CN104316689A - 一种髓过氧化物酶定量检测方法及检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药生物技术应用领域，涉及基于髓过氧化物酶与特异性单克隆抗体结合的免疫反应及其自身酶活性的免疫吸附检测方法。该方法是在酶标板上包被经筛选的髓过氧化物酶单克隆抗体，可与待测样品中髓过氧化物酶特异性结合，但并不影响髓过氧化物酶自身酶活性反应，通过吸附的髓过氧化物酶直接对底物TMB催化作用，实现对髓过氧化物酶的定量检测。该检测方法特异性好；且具有良好的稳定性和重复性；操作简便；避免了现有ELISA检测方法中辣根过氧化物检测系统对髓过氧化物酶检测的影响，为髓过氧化物酶的检测开辟了一条新途径。

Description

一种髓过氧化物酶定量检测方法及检测试剂
技术领域
本发明属于医药生物技术应用领域，涉及一种髓过氧化物酶定量检测方法及检测试剂。
背景技术
髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)是一种来源于白细胞的亚铁血红素酶，主要存在于髓系细胞(主要是嗜中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，外界刺激可导致中性粒细胞聚集，释放MPO，血液中95％的MPO是由活化的嗜中性粒细胞脱颗粒释放入血的。MPO的相对分子质量约为150kDa，是由2个亚单位聚合而成的二聚体，每个亚单位又由一条重链(α链,相对分子质量约59kDa左右)和一条轻链(β链,相对分子质量约15kDa)构成，2个亚单位在α链处由1个二硫键相连。
目前MPO测定方法常用的为比色法活性检测和免疫学ELISA检测。比色法直接测定血液中MPO的酶活性，受血液中其他广泛存在的过氧化物酶，如嗜酸性粒细胞过氧化物酶等的干扰，导致假阳性结果。而已有的特异性的免疫检测ELISA法采用二株抗MPO抗体，一株作为捕捉抗体，另一株作为酶标抗体(显色抗体)，最常使用的是辣根过氧化物酶(HRP)系统，但检测的MPO具有过氧化物酶活性，可干扰辣根过氧化物酶活性，影响检测结果。因此本发明结合免疫反应的特异性及过氧化物酶活性的检测方法，可避免上述假性结果的产生。
发明内容
本发明的目的是提供基于髓过氧化物酶免疫反应及自身酶活性的髓过氧化物酶免疫吸附定量检测方法(MPO-ISA)。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于髓过氧化物酶免疫反应及自身酶活性的免疫吸附检测方法，在酶标板上包被髓过氧化物酶单克隆抗体，利用酶标板包被的髓过氧化物酶单克隆抗体与待测样品中的髓过氧化物酶特异性结合，通过吸附的髓过氧化物酶直接催化底物TMB，实现髓过氧化物酶的定量检测，MPO-ISA检测示意图见附图1。
其中，所述的髓过氧化物酶单克隆抗体为经过筛选的高特异性的单克隆抗体，能够与髓过氧化物酶结合，且不影响其底物结合中心、催化中心等与酶活性相关的位点。
所述的髓过氧化物酶单克隆抗体优选保藏号为CCTCC NO：C2014165的杂交瘤细胞株MCM1分泌的抗人髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1。
一株抗人髓过氧化物酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCM1，于2014年9月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014165。
用于髓过氧化物酶定量检测的单克隆抗体mcm1，由所述的杂交瘤细胞株MCM1分泌。
所述的杂交瘤细胞株MCM1、所述的单克隆抗体mcm1在制备髓过氧化物酶检测试剂中的应用，优选在制备髓过氧化物酶定量检测试剂中的应用。
一种髓过氧化物酶定量检测试剂盒，含有包被所述的髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1的固相材料。
其中，所述的固相材料选自酶标板、磁性微球、玻璃珠。
有益效果：
本发明利用髓过氧化物酶免疫反应和自身过氧化物酶的催化活性，仅使用一株单克隆抗体，就能实现髓过氧化物酶的定量检测，具有操作简便，缩短了检测时间，减少了经费支出的优点。相比现有ELISA法，还避免与辣根过氧化物酶交叉干扰检测结果。本方法具有良好的稳定性和重复性。
本发明利用人髓过氧化物酶(人白细胞提取)为免疫原，经过腹腔免疫及脾内免疫、常规细胞融合、筛选及克隆化，获得了一株能够稳定分泌抗髓过氧化物酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株MCM1(CCTCC NO：C2014165)。经ELISA、免疫印迹等方法鉴定，该杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体mcm1能够特异性识别髓过氧化物酶，并且抗原抗体结合反应不影响抗原的酶活性。利用该特性，在酶标板上包被mcm1，与待测样品中的髓过氧化物酶特异性结合，通过吸附的髓过氧化物酶直接催化底物TMB，使髓过氧化物酶的定量检测具有更高的准确性。
附图说明
图1.MPO-ISA检测方法示意图。
图2.Western blot鉴定制备的抗人MPO单克隆抗体mcm1。所用抗原为MPO标准品500ng(8M80，来源于人白细胞，购自芬兰Hytest,Ltd.公司),mcm1浓度10μg/mL。18B7为抗人MPO单抗，购自芬兰Hytest,Ltd.公司，在本实验中作为阳性对照，浓度10μg/mL。Marker为蛋白分子量标准，购自Bio-Rad Laboratories,Inc.(#161-0374)。
图3.间接ELISA法比较MPO对HRP及AP显色系统的影响
图4.抗MPO单抗选择，hWBC:人白细胞裂解液
图5.mcm1单抗不同包被浓度吸光度值比较，曲线为经Sigmoidal拟合,n＝4。
图6.MPO-ISA方法孵育时间(A)及显色时间(B)选择,n＝3
图7.MPO-ISA方法典型标准曲线，线性范围为1.95～250ng/mL，Y＝0.0104X-0.0104,r2＝0.9989,p<0.0001。
图8.不同种属白细胞裂解液MPO-ISA检测结果(h:人；c:豚鼠；r:大鼠；m:小鼠),n＝6图9.MPO-ISA与上市产品(武汉华美生物CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒CSB－E08721h)对照检测。A：CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒标准品对照检测结果；B：Hytest公司人MPO标准品对照检测结果；C：人白细胞裂解液对照检测结果
生物材料保藏信息
杂交瘤细胞株MCM1，于2014年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2014165，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1.单克隆抗体的制备
步骤1、免疫动物
第1天取人MPO抗原(P257-5，购自英国SCIPAC Ltd.公司)按80μg/只与等体积的弗氏完全佐剂混匀并充分乳化，腹腔注射3只6周龄与骨髓瘤细胞同种系的雌性BALB/c小鼠(南京医科大学实验动物中心)。第21天，1％戊巴比妥钠10μL/g腹腔麻醉小鼠，打开腹腔并暴露脾脏，取40μg MPO溶于100μL无菌PBS中，以弯头镊轻轻提起脾脏尾端系膜，用胰岛素注射器从脾脏尾端注入脾脏，每次注射后停滞30s以防回流，放回脾脏并分层缝合。第24天，小鼠剪尾采血用间接酶联免疫吸附试验法检测免疫小鼠血清中MPO多克隆抗体的效价，效价高则进行细胞融合。
步骤2、细胞融合
无菌制备上述步骤1免疫小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0(购自中科院上海细胞库)以6:1的比例在PEG(购自Sigma公司)作用下融合，融合按常规法(Nature.1975；256:495-497)进行,用1mL PEG，1分钟内缓慢加完，反应时间为90秒，无血清的DMEM(购自Gibco BRL公司)培养基终止反应，1000rpm离心10min，HAT(H次黄嘌呤、A氨基蝶呤、T胸腺嘧啶核苷，购自Gibco BRL公司)完全DMEM培养基调整细胞浓度至1×106/mL，加入已预先铺有饲养细胞(BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞)的96孔培养板，100μL/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养，每隔3天观察并换液，10天后以HT DMEM(Gibco BRL公司)培养基换液，1周后换为完全DMEM培养基培养。
步骤3、间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞
用MPO抗原(P257-5,1.4μg/mL)包被96孔酶标板，4℃过夜；3％牛血清白蛋白(BSA)封闭，4℃过夜，加入上述步骤2制得的杂交瘤细胞培养上清，37℃孵育1小时，SP2/0培养上清为阴性对照；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)37℃孵育1小时；PNPP底物显色10min，0.2mol/L NaOH终止反应。每步完成均用含0.05％Tween 20的PBS充分洗涤，Ultra Microplate Reader(EL808Ultra Microplate Reader BIO-TEK Instruments,Inc.,Winooski,VT)测OD 405值。挑选所测的OD 405比阴性对照高10倍的孔，进行亚克隆化，
并进行扩增冻存。
步骤4、阳性杂交瘤细胞的克隆化-采用有限稀释法
将上述步骤3筛选得到的细胞用HT DMEM培养基稀释至每孔1个细胞，铺于U型96孔细胞培养板，4小时内光镜下观察每孔实际细胞数，记录单个细胞孔，待其长成克隆且ELISA鉴定抗体分泌呈阳性，即获得单克隆抗体分泌株，大量扩增并冻存，长期传代培养后，以相同的方法再次克隆化并鉴定，从而获得了稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株三株，培养上清间接ELISA法测定抗体效价大于102。杂交瘤细胞染色体核型示细胞染色体数目大于100条，符合杂交瘤细胞染色体核型。
步骤5、抗体获得
杂交瘤细胞扩大培养，用细胞数106/只接种BALB/c小鼠，体内诱生法制备单抗腹水，腹水效价大于105。腹水用Protein A亲和层析纯化后获得浓度为3-5mg/mL的抗体溶液。纯化的单抗SDS-PAGE电泳呈现明显的两条带，分子量分别约为50000和25000，与IgG轻链和重链位置一致。Western blot鉴定与购买的Hytest公司标准MPO(8M80，来源于人白细胞)能特异性结合。见附图2。
实施例2、MPO-ISA方法的建立和条件优化
步骤1、MPO-ISA方法建立的背景
具活性的MPO在体外亦具有过氧化物酶活性，可直接用于酶活性法检测(J Immunol Methods.1990；126(1):125-133)，因此ELISA检测方法中MPO可能会干扰HRP系统的检测，影响检测结果。我们用间接ELISA法比较HRP(辣根过氧化物酶)系统和AP(碱性磷酸酶)系统检测MPO进行了验证。以MPO抗原(P257-5,1.4μg/mL)包板，一抗采用抗人MPO单克隆抗体18B7，分为0ng/mL、8.1ng/mL、81ng/mL、810ng/mL四组，37℃温育1h，然后再分别以HRP标记二抗A0168(1:2000)，AP标记二抗A3562(1：5000)，显色。结果可见附图3，HRP系统检测光密度值明显高于AP系统，不加抗体(即0ng/mL)HRP显色光密度值明显增高，说明包被MPO可干扰HRP系统的检测，影响检测结果。据此，我们设想建立MPO免疫吸附法(MPO-ISA)：利用一株抗MPO单抗对标本中MPO进行捕捉，随后利用MPO自身酶活性进行显色，系统中不再引入HRP酶联抗体，避免影响检测结果。
步骤2、抗体选择
分别用包被液稀释三株实施例1制备的MPO单克隆抗体，浓度为10μg/mL，每孔200μL，4℃包被过夜；常规方法洗涤与封闭后备用。用市售武汉华美生物CUSABIO公司已包被MPO抗体酶标条及备用的MPO单抗酶标条，加入人白细胞裂解液(从全血中提取人白细胞，反复冻融四次得到含MPO的白细胞裂解液，用0.5％牛血清白蛋白PBS稀释1：50～1：1600)，200μL/孔，置37℃孵育2h，洗涤5次；分别加TMB液(Sigma,St.Louis,MO,USA)显色20分钟。终止液终止后450nm读取吸光度(A)值，比较不同抗体A值与人白细胞裂解液MPO浓度关系(附图4)。其中一株自制抗体及市售抗体显色无变化，提示此两株抗体不能吸附人白细胞裂解液MPO，或者是其与MPO的结合影响了MPO的酶活性。另外两株抗体包被酶标板后能吸附人白细胞裂解液MPO，且不影响MPO酶活性，选择其中一株抗体mcm1作为MPO-ISA吸附抗体,其分泌的杂交瘤细胞株MCM1于2014年9月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014165。亚型测定mcm1为IgG1型。
步骤3、抗体包被浓度选择
用包被液将抗人MPO单克隆抗体mcm1(CCTCC NO：C2014165)稀释成20、10、5、2.5和1.25μg/mL 5个浓度，包被酶标板。检测不同浓度梯度的MPO(0、31.25、62.5、125、250、500ng/mL)，TMB显色37℃孵育20min。终止液终止后450nm读取吸光度(A)值，经Sigmoidal拟合，以同一浓度的MPO的A值达到饱和的抗体浓度为最适包被抗体浓度。结果显示同一浓度的MPO检测A值随包被抗体浓度的增加逐渐增加(附图5)，至抗体为10μg/mL A值接近饱和，最佳抗体浓度为10μg/mL。
步骤4、孵育时间选择
用包被MPO单克隆抗体mcm1(CCTCC NO：C2014165)的酶标板，加入浓度为125ng/mL MPO，分别37℃孵育60min、90min、120min、150min。加TMB液37℃显色20min，终止液终止后450nm读取吸光度(A)值进行比较，结果显示当孵育时间增加到120min时，其A值增加很大，再延长孵育时间，A值变化平缓，最佳孵育时间选择120min，见附图6A。
步骤5、显色时间选择
用包被MPO单克隆抗体mcm1(CCTCC NO：C2014165)的酶标板，加入浓度为125ng/mL MPO孵育120min后，加TMB 37℃分别孵育10min、20min、30min、40min、50min、60min，终止液终止后450nm读取吸光度(A)值进行比较，结果显示，10～20min范围，A值逐渐增加，20min后逐渐降低，最佳显色时间选择20min，见附图6B。
实施例3、MPO-ISA方法性能评估
步骤1、标准曲线
用0.5％牛血清白蛋白PBS稀释MPO标准品(8M80，来源于人白细胞，购自芬兰Hytest,Ltd.公司)，浓度范围为1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250ng/mL，用实施例2建立的MPO-ISA方法检测。以浓度为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示MPO标准线性范围为0～250ng/mL，见附图7，Y＝0.0104X-0.0104,r2＝0.9989,p<0.0001)。MPO-ISA最低检测限浓度为3.68ng/mL，是依据由20次0值标本A值的平均值+3SD所对应的MPO浓度计算而得。
步骤2、方法回收率
将MPO浓度为31.25和125ng/mL的标本，分别与MPO标准品(浓度为50、200、500ng/mL)按体积比为9:1混合，用实施例2建立的MPO-ISA方法测定其混合液的浓度，依据测定值与理论值，计算回收率。结果显示MPO-ISA的回收率90.99～107.07％，平均101.02％，具体数据见表1。
表1    MPO-ISA方法回收率(n＝4)
步骤3、方法精密度确定
用0.5％牛血清白蛋白PBS将MPO稀释为分析范围内的低、中、高三个不同浓度。用实施例2建立的MPO-ISA方法在同一块板检测，每个浓度各24孔，计算批内差异的变异系数，结果显示三个不同浓度MPO批内差异的变异系数均<7％(具体见表2)。用0.5％牛血清白蛋白PBS将MPO稀释为分析范围内的低、中、高三个不同浓度，分装650μL/支，-20℃保存，包被三块酶标板条，-20℃保存，分别在7天每天上下午用实施例2建立的MPO-ISA方法检测，计算批间差异的变异系数，结果显示低、中浓度MPO批间差异的变异系数<8％，高浓度MPO批间变异测定的变异系数<15％(具体见表2)。
表2    MPO-ISA方法精密度测定
步骤4、不同种属差异
MPO主要储存于髓系细胞(主要是嗜中性粒细胞和单核细胞)的嗜苯胺蓝颗粒中，分别从全血中提取人、小鼠、大鼠及豚鼠白细胞，反复冻融四次得到含MPO的白细胞裂解液，用0.5％牛血清白蛋白PBS以1：10～1：400稀释。用实施例2建立的MPO-ISA方法检测，比较是否具种属差异。结果显示此MPO-ISA方法可检测人及豚鼠MPO，而与小鼠及大鼠MPO无反应，见附图8。
实施例4、MPO-ISA与上市产品(武汉华美生物CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒CSB－E08721h)对照
步骤1、CUSABIO公司MPO标准品检测
按CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒操作说明，用试剂盒样本稀释液配制MPO标准品(重组人MPO蛋白165-745片段)，至浓度为0、6.25、12.5、25、50、100、200、400ng/mL，分别用该公司ELISA试剂盒(MPO抗体包被作为捕捉抗体，加入稀释的标准品、生物素化的抗MPO抗体、HRP标记的亲和素，洗涤后底物TMB显色)及实施例2建立的MPO-ISA方法检测，设置复孔。以浓度为横坐标，复孔平均A值为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示CUSABIO人MPO ELISA试剂盒可检测其本公司MPO标准品，而实施例2建立的MPO-ISA方法对CUSABIO公司MPO标准品无反应，见附图9A。
步骤2、Hytest公司MPO标准品检测
用0.5％牛血清白蛋白PBS将芬兰Hytest,Ltd.公司人MPO标准品(8M80，来源于人白细胞)稀释至浓度为0、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250ng/mL，分别用CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒及实施例2建立的MPO-ISA方法检测，设置复孔。以浓度为横坐标，复孔平均A值为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示CUSABIO人MPO ELISA试剂盒与Hytest公司人MPO标准品无反应，而实施例2建立的MPO-ISA可检测Hytest公司人MPO标准品，并呈线性相关，见附图9B。
步骤3、人白细胞裂解液MPO浓度检测比较
从全血中提取人白细胞，反复冻融四次得到含MPO的白细胞裂解液，用0.5％牛血清白蛋白PBS以1：100、1：200、1：400稀释，分别用CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒及实施例2建立的MPO-ISA方法检测，设置复孔。结果显示CUSABIO人MPO ELISA试剂盒与人白细胞裂解液MPO无反应，而实施例2建立的MPO-ISA可检测人白细胞裂解液MPO浓度，见附图9C。结果提示CUSABIO公司人MPO ELISA试剂盒可检测重组表达的人MPO片段，但不能检测人天然MPO，而实施例2建立的MPO-ISA方法可检测人天然MPO，可用于临床标本检测，为临床标志物分子MPO浓度检测提供快速、可靠方法。

Claims (8)

1.一种基于免疫反应及自身酶活性的髓过氧化物酶检测方法，其特征在于在酶标板上包被经选择的髓过氧化物酶单克隆抗体，利用酶标板包被的髓过氧化物酶单克隆抗体与待测样品中髓过氧化物酶的特异性结合，通过吸附的髓过氧化物酶直接对底物TMB催化作用，实现对样品中髓过氧化物酶的定量检测。
2.根据权利要求1所述的髓过氧化物酶检测方法，其特征在于所述的髓过氧化物酶单克隆抗体为髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1，由杂交瘤细胞株MCM1分泌，杂交瘤细胞株MCM1于2014年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014165。
3.一株用于髓过氧化物酶检测的杂交瘤细胞株MCM1，于2014年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2014165。
4.用于髓过氧化物酶定量检测的单克隆抗体mcm1，其特征在于由权利要求3所述的杂交瘤细胞株MCM1分泌。
5.权利要求3所述的杂交瘤细胞株、权利要求4所述的单克隆抗体在制备髓过氧化物酶检测试剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求3所述的杂交瘤细胞株、权利要求4所述的单克隆抗体在制备髓过氧化物酶定量检测试剂中的应用。
7.一种髓过氧化物酶定量检测试剂盒，其特征在于含有包被所述的髓过氧化物酶单克隆抗体mcm1的固相材料。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的固相材料选自酶标板、磁性微球、玻璃珠。
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