CN111269317B - 固体支持物包被mpo的方法及其产品与应用 - Google Patents

固体支持物包被mpo的方法及其产品与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，提供了一种固体支持物包被MPO的方法及其产品与应用。本发明提供一种固体支持物包被MPO的方法，在硼酸盐缓冲液的环境中，将MPO包被在固体支持物上，得到包被产物。发明人针对MPO这一抗原进行研究，提供本发明的包被方法，同时发现不同的包被环境，包被效果并不相同，现有技术中多数采用的缓冲液主要适用于抗体的包被，对于MPO的包被效率并不高。在硼酸盐缓冲液作为包被环境时，固体支持物包被MPO效率高，得到的包被产物反应性能好，精密度高，同时稳定性得到显著提高。

Description

固体支持物包被MPO的方法及其产品与应用
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种固体支持物包被MPO的方法及其产品与应用。
背景技术
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎(AAV)是一类累及肾、肺等多器官的自身免疫性小血管炎。该类疾病临床表现复杂多样但无特异性，易漏诊和误诊，约1/3的患者的诊断延迟超过6个月；同时AAV病情进展快且凶险，未经治疗的患者1年病死率高达80％；而经过治疗后，患者5年存活率约75％。因此AAV的准确诊断对临床极为重要。ANCA作为AAV的血清学标志物，在AAV的诊断中发挥着不可替代的作用，并被中华医学会风湿学分会纳入诊断和治疗指南。ANCA中阳性率最高的是抗髓过氧化物酶(MPO)抗体和抗蛋白酶3(PR3)抗体。而在我国，ANCA阳性患者抗MPO抗体阳性率明显高于抗PR3抗体(5.1-7.5倍)。另外，抗MPO抗体阳性患者起病更急、肾损伤更快、急性期死亡率更高且慢性化病变较严重。因此，抗MPO抗体的准确检测在我国有重要意义。
然而，目前的MPO抗体检测效果较差，灵敏度和准确性都有待提高，主要原因在于检测的试剂性能较差，固体支持物包被MPO的效果较低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种固体支持物包被MPO的方法。
本发明的第二目的在于提供上述方法得到的包被产物。
本发明的第三目的在于提供上述包被产物的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种固体支持物包被MPO的方法，在硼酸盐缓冲液的环境中，将MPO包被在固体支持物上，得到包被产物。
进一步地，所述MPO为不含有heme的重组MPO。
进一步地，所述硼酸盐缓冲液的pH为8.0-9.0。
进一步地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100-200mmol/L；
优选地，所述包被产物的保存液包括PBST、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中的一种或多种。
进一步地，固体支持物的材质包括塑料、磁性金属或玻璃；
优选地，固体支持物的构型包括微粒、珠子、试管、膜、微孔滴定板或芯片；
优选地，固体支持物包括磁性微粒、微孔滴定板、硝酸纤维素膜或聚苯乙烯胶乳，例如羧基磁珠；
优选地，磁性微粒与MPO的比例为(40-60个)：(10-25ng)。
进一步地，对固体支持物进行活化后，再将MPO包被在固体支持物上。
进一步地，将MPO包被在固体支持物上后，还包括封闭的步骤，再得到包被产物；
优选地，所述封闭用封闭蛋白为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或小牛血清；
优选地，所述封闭用缓冲液包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
上述方法得到的包被产物。
上述包被产物在制备免疫诊断试剂中的应用。
上述包被产物在荧光免疫分析、ELISA、化学发光免疫分析或免疫层析中的应用，优选为荧光免疫分析，进一步优选藻红蛋白为标记物的荧光免疫分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种固体支持物包被MPO的方法，在硼酸盐缓冲液的环境中，将MPO包被在固体支持物上，得到包被产物。发明人针对MPO这一抗原进行研究，提供本发明的包被方法，同时发现不同的包被环境，包被效果并不相同，现有技术中多数采用的缓冲液主要适用于抗体的包被，对于MPO的包被效率并不高。在硼酸盐缓冲液作为包被环境时，固体支持物包被MPO效率高，得到的包被产物反应性能好，精密度高，同时稳定性得到显著提高。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
一种固体支持物包被MPO的方法，在硼酸盐缓冲液的环境中，将MPO包被在固体支持物上，得到包被产物。
发明人发现不同的包被环境，包被效果并不相同，现有技术中多数采用的缓冲液主要适用于抗体的包被，对于MPO的包被效率并不高。发明人针对MPO这一抗原进行研究，在对MPO的包被工艺进行了诸多探索后，提供了本发明的包被方法，在硼酸盐缓冲液作为包被环境时，固体支持物包被MPO效率高，得到的包被产物反应性能好，精密度高，同时稳定性得到显著提高。此外，该包被条件对其他抗原的包被过程适用性低。因此，硼酸盐缓冲溶液对MPO包被固体支持物的专属性较强。
需要说明的是，本发明中固体支持物又称固相载体，在免疫检测中，固体支持物上包被有特异性结合的部分，以实现目的检测物的捕获与分离。固体支持物的材质可以是塑料、磁性金属、玻璃等等，构型可以是微粒、珠子、试管、膜、微孔滴定板或芯片等等，固体支持物具体可以为磁性微粒、微孔滴定板、硝酸纤维素膜或聚苯乙烯胶乳等等。
可以理解的是，本发明是针对MPO这一特定抗原，在需要与固体支持物进行包被这一方案提供的包被方法，也就是说，在免疫检测或诊断试剂中需要固体支持物包被MPO抗原时，包被环境为硼酸盐缓冲液可以显著提高包被效率，提高包被产物的性能和稳定性。
此外，MPO是一种强过氧化物酶，可以催化过氧化氢氧化底物，从而存在影响检测信号的可能性，并且heme(血红素)可以有效地淬灭荧光蛋白的荧光，所以当包被产物用于荧光检测分析中时，MPO优选为不含有heme的重组MPO。该重组MPO的反应性较天然抗原高，同时抗原表位完整，同时又避免了其活性中心heme对荧光判读的影响。
在优选地实施方式中，硼酸盐缓冲液的pH为8.0-9.0。硼酸盐缓冲液的pH典型但非限制性的为8.0、8.2、8.4、8.6、8.8或9.0。硼酸盐缓冲液的pH会对包被效果产生较大的影响，本发明提供的pH范围内包被效果较好。
在优选地实施方式中，硼酸盐缓冲液以足以实现其预期功能的量存在，即维持所需的pH。硼酸盐缓冲液的浓度为100-200mmol/L。硼酸盐缓冲液的浓度例如为100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L、160mmol/L、180mmol/L或200mmol/L。
在优选地实施方式中，固体支持物包括磁性微粒、微孔滴定板、硝酸纤维素膜或聚苯乙烯胶乳，例如羧基磁珠。
在优选地实施方式中，固体支持物为磁性微粒(磁珠)时，磁珠与MPO的包被用量比例优选为(40-60个)：(10-25ng)。该比例可以但不限于40个：10ng、40个：25ng、60个：10ng、60个：25ng或50个：20ng。发明人通过研究发现磁珠与MPO的用量比会对包被的效果产生影响，在本发明提供的包被用量比例范围内，包被效果较好。
在优选地实施方式中，对固体支持物进行活化后，再将MPO包被在固体支持物上。例如固体支持物为羧基磁珠时，可以先用NHS和EDC对磁珠先进行活化，再将MPO包被在固体支持物上。
在优选地实施方式中，将MPO包被在固体支持物上后，还包括封闭的步骤，再得到包被产物。本发明中封闭可以为本领域常规的封闭方法，在此不做特定的限定，优选为使用BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或小牛血清等等对固体支持物进行封闭。封闭蛋白的使用浓度为足够量的。
在可选的实施方式中，包被产物保存于PBST缓冲液中。
本发明还保护上述方法得到的包被产物。
本发明还保护上述包被产物在制备免疫诊断试剂中的应用。
本发明还保护上述包被产物在荧光免疫分析、ELISA、化学发光免疫分析或免疫层析中的应用，优选为荧光免疫分析，进一步优选藻红蛋白为标记物的荧光免疫分析。
需要说明的是，使用藻红蛋白为标记物，并应用于荧光免疫分析系统，该分析系统与化学发光相比不需要底物、酶等参与，节约成本且信噪比高、背景极低。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例中部分材料与仪器如下：
羧化磁微粒：表面含有羧基；
重组表达的MPO(不含有heme)：纯度大于99％；
天然提取的MPO：纯度大于96％；
藻红蛋白标记的抗人IgG抗体：抗人IgG抗体来源于鼠；
血清样本：由合作医院提供；
试剂：2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、三羟甲基氨基甲烷、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸、醋酸钠、硼砂、硼酸、Tween20、牛血清白蛋白和其它试剂应达到分析纯；
恒温混匀仪、磁力架、恒温振荡器、磁力板，判读仪。
实施例1、羧化磁微粒包被MPO抗原
包被方法
(1)取50000个羧化磁微粒(1000人份)，磁分离去上清，用100mM MES缓冲液(pH6.0)洗涤2遍，再采用152μL MES缓冲液(pH 6.0)重悬；
(2)加入28μL新鲜配制的NHS(50mg/mL)，涡旋混匀，再加入20μL新鲜配制的EDC(50mg/mL)，在室温下震荡50min(1000rpm/min)；
(3)采用100mM硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0-9.0)洗涤2遍，再用200μL 100mM硼酸盐缓冲溶液(pH 8.0-9.0)重悬；
(4)按20ng/人份的用量加入重组表达的MPO抗原，在室温下震荡2.5h(1500rpm/min)；
(5)采用含0.5％tween-20的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)；
(6)采用封闭液(含1％BSA牛血清白蛋白)洗涤2遍，加入500μL封闭液，在室温下震荡1h(1000rpm/min)；
(7)采用PBST(含1％BSA牛血清白蛋白)洗涤后悬浮待用。
实施例2性能检测
测试方法
(1)取50μL磁微粒(含50个磁微粒)于透明材质的96孔板，加入50μL采用PBST(含1％BSA牛血清白蛋白)预稀释50倍的血清样本，于37℃条件下振荡15分钟；
(2)采用磁力板吸附磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；
(3)加入50μL藻红蛋白标记的抗人IgG抗体，于37℃条件下振荡15分钟；
(4)采用磁力板吸附磁微粒，移除反应液后，用PBST洗涤2遍；
(5)采用PBST悬浮并采用判读仪读取荧光信号值。
测试结果
(1)反应性考察
Figure BDA0002382725830000071
通过34份不同抗MPO抗体滴度的样本可以看出，阴性样本本底较低，弱阳性样本有较强的荧光信号，阳性、强阳性样本的荧光信号呈递增趋势。
(2)精密度考察
Figure BDA0002382725830000081
对同一份样本测试10次，其变异系数在5％以内，测试重复性较优。
(3)37℃加速稳定性考察
Figure BDA0002382725830000082
Figure BDA0002382725830000091
包被抗原的磁微粒经37℃加速七天后，强、中、弱阳样本反应性下降不多，依然可以检出；阴性样本背景干净。总的来说，加速稳定性合格。
(4)液相稳定性考察
Figure BDA0002382725830000092
包被抗原的磁微粒在4℃存放4周后，强、中、弱阳样本反应性下降不多，均可以检出；阴性样本背景干净。
结论：采用本工艺包被的磁微粒对于不同滴度的样本区分度较好，且测试重复性较优，稳定性(冻干加速稳定性和液相稳定性)良好。
实施例3、包被缓冲液筛选
按照实施例1的包被方法，其中，步骤(3)中分别采用2-吗啉乙磺酸(MES，pH 5.0)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH 8.0)、磷酸盐(PBS，pH 7.4)、硼酸盐(pH 8.0)、碳酸盐(CB，pH 9.6)、醋酸盐(pH 5.1)或柠檬酸盐(pH5.0)为包被缓冲液进行包被，并考察其反应性，结果如下所示。
Figure BDA0002382725830000101
测试结果表明，在100mM硼酸盐缓冲液(pH 8.0)中包被的磁微粒对于弱阳、阳性、强阳性样本反应性最高(相对于阴性样本，其荧光信号值较高)，且具有最好的区分度，同时背景干净。因此，该种包被缓冲液效果最佳。
结论：与2-吗啉乙磺酸(pH5.0)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(pH8.0)、磷酸盐(pH7.4)、碳酸盐(pH9.6)、醋酸盐(pH5.1)和柠檬酸盐(pH5.0)缓冲液相比，硼酸盐缓冲溶液(pH8.0)包被效果最优。
实施例4、包被缓冲液pH筛选
参考实施例1，包被方法第(3)步中的包被缓冲液(硼酸盐缓冲液)pH采用8.0、9.0、10.0或11.0。
Figure BDA0002382725830000111
测试结果表明，当硼酸盐缓冲溶液pH为8.0或9.0时，强、中、弱阳性样本反应性较高(相对于阴性样本，其荧光信号值较高)，且对不同滴度样本的区分最好；因此该条件下包被效果最佳。
结论：硼酸盐缓冲溶液pH为8.0-9.0时，包被效果较优。
实施例5、包被缓冲液浓度筛选
参考实施例1，包被方法第(3)步中的包被缓冲液浓度采用20、50、100或200mM。
Figure BDA0002382725830000112
测试结果表明，当包被缓冲溶液浓度为100或200mM时，反应性最优；浓度下降时，反应性降低。考虑到低值样本的反应性及成本，优选为100mM。
结论：硼酸盐缓冲溶液浓度优选100-200mM，进一步优选为100mM。
实施例6、抗原用量筛选
参考实施例1，包被方法第(4)步中的抗原用量分别采用10、15、20、25、30、35或40ng/人份。
Figure BDA0002382725830000121
测试结果表明，当抗原用量为20ng/人份时，反应性最高；抗原用量高于或低于20ng/人份时，反应性均降低。
结论：抗原用量优选为10-25ng/人份，进一步优选为20ng/人份。
实施例7、对比天然提取MPO，考察重组表达MPO淬灭荧光情况
参考实施例1，包被方法第(4)步中的抗原分别采用天然提取MPO、重组表达MPO，按照实施例2中检测方法第(5)步中待测板分别放置于暗室0、0.5、1、1.5、2、2.5、3h后开始检测。
测试结果
(1)淬灭荧光情况考察
Figure BDA0002382725830000131
Figure BDA0002382725830000141
测试结果表明，包被重组表达MPO的磁微粒，反应性较高且样本经过3h的放置后均可以检出，这表明重组表达MPO(不含heme辅基)对藻红蛋白荧光的淬灭能力得到有效地抑制；而天然提取MPO反应性较差，且放置1.5h后大部分样本已无法有效检出。这表明对于使用藻红蛋白(荧光蛋白)标记抗人IgG二抗检测方法，使用重组表达MPO作为原料更为合适。
实施例8、组氨酰tRNA合成酶抗原采用硼酸盐缓冲液包被
参考实施例1，包被方法第(3)步中的包被缓冲液采用硼酸盐或柠檬酸盐缓冲液，第(4)步中的抗原由MPO抗原更换为组氨酰tRNA合成酶。
反应性考察
Figure BDA0002382725830000142
Figure BDA0002382725830000151
测试结果表明，组氨酰tRNA合成酶抗原采用100mM硼酸盐缓冲溶液包被后的反应性较差，而采用100mM柠檬酸缓冲溶液包被后的反应性较优，说明不同抗原在不同缓冲液中的构象存在差异，特定缓冲液无法通用。
结论：硼酸盐缓冲液适用于MPO抗原与磁微粒的包被，包被效果显著。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (12)

1.一种固体支持物包被髓过氧化物酶的方法，其特征在于，在硼酸盐缓冲液的环境中，将髓过氧化物酶包被在固体支持物上，得到包被产物；
所述硼酸盐缓冲液的pH为8.0-9.0；所述硼酸盐缓冲液的浓度为100-200mmol/L；
固体支持物为磁性微粒，磁性微粒与髓过氧化物酶的比例为50个：（10-25ng）；
所述髓过氧化物酶为人细胞表达出来的且不含有heme的重组髓过氧化物酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述包被产物的保存液包括PBST、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磁性微粒为羧基磁珠。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，对固体支持物进行活化后，再将髓过氧化物酶包被在固体支持物上。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，将髓过氧化物酶包被在固体支持物上后，还包括封闭的步骤，再得到包被产物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述封闭用封闭蛋白为BSA、脱脂奶粉、酪蛋白或小牛血清。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述封闭用缓冲液包括磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液、三乙醇胺缓冲液或4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液。
8.权利要求1-7任一项所述的方法得到的包被产物。
9.权利要求8所述的包被产物在制备免疫诊断试剂中的应用。
10.权利要求8所述的包被产物在制备荧光免疫分析、ELISA、化学发光免疫分析或免疫层析的产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品为荧光免疫分析产品。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述产品为藻红蛋白为标记物的荧光免疫分析产品。
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