JP2002277469A - 血清中の前立腺特異的膜抗原の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 体液中の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の
検出方法を提供する。 【解決手段】 体液中のＰＳＭＡを検出する方法であっ
て、ＰＳＭＡ抗体を使用して、ＰＳＭＡを含む体液サン
プルからＰＳＭＡを捕捉する工程、及び、捕捉したＰＳ
ＭＡを、抗α_１−抗キモトリプシン抗体を用いて検出す
る工程、を含み、ＰＳＭＡを免疫アッセイにより検出す
ることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野及び従来の技術】本出願は同時
係属している米国出願第０９／６２４，６９２号（２０
００年７月２４日出願）の一部継続出願である。前立腺
特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のモニターが前立腺癌の検出
及び処置にとって望ましいことがだんだん明らかになっ
てきている。前立腺癌は米国の男性において最も発症率
の高い癌である。前立腺癌の早期検出の効率は、前立腺
特異的抗原（ＰＳＡ）についての血清テストを用いて増
加してきた。しかしながら、ＰＳＡは組織特異的でもな
く疾患特異的でもない。前立腺のその他多くの状態、良
性の中のあるものは、血清中のＰＳＡレベルの異常な上
昇を引き起こすことができる（Ｐｏｌａｓｃｉｋら，Ｐ
ｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：
Ａ ｄｅｃａｄｅ ｏｆ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−ｗｈａ
ｔ ｗｅ ｈａｖｅ ｌｅａｒｎｅｄ ａｎｄ ｗｈｅ
ｒｅ ｗｅａｒｅ ｇｏｉｎｇ，Ｊ．Ｕｒｏｌ，ｖｏｌ
１６２，ｐｐ ２９３−３０６，１９９９）。前立腺
特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は細胞内ドメイン及び細胞外
ドメインの両方を有する膜貫通型糖タンパク質であり、
前立腺組織に高度に特異的である（Ｉｓｒａｅｌｉら，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｃｏ
ｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖ
ｏｌ ５３，ｐｐ ２２７−２３０，１９９３）。ＰＳ
ＭＡは、良性及び悪性の前立腺上皮で発現し、免疫組織
化学的に検出することができる（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃ
ｚら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ｔｏ ａ ｎｅｗａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｍａｒｋｅｒ
ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃ
ｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔ
ｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ａｎｔｉｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ ７，ｐｐ ９２７−９３
６，１９８７；Ｓｉｌｖｅｒら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓ
ｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍ
ａｌｉｇｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｃｌ
ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖｏｌ ３，ｐｐ ８１
−８５，１９９７；Ｗｒｉｇｈｔら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍ
ｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｉｎ ｎ
ｏｒｍａｌ，ｂｅｎｉｇｎ，ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎ
ｔ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｕｒｏｌ Ｏ
ｎｃｏｌ，ｖｏｌ １，ｐｐ １８−２８，１９９５；
Ｂｏｓｔｗｉｃｋら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｉｎｔｒａｅ
ｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ａｎｄ ａ
ｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ
１８４ ｃａｓｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ ８２，ｐ
ｐ２２５６−２２６１，１９９８及びＳｗｅａｔら，Ｐ
ｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓ ｇｒｅ
ａｔｅｓｔ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ａｄｅｎｏｃａ
ｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｍｅ
ｔａｓｔａｓｉｓ，Ｕｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ ５２，ｐ
ｐ ６３７−６４０，１９９８）。ＰＳＭＡの血清レベ
ルは進行型の疾患を患う前立腺癌患者における徴候の有
意性（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃ
ｅ）であることが提案されてきている。例えば、Ｇｒａ
ｓｓｏら，Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｎｅｓｔｅｄ ＲＴ−Ｐ
ＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｓｔａｔ
ｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇ
ｅｎ ｉｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔ
ｉｅｎｔｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈ ｐａｔ
ｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔａｇｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ｖｏｌ ５８，ｐｐ １４５６−１４５
９，１９９８を参照のこと。

【０００２】血清中のＰＳＭＡを確実に検出する試みは
成功しておらず、現在、前立腺癌患者の血清中のＰＳＭ
Ａレベルをモニターするために利用することができるル
ーチンな方法論は存在していない。ヒト前立腺組織にお
けるＰＳＭＡ発現は、７Ｅ１１．Ｃ５−抗体を用いた免
疫組織化学的染色によりはじめて考証された（前出、Ｈ
ｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚら）。ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣ
ａＰ）に対して産生された７Ｅ１１．Ｃ５モノクローナ
ル抗体は、ＰＳＭＡのアミノ末端近くの細胞内エピトー
プに結合することが知られている。ＣＹＴ−３５６と命
名された７Ｅ１１．Ｃ５のアイソトープコンジュゲート
形態は、局所及び遠位（ｄｉｓｔａｎｔ）の前立腺癌の
転移及び再発の同定に利用されてきた。７Ｅ１１．Ｃ５
抗体は、ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０４９４でアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）に寄託されている。
ＰＳＭＡの免疫反応性は、良性の前立腺肥大（ＢＰＨ）
及び正常細胞と比較して高度な前立腺腫瘍において高い
ことが見いだされた（前出、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ
ら；前出、Ｓｉｌｖｅｒら；前出、Ｗｒｉｇｈｔら；前
出、Ｂｏｓｔｗｉｃｋら及び前出、Ｓｗｅａｔら）。し
かしながら、前出、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚらにより試
験された３３の細胞系の中では、前立腺のリンパ節癌
（ＬＮＣａＰ）細胞においてのみＰＳＭＡの免疫反応性
が検出された。１９９７年、米国食品医薬品庁は、局在
的前立腺癌の検出のための７Ｅ１１．Ｃ５のラジオイム
ノコンジュゲート形態（ＣＹＴ３５６）の使用を承認し
た。前立腺癌患者の血清中のＰＳＭＡをウエスタンブロ
ット分析により測定する試みは確証的なものではない
（Ｔｒｏｙｅｒら，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏ
ｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａ
ｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｅｘｔｒ
ａｃｔｓ ａｎｄ ｂｏｄｙ ｆｌｕｉｄｓ，Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ ６２，ｐｐ ５５２−５５
８，１９９５；Ｒｏｃｈｏｎら，Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｂｌ
ｏｔ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ
ｓｅｒｕｍ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ
ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，ｖｏｌ ２
５，ｐｐ ２１９−２２３，１９９４及びＢｅｃｋｅｔ
ｔら，Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂ
ｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎｓｅｒ
ａ ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｍｅｎ ａｎｄ ｐａ
ｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｂｅｎｉｇｎ ｐｒｏｓｔａ
ｔｅ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｏｒ ｐｒｏｓｔａｔ
ｅ ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，
ｖｏｌ ５，ｐｐ ４０３４−４０４０，１９９９）。
ウエスタンブロット分析は、後期Ｃ_１、Ｄ_１及びＤ_２前
立腺癌患者において健常者よりも血清ＰＳＭＡレベルが
増加していることを示すことができることが報告されて
いる（前出、Ｒｏｃｈｏｎら）。一方、前出、Ｔｒｏｙ
ｅｒらは、前立腺癌患者の血清中のＰＳＭＡを検出する
ことができなかったことを報告している。前出、Ｂｅｃ
ｋｅｔｔらは、血清中のＰＳＭＡを検出することができ
たが、疾患の初期と後期とを区別することができなかっ
たことを報告している。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】本発明よりも前においては、前立腺癌を検出す
るために単純なＥＬＩＳＡを使用する試みは成功してい
なかった。「競合阻害」ＥＬＩＳＡにおいて、ＰＳＭＡ
は前立腺癌患者由来の血清の４６％で検出され、ＢＰＨ
又は健常者においては検出されなかった（前出、Ｈｏｒ
ｏｓｚｅｗｉｃｚら）。このことは、決定的な試験につ
いて明らかに十分な信頼性である。同時係属している米
国特許出願第０９／６２４，６９２号（２０００年７月
２４日出願）に記載されているように、本発明者等の過
去の研究において、ＰＳＡはチオフィリック（Ｔｈｉｏ
ｐｈｉｌｉｃ）ゲル（１Ｓ、２Ｓ及び３Ｓ）に対して強
いアフィニティーを有することが示された。最近、本発
明者等は、ＰＳＭＡもＴ−ゲルに対しても強いアフィニ
ティーを有するという観察結果を得た。要約すると、Ｔ
−ゲルスラリーをカラム（０．５×５ｃｍ）に充填し、
１Ｍ 硫酸ナトリウムを含有する２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ
緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化する。ＰＳＭＡ源、例えば
ＬＮＣａＰ細胞（５×１０^７細胞／ｍｌ）由来の可溶化
細胞抽出物又はヒト血清（４００μｌ）を、カラム平衡
化緩衝液を用いて再構成し、これをカラムに適用する。
次いでカラムを約１０空隙容量のカラム平衡化綴衝液で
洗浄し、結合したタンパク質を２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩
衝液、ｐＨ７．０を用いて溶離する。種々のカラム画分
中のＰＳＭＡの存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びモノクロ
ーナル抗ＰＳＭＡ抗体、例えば７Ｅ１１．Ｃ５を用いた
ウエスタンブロット分析により検出する。例として、画
分の電気泳動を、４〜１５％勾配のポリアクリルアミド
ゲル中の非還元条件下で行った。サンプルを、比較可能
なタンパク質レベルを含有する等量でロードし、２００
ボルトで４０分間泳動にかけた。電気泳動後、ゲル中の
タンパク質を、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤ
Ｆ）膜へ電気泳動的に移した。移動用緩衝液は２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ グリシン及び２０％ メタノ
ールを含み、ｐＨ８．３であった。移動は１００ボルト
で１時間行った。移動後、膜を、穏やかに攪拌した広範
に機能するタンパク質をベースとするブロッカー中で１
時間ブロックした。前記のブロッカーはアルブミン、カ
ゼイン又はドライミルク溶液を含んでいる。前記のブロ
ッカーはＮＡＰ−Ｓｕｒｅ ｂｌｏｃｋｅｒ（登録商
標）（Ｇｅｎｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）として商業的に入手することが
できる。免疫染色は、ＮＡＰ−Ｓｕｒｅ ｂｌｏｃｋｅ
ｒ（登録商標）（Ｇｅｎｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で濃度５μｇ／ｍｌ
に希釈した７Ｅ１１．Ｃ５抗体又はα_１−抗キモトリプ
シンに対するモノクローナル抗体を用いて１時間行っ
た。二次抗体、セイヨウワサビペルオキシダーゼをコン
ジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を１
％ アルブミン／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で
１：５０００に希釈したものを、膜と共に４５分間イン
キュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼに対
する強化ルミノール（ＥＣＬ）試薬を用いてタンパク質
を検出した。前記の試薬は商標名ＮＥＬ１０２（ＮＥ
Ｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の下で入手可能である。複合
タンパク質をＸ線フィルムに曝露し、陽性のバンドを可
視化した。

【０００４】本発明は、イムノアッセイにより前立腺特
異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を含む体液サンプル中のＰＳＭ
Ａを検出する方法であって、サンプル由来のＰＳＭＡを
ＰＳＭＡ抗体を用いて捕捉する工程及び捕捉したＰＳＭ
Ａを抗−α_１−抗キモトリプシン抗体を用いて検出する
工程を含む方法を含んでいる。好ましい態様において、
ＰＳＭＡは、抗ＰＳＭＡ抗体の適切な希釈物を使用する
工程、得られた溶液を用いて表面、例えばマイクロタイ
タープレート中のウェル表面をコーティングする工程、
前記表面上の非特異的部位をブロッキング溶液、例えば
アルブミンでブロックする工程、サンプルをブロッキン
グ緩衝液、例えば緩衝化アルブミンで希釈する工程、及
び、希釈したサンプルを前記表面に適用してＰＳＭＡを
捕捉する工程により捕捉される。体液は好ましくは血清
であるが、その他の液体、例えば尿であってもよい。捕
捉したＰＳＭＡを検出するための好ましい態様は、前記
表面を洗浄することにより非捕捉物質を除去する工程、
ブロッキング溶液、例えばアルブミン溶液中で希釈した
抗−α_１−抗キモトリプシン抗体を適用する工程、及
び、結合したＰＳＭＡを二次抗体、例えばペルオキシダ
ーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ及び基質、例えばＯ−フ
ェニレンジアミン（ＯＰＤ）を用いて検出する工程を含
んでいる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本明細書で使用する「ＰＳＭＡ」
とは、前立腺腫瘍及びＬＮＣａＰ細胞膜に存在し、α_１
抗キモトリプシン（ＡＣＴ）と複合体を形成する抗原で
ある。「抗α_１抗キモトリプシン抗体」（抗ＡＣＴ抗
体）とは、α_１抗キモトリプシンと特異的に複合体を形
成する抗体である。本明細書で使用する「ＰＳＭＡ抗
体」とは、ＰＳＭＡを選択的に捕捉する抗体を意味す
る。ＰＳＭＡ抗体の例は７Ｅ１１．Ｃ５（ＡＴＣＣ寄託
番号ＨＢ−１０４９４、米国特許第５，１６２，５０４
号）及びＢ−６（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３１６０）
である。「ブロッキング溶液」とは、非特異的結合部位
をブロックするために使用する広範囲の抗原を有するブ
ロッキング化合物を含む溶液である。最も一般的なブロ
ッキング溶液はアルブミン、通常はウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）の溶液である。その他のブロッキング化合
物、例えばミルク固形物、カゼイン又は混合した多糖を
使用してブロッキング溶液を形成してもよい。「ブロッ
キング緩衝液」とは、緩衝化ブロッキング溶液である。
最も一般的な緩衝液はリン酸緩衝液である。特定の抗体
による検出のためにブロッキング溶液を１以上の工程で
使用する場合、通常は同一のブロッキング化合物がブロ
ッキング溶液中に存在する。５５名の前立腺癌患者由来
の血清サンプル、前立腺炎と診断された患者由来の９つ
のサンプル、ＢＰＨ患者由来の４６のサンプル及び健常
者ドナー由来の２０の血清サンプルを、ＰＳＭＡを選択
的に保持するチオフィリック吸着クロマトグラフィーに
より処理した。単離したＰＳＭＡをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
び７Ｅ１１．Ｃ５抗体を用いたウエスタンブロットによ
り分析した。ウエスタンブロット分析におけるＰＳＭＡ
検出の前に、血清サンプルをチオフィリックゲルクロマ
トグラフィーにより処理することは必須である。しかし
ながら、ＥＬＴＳＡによるＰＳＭＡ決定の場合、チオフ
ィリックゲルクロマトグラフィー工程は要求されない。
どんな処理をすることなくＰＳＭＡを血清中でモニター
することができる。

【０００６】二重決定（ｄｏｕｂｌｅ ｄｅｔｅｒｍｉ
ｎａｎｔ）ＥＬＩＳＡは、ＰＳＭＡに対する「捕捉」抗
体としてのＰＳＭＡ抗体及び「検出」抗体としてのポリ
クローナル抗−α_１−抗キモトリプシン抗体を用いて開
発された。ＥＬＩＳＡの結果は、３名の進行した前立腺
癌患者由来のプールした血清の希釈物に基づく検量線か
ら導かれた任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）
で表現する。結果：ＰＳＭＡはチオフィリックゲルに対
して強いアフィニティーを有している。チオフィリック
ゲルにおける患者血清のクロマトグラフィーは、アルブ
ミンを含む９０％より多くのタンパク質を除去する。こ
れにより、ＰＳＭＡ抗体を用いて染色したときに、ＰＳ
ＭＡのウエスタンブロット分析において、〜７５から９
０ｋＤａに対応する単一のバンドとして可視化すること
が可能になる。非癌性血清（健常者、前立腺炎及びＢＰ
Ｈ）と比較して前立腺癌患者の血清では、染色がより強
かった。前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰから単離して同様に
処理したＰＳＭＡも単一のバンドを示した。しかしなが
ら、そのバンドは１００〜１１０ｋＤａに対応するやや
大きい分子量であった。直接的なサンドイッチ型酵素結
合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を、血清ＰＳＭＡの
決定のために開発した。ＥＬＩＳＡにおいて、ＰＳＭＡ
レベルを任意の単位として表したところ、結果は疾患の
ステージと十分に相関する。

【０００７】

【実施例】ＬＮＣａＰ細胞抽出物の調製 ＬＮＣａＰ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）（ＡＴＣＣ
寄託番号ＣＲＬ１７４０）から入手した。これらの細胞
は、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹにおいてはじめて
単離され、特徴付けられたものである。この細胞系の開
発及び特徴付けに関する詳細は、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃ
ｚら，ＬＮＣａＰ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｐｒｏｓｔａｔ
ｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｖ
ｏｌ ４３，ｐｐ １８０９−１８１８，１９８３によ
り公開されている。ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ウシ胎仔
血清及び１ｍＭ Ｌ−グルタミンを補充した完全ＲＰＭ
Ｉ１６４０増殖培地（Ｇ．Ｍｏｏｒｅら，ＡＭＡ，Ｖ．
１９９，ｐｐ．５１９，１９６７により公開）中で維持
した。ＬＮＣａＰ細胞の集密単層をトリプシン処理し、
ＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁液を１μｇ／ｍｌのプロテア
ーゼ阻害剤（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在
下、−７０℃で凍結した。凍結及び解凍からなる追加の
サイクルを１回した後、細胞溶解液を３０００×ｇで遠
心分離して核及び不完全な破壊細胞を除去した。上清
を、０．５％のＮＰ４０を含むように再構成し、回転式
振盪機中に４℃で３０分間置いた。可溶化した物質を１
５０００×ｇで３０分間回転させた。上清を集め、使用
するまで−７０℃で保存した。血清サンプル １１０名の患者（前立腺炎、ＢＰＨ及び前立腺腫瘍）及
び２０名の健常者ドナーに由来する血清サンプルを、本
研究に使用した。患者の中で、３７の血液サンプルは、
クリニックにおいて定期的な外来通院の間に新たに採血
したものであり、１８の患者血清サンプルは、Ｄｅｐａ
ｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ ａｔ Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから保存された血清サンプル
として入手したものである。残り５４名の患者の血清サ
ンプルはニューヨーク西地区の泌尿器クリニックへの定
期的通院の間に患者から新たに採取したものである。採
取後９０日以内に分析した保存サンプルを除く全ての血
清サンプルを−７０℃で凍結して維持し、７２時間以内
に処理した。健常者を含む全てのドナーは、地方条例の
要求により書面によるインフォームドコンセントを受け
た。血清サンプルは使用するまで−７０℃で凍結して維
持した。

【０００８】抗体 ７Ｅ１１．Ｃ５ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣＣ ＨＢ
１０４９４）及びＢ−６ハイブリドーマ細胞系（ＡＴＣ
Ｃ ＰＴＡ３１６０）は、本発明者等の研究所において
ルーチン的に維持され、また、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクションに寄託され、そこから入手可能
である。７Ｅ１１．Ｃ５抗体及びＢ−６抗体は、化学的
に安定なアミド結合を介して架橋したアガロースビーズ
（例えば、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｍ
ＡＰＳ ＩＩ ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏ−ｒａｄ，ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に結合
したタンパク質Ａを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーにより、公表された製造者の指示に従い、マウス
の腹水から精製した。モノクローナル抗体７Ｅ１１．Ｃ
５及びＢ−６は、ＬＮＣａＰ細胞を用いた免疫化により
生成したマウス免疫グロブリン（ＩｇＧ１）である。こ
れらの抗体はＬＮＣａＰ細胞の膜リッチ画分とは反応す
るが、サイトソル又は抗原性物質、例えば前立腺特異的
抗原（ＰＳＡ）又は前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡ
Ｐ）との反応性は有しない。二重決定ＥＬＩＳＡによるＰＳＭＡの定量化 未処理の血清サンプル中のＰＳＭＡの定量化は以下の通
りにして行った。モノクローナル抗体７Ｅ１１．Ｃ５
を、２０ｍＭリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．０）中で５μ
ｇ／ｍｌに希釈し、マイクロタイタープレートのウェル
の４℃で一晩のコーティングに使用した。ウェルを、Ｐ
ＢＳブロッキング緩衝液中の２％ウシアルブミンを用い
１時間かけてブロックした。ブロッキング工程及び続く
すべての工程は室温下で行った。試験サンプルをブロッ
キング緩衝液で希釈し、プレートへ三重に適用した（５
０μｌ／ウェル）。１時間インキュベーションした後、
プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅ
ｅｎ２０の１％中のアルブミン溶液中で１：２０００に
希釈したα_１−抗キモトリプシンポリクローナル抗体を
適用した（５０μｌ／ウェル）。結合した抗原を、ペル
オキシダーゼ標識した抗ウサギＩｇＧ及びＯ−フェニレ
ンジアミン（ＯＰＤ）基質により検出した。Ｔ_３ステー
ジの癌患者由来のプール血清を内部標準として使用し、
結果を各プレートについて行った検量線から導いた任意
単位にて表した。

【０００９】結果 ＬＮＣａＰ細胞抽出物及び前立腺癌患者血清中のＰＳＭ
Ａのウエスタンブロットによる検出 別シリーズの実験において、本発明者等はＰＳＭＡが３
Ｓ−チオフィリックゲルに対して強いアフィニティーを
有することを示した。ＬＮＣａＰ細胞抽出物（１ｍｌ、
５×１０^７細胞）又は前立腺癌患者由来の血清（４００
μｌ）を、前記と同様にして、３Ｓ，Ｔ−ゲル中のクロ
マトグラフィーに付した。１０μｌの溶離した画分を、
ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析に付し、７
Ｅ１１．Ｃ５抗体を用いて免疫染色した。ＬＮＣａＰ細
胞抽出物の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に溶離した
画分を濃縮（６×）する必要があった。チオフィリック
ゲルクロマトグラフィーからのカラム溶離物を、全く凍
結することなく直ちに分析した。その一例の結果を図１
に示す。７５〜９０ｋＤａ（血清）又は１００〜１１０
ｋＤａ（ＬＮＣａＰ細胞抽出物）に対応する免疫反応性
の唯一のバンドが、種々のサンプルの中で観察された。
すべての場合において、患者血清から回収したＰＳＭＡ
は、ＬＮＣａＰ細胞中のＰＳＭＡと比較して常に分子量
が小さい。しかしながら、数回の凍結解凍サイクル後の
ＬＮＣａＰ細胞抽出物のカラム溶離物は、１８０ｋＤａ
に対応する第二の弱いバンドをしばしば示した。この１
８０ｋＤａのバンドは、前出、Ｔｒｏｙｅｒらによって
も観察されている。チオフィリックゲルクロマトグラフ
ィーは血清中の多数のタンパク質を明らかに除去し、こ
れにより、電気泳動的分離及びＰＶＤＦ膜への移動後に
抗ＰＳＭＡ抗体により染色したときのＰＳＭＡ検出が許
容される。チオフィリックゲルクロマトグラフィーの前
に７Ｅ１１．Ｃ５を用いて患者血清のウエスタンブロッ
トを染色したとき、免疫反応性は観察されなかった。Ｐ
ＳＭＡの分子量はその起源に依存して変化する。ＬＮＣ
ａＰ細胞抽出物中のＰＳＭＡは１００〜１１０ｋＤａの
分子量を有する（前出、Ｉｓｒａｅｌｉら及び前出、Ｔ
ｒｏｙｅｒら）。前立腺癌腫瘍組織から単離したＰＳＭ
Ａは１２０ｋＤａである（前出、Ｔｒｏｙｅｒら）。本
発明者等の研究において、異なる前立腺癌患者の血清中
のＰＳＭＡは約７５〜９０ｋＤａの分子量を有している
ことを見いだした（図１）。これらの差異についての理
由は不明である。ＰＳＡは異なるプロテアーゼ阻害剤と
複合体を形成することが知られている（前出、Ｐｏｌａ
ｓｃｉｋら）。ＰＳＭＡも異なるタンパク質／プロテア
ーゼ阻害剤と複合体を形成することが考えられる。本発
明者等の研究では、そのような可能性を探求している。
異なる疾患ステージにある前立腺癌患者由来の血清を、
最初にチオフィリックゲル吸着クロマトグラフィーによ
り処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロットによ
り分析した。エレクトロブロットの後、膜を、抗ＰＳＭ
Ａ抗体７Ｅ１１．Ｃ５又はプロテアーゼ阻害剤に対する
抗体、例えばα_１−抗トリプシン、α_１−抗キモトリプ
シン及びタンパク質Ｃ阻害剤に対するモノクローナル抗
体等を用いて染色した。図２Ａに示すデータは、７Ｅ１
１．Ｃ５抗体との免疫反応の１つのバンドを示してい
る。α_１−抗トリプシン又はタンパク質Ｃ阻害剤に対す
る抗体との免疫反応性は観察されなかった。α_１−抗キ
モトリプシンに対する抗体との免疫反応性が２つ観察さ
れた。一つはＰＳＭＡ／α_１−抗キモトリプシン複合体
に対応するものであり、他方は血清中に存在することが
知られている遊離のα_１−抗キモトリプシンに対応する
ものである（図２Ｂ）。本発明者等の以前の研究（デー
タは示さず）において、遊離のα_１−抗キモトリプシン
はチオフィリックゲルに対するアフィニティーを有する
ことが実証されている。これが、血清中のＰＳＭＡがα
_１−抗キモトリプシンとの複合体（ＰＳＭＡ−ＡＣＴ）
として存在していることの第一の証拠である。ＬＮＣａ
Ｐ細胞から調製したＰＳＭＡと女性の血清又は市販のα
_１−抗キモトリプシンとのインキュベートにより前記の
複合体を作成する試みは失敗した。

【００１０】ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡによ
る、前立腺癌患者血清中のＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体の検
出 異なる疾患ステージにある前立腺癌患者５５名に由来す
る血清、健常者（２０名）、ＢＰＨ（４６名）及び前立
腺炎（９名）の血清サンプルをブラインド様式で無作為
化し、ＰＳＭＡの存在について分析した。全ての血清サ
ンプル最初にチオフィリックゲルクロマトグラフィーに
付した。カラム溶離物を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ／ウエスタ
ンブロット分析及び７Ｅ１１．Ｃ５抗体を用いた免疫染
色によりＰＳＭＡの存在について分析した。図３Ａに示
すデータは、対照、ＢＰＨ、前立腺炎血清及び異なる疾
患ステージ（Ｔ_１、Ｔ_２、Ｔ_３及びＴ_４）にある８名の
前立腺癌患者由来の血清を示している。全ての場合にお
いて、７５〜９０ｋＤａに対応する免疫反応性の唯一の
バンドが観察された。免疫染色の強度は、非癌性患者と
比較して癌患者由来の血清において有意に高かった。抗
ＰＳＭＡ抗体Ｂ−６を用いて同様の結果が見いだされた
（図６参照）。図２及び６において本発明者等は、患者
血清中のＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体をＰＳＭＡ抗体及び抗
α_１−抗キモトリプシン抗体を用いて同定することがで
きることを実証した。この結果は、ＰＳＭＡ抗体、例え
ば７Ｅ１１．Ｃ５又はＢ−６を「捕捉」抗体として及び
抗α_１抗キモトリプシン抗体を「検出」抗体として使用
することにより、患者血清中のＰＳＭＡをモニターする
ためのＥＬＩＳＡアッセイを開発するための機会をはじ
めて提供した。図３Ｂに示される全ての血清サンプル
を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＰＳＭＡ−ＡＣＴ
複合体の存在について分析した。図３Ａに示すＥＬＩＳ
Ａの結果は、４９０ｎＭにおける吸光度として表した。
ＢＰＨ又は前立腺炎中のＰＳＭＡ−ＡＣＴレベルは、よ
り進行した疾患と比較して低い。ウエスタンブロット分
析により検出されたＰＳＭＡレベル（図３Ｂ）は、サン
ドイッチＥＬＩＳＡで見ることができるもの（図３Ａ）
に対応する。ＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体は血清中で検出す
ることができ、かつ、血清に基づくＰＳＭＡ調製物が今
までのところ入手不可能であるという事実より、本発明
者等は３名の前立腺癌患者（Ｔ_３ステージ）由来のプー
ル血清を使用して内部標準を調製し、血清のスクリーニ
ングに使用した。本発明者等は、１：５〜１：１６０の
範囲の血清希釈を用いて、直線的な用量反応曲線を得た
（図５）。総数１３０の血清サンプルを、新規に開発し
たサンドイッチＥＬＩＳＡにおいてＰＳＭＡ−ＡＣＴ複
合体レベルについてアッセイし、結果を図４に示す。Ｐ
ＳＭＡの結果は、各プレートについて行った検量線から
導いた任意の単位で表した。対照、ＢＰＨ及び前立腺炎
のＰＳＭＡレベルは通常１０単位よりも低いが、異なる
疾患ステージにあるＰＳＭＡレベルは高く、通常は疾患
の進行と十分に相関している。これらの結果は、通常は
擬陽性が真の陽性をこえる現在のＰＳＡ試験よりもはる
かに優れている。Ｂ−６ハイブリドーマクローンは、７
Ｅ１１．Ｃ５細胞の親となるソースでもある７Ｅ１１ハ
イブリドーマ細胞の未クローン培養からはじめて単離し
た。Ｂ−６ハイブリドーマ細胞を、１０％熱不活性化ウ
シ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で消費（ｅｘ
ｐｅｎｄ）した。Ｂ−６ハイブリドーマ細胞は低温保存
した。Ｂ−６ハイブリドーマ細胞が前立腺特異的膜抗原
を選択的に同定する抗体を産生する能力は、以下の３つ
の異なる方法により確認した。（ａ）間接的免疫ペルオ
キシダーゼ染色、（ｂ）ウエスタンブロット及び（ｃ）
サンドイッチＥＬＩＳＡ。ＰＳＭＡに対する抗体を含む
Ｂ−６細胞由来のならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ
ｍｅｄｉｕｍ）を、前立腺癌細胞の免疫染色に使用し
た。Ｂ−６細胞を使用してＢａｌｂ／ｃマウス中で腹水
を生成し、精製抗体をＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロッ
ト分析に使用した。

【００１１】モノクローナル抗体の産生と精製 Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）に、Ｂ−６細胞
（０．５ｍｌ ＰＢＳ中、５×１０^６細胞／マウス）を
腹腔内注射した。３週間後に腹水を集め、モノクローナ
ル抗体（Ｂ−６）を、硫酸アンモニウムを用いた沈殿、
続く製造者の指示に従うタンパク質Ａアガロースカラム
クロマトグラフィーにより最初に精製した。ＩｇＧの精
製を、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色によ
り確認した。ＩｇＧ濃度は、ＢＣＡアッセイ法（Ｐｉｅ
ｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により測定した。間接的免疫ペルオキシダーゼ染色 免疫染色について、４つのヒト前立腺癌細胞系（ＰＣ−
３、ＰＣ−３Ｍ、ＤＵ−１４５、ＬＮＣａＰ）及び２系
統の正常なヒト繊維芽細胞（ＢＧ−９、ＭＬＤ）を使用
した。培養細胞、未固定及びホルマリン固定した、調製
したばかりのサイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）標本
を、最初にブロッキング溶液（ＰＢＳ中の１％アルブミ
ン）で１時間処理し、続いてＢ−６抗体を含むＢ−６な
らし培地（ブロッキング溶液中１：５００に希釈（ｄｉ
ｌ））と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳで細胞
を３回洗浄した後、ペルオキシドをコンジュゲートした
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：
１００００希釈物に６０分間曝露した。呈色反応は、Ｐ
ＢＳ（ｐＨ７．２）中の３，３’−ジアミノベンジジン
（０．０５％）：Ｈ_２Ｏ_２（０．０１％）を用いて展開
した。一次抗体に代えてＰＢＳ及びミエローマ細胞系由
来の培養液を、追加の対照として含めた。免疫特異的染
色の強度を、ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）顕微鏡（４０×対
物、１０×接眼）を用いて評価した。未固定の細胞系
は、Ｂ−６抗体に対する免疫反応性を全く示さなかっ
た。ホルマリンで固定した細胞のなかで、ＬＮＣａＰ細
胞のみがＢ−６抗体に対する特異的な免疫反応性を示し
た。ＬＮＣａＰ細胞の免疫ペルオキシダーゼ染色の強度
は、膜貫通領域において支配的である。そのような免疫
反応性は、固定したＰＣ−３、ＰＣ−３Ｍ、ＤＵ−１４
５、ＢＧ−９及びＭＬＤ細胞においては見られなかっ
た。

【００１２】ウエスタンブロット分析 ＬＮＣａＰ、ＰＣ３及びＤＵ−１４５由来の細胞溶解物
を、Ｂ−６抗体を用いたウエスタンブロット分析に使用
した。細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、２回
の凍結解凍サイクルに付した。細胞溶解物を２０００×
ｇで１０分間遠心分離し、ＮＰ−４０（終濃度０．５
％）を添加した後に、上清を４℃で３０分間インキュベ
ートした。可溶化した物質を１００００×ｇで２０分間
遠心し、前記と同様にして上清を３Ｓ，Ｔ−ゲルクロマ
トグラフィーに使用した。ＰＳＭＡを含むＴ−ゲルカラ
ム由来の画分をプールし、濃縮（×６）し、非還元条件
下で４〜１５％ ＳＤＳ／ＰＡＧＥに適用した。ＰＶＤ
Ｆ膜に電気泳動的に移した後、ＰＳＭＡ抗原を、Ｂ−６
抗体により同定した。ＤＵ−１４５及びＰＣ−３細胞由
来の細胞溶解物は、Ｂ−６抗体に対する免疫反応性を全
く示さなかった。しかしながら、ＬＮＣａＰ細胞調製物
の場合、１００〜１１０ｋＤａに対応する単一の免疫反
応バンドが見られた。別実験において、Ｂ−６及び７Ｅ
１１．Ｃ５抗体の両方を用いてＬＮＣａＰ細胞溶解物を
平行して精査した。結果を図６に示す。両方の抗体は、
ＬＮＣａＰ細胞溶解物中のＰＳＭＡ抗原を同定すること
ができた。ＥＬＩＳＡ Ｂ−６及び７Ｅ１１．Ｃ５抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ
アッセイにより、前立腺癌患者の血清中のＰＳＭＡを測
定した。正常な個体及びＢＰＨ患者由来の血清も含め
た。９６ウェル免疫プレートを２等分し、一方はＢ−６
抗体でコーティングし、他方は７Ｅ１１．Ｃ５抗体でコ
ーティングした。プレートの各半分はＰＳＭＡに対する
自身の内部標準を有していた。ＥＬＩＳＡ手順のその他
の詳細は前記と同様であった。この試験の結果を図７に
示す。各血清について、ＰＳＭＡ抗原のインデックス
は、Ｂ−６及び７Ｅ１１．Ｃ５抗体の両方と本質的に同
一である。ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロットの結果に
基づいて、Ｂ−６及び７Ｅ１１．Ｃ５抗体の両方が、前
立腺癌患者血清中のＰＳＭＡの存在を検出するために効
果的に利用することができることが明らかになる。癌患
者のＰＳＭＡレベルは、ＢＰＨ又は前立腺炎と比較して
有意に高い。

【００１３】本発明者等は、ＥＬＩＳＡ及びウエスタン
ブロット分析の両方による血清ＰＳＭＡをモニターし
た。ウエスタンブロット分析について、血清を、血清タ
ンパク質の大部分を除去する３Ｓ−チオフィリックゲル
中でクロマトグラフィーに付した。チオフィリックゲル
処理後の血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＰＳＭＡ抗体を
用いたウエスタンブロットにより分析した。全ての場合
において、７５〜９０ｋＤａに対応する単一のＰＳＭＡ
バンドが観察された。総数１３０の血清サンプルを処理
した。前立腺癌血清、ＢＰＨ、前立腺炎及び正常血清を
含む代表的な結果を図３Ｂに示す。血清及びＬＮＣａＰ
細胞抽出物に存在するＰＳＭＡの分子量は異なるという
ことは言及する価値がある。血清ＰＳＭＡは７５〜９０
ｋＤａであり、ＬＮＣａＰ細胞由来のＰＳＭＡは１００
〜１１０ｋＤａである。ＬＮＣａＰ細胞由来のＰＳＭＡ
の分子量は、還元又は非還元条件下の両方で同一のまま
であった。しかしながら、還元条件下において、血清由
来のＰＳＭＡはウエスタンブロットでは検出不可能であ
る。ＰＳＭＡに対する追加の抗体は現在入手不可能であ
るので（前出、Ｌｉｕら及び前出、Ｇｒａｕｅｒら）、
異なる体液中のＰＳＭＡをモニターするためのイムノア
ッセイを開発する試みを行った。Ｓｏｋｏｌｏｆｆら
は、ＰＳＭＡに対する二重モノクローナルサンドイッチ
アッセイを開発した（Ｓｏｋｏｌｏｆｆら，Ａ ｄｕａ
ｌ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓ
ａｙ ｆｏｒ ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ：Ｌｅｖｅｌｓ ｉ
ｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｓｅｍｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ａ
ｎｄ ｕｒｉｎｅ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，ｖｏｌ ４３，
ｐｐ１５０−１５７，２０００）。Ｓｏｋｌｏｆｆら
は、組織抽出物、尿及び精液中のＰＳＭＡレベルの測定
には成功した。しかしながら、血清中のＰＳＭＡをモニ
ターする試みは失敗している。本発明者等の血清中のＰ
ＳＭＡレベルをモニターする試みは成功した。この成功
は、血清中のＰＳＭＡがα_１−抗キモトリプシンとの複
合体（ＰＳＭＡ−ＡＣＴ）として存在するとのはじめて
の認識に大きく依存している。本発明者等のサンドイッ
チＥＬＩＳＡにおいては、ＰＳＭＡ抗体７Ｅ１１．Ｃ５
及びＢ−６を「捕捉」抗体として、及び、抗α_１−抗キ
モトリプシン抗体を「検出」抗体として使用した。

【００１４】ＰＳＭＡは膜貫通型糖タンパク質である。
ＰＳＭＡ抗体はＰＳＭＡのＮＨ_２末端とのみ結合するこ
とも知られている。血清中で検出されたＰＳＭＡは、Ｐ
ＳＭＡに対するエピトープを含む抗原の断片であるに違
いなく、ＡＣＴと複合体を形成したときに、分子量が７
５〜９０ｋＤａになる。ウエスタンブロット分析におけ
るＰＳＭＡ検出は、妨害タンパク質の大部分を効率的に
除去するチオフィリックゲルクロマトグラフィーにより
ＬＮＣａＰ細胞抽出物を処理した後にのみ実施可能であ
った。ＬＮＣａＰ細胞抽出物及び血清中のＰＳＭＡの分
子量は異なる。血清ＰＳＭＡは７５〜９０ｋＤａであ
り、ＬＮＣａＰ細胞中のＰＳＭＡは１００〜１１０ｋＤ
ａである。血清ＰＳＭＡはサンドイッチＥＬＩＳＡによ
りはじめて検出することができる。明らかに、７Ｅ１
１．Ｃ５又はＢ６抗体に対するエピトープを含むＰＳＭ
Ａ断片は、α_１−抗キモトリプシンと複合体化してＰＳ
ＭＡ−ＡＣＴ複合体を形成する血清へ放出される。この
ことは、新規に開発するＥＬＩＳＡ試験についての基礎
を構成する。本発明者等のＥＬＩＳＡ試験では、７Ｅ１
１．Ｃ５又はＢ−６抗体を使用してＰＳＭＡを捕捉し、
検出はα_１−抗キモトリプシン抗体の使用に基づく。Ｅ
ＬＩＳＡにより検出されるＰＳＭＡのレベルは、疾患の
ステージと十分に相関する。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、チオフィリックゲルクロマトグラフィ
ー後のＬＮＣａＰ細胞抽出物及び前立腺癌患者における
ＰＳＭＡのウエスタンブロット検出を示している。ＬＮ
ＣａＰ細胞抽出物又は患者血清を３−Ｓ−チオフィリッ
クゲル中でクロマトグラフィーに付した。カラム溶離物
中のＰＳＭＡの存在を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＰＳＭ
Ａ抗体７Ｅ１１．Ｃ５を用いたウエスタンブロットによ
り検出した。「Ａ」はＬＮＣａＰ細胞抽出物を示し、
「Ｂ」は前立腺癌血清（ステージＴ−３）を示してい
る。ＬＮＣａＰ細胞抽出物の４つの異なる調製物及びス
テージＴ_３にある１０名の患者の血清を分析した。結果
は全ての場合において本質的に同一であった。

【図２】図２は、患者血清中のＰＳＭＡが、当該抗原と
α_１−抗キモトリプシンとの複合体の形態で存在するこ
とを示すウエスタンブロット分析を示している。ステー
ジＴ_３の前立腺癌患者に由来する血清を３Ｓ、Ｔ−ゲル
中でクロマトグラフィーに付し、ウエスタンブロットに
より分析し、抗ＰＳＭＡ抗体７Ｅ１１．Ｃ５（レーン
Ａ）又は抗α_１−抗キモトリプシン抗体（レーンＢ）を
用いて免疫染色した。抗ＡＣＴ抗体によって２つのバン
ドが検出された。１つはα_１−抗キモトリプシン抗体
（下部のバンド）に対応し、他方はＰＳＭＡ−ＡＣＴ複
合体（上部のバンド）に対応する。同様の手順により更
に１３名の患者でＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体の存在を検出
した。

【図３】図３は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ａ）及びウ
エスタンブロット（Ｂ）を用いた前立腺癌患者血清中の
ＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体検出の比較を示している。Ｔ
_{１、Ｔ ２}、Ｔ_３及びＴ_４ステージの前立腺癌患者、対照
（Ｃ）、前立腺炎（Ｐ）及びＢＰＨ由来の各血清サンプ
ルにおいてＰＳＭＡを検出した。示されているデータ
は、異なるステージの疾患及び対照における１２の代表
的な血清サンプルを含んでいる。

【図４】図４は、患者血清におけるＰＳＭＡ−ＡＣＴ複
合体のＥＬＩＳＡによる決定のグラフを示している。正
常な対照（２０）、前立腺炎（９）、ＢＰＨ（４６）及
び異なるステージの前立腺癌（５５）を含む全１３０の
血清サンプルをサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析し
た。モノクローナル抗ＰＳＭＡ抗体７Ｅ１１．Ｃ５によ
り抗原を捕捉し、ポリクローナル抗ＡＣＴ抗体により検
出した。結果を、各マイクロプレート中に含まれる検量
線から導かれる任意単位として表す。標準は、Ｔ３ステ
ージの患者に由来するプールした血清の連続的な２倍希
釈物（１単位（１：１６０希釈）〜１００単位（１：５
希釈）の範囲）から構成されている。各点は１つの血清
サンプルを示している。グラフは、非前立腺癌サンプル
では１０未満の値に減少し、前立腺癌サンプルでは１０
より高い値に減少し、約１０単位ではオーバーラップが
極めて少ないことを示している。

【図５】図５は、ＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体についてのＥ
ＬＩＳＡの較正を示している。Ｔ−３ステージにある３
名の前立腺癌患者に由来するプールした血清を連続希釈
し、５０μｌのアリコートを抗ＰＳＭＡ抗体で被覆した
マイクロタイタープレートに三重に添加した。抗ＡＣＴ
抗体を使用してＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体の存在を検出し
た。比較可能な希釈にある正常血清を対照として使用し
た。標準は、プールした血清の連続希釈物（１単位
（１：１６０希釈）〜１００単位（１：５希釈）の範
囲）から構成される。示される結果は、６つの独立した
アッセイを示している。

【図６】図６は、チオフィリックゲルクロマトグラフィ
ーによる分離、続く（Ａ）７Ｅ１１．Ｃ５抗体及び
（Ｂ）Ｂ−６抗体を用いたウエスタンブロット分析によ
るＬＮＣａＰ細胞溶解物中のＰＳＭＡ検出を示してい
る。

【図７】図７は、ＥＬＩＳＡによる前立腺癌患者血清中
のＰＳＭＡ−ＡＣＴ複合体の測定についての７Ｅ１１．
Ｃ５とＢ−６抗体との比較を示している。正常な対照
（１１）、ＢＰＨ（１２）及び前立腺癌患者（３５）を
含む全５８の血清サンプルを、サンドイッチＥＬＩＳＡ
により分析した。モノクローナル７Ｅ１１．Ｃ５又はモ
ノクローナルＢ−６抗体のいずれかにより抗原を捕捉
し、ポリクローナル抗ＡＣＴ抗体により検出した。その
他の詳細は前記と同様である。結果は任意単位により示
される。

フロントページの続き (72)発明者 エルツビータ カウィンスキー アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14127 オーチャード パーク ジュエット ホ ルムウッド 7600 (72)発明者 カイラッシュ シー チャッダ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 14221 ウィリアムスヴィル サマーヴュー ロ ード 106

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 体液中の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ
   Ａ）を検出する方法であって、 ＰＳＭＡ抗体を使用して、ＰＳＭＡを含む体液サンプル
   からＰＳＭＡを捕捉する工程、及び、 捕捉したＰＳＭＡを、抗α_１−抗キモトリプシン抗体を
   用いて検出する工程、を含み、ＰＳＭＡを免疫アッセイ
   により検出することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 ＰＳＭＡを、以下の工程：ＰＳＭＡ抗体
   を希釈することにより該ＰＳＭＡ抗体を使用する工程、 得られた溶液を用いて表面をコーティングする工程、 該表面上の非特異的部位をブロックする工程、 サンプルをブロッキング緩衝液で希釈する工程、及び、 希釈したサンプルをウェルに適用してＰＳＭＡを捕捉す
   る工程により捕捉する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 捕捉したＰＳＭＡを、抗−α_１−抗キモ
   トリプシン抗体を用いて、以下の工程：ウェルを洗浄す
   ることにより非捕捉物質を除去する工程、 ブロッキング溶液中で希釈した抗−α_１−抗キモトリプ
   シン抗体を適用する工程、及び、 結合したＰＳＭＡを、ペルオキシダーゼで標識した抗ウ
   サギＩｇＧ及びＯＰＤ基質を用いて検出する工程、によ
   り検出する、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 体液が血清である、請求項１に記載の方
   法。
5. 【請求項５】 体液が血清である、請求項２に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 体液が血清である、請求項３に記載の方
   法。
7. 【請求項７】 体液が尿である、請求項１に記載の方
   法。
8. 【請求項８】 体液が尿である、請求項２に記載の方
   法。
9. 【請求項９】 体液が尿である、請求項３に記載の方
   法。