した。ｐＡｂ：ウサギポリクローナル抗薬物抗体（薬物：ヒトＩｇＧ４定常領域を持つモノクローナル抗体）。ＥＣＬ：電気化学発光。 ＰａｎｄＡアッセイにおけるヒト、ラット、サルおよびマウス血清マトリックスにおけるクローン２Ｃ５ならびに１１Ｇ５それぞれの成績を示す図である。Ｐｏｓ ｃｔｒｌ：陽性対照。 ＰａｎｄＡアッセイにおけるヒト、ラット、サルおよびマウス血清マトリックスにおけるクローン２Ｃ５ならびに１１Ｇ５それぞれの成績を示す図である。Ｐｏｓ ｃｔｒｌ：陽性対照。

本開示は、高い親和性でヒト免疫グロブリンＧおよびそのＦａｂ断片に結合するが、サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）のような非ヒト霊長類のＩｇＧに検出可能なレベルで結合しないウサギモノクローナル抗体を提供する。これらウサギ抗体は、カニクイザルまたは別の非ヒト霊長類におけるヒトＩｇＧに基づく治療用抗体の前臨床薬学研究においてヒトＩｇＧまたはその断片を検出するための試薬として特に有用である。例えば、これらウサギ抗体を使用して、完全ヒトＩｇＧ抗体、ヒト化ＩｇＧ抗体、ヒトＩｇＧ定常領域を有するキメラ抗体、およびそのＦａｂ断片である治療用抗体を研究することができる。本ウサギ抗体は、前臨床免疫組織化学研究およびヒトＩｇＧに基づく治療用抗体（例えば、単一特異的、二重特異的および三重特異的抗体を含めた全抗体、ならびにそのＦａｂ断片）の製造工程の開発にも使用できる。

本ウサギモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ上の３つの固有のエピトープに結合し、そのエピトープは、市販のマウス抗ｈＩｇＧ抗体ＭＣＡ５７４８Ｇによって結合されるエピトープと更に違う。ウサギモノクローナル抗体は、伝統的なマウスモノクローナル抗体に勝るいくつかの優位性を示す。これら優位性は、より高い結合親和性および特異性ならびにより多様なエピトープ認識を含む。ウサギの免疫系は、齧歯動物のそれと進化的に違っており、産生する抗体の親和性を生成し、多様化し、最適化するために異なる機序を使用する。加えて、ウサギの免疫系は、マウスにおいて免疫原性でないより小さなサイズのエピトープを認識することができ、強い免疫応答を産生する能力を維持している。したがって、本明細書に記載されるウサギ抗体は、マウス抗体よりも有利である。

ウサギ抗ｈＩｇＧ抗体
本開示は、ヒトＩｇＧおよびその抗原結合部分（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）に特異的に（即ち、高親和性で）結合する抗体を提供する。これら抗体は、前臨床試験において一般に使用される他の種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類またはイヌなど）の免疫グロブリン（ＩｇＧなど）には検出可能なレベルで結合しない。

本明細書では、用語「親和性」は、抗原と抗体の間の誘引力の尺度のことを指す。抗原に対する抗体の内因的誘引効果は、特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性平衡定数（Ｋ_Ｄ）として一般に表される。結合親和性が高い、即ち、Ｋ_Ｄ≦１００ｎＭ（例えば、≦１０ｎＭまたは≦１ｎＭ）である場合、抗体は抗原に特異的に結合すると言われる。例えば、Ｋ_Ｄ結合親和性定数は、例えばＢｉａｃｏｒｅ製のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００を使用する表面プラスモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））によって測定することができる。特定の抗体－抗原相互作用の結合親和性は、例えばＧｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰｌｏｒｅを使用する標準濃度－応答曲線によって示すこともできる。一部の実施形態において、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにおいて本抗体は、Ｋ_Ｄ ２ｎＭ以下でヒトＩｇＧおよびそこから得られるＦａｂ断片に結合するが、カニクイザルＩｇＧに対しては検出可能な結合を示さない。

本明細書に例示される抗体は、ｈＩｇＧおよびそのＦａｂ断片上の３つの違うエピトープに結合する。本明細書では、用語「エピトープ」とは、抗体または二重特異的結合分子のような関連する分子に対して特異的に結合する抗原の部分（決定因子）のことを指す。エピトープの決定因子は、一般にアミノ酸もしくは炭水化物または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面群からなり、特定の３次元構造特性および特定の電荷特性を一般に有する。エピトープは、「直鎖状」であることも「立体配座」であることもできる。直鎖状エピトープにおいて、タンパク質（例えば、抗原）と相互作用分子（抗体など）の間の相互作用点の全ては、タンパク質のアミノ酸一次配列に沿って線状に存在する。立体配座エピトープにおいて、相互作用点は、アミノ酸一次配列中で互いに離れたタンパク質上のアミノ酸残基の間に存在する。抗原上の所望のエピトープが決定されたら、当業者に周知の技術を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能となる。例えば、直鎖状エピトープに対する抗体は、例えば、直鎖状エピトープのアミノ酸残基を有するペプチドで動物を免疫することによって生成される。立体配座エピトープに対する抗体は、例えば、立体配座エピトープの関連するアミノ酸残基を含有するミニドメインで動物を免疫することによって生成される。また、特定のエピトープに対する抗体は、例えば、対象となる標的分子（例えば、ＩｇＧまたはＦａｂ）またはその関連する部分で動物を免疫し、エピトープへの結合に対してスクリーニングすることによって生成される。

競合アッセイ、エピトープビニングおよびアラニンスキャニングを含むが、これに限定されない当業者に公知の方法を使用することによって、抗体が、同じエピトープに結合するか本開示の抗ｈＩｇＧ抗体と結合を競合するか決定することができる。一部の実施形態において、本開示の抗ｈＩｇＧ抗体を飽和条件下でｈＩｇＧに結合させ、次いで、試験抗体がｈＩｇＧに結合する能力を測定する。試験抗体が、参照抗ＩｇＧ抗体と同時にｈＩｇＧに結合できる場合、試験抗体は、参照抗ＩｇＧ抗体と異なるエピトープに結合していることになる。しかしながら、試験抗体が、ｈＩｇＧに同時に結合することができない場合、試験抗体は、本開示の抗ＩｇＧ抗体に結合されるエピトープと同じエピトープ、重なり合うエピトープまたは隣接しているエピトープに結合する。この実験は、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、ＳＰＲ、バイオレイヤー干渉法またはフローサイトメトリーを使用して実行することができる。抗ｈＩｇＧ抗体が、別の抗ＩｇＧ抗体と交差競合するかどうか試験するために、上記競合方法を２方向で使用する、即ち、公知の抗体が試験抗体を遮断するかどうか、およびその逆を決定することができる。競合実験は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００機器を使用して実行することができる。

本明細書に開示される抗ｈＩｇＧ抗体の抗原結合部分は、完全抗体の代わりに使用することができる。用語「抗原結合部分」とは、抗原（例えば、ヒトＩｇＧまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つもしくはそれ以上の部分または断片のことを指す。抗原結合部分の例には、それだけには限らないが、（ｉ）Ｆａｂ断片：ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片：ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１つの腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片；ならびに（ｖｉ）抗原に特異的に結合する能力がある単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子にコードされているが、それらドメインは、組換え方法を使用してＶＬおよびＶＨドメインが対になって１価の分子を形成する１本のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である）とすることができる合成リンカーによって接続することができる。ダイアボディのような一本鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが、１本のポリペプチド鎖上に発現されるが、同一鎖上の２つのドメイン間で対になるには短すぎるリンカーを使用しており、そのためドメインは別の鎖の相補的ドメインと対になることを強いられ、２つの抗原結合部位ができる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、全抗体のパパインもしくはペプシン消化または組換えＤＮＡ技術などの従来通りの技術を使用して全抗体から調製することができる。

本抗体は、ヒトＩｇＧサブタイプｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、およびｈＩｇＧ４のうち１つ、より多く、または全てに結合する。特定の実施形態において、本抗体は前記サブタイプの全てを結合する。本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ由来配列を含むヒト化および／またはキメラ抗体に結合できるものと理解される。

一部の実施形態において、本開示は、抗ｈＩｇＧモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その重鎖ＣＤＲ１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３は、配列番号２７～３２、３３～３８、３９～４４、４５～５０、５１～５６または５７～６２をそれぞれ含む。この抗体のフレームワークは、ウサギまたは別の種（例えば、マウス、ヒトまたはラット）の抗体から得ることができる。

一部の実施形態において、本開示は、抗ｈＩｇＧモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、その重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）は、配列番号１３および１９、１４および２０、１５および２１、１６および２２、１７および２３、または１８および２４をそれぞれ含む。この抗体の定常領域は、ウサギまたは別の種（例えば、マウス、ヒトまたはラット）の抗体から得ることができる。

一部の実施形態において、本開示は：
ａ）配列番号１３および２５のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）ならびに配列番号１９および２６のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
ｂ）配列番号１４および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２０および２６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｃ）配列番号１５および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２１および２６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｄ）配列番号１６および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２２および２６のアミノ酸配列を含むＬＣ；
ｅ）配列番号１７および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２３および２６のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
ｆ）配列番号１８および２５のアミノ酸配列を含むＨＣならびに配列番号２４および２６のアミノ酸配列を含むＬＣ
を含む抗ｈＩｇＧモノクローナル抗体を提供する。

一部の実施形態において、抗ｈＩｇＧ抗体または抗原結合部分は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７または１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＶＨアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態において、抗ｈＩｇＧ抗体または抗原結合部分は、配列番号１９、２０、２１、２２、２３または２４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＶＬアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態において、抗ｈＩｇＧ抗体または抗原結合部分は、配列番号１３および１９、１４および２０、１５および２１、１６および２２、１７および２３または１８および２４に対してそれぞれ少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を有する。

一部の実施形態において、抗ｈＩｇＧ抗体は、リーダー配列を含むもしくは含まない、配列番号６３および６９、６４および７０、６５および７１、６６および７２、６７および７３、または６８および７４をそれぞれ含むＨＣおよびＬＣを有する。

一部の実施形態において、本開示の抗ｈＩｇＧ抗体または抗原結合部分は、抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５または１９Ｂ１のＨＣＤＲ１～３およびＬＣＤＲ１～３、ＶＨおよびＶＬもしくはＨＣおよびＬＣアミノ酸配列を含む。

アミノ酸番号およびＣＤＲの割当ては、Ｋａｂａｔ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９８７年および１９９１年））の定義に従うことができる。上記、Ｚｈａｎｇも参照のこと。

本開示の抗ｈＩｇＧ抗体または抗原結合部分は、誘導体化または別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結することができる。一般に、抗体またはその部分は、ＩｇＧ結合が誘導体化または標識化によって不都合な影響を受けないように誘導体化される。例えば、本開示の抗体または抗体部分は、別の抗体または検出可能な標識もしくはタグなど１つもしくはそれ以上の他の分子的実体に（化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合性会合または別の方法によって）機能的に連結することができる。例には、放射性同位体または放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１５Ｎ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体、フィコエリトリンまたはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素）、酵素的標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポータによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、およびガドリニウムキレートなどの磁気薬剤があるが、これに限定されない。一部の実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサー腕によって付加される。

本開示の本抗ｈＩｇＧ抗体および抗原結合部分は、動物（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどの非ヒト霊長類）由来サンプル中のヒトＩｇＧもしくはＦａｂのレベルを検出および／または測定するのに有用である。一部の実施形態において、本抗体および抗原結合部分を使用して、ヒト由来サンプル中のヒトＩｇＧもしくはＦａｂのレベルを検出および／または測定することができる。適切な検出および測定方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織学などの免疫学的方法がある。一部の実施形態において、本抗体および抗原結合部分を使用して、前臨床もしくは臨床的免疫組織化学（ＩＨＣ）研究のヒト由来サンプル中のヒトＩｇＧもしくはＦａｂのレベルを検出および／または測定することができる。

本明細書に記載されるウサギ抗体は、違うエピトープに結合することができるので、前臨床試験における治療用モノクローナル抗体開発の必要性を満たすために、任意の宿主動物において、ヒトＩｇＧを検出するために単独でまたは２つ１組で使用することができる。例えば、抗体１６Ｆ５、１１Ｆ９および１１Ｇ５／１９Ｂ１／２Ｃ５／９Ｅ６は、ＭＣＡ５７４８Ｇのエピトープとも異なる３つの違うエピトープに結合する。したがって、２つの違うエピトープに結合する抗体から選択される１対を一緒に使用して、例えばアッセイ感度および特異性を増大させることができる。例えば、１６Ｆ５は、１１Ｆ９と一緒に使用することができ；１６Ｆ５または１１Ｆ９は、１１Ｇ５、１９Ｂ１、２Ｃ５または９Ｅ６と一緒に使用することができ；ＭＣＡ５７４８Ｇは、１６Ｆ５、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１９Ｂ１、２Ｃ５および９Ｅ６のいずれか１つと使用できる。対の抗体は、異なって標識される。

抗ｈＩｇＧ抗体の作製
本抗ｈＩｇＧ抗体は、対象となる抗体を産生するウサギＢ細胞を不死化細胞と融合して、抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を形成する周知のハイブリドーマ技術によって作製することができる。

別法として、本ｈＩｇＧ抗体またはその抗原結合部分は、抗体または部分の重鎖および軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を含有する宿主細胞を使用して組換え技術によって作製される。したがって、本開示は、本明細書に記載される抗ＩｇＧ抗体またはその抗原結合部分をコードしている核酸分子および配列も提供する。重鎖および軽鎖アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列は、２つの異なるベクターでまたは同じベクターで宿主細胞に導入される。それらは、１つのプロモーターまたは２つの別々のプロモーターの転写制御下で発現される。

一部の実施形態において、本核酸分子は、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２；または（ｉｉ）配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５もしくは２６をコードしているヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む。

アミノ酸および核酸配列の文脈において、用語「パーセント配列同一性」とは、最大に対応させて整列させた場合に２つの配列内で同一である残基のことを指す。例えば、配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約１８ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、一般には少なくとも約２８ヌクレオチド、より一般には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８またはより多くのヌクレオチドの区間にわたる。アミノ酸およびヌクレオチド配列の同一性を測定するために使用できる当業者に公知の異なるアルゴリズムが多数存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷｉｓｃｏｎｓｉｎのプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。例えば、プログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含めたＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最良の重なりの領域の整列化およびパーセント配列同一性を提供する（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０年）１８３：６３～９８頁；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００年）１３２：１８５～２１９頁；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９６年）２６６：２２７～５８頁；およびＰｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８年）２７６：７１～８４頁を参照のこと；参照によって本明細書に組み入れる）。特に明記しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムに対する初期設定のパラメータが、使用される。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、初期設定のパラメータ（単語サイズ６およびスコア行列にＮＯＰＡＭ因子）でＦＡＳＴＡを使用し、またはＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１に提供される初期設定のパラメータでＧａｐを使用して決定することができ、参照によって本明細書に組み入れる。

特定の実施形態において、本開示は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施形態において、核酸分子は、配列番号１および７、２および８、３および９、４および１０、５および１１、または６および１２のヌクレオチド配列を含む。

上記実施形態のいずれかにおいて、核酸分子は単離される。「単離された」または「精製された」として本明細書に参照される核酸分子は、（１）起源の供給源のゲノムＤＮＡもしくは細胞性ＲＮＡの核酸から分離されている；および／または（２）天然に存在しない核酸である。

さらなる態様において、本開示は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分の鎖の一方または両方を発現するのに適したベクターを提供する。本明細書では用語「ベクター」は、連結された別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を意味する。一部の実施形態において、ベクターは、プラスミド、即ち、追加のＤＮＡ断片がライゲートされるＤＮＡの環状二本鎖片である。更に、特定のベクターは、作動的に連結されている遺伝子の発現を指令する能力がある。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。

本開示は、本明細書に記載の抗ｈＩｇＧ抗体またはその抗原結合部分の重鎖、軽鎖もしくは重鎖と軽鎖両方をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ベクターは、発現制御配列を更に含むことができる。

本明細書では用語「発現制御配列」は、ライゲートされるコード配列の発現およびプロセッシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセッシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強させる配列（即ち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を増強させる配列；必要に応じて、タンパク質分泌を増強させる配列がある。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり；原核生物において、そのような制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を一般に含み；真核生物において、一般に、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現およびプロセッシングに必須である全ての成分を含むことが意図され、その存在が有利となる追加の成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。

一部の実施形態において、本明細書に記載の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常領域をコードしているヌクレオチド配列にインフレームで接続された本明細書に記載の抗ＩｇＧ抗体または抗原結合部分のＶＨドメインをコードしているヌクレオチド配列を含む。同様に、本明細書に記載の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常領域をコードしているヌクレオチド配列にインフレームで接続された本明細書に記載の抗ＩｇＧ抗体または抗原結合部分のＶＬドメインをコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。

本開示のさらなる態様において、ＶＨおよび／またはＶＬをコードしている核酸分子は、全長抗体遺伝子に「変換される」。一部の実施形態において、ＶＨまたはＶＬドメインをコードしている核酸分子は、ＶＨ区分がベクター内のＣＨ区分に作動的に連結されおよび／またはＶＬ区分がベクター内のＣＬ区分に作動的に連結されるように、重鎖定常（ＣＨ）もしくは軽鎖定常（ＣＬ）領域を既にコードしている発現ベクターへそれぞれ挿入されることによって全長抗体遺伝子に変換される。別の態様において、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードしている核酸分子は、標準的な分子生物学的技術を使用してＣＨおよび／またはＣＬ領域をコードしている核酸分子にＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードしている核酸分子を連結する、例えばライゲートすることによって全長抗体遺伝子に変換される。全長重鎖および／または軽鎖をコードしている核酸分子は、導入された細胞から次いで発現され、抗ＩｇＧ抗体が単離される。

一部の実施形態において、フレームワーク領域は、得られるフレームワーク領域が、対応する生殖細胞遺伝子のアミノ酸配列を有するように突然変異される。突然変異を、例えば、抗ＩｇＧ抗体の半減期を増大させるためにフレームワーク領域または定常領域内に作ることができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０を参照のこと。フレームワーク領域または定常領域における突然変異は、抗体の免疫原性を改変するため、および／または別の分子に対する共有結合もしくは非共有結合の部位を提供するために作ることもできる。本開示によると、抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域の任意の１つもしくはそれ以上、または定常領域に突然変異を有することができる。

本開示は、本明細書に記載される抗体組成物および抗体ならびにその抗原結合部分を作製する方法も提供する。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載される抗ＩｇＧ抗体または抗原結合部分の、重鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、および軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を準備する工程と；前記宿主細胞を、抗体または抗原結合部分の発現に適した条件で培養する工程と；得られた抗体もしくは抗原結合部分を単離する工程とを含む、本明細書に記載の抗ＩｇＧ抗体または抗原結合部分を作製する方法に関する。そのような組換え宿主細胞においてそのような発現によって産生される抗体または抗原結合部分は、本明細書において「組換え」抗体または抗原結合部分と称される。本開示は、そのような宿主細胞の後代細胞、およびそれによって産生される抗体または抗原結合部分も提供する。

本明細書では用語「組換え宿主細胞」（または、単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。定義により、組換え宿主細胞は、天然には存在しない。本開示は、例えば、本明細書に記載のベクターを含むことができる宿主細胞を提供する。本開示は、例えば、本明細書に記載される抗ＩｇＧ抗体もしくはその抗原結合部分の重鎖もしくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードしているヌクレオチド配列、または両方を含む宿主細胞も提供する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が、特定の対象細胞だけでなくその細胞の後代も意味することは理解されるべきである。突然変異または環境の影響のいずれかにより、ある程度の修飾が後の世代に存在する可能性があるので、そのような後代は、実際には親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書の用語「宿主細胞」の範囲になお含まれるものとする。

抗ＩｇＧ抗体およびその抗原結合部分をコードしている核酸分子ならびにこれら核酸分子を含むベクターを使用して、適当な哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞をトランスフェクションすることができる。形質転換は、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の公知の方法によることができる。哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチドの導入方法は当業者に周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションがある。加えて、核酸分子は、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞に導入される。

異なる細胞系によってまたはトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化様式を有することになると思われる。しかしながら、本明細書に提供される核酸分子にコードされる、または本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む全ての抗体は、抗体のグリコシル化状態にかかわらず、より一般には翻訳後修飾の有無にかかわらず、本開示の一部である。

本明細書において別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学および技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。典型的な方法および材料について下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料も本開示の実施または試験に使用することができる。矛盾がある場合、定義を含めて本明細書が支配することになる。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、細菌学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医薬および薬学化学、およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法ならびに技術は当業者に周知であり、一般的に使用されるものである。酵素反応および精製技術は、当業者において一般に達成されるまたは本明細書に記載される通り、製造業者の仕様に従って実行される。更に、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書および実施形態の全体を通じて、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載される整数または整数の群を内包するが、他の任意の整数または整数の群を排除しないことを意味すると理解されることになる。本明細書に言及される刊行物および他の参照の全ては、その全体を参照によって組み入れる。本明細書には多くの文献が引用されるが、この引用は、これら文献のいずれかが、当業者に共通の一般的な知見の一部を形成することを承認するものではない。

本開示をよりよく理解できるように、以下の例が述べられる。これらの例は、単なる実例のためのものであり、いかなる様式でも本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきでない。

以下の例は、ヒトＩｇＧ Ｆａｂを使用してウサギを免疫し、脾細胞を単離し、それを使用してヒトＩｇＧ特異的Ｂ細胞を選別する実験について記載する。カウンタースクリーニング剤としてカニクイザルＩｇＧを使用してヒトＩｇＧおよびＦａｂ特異的ｍＡｂクローンを６つ入手した。これらクローンは、より優れた結合親和性を実証し、唯一市販されているマウス起源の抗ｈＩｇＧ ｍＡｂクローンＭＣＡ５７４８Ｇとは異なるエピトープを標的した。これらウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂクローンを、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイによって評価し、カニクイザル血清の存在下で包括的薬物動態学的アッセイにおける捕捉試薬として使用するのに適していることを見出した。本明細書に記載される実験のための材料および方法は、以下の通りである。

化学物質および試薬
これら実験に使用した治療用抗体は、ヒト化治療用モノクローナル抗体ＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）、ヒト化開発候補モノクローナル抗体ＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）および内部研究試薬ヒトＦａｂ（ｈＦａｂ）であった。カニクイザルＩｇＧ（ｃｙｎｏＩｇＧ）を、プロテインＡ親和性精製によってＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎｏｖｉ、ＭＩ ４８３７７）から購入したカニクイザル血清から精製した。マウス抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体ＭＣＡ５７４８Ｇ（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ．（２００９年）４９：１００３～８頁）を、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から購入した。細胞培養培地およびリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入した。他の全ての化学物質は、分析品質であった。

結合特異性を決定するためのＥＬＩＳＡ
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、対照としてｃｙｎｏＩｇＧを使用してヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）に対する結合について抗体クローンの特異性を評価した。ＥＬＩＳＡを、ＰＢＳ中のｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４またはｃｙｎｏＩｇＧで１時間最初にコーティングしたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製マイクロタイタープレート上で、室温で実行した。リン酸緩衝食塩水－ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄した後、プレートをＰＢＳ／３％ウシ血清アルブミンで１時間ブロッキングした。プレートを、次いで再び洗浄し、抗ヒトＩｇＧ抗体クローンと１時間インキュベートした。もう１度の洗浄工程後、結合している抗体を、製造業者の指示に従ってＳｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）製ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ抗体によって検出した。

結合特異性および動態を決定するためのＢｉａｃｏｒｅアッセイ
ウサギ抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体の特異性を、他で記載されている第２のアッセイ系で評価した（Ｃｈｕら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１５年）４：７３６０頁）。これらの実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ製ストレプトアビジンまたはＣＭ５センサチップを使用してＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で実行した。ストレプトアビジンチップへの抗体のコーティングは、製造業者の手引書に従ってＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ａｍｉｎｅ－ＰＥＧ１１－Ｂｉｏｔｉｎ試薬を使用してアミンカップリングしたビオチン化標的抗体を注入することによって達成された。ＣＭ５チップの場合には、標的抗原または抗体を、Ｂｉａｃｏｒｅ製アミンカップリングキットを使用して、標準的なアミンカップリングによってチップ表面にカップリングした。特に明記しない限り、全ての結合および動態アッセイを、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％容積／容積Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）中で、２５℃で実行した。解離定数値（ＫＤ）を、Ｂｉａｃｏｒｅ製ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアＶ４．１を使用して１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いて算出した。

ウサギ免疫化およびＢ細胞クローニング
Ｗｕら、Ｎａｔ Ｃａｎｃｅｒ（２０２０年）１：８６～９８頁に記載されるｈＩｇＧ Ｆａｂを使用して、合計５回の抗原注射で２匹のウサギを免疫した。一次注射には、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を使用し、４回の追加免疫には不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。ＣＦＡとＩＦＡは両方とも、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）製であった。血清力価を、抗原タンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって監視した。より高いＥＬＩＳＡ力価を持つウサギを、脾臓摘出に選択した。

Ｂ細胞の単離のために、新しい脾細胞を脾臓から単離した。およそ１．２×１０^８個の脾細胞を、選別前にＹｕｒｏｇｅｎ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）によってカスタマイズされた特別なＢ細胞培地中で終夜培養した。脾細胞を、ＹｕｒｏｇｅｎのＳＭａｂ（商標）プラットフォームを使用して処理して抗原認識Ｂ細胞を富化した。抗原選別したＢ細胞を、１細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種し、１０～１４日間培養した。

抗原を認識するＢ細胞クローンを同定し、ｈＩｇＧ４をコーティングした直接ＥＬＩＳＡを使用して確認し、精製したｃｙｎｏＩｇＧを、カウンタースクリーニングのためにＥＬＩＳＡに使用した。抗原特異的Ｂ細胞クローンを、陽性／陰性ＥＬＩＳＡシグナル比に従ってランク付けし、選択し、ＩｇＧコード配列の重鎖および軽鎖をＲＴ－ＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を組み合わせ、それを使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞を直接トランスフェクトした。その後、一過性に発現された組換えウサギＩｇＧクローンを、ＥＬＩＳＡならびにＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイによってｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂに対する特異的結合について更に確認した。ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂに対する特異的結合を確認したら、選択した陽性Ｂ細胞からのＰＣＲ産物を哺乳動物発現ベクターにクローニングして、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における抗体産生を拡大した。ＨＥＫ２９３Ｆのトランスフェクションによって産生された組換えウサギｍＡｂクローンを、さらなる評価のためにプロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製した。

Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイ
Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）製Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰｌｏｒｅ、Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ｎＬ ＣＤ、Ｒｅｘｘｉｐ ＡおよびＲｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液を、全ての実験に使用した（Ｆｒａｌｅｙら、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（２０１３年）５：１７６５～７４頁）。ビオチン化捕捉抗体を、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液で０．１～０．２μｇ／μＬに希釈し、Ｂｉｏａｆｆｙ ＣＤの微細構造内のストレプトアビジンビーズカラムに流した。標準曲線および品質管理（ＱＣ）サンプルを、様々な量のカニクイザル血清を含有するＲｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中に、示した範囲でｈＩｇＧ４またはｈＦａｂをスパイクすることによって調製した。標準曲線サンプル、ＱＣサンプル、模擬サンプルおよびアッセイ試薬をＰＣＲプレートに添加し、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）機器にロードした。標準曲線、ＱＣサンプルまたは模擬サンプルの１つの複製を、Ｇｙｒｏｓ機器によって２つのＣＤ微細構造に入れ、次いでビーズカラムに流した。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）から購入したＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、Ｒｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液中に２μｇ／ｍＬで検出試薬として使用した。０．０１％容積／容積Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳの洗浄溶液を各行程前にカラムに流してストレプトアビジンビーズを予め濡らし、アッセイの各工程後に結合していないあらゆる試薬を洗い落とした。サンプル濃度は、１％レベルの光増倍でのデータ収集によって決定した。Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍを使用して、製造業者によって指示される５パラメータフィッティングおよび１／Ｙ２重み付けで結果を分析した。

ヒトＩｇＧ特異的ウサギ抗体クローンの単離
本例は、ヒトＩｇＧとＦａｂの両方を認識するが、カニクイザルＩｇＧを認識しない６つのウサギ抗体クローンを、ウサギＢ細胞クローニング技術を使用して開発した実験について記載する。

ウサギモノクローナル抗体の開発にハイブリドーマスクリーニングと提示方法論を使用したが、その両方が、いくつかの欠点を有しており：ハイブリドーマ技術は、細胞融合の効率が低く、提示方法は、重鎖および軽鎖の天然の同族対を消失する（Ｚｈａｎｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１７年）８：４９４頁）。これらの問題を克服するために、単一Ｂ細胞に基づく抗体遺伝子クローン技術（または、単一Ｂ細胞クローニング）が、最近開発された（Ｓｅｅｂｅｒら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ（２０１４年）９：ｅ８６１８４頁；ＺｉｅｌｏｎｋａおよびＫｒａｈ（編）Ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０７０巻、Ｈｕｍａｎａ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０２０年中のＲａｓｈｉｄｉａｎら、「Ｓｉｎｇｌｅ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｂｂｉｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）。

簡潔には、単一Ｂ細胞クローニングは、（ｉ）抗原に基づくＦＡＣＳ選別によって末梢血またはリンパ組織から特定の単一Ｂ細胞を単離する工程と、（ｉｉ）単一Ｂ細胞を２週間成長させ拡大する工程と、（ｉｉｉ）抗体特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実行して抗体遺伝子を増幅し、配列決定する工程と、（ｉｖ）発現ベクターに抗体遺伝子をクローニングし、哺乳動物細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ細胞）において組換えモノクローナル抗体を産生させる工程と、（ｖ）組換えモノクローナル抗体を精製し、ＥＬＩＳＡおよび他のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって評価する工程とからなる。

ヒトＩｇＧ１ Ｆａｂを使用してウサギを免疫し、得られた脾細胞をヒト化全ＩｇＧ１分子であるビオチン化ｈＩｇＧ１によって選別した。合計５３０個の一次Ｂ細胞を、９６ウェルプレート中に１個の細胞で播種し、２週間成長させた。モノクローナルウサギＩｇＧ抗体を含有するＢ細胞培養培地を、ｈＩｇＧ４、ｈＩｇＧ１およびｃｙｎｏＩｇＧを使用して直接ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。ＥＬＩＳＡ ｈＩｇＧ１／ｃｙｎｏＩｇＧおよびｈＩｇＧ４／ｃｙｎｏＩｇＧシグナル値に基づいて、ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ４ ＯＤ４５０＞０．９とＣｙｎｏＩｇＧ ＯＤ４５０＜０．２両方を有するクローンを１７個選び（表１）、その抗体コード配列をＰＣＲによって増幅した。

これら１７個のクローンのうち１１個において、重鎖と軽鎖両方のＰＣＲ産物を得ることができた。各クローンの重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、１：１の比で組み合わせ、使用してＨＥＫ２９３Ｆ細胞を直接トランスフェクトした。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞の細胞培養培地を、同じＥＬＩＳＡスクリーンアッセイによって更に確認した。表２は、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定したｈＩｇＧ１またはｈＩｇＧ４対カニクイザルＩｇＧ（ｃｙｎｏＩｇＧ）の結合のシグナル比によって示される、全ヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）およびＦａｂに特異的結合するが、ｃｙｎｏＩｇＧには結合しない６つのウサギ組換え抗体クローンの結合を示す。これら６つのクローンは、４．９４～１４．９９の範囲の優れたｈＩｇＧ４／ｃｙｎｏＩｇＧおよびｈＩｇＧ１／ｃｙｎｏＩｇＧ ＥＬＩＳＡシグナル比を呈した。

これらの６つのクローンを、図１に示すようにＢｉａｃｏｒｅによってｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４、ｈＦａｂおよびｃｙｎｏＩｇＧに対する直接結合について更に分析した。６つ全てのクローンが、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂに対して様々なレベルの結合を示したが、ｃｙｎｏＩｇＧに対しては示さなかった。これらデータは、これらのクローンがヒトＩｇＧおよびＦａｂに特異的であるが、ｃｙｎｏＩｇＧには特異的でないことを示す。

ウサギ抗ｈＩｇＧ抗体の配列
６つのクローンの特徴を決定するために、重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、ＤＮＡ配列決定に供した。重鎖および軽鎖それぞれの可変領域の推定アミノ酸配列を、ＥＭＢＬ－ＥＢＩ ｗｅｂベースのＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して整列させた（Ｓｉｅｖｅｒｓら、Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．（２０１１年）７：５３９頁）。図２Ａおよび図２Ｂに示すように、６つ全てのクローンが、重鎖および軽鎖両方について固有のアミノ酸配列を保有した。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａに基づく系統樹を構築して、相対的距離を可視化した（図２Ｃ）。特に、クローン１６Ｆ５は、重鎖および軽鎖両方で他の５つのクローンと大きく分岐していた、一方クローン１１Ｆ９は、重鎖において次に分岐しているクローンであるが、軽鎖では分岐していなかった。

表３は、抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５および１９Ｂ１（配列：配列番号）をコードしているヌクレオチド配列を示す。

表４は、抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５および１９Ｂ１の可変ドメインの推定アミノ酸配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）を太字にし、下線を引く。

表５は、６つの抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５ならびに１９Ｂ１の重鎖および軽鎖定常領域アミノ酸配列（それぞれＣＨおよびＣＬ）を示す。

表６は、抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５ならびに１９Ｂ１の重鎖ＣＤＲ（ＨＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲ（ＬＣＤＲ）のアミノ酸配列を示し、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って定義した。配列の配列番号を、括弧内に示す。

表７は、抗体２Ｃ５、９Ｅ６、１１Ｆ９、１１Ｇ５、１６Ｆ５および１９Ｂ１の配列番号情報を示す。「ｎｔ」（ヌクレオチド）によって示した場合を除いて、表中の配列は全てアミノ酸配列である。

ウサギ抗ｈＩｇＧ抗体の結合親和性およびエピトープ
重鎖および軽鎖抗体コード配列を含有する増幅されたＰＣＲ産物を、発現ベクターにクローニングし、一過性トランスフェクションおよび抗体精製に使用した。アミンカップリングを使用して、マウス抗ウサギｍＡｂをＣＭ５チップ上に直接固定化した（Ｃｈｕら、Ｓｃｉ Ｒｅｐ．（２０１５年）４：７３６０）。精製したウサギｍＡｂクローンを次いで注入し、その後８０～０ｎＭの範囲で１：２に段階希釈したｈＦａｂ、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４およびｃｙｎｏＩｇＧを流した。

表８に例示した通り、全てのクローンが、ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ４およびｈＦａｂに対してサブナノモルより強い結合親和性（ＫＤ）を呈したが、ｃｙｎｏＩｇＧに対しては呈さなかった。しかしながら、同じ条件下で対照の市販のクローンＭＣＡ５７４８Ｇ（Ｂｉｏ－ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）は、ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ４に結合できたが、ｈＦａｂおよびｃｙｎｏＩｇＧには結合できなかった。

６つのウサギ抗ｈＩｇＧクローンが、唯一市販されているクローンＭＣＡ５７４８Ｇと異なるエピトープを有するかどうか決定するために、ＭＣＡ５７４８Ｇ、１９Ｂ１および１１Ｆ９クローンならびにマウス抗ｈＩｇＧ ｍＡｂ（アッセイ対照）を、ビオチン化した。これらビオチン化抗体を、ストレプトアビジンチップの異なるフローセルに次いで注入して、５００～６００ＲＵの範囲に到達させ、続いて競合剤である異なるウサギｍＡｂクローン２４０ｎＭの存在下で、８０～０ｎＭの範囲で１：２に段階希釈したｈＩｇＧ１抗体を流した。図３Ａおよび図３Ｂに示す通り、ＭＣＡ５７４８Ｇをチップ表面の捕捉抗体として使用した場合、競合は、クローンＭＡＣ５７４８Ｇ自体でのみ見られ、このことは、この市販のマウス抗ｈＩｇＧクローンＭＡＣ５７４８Ｇが、本明細書に開示されるウサギ抗ｈＩｇＧクローンの６つ全てと異なるエピトープを有することを示した。

ウサギ抗ｈＩｇＧクローン１９Ｂ１をチップ表面の捕捉抗体として使用した場合、競合は、クローン１１Ｇ５、１９Ｂ１、２Ｃ５および９Ｅ６で見られた。したがって、これら４つのクローンのエピトープは、同一であるが、クローン１１Ｆ９および１６Ｆ５とは異なった。更に、クローン１１Ｆ９をチップ表面に捕捉した場合、競合は、クローン１１Ｆ９自体とのみ見られ、クローン１６Ｆ５では見られず、また、同じエピトープを共有している他の４つのクローンのいずれでも見られなかった。したがって、クローン１６Ｆ５も、クローン１１Ｆ９と異なるエピトープを有した。これらの結果は、クローン１６Ｆ５および１１Ｆ９それぞれが、固有のエピトープを有し、一方でクローン１１Ｇ５、１９Ｂ１、２Ｃ５および９Ｅ６が、同じエピトープを共有することを示した。ＣＤＲ内のパラトープは、抗体結合エピトープを決定し、重鎖が、支配的な役割を演じ、６つのウサギ抗ｈＩｇＧクローンのエピトープ分類は、系統樹の関係とよく相関している（図２Ｃ）。

追加のＢｉａｃｏｒｅ実験は、６つ全てのウサギ抗ｈＩｇＧクローンが、試験した異なる１０個のヒトＩｇＧおよび２つのＦａｂのそれぞれに結合する能力があることを示した。１０個の抗体は、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ４を有するものを含んだ。Ｆａｂを免疫原として使用してこれらウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂクローンを生成したので、その全てが、ＩｇＧのＦａｂ領域内に結合するべきである。異なるヒトＩｇＧサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）は、Ｆａｂ領域の部分ではないＦｃ配列によって分類されるので、ウサギ抗ｈＩｇＧ抗体クローンの６つ全てが、ヒトＩｇＧの全てのサブタイプを認識できるべきである。これらのウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂが、前臨床試験および／または開発過程において異なるサブタイプの治療用ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４）分子の検出に使用される場合、これは大きな利点となる。

要約すると、アミノ酸配列の整列化は、本明細書で得た６つのクローン全てが、固有であり多様性があることを示した。それらは、３つの異なるエピトープ群（１６Ｆ５；１１Ｆ９；および１１Ｇ５／１９Ｂ１／２Ｃ５／９Ｅ６）に結合し、より優れた結合親和性を実証し、唯一市販されているマウス起源の抗ｈＩｇＧ 抗体クローンＭＣＡ５７４８Ｇとは異なるエピトープを標的した。異なる結合エピトープを持つクローンを使用して、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡおよびＧｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイのような、ペアワイズヒトＩｇＧ検出アッセイを開発することができる。

Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおけるウサギ抗体によるヒトＩｇＧの特異的検出
ウサギ抗ｈＩｇＧ ｍＡｂが、サル血清の存在下でヒトＩｇＧ分子を検出できるかどうか試験するために、ビオチン化クローン１６Ｆ６を、捕捉試薬として最初に使用した。Ｇｙｒｏｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）製Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）ｘＰｌｏｒｅ、Ｂｉｏａｆｆｙ １０００ｎＬ ＣＤ、Ｒｅｘｘｉｐ ＡおよびＲｅｘｘｉｐ Ｆ緩衝液を、全ての実験に使用した。ビオチン化捕捉抗体を、Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液で０．１～０．２μｇ／μＬに希釈し、Ｂｉｏａｆｆｙ ＣＤの微細構造内のストレプトアビジンビーズカラムに流した。標準曲線および品質管理（ＱＣ）サンプルを、０、４％、１０％および２５％カニクイザル血清と混合したＧｙｒｏｌａｂ（商標）Ｒｅｘｘｉｐ Ａ緩衝液中に、示した範囲でｈＩｇＧ４またはｈＦａｂをスパイクすることによって調製した。ヒトＩｇＧ４抗体ｈＩｇＧ４を使用して、アッセイマトリックスにおいて１２００～０．３ｎｇ／ｍＬの範囲で１：４希釈の標準曲線を調製した。

図４Ａに示すように、１２００～０．３ｎｇ／ｍＬの範囲で、いかなるマトリックス効果もカニクイザル血清濃度０～４％で観察されなかった。アッセイマトリックスが、１０％および２５％のカニクイザル血清を含有した場合、いくらかの僅かなバックグラウンドシグナルが、標準曲線の下半分で観察された。したがって、４％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスを、同じ標準曲線を使用して３つのＱＣ（７５０、４０および０．６ｎｇ／ｍＬ ｈＩｇＧ４）で更に試験した。図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、典型的な標準曲線が得られ、３つのＱＣのうち２つは、＜２０％バイアスと＜２０％ ＣＶの両方を満たしたが、高いＱＣは、バイアスのカットオフを０．９％だけ外れ（２０．９％）、そのＣＶは典型的であった（４．５６％）。

Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおいて捕捉試薬として使用される他のウサギ抗ｈＩｇＧクローンの適合性を更に試験した。市販のマウス抗ｈＩｇＧ ｍＡｂ ＭＣＡ５７４８Ｇクローンと同様に６つ全てのウサギ抗ｈＩｇＧクローンをビオチン化し、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおいて類似の濃度で使用した。Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）の包括的ＰＫアッセイ捕捉試薬を対照として使用した。図５Ａおよび図５Ｂに示すように、全抗体分子ｈＩｇＧ４を標準として使用した場合（同じ範囲１２００～０．３ｎｇ／ｍＬ）、全ての捕捉試薬は、濃度依存的曲線を生成し、市販のクローンＭＣＡ５７４８Ｇで最も高いバックグラウンドが見られた。しかしながら、Ｆａｂ抗体分子ｈＦａｂを標準として使用した場合（同じ範囲１２００～０．３ｎｇ／ｍＬ）、６つ全てのウサギ抗ｈＩｇＧ捕捉試薬が、同様に濃度依存的曲線を生成した。それに対し、市販のマウス抗ｈＩｇＧクローンＭＡＣ５７４８Ｇおよび対照Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）捕捉試薬は、濃度依存的曲線を作製することができなかった。

Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおけるウサギｍＡｂクローンのダイナミックレンジ
Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイの１つの優位性は、ＥＬＩＳＡおよびＭＳＤのような表面ベースのアッセイプラットフォームと比較して有意により大きいダイナミックレンジを示すということである（Ｆｒａｌｅｙら、Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ（２０１５年）５：１７６５～７４頁）。ヒト全抗体ｈＩｇＧ４を再び使用して、表９に示すように５０００～０．３２ｎｇ／ｍＬの範囲で１：５希釈の線形の６点アッセイ標準を調製した。

類似のＧｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイ手順を実行し、データを次いで抽出し、比較した。上限（５０００ｎｇ／ｍＬ）において、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）捕捉ならびにウサギｍＡｂクローン９Ｅ６、２Ｃ５および１９Ｂ１は全て許容可能なバイアス（＜２０）および１００より大きいシグナル対ノイズ比を有した。３つのウサギ抗ｈＩｇＧクローンは、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）捕捉より優れたシグナル対ノイズ比を示した。５０００ｎｇ／ｍＬの高い終点において、クローン１１Ｇ５は許容可能な平均バイアスを有したが、そのシグナル対ノイズ比は低く（６３．３％）、それは比較的高いブランクシグナルレベル（７．４）に起因した。同じ理由から、市販のｍＡｂクローンＭＣＡ５７４８も、上限でシグナル対ノイズ比は非常に悪かった（２４．０）。

これらデータは、クローン９Ｅ６、２Ｃ５および１９Ｂ１が、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）捕捉試薬と比較した場合により優れたシグナル対ノイズ比で類似のダイナミックレンジを示すことを示唆した。クローン９Ｅ６、２Ｃ５および１９Ｂ１による検出のダイナミックレンジは、市販のマウス抗ｈＩｇＧクローンＭＣＡ５７４８Ｇより有意に優れていた。クローン１６Ｆ５および１１Ｆ９は、０～１０００ｎｇ／ｍＬにおいて平均バイアス＜２０％でよく機能したが、５０００ｎｇ／ｍＬデータ点においては機能しなかった。このことは、これら２つのクローンが、他の４つのクローンとは異なる結合エピトープを保有するという事実による可能性がある。

したがって最初のＧｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおいて、捕捉試薬としてクローン１６Ｆ５を使用して本実験を実行した場合、濃度依存的アッセイ曲線が、カニクイザル血清を最高２５％含有するアッセイマトリックスで生成された。アッセイは、４％カニクイザル血清を含有するアッセイマトリックスで、０．３０～１２００ｎｇ／ｍＬの範囲で良く機能した。拡張したＧｙｒｏｌａｂ（商標）評価アッセイにおいて、６つ全てのウサギｍＡｂクローンが、全ヒトＩｇＧとＦａｂ分子両方の検出のための捕捉試薬として機能を果たす能力を実証した。しかしながら、２つの対照捕捉試薬、Ｇｙｒｏｓ捕捉試薬および市販のクローンＭＣＡ５７４８Ｇは、全ヒトＩｇＧしか検出できず、Ｆａｂ分子は検出できなかった。

表１０に要約した通り、カニクイザルＩｇＧに結合せずに全ヒトＩｇＧ分子とＦａｂ分子両方に結合できるウサギ抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂクローンを６つ開発した。これら６つのクローンは、３つの異なるエピトープ群に属し、市販のクローンＭＣＡ５７４８Ｇとは異なった。これらクローンのそれぞれを、Ｇｙｒｏｌａｂ（商標）アッセイにおいてヒトＩｇＧおよびＦａｂを検出するために試験し、そのうちの３つは、より大きいダイナミックレンジおよびシグナル対ノイズ比を呈した。

ＰａｎｄＡアッセイのための包括的陽性対照としてのウサギ抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体クローンの使用
ウサギポリクローナル抗薬物抗体（ｐＡｂ）は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）検出のための成績対照として一般に使用される。しかし、ｐＡｂの生成には時間を要し、実験動物を繰り返し使用する必要がある。更に、ｐＡｂは、対照として低い感度をしばしば示す。本実施例は、ＰａｎｄＡアッセイにおいて、組換えにより作製された２つのウサギ抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂ、２Ｃ５および１１Ｇ５と陽性対照としての市販のマウス抗Ｆｃ ｍＡｂ（ＪＤＣ－１０；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号９０４０－０１）とを比較する研究について記載する。

２Ｃ５および１１Ｇ５をＪＤＣ－１０とともにサル血漿プール中に５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬでそれぞれ希釈した。

希釈した抗体を含有する血漿サンプルを、過剰な薬物（ヒトＩｇＧ４アイソタイプのモノクローナル抗体；１０～５０μｇ／ｍＬ）を含有するアッセイ緩衝液（３００ｍＭ酢酸、２％ ＢＳＡ）に１：５に最初に希釈し、ポリプロピレンプレート中で、４５０ｒｐｍで、３７℃で１時間インキュベートして、薬物とサンプル中の添加した抗体の間で複合体を形成させた。その後、各サンプルにホウ酸塩（ｐＨ８．０）中の３％ ＰＥＧを添加し、２～８℃で終夜インキュベートした。各サンプルにおけるＰＥＧ緩衝液の終濃度は、１．５％であった。

翌日、プレートを４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、ペレット内に複合体を沈殿させた。ペレットを、ホウ酸塩（ｐＨ８．０）中の１．５％ ＰＥＧで再懸濁し、４０００ｒｐｍで２０分間、２回目の遠心分離をした。洗浄サイクルを３回繰り返した。最後の遠心分離後、各サンプルを、３００ｍＭ酢酸１００μＬ中に懸濁し、１：１０（サンプル２０μＬ＋酢酸１８０μＬ）に更に希釈して、最終サンプル希釈１：５０にした。希釈したサンプルを、ＭＳＤ Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄプレートのウェルにウェル当たり２５μＬで複製して添加し、４５０ｒｐｍで振盪しながら、２４℃で１時間インキュベートした。

インキュベーション後、プレートを、１×プレート洗浄緩衝液で洗浄し、振盪しながらＰＢＳ中の３％ミルクを用いて２４℃で１時間ブロッキングした。プレートを、次いで洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬスルホ－ＴＡＧ－Ｄｒｕｇをサンプルに添加し、振盪しながら２４℃で１時間インキュベートした。最終のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ中の０．０５％ Ｔｗｅｅｎで洗浄した。読み取り緩衝液Ｔ ２×を次いで添加し、プレートを、Ｓｅｃｔｏｒ ＰＲ２４００によって読み取った。各サンプルにおいて電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルは、抗薬物抗体に比例した。

図６Ａおよび表１１に示すように、２つのウサギ抗ｈＩｇＧクローン２Ｃ５および１１Ｇ５は、市販の抗Ｆｃ ｍＡｂクローンＪＤＣ－１０と比較してより大きいダイナミックレンジおよび感度を実証した。

クローン２Ｃ５および１１Ｇ５も成績対照としての機能を果たし、ヒト、ラット、サルならびにマウスの血漿および血清マトリックスにおいて試験した。このデータは、２Ｃ５（図６Ｂ）と１１Ｇ５（図６Ｃ）の両方が、ヒト、サル、マウスおよびラット血清を区別することができ、２Ｃ５が、１１Ｇ５より高感度であることを示す（表１２）。ヒトマトリックスにおいて、バックグラウンドは、予想通り両方のクローンで増大した。

上記の結果は、組換えにより作製されたウサギ抗ヒトＩｇＧ ｍＡｂが、前臨床アッセイ、特にＰａｎｄＡフォーマット（例えば、サル、ラットおよびマウスマトリックス）のための優れた包括的陽性対照となることを実証した。これら抗体は、血漿と血清両方のマトリックスにおいてよく機能した。ウサギＩｇＧ ｍＡｂのダイナミックレンジおよびアッセイ感度は改善された。

Claims (20)

1. ヒトＩｇＧに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
   前記抗体または部分は、
   配列番号２７～３２、
   配列番号３３～３８、
   配列番号３９～４４、
   配列番号４５～５０、
   配列番号５１～５６または
   配列番号５７～６２
   をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３および軽鎖ＣＤＲ１～３を含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
2. 前記抗体または部分は、
   配列番号１３および１９、
   配列番号１４および２０、
   配列番号１５および２１、
   配列番号１６および２２、
   配列番号１７および２３、または
   配列番号１８および２４
   をそれぞれ含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）ならびに軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
3. 前記抗体は、ウサギＩｇＧ抗体である、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体。
4. 配列番号２５の重鎖定常領域アミノ酸配列および／または配列番号２６の軽鎖定常領域アミノ配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
5. リーダー配列を含むもしくは含まない、
   配列番号６３および６９、
   配列番号６４および７０、
   配列番号６５および７１、
   配列番号６６および７２、
   配列番号６７および７３、または
   配列番号６８および７４
   のアミノ酸配列をそれぞれ有する重鎖ならびに軽鎖を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
6. 検出可能な標識を更に含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
7. 水性緩衝溶液中に請求項１～６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分を含む、組成物またはキット。
8. 請求項１～６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分の前記重鎖、前記軽鎖もしくは両方をコードしている単離された核酸分子。
9. 配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１および／または１２を含む、請求項８に記載の核酸分子。
10. 配列番号１および７、
    配列番号２および８、
    配列番号３および９、
    配列番号４および１０、
    配列番号５および１１、または
    配列番号６および１２
    を含む、請求項９に記載の核酸分子。
11. 請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現構築物。
12. 請求項１～６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分の重鎖および軽鎖をコードしているヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
13. 前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
14. 抗体もしくは部分の重鎖および軽鎖の発現が可能な条件下で請求項１３に記載の宿主細胞を培養する工程と、培養細胞または細胞培養の上清から前記抗体もしくは部分を単離する工程とを含む、抗体もしくはその抗原結合部分を作製する方法。
15. サンプルを請求項１～６のいずれか１項に記載の１つもしくはそれ以上のモノクローナル抗体または抗原結合部分と接触させる工程を含む、サンプル中のヒトＩｇＧまたはその断片を検出する方法。
16. 前記サンプルは、ヒトＩｇＧ定常領域を含む抗体またはその断片を投与された動物から入手される、請求項１５に記載の方法
17. 前記ヒトＩｇＧ定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域である、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記動物は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常領域を含む抗体のＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２断片を投与される、請求項１５または１６に記載の方法。
19. 前記サンプルは、組織サンプル、場合により血液、血清または血漿サンプルである、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記動物は、非ヒト霊長類、場合によりカニクイザルまたはアカゲザルである、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。

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