CN107064512A - 一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents

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贾志磊
王洋
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Abstract

本发明公开了一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法，所述免疫层析试纸条包括依次相连接的样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫；所述标记抗体垫中含有60‑80μg的胶体金或荧光标记的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体；所述制备方法包括抗体包被硝酸纤维素膜的制备和免疫层析试纸条的组装，本公开所述抗体包被硝酸纤维素膜的制备中使用3‑氨基丙基三乙氧基硅烷，使制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的灵敏性提高。

Description

一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术
人髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)由中性粒细胞、单核细胞和某些组织的巨噬细胞分泌的含血红素辅基的血红素蛋白酶，是血红素过氧化物酶超家族成员之一。MPO是中性粒细胞的功能标志和激活标志，活化的中性粒细胞释放大量的MPO，影响多种疾病的发生。研究发现动脉粥样硬化患者外周血中活化的中性粒细胞增加，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进动脉粥样硬化斑块的形成并导致斑块的不稳定性增加，加速了动脉粥样硬化的进程；MPO可用于区别诊断早期急性髓性白血病和急性淋巴细胞白血病。检测MPO的浓度在疾病的诊断与疾病进展预警发明具有重要意义。
目前，免疫层析试纸条为用来检测MPO在血液中的浓度，但是传统方法制备得到的免疫层析试纸条虽然使用简易、快捷，但是存在准确度和灵敏度不够的缺点。开发一种新的MPO的免疫层析试纸条的制备方法提高检测的准确度和灵敏度是亟需的。
发明内容
本公开的目的是提供一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法，该制备方法可以提高检测的准确度和灵敏度。
为了实现上述目的，本公开提供一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括依次相连接的样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫；所述标记抗体垫中含有60-80μg的胶体金或荧光标记的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体；所述制备方法包括抗体包被硝酸纤维素膜的制备和免疫层析试纸条的组装，所述抗体包被硝酸纤维素膜的制备包括如下步骤：
S1.将1-2mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.3-0.7％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：(4-6)混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；
S2.使用浓度为0.01-0.03M且pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5-1.0mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；
S3.将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔0.5cm-1.0cm，随后置于36-38℃烘干1.5-2.5h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；
S4.烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.01-0.03M且pH值为7.1-7.6的磷酸盐缓冲液、0.4-0.6％(W/V)牛血清白蛋白和3-5％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液、双蒸水中处理，处理完成后于36-38℃通风干燥100-140min，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
本公开还提供了上述制备方法制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条。
通过上述技术方案，3-氨基丙基三乙氧基硅烷用于硝酸纤维素膜上抗体的包被可以使抗体倾向于以Fc区接近硝酸纤维素膜表面的羟基官能团，使Fab区向外伸展，提高了抗体的利用率。通过本公开制备方法制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条灵敏度提高，可以快速准确的测定人髓过氧化物酶的浓度。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是抗体在硝酸纤维素膜上的包被示意图。
图2是人髓过氧化物酶免疫层析试纸条结构图。
图3是人髓过氧化物酶胶体金标记免疫层析试纸条阴性结果。
图4是人髓过氧化物酶胶体金标记免疫层析试纸条阳性结果。
图5是人髓过氧化物酶浓度定量检测标准曲线。
附图标记说明
1 样品垫 2 标记抗体垫
3 检测线(T线) 4 抗体包被硝酸纤维素膜
5 质控线(C线) 6 吸收垫
7 PVC板
具体实施方式
以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
本公开第一方面：提供一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括依次相连接的样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫；所述标记抗体垫中含有60-80μg的胶体金或荧光标记的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体；所述制备方法包括抗体包被硝酸纤维素膜的制备和免疫层析试纸条的组装，所述抗体包被硝酸纤维素膜的制备包括如下步骤：
S1.将1-2mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.3-0.7％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：(4-6)混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；
S2.使用浓度为0.01-0.03M且pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5-1.0mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；
S3.将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔0.5cm-1.0cm，随后置于36-38℃烘干1.5-2.5h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；
S4.烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.01-0.03M且pH值为7.1-7.6的磷酸盐缓冲液、0.4-0.6％(W/V)牛血清白蛋白和3-5％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液、双蒸水中处理，处理完成后于36-38℃通风干燥100-140min，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
其中，免疫试纸的检测原理包括：将待检样品滴入样品垫中，若样品中含有人髓过氧化物酶，待测样品中的人髓过氧化物酶先和过量的胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体结合，然后由于毛细管作用人髓过氧化物酶和胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体形成的复合物沿着基膜向前泳动到达检测线与硝酸纤维素基膜上的第二单克隆抗体相遇，形成“胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体-人髓过氧化物酶-第二单克隆抗体”复合物富集在检测线(T线)上显出胶体金红色或者荧光信号；剩余的胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体到达质控线与质控线上的兔抗鼠IgG抗体结合，并富集在质控线上显出胶体金红色或者荧光信号，在检测线与质控线同时显色的情况下判断为阳性结果，如质控线不显色则判为检测失败，需要重新检测。若样品中无人髓过氧化物酶，无法形成复合物；没有与人髓过氧化物酶结合的胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体则直接通过检测线(T线)到达质控线与质控线上的兔抗鼠IgG抗体结合，形成IgG-胶体金或荧光标记的第一单克隆抗体复合物富集在质控线上，检测线(T线)不显色但质控线(C线)显色的情况下判断为阴性结果，如果质控线(C线)不显色则判为检测失败，需要重新检测。胶体金标记的人髓过氧化物酶免疫试纸条的阴性结果如图2所示，阳性结果如图3所示。其中使用荧光标记第一单克隆抗体的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条，可通过检测荧光强度来即时快速测定人髓过氧化物酶在待检测物中的浓度。
通过上述技术方案，3-氨基丙基三乙氧基硅烷用于硝酸纤维素膜上抗体的包被可以使抗体倾向于以Fc区接近硝酸纤维素膜表面的羟基官能团，使Fab区向外伸展，提高了抗体的利用率。通过本公开制备方法制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条灵敏度提高，可以快速准确的测定人髓过氧化物酶的浓度。
根据本公开第一方面，为了保持免疫试纸条中检测线的均一性，进一步地，步骤S3中所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液与兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液的喷涂速度可以为0.8-1.2μL/cm。
根据本公开第一方面，为了清除硝酸纤维素膜表面多余的3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体，进一步地，步骤S4中使用所述0.01-0.03M且pH值为7.1-7.6的磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液漂洗2-4次。
根据本公开第一方面，为了提高免疫试纸条使用中的准确性与灵敏度、减少非特异性相互作用，进一步地，步骤S4中使用含有0.4-0.6％(W/V)牛血清白蛋白和3-5％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理10-20min。
根据本公开第一方面，进一步地，步骤S4中使用双蒸水漂洗2-4次。
根据本公开第一方面，进一步地，所述样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫的长度比为(15-20):(10-12):(22-26):(18-22)。
根据本公开第一方面，进一步地，本公开对所述样品垫和标记抗体垫无特别限制，所述样品垫可以为无纺布、聚酯膜、纤维素滤纸或玻璃纤维素膜；所述标记抗体垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布；所述荧光标记为含镧系元素聚苯乙烯荧光微球。
根据本公开第一方面，进一步地，人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号18B7的单克隆抗体；人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号4B3的单克隆抗体。
根据本公开第一方面，进一步地，为了提高吸收率、促进虹吸作用，所述吸收垫可以为吸水滤纸。
本公开第二方面：提供了如上所述的制备方法制备得到的人髓过氧化物酶的免疫层析试纸条。
下面通过实施例进一步说明本发明，但是本发明并不因此受到任何限制。
本公开中，所述人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号18B7的单克隆抗体；人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号4B3的单克隆抗体；胶体金购自成都微森生物科技有限公司；含铕聚苯乙烯荧光微球购自美国Bangs公司。
实施例1
取20mL 40μg/mL胶体金溶液于50mL干净的离心管中，恢复至室温后，用0.2mol/LK2CO3调整pH8.0，避光条件下以200转/分钟速率搅拌。将10μg人髓过氧化物酶第一单克隆抗体加入到0.5ml硼酸缓冲液中混匀后，缓慢滴加到胶体金中，继续搅拌20min。然后缓慢滴加10％(W/V)的牛血清蛋白至终浓度为l％(W/V)，继续搅拌1h。4℃静置过夜，终止反应。反应结束后，4℃条件下15000转/分钟离心1h，弃上清液。将沉淀悬浮于原体积1/10的1％(W/V)的牛血清蛋白溶液中得到胶体金标记的含人髓过氧化物酶第一单克隆抗体的溶液，将所述溶液使用喷金点膜机均匀的以15μL/cm的喷涂速度均匀喷于玻璃纤维素膜上，于37℃干燥120min够得到标记抗体垫。
将6mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.5％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：5混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到胶体金标记的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条。
实施例2
将含铕聚苯乙烯荧光微球使用0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液稀释为0.04mg/ml浓度，然后加入终浓度为2mM的EDC(碳化二亚胺)和终浓度为5mM的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)室温下反应15min后以15000转/分离心去除上清液。向沉淀中加入1.7μL浓度为6mg/mL的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体，室温下反应4h，然后加入含有2％(W/V)甘氨酸、1％(W/V)牛血清白蛋白的0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液处理30min，离心去除上清液，再向沉淀中加入1％(W/V)牛血清白蛋白的0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液悬浮得到含铕聚苯乙烯荧光微球标记的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体溶液。将所述溶液使用喷金点膜机均匀的以15μL/cm的喷涂速度均匀喷于玻璃纤维素膜上，于37℃干燥120min得到标记抗体垫。
将6mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.5％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：5混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条。
对比例1
通过与实施例2相同的方法制备得到标记抗体垫。
使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将1mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干1.5h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条。
对比例2
通过与实施例2相同的方法制备得到标记抗体垫。
将6mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.5体积％的EDC(碳化二亚胺)磷酸盐缓冲液按照体积比1：5混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将EDC(碳化二亚胺)/抗体包被溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条。
对比例3
通过与实施例2相同的方法制备得到标记抗体垫。
将6mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.2％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：5混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条。
对比例4
通过与实施例2相同的方法制备得到标记抗体垫。
将6mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和1％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：5混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；使用浓度为0.02M且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪以1.0μL/cm的喷涂速度均匀喷于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔1.0cm，随后置于37℃烘干2h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.02M浓度的pH7.4磷酸盐缓冲液中漂洗5次、含有0.5％(W/V)牛血清白蛋白和4％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液处理15min、双蒸水中漂洗3次，完成后于37℃放置120min干燥，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
将300mm的无纺布作为吸收垫、300mm的标记抗体垫、300mm的抗体包被硝酸纤维素膜、300mm的吸水滤纸依次连接组装起来，制备得到人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条。
测试实施例1
本测试实施例用于实施例1-2中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条和对比例1中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的阴阳性检测试验。
分别滴加含有10ng/mL人髓过氧化物酶的PBS溶液作为阳性溶液，不含有人髓过氧化物酶的PBS溶液作为阴性溶液在实施例和对比例中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的样品吸收垫上，水平静置15min后，检测免疫层析试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)状态。其中，人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条于荧光检测装置下检测其状态。
实验结果的判断：免疫层析试纸条T线处出现红色条带或荧光条带为阳性，记为“+”；T线处不出现红色条带或荧光条带，C线处出现红色条带或荧光条带为阴性，记为“－”。具体结果见表1。
表1
含有人髓过氧化物酶 不含有人髓过氧化物酶
实施例1 + -
实施例2 + -
对比例1 - -
对比例2 - -
对比例3 - -
对比例4 + +
经表1中实施例1-2与对比例1-4比较可以看出，本公开制备得到的免疫层析试纸条，可以对10ng/mL的人髓过氧化物酶PBS溶液呈现出阳性反应，灵敏性好。
测试实施例2
本测试实施例用于检测实施例1-2中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条和对比例1中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的特异性。
分别滴加含有10ng/mL人髓过氧化物酶、含有60mg/ml人血清白蛋白、100ng/ml癌胚抗原、1.6mg/mL高密度脂蛋白HDL的溶液在实施例和对比例中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的样品吸收垫上，水平静置15min后，检测免疫层析试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)状态。其中，人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条于荧光检测装置下检测其状态。
实验结果的判断：免疫层析试纸条T线处出现红色条带或荧光条带为阳性，记为“+”；T线处不出现红色条带或荧光条带，C线处出现红色条带或荧光条带为阴性，记为“－”。具体结果见表2。
表2
人髓过氧化物酶 人血清白蛋白 癌胚抗原 高密度脂蛋白HDL
实施例1 + － － －
实施例2 + － － －
对比例1 － － － －
对比例2 － － － －
对比例3 － － － －
对比例4 + － － +
经表2中实施例1-2与对比例1-4比较可以看出，本公开制备得到的免疫层析试纸条的具有极好的特异性，不结合其他非目标蛋白。
测试实施例3
本测试实施例用于检测实施例1-2中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条和对比例1中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的敏感性。
将100ng/mL人髓过氧化物酶的标准溶液分别稀释为1/2、1/8、1/16、1/32标准溶液。
分别滴加不同浓度的人髓过氧化物酶的溶液在实施例和对比例中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的样品吸收垫上，水平静置15min后，检测免疫层析试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)状态。其中，人髓过氧化物酶含铕聚苯乙烯荧光微球标记的免疫层析试纸条于荧光检测装置下检测其状态。
实验结果的判断：免疫层析试纸条T线处出现红色条带或荧光条带为阳性，记为“+”；T线处不出现红色条带或荧光条带，C线处出现红色条带或荧光条带为阴性，记为“－”。具体结果见表3。
表3
1 1/2 1/8 1/16 1/32
实施例1 + + + + －
实施例2 + + + + －
对比例1 + + － － －
对比例2 + + － － －
对比例3 + + － － －
对比例4 + + － － －
经表3中实施例1-2、对比例1-4比较可以看出，本公开制备得到的免疫层析试纸条灵敏度达到了6.25ng/mL，远低于使用其他方法制备得到的免疫层析试纸条，同时3-氨基丙基三乙氧基硅烷的使用量也是影响免疫层析试纸条灵敏度的重要因素。
测试实施例4
本测试实施例用于检测实施例1-2中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条和对比例1中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的稳定性。
分别取4个不同批次生产的实施例1-2、对比例1中制备方法制备的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条置于4℃保存，隔4周后检测阳性溶液和阴性溶液各5份。
实验结果的判断：免疫层析试纸条T线处出现红色条带或荧光条带为阳性，记为“+”；T线处不出现红色条带或荧光条带，C线处出现红色条带或荧光条带为阴性，记为“－”。具体结果见表4。
表4
经表4中实施例1-2、对比例1-4中不同方法制备得到的不同批次的免疫层析试纸条的比较可以看出，本公开制备方法得到的免疫层析试纸条具有较好的稳定性，有效控制了批间差。
测试实施例5
本测试实施例用于说明实施例2中人髓过氧化物酶免疫层析试纸条用于测定未知溶液中人髓过氧化物酶的浓度。
标准曲线绘制：将25μg/mL人髓过氧化物酶的标准溶液分别稀释为10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml人髓过氧化物酶标准溶液。分别滴加不同浓度的人髓过氧化物酶的溶液在实施例和对比例中制备得到的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的样品吸收垫上，水平静置15min后，使用荧光检测装置检测免疫层析试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)荧光强度并绘制出标准曲线，标准曲线以T线/C线荧光强度的比值为纵坐标，人髓过氧化物酶标准溶液的浓度为横坐标，建立方程并拟合标准曲线，将标准曲线整合于荧光检测装置荧光强度分析软件中。
样品检测：将待测样品滴加到免疫层析试纸条，水平静置15min。然后用荧光检测装置检测，根据已整合仪器软件的标准曲线计算得出所述的样品中的人髓过氧化物酶的浓度。
检测结果验证：将待测样品使用人髓过氧化物酶(酶联免疫法)浓度测定试剂盒(购自北京协和洛克生物技术有限责任公司)测定浓度，使用方法见说明书。具体结果见表5。
表5
样品1 样品2 样品3
酶联免疫法检测 25.5±1.0ng/mL 100.7±2.0ng/mL 400.8±4.5ng/mL
本法验证结果 26.5±1.2ng/mL 104.5±2.5ng/mL 405.0±4.0ng/mL
误差 4％ 3.8％ 1.0％
经表5中数据可以看出本公开制备的含铕荧光微球标记的人髓过氧化物酶免疫层析试纸条可以用于测定未知溶液中人髓过氧化物酶的浓度，并且经验证证明本公开免疫层析试纸条检测出的浓度和误差小于5％。
以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种人髓过氧化物酶免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述免疫层析试纸条包括依次相连接的样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫；所述标记抗体垫中含有60-80μg的胶体金或荧光标记的人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体；所述制备方法包括抗体包被硝酸纤维素膜的制备和免疫层析试纸条的组装，所述抗体包被硝酸纤维素膜的制备包括如下步骤：
S1.将1-2mg/mL的人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体溶液和0.3-0.7％(W/V)的3-氨基丙基三乙氧基硅烷磷酸盐缓冲液按照体积比1：(4-6)混合均匀，得到3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液；
S2.使用浓度为0.01-0.03M且pH值为7.2-7.6的磷酸盐缓冲液稀释兔抗鼠IgG至0.5-1.0mg/mL，得到兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液；
S3.将3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的一处作为检测线，并且将兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液使用定点喷膜仪均匀喷雾于硝酸纤维素膜上的另一处作为质控线，检测线与质控线之间间隔0.5cm-1.0cm，随后置于36-38℃烘干1.5-2.5h，得到烘干后的硝酸纤维素膜；
S4.烘干后的硝酸纤维素膜在室温下依次置于0.01-0.03M且pH值为7.1-7.6的磷酸盐缓冲液、含有0.4-0.6％(W/V)牛血清白蛋白和3-5％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液、双蒸水中漂洗，漂洗完成后于36-38℃通风干燥100-140min，得到抗体包被硝酸纤维素膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S3中所述3-氨基丙基三乙氧基硅烷/抗体包被溶液与兔抗鼠IgG磷酸盐缓冲液的喷涂速度为0.8-1.2μL/cm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S4中使用所述0.01-0.03M且pH值为7.1-7.6磷酸盐缓冲液漂洗2-4次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S4中使用含有0.4-0.6％(W/V)牛血清白蛋白和3-5％(W/V)蔗糖的磷酸盐缓冲液漂洗10-20min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，步骤S4中使用双蒸水漂洗2-4次。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述样品垫、标记抗体垫、抗体包被硝酸纤维素膜和吸收垫的长度比为(15-20):(10-12):(22-26):(18-22)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述样品垫为无纺布、聚酯膜、纤维素滤纸或玻璃纤维素膜；所述标记抗体垫为玻璃纤维素膜、聚酯膜、纤维素滤纸或无纺布；所述荧光标记为含镧系元素的聚苯乙烯荧光微球。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述人髓过氧化物酶的第一单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号为18B7的单克隆抗体；人髓过氧化物酶的第二单克隆抗体为购自Hytest公司克隆号为4B3的单克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述吸收垫为吸水滤纸。
10.权利要求1-9中任意一项制备方法制备得到的人髓过氧化物酶的免疫层析试纸条。
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