JP2002523758A - Ｓ１００に対するモノクローナル抗体 - Google Patents
Ｓ１００に対するモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００に対する新規モノクローナル抗体と、総Ｓ１００の測定のため、または血清、血漿、脳脊髄液および他の体液中のＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測定用の、イムノアッセイの開発のためのこれら抗体の使用に関する。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００に対する新規モノクローナル抗
体と、総Ｓ１００の測定のため、または血清、血漿、脳脊髄液および他の体液中
のＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測定用の、イムノアッセイの開発の
ためのこれら抗体の使用に関する。
体と、総Ｓ１００の測定のため、または血清、血漿、脳脊髄液および他の体液中
のＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測定用の、イムノアッセイの開発の
ためのこれら抗体の使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） Ｓ１００は、ＥＦ−ハンドカルシウム結合タンパク質のＳ１００／カルモジュ
リン／トロポニンＣスーパーファミリーに属する２１ｋＤａのタンパク質である
（論評については、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４
１７−４２９、１９９５参照）。Ｓ１００は初めＭｏｏｒｅおよび共同研究者ら
によりヒト脳から単離され、当初は脳特異的タンパク質と考えられていた（Ｍｏ
ｏｒｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９：７３
９−７４４、１９６５）。今日、アミノ酸配列および機能的類似性に基づきＳ１
００ファミリーの１６のメンバーが同定されている（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉ
ｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４１７−４２９、１９９５）。
リン／トロポニンＣスーパーファミリーに属する２１ｋＤａのタンパク質である
（論評については、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４
１７−４２９、１９９５参照）。Ｓ１００は初めＭｏｏｒｅおよび共同研究者ら
によりヒト脳から単離され、当初は脳特異的タンパク質と考えられていた（Ｍｏ
ｏｒｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９：７３
９−７４４、１９６５）。今日、アミノ酸配列および機能的類似性に基づきＳ１
００ファミリーの１６のメンバーが同定されている（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉ
ｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４１７−４２９、１９９５）。
【０００３】 脳組織のＳ１００は、αおよびβサブユニットのホモおよびヘテロダイマーか
らなる。αおよびβサブユニットは、高度の配列および種相同性を示す（Ｉｓｏ
ｂｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９：３７９−３８８、１９７８；Ｉ
ｓｏｂｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：７９−８６、１９８１）。
Ｓ１００ββは、高濃度でグリア細胞およびシュワン細胞に存在し、一方、Ｓ１
００αβは、グリア細胞に発現されるが、シュワン細胞には発現されない（Ｉｓ
ｏｂｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ４３：１４９４−１４９６、１９８４）。
Ｓ１００ααは、神経細胞に存在するが、主に骨格筋、腎臓および心臓などの脳
外組織に発現される（ＫａｔｏおよびＫｉｍｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ａｃｔａ ８４２：１４６−１５２、１９８５）。少量のＳ１００が、
異なる正常なヒト組織：皮膚、軟骨細胞、脾臓、脂肪組織、腎臓、心臓、骨格筋
、並びに、異なる悪性組織；悪性黒色腫、神経膠腫、および軟組織腫瘍に存在す
る（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４１７−４２９、
１９９５）。
らなる。αおよびβサブユニットは、高度の配列および種相同性を示す（Ｉｓｏ
ｂｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９：３７９−３８８、１９７８；Ｉ
ｓｏｂｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１６：７９−８６、１９８１）。
Ｓ１００ββは、高濃度でグリア細胞およびシュワン細胞に存在し、一方、Ｓ１
００αβは、グリア細胞に発現されるが、シュワン細胞には発現されない（Ｉｓ
ｏｂｅら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ４３：１４９４−１４９６、１９８４）。
Ｓ１００ααは、神経細胞に存在するが、主に骨格筋、腎臓および心臓などの脳
外組織に発現される（ＫａｔｏおよびＫｉｍｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ Ａｃｔａ ８４２：１４６−１５２、１９８５）。少量のＳ１００が、
異なる正常なヒト組織：皮膚、軟骨細胞、脾臓、脂肪組織、腎臓、心臓、骨格筋
、並びに、異なる悪性組織；悪性黒色腫、神経膠腫、および軟組織腫瘍に存在す
る（Ｚｉｍｍｅｒら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ ３７：４１７−４２９、
１９９５）。
【０００４】 血清および脳脊髄液中のＳ１００の測定は、脳外傷患者の管理に、および心肺
バイパス手術後の神経学的合併症の評価に有用であることが示された（Ｍｉｃｈ
ｅｔｔｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．４４：７３１−７４３ １９８０；Ｐ
ｅｒｓｓｏｎら、Ｓｔｒｏｋｅ １８：９１１−９１８、１９８７；Ｉｎｇｅｂ
ｒｉｇｈｔｓｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．５
９：１０３−１０４、１９９５；Ｗｅｓｔａｂｙら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓ
ｕｒｇ ６１：８８−９２、１９９６）。Ｓ１００の血清学的測定も、追跡調査
や、悪性黒色腫の患者の予後情報を得るのに有用であることが示された（Ｈｅｎ
ｚｅら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １９４：２０８−２１２、１９９７；Ｂｕｅ
ｒら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、７５：１３７３−１３７６、１９９７）。様々
な障害が、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの総量の変化またはＳ１００の異な
るアイソフォーム間の比の変化に関連し得る。それ故、Ｓ１００αβおよびＳ１
００ββの総量の測定、並びに、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの相異なるア
イソフォームの測定のための、正確な方法が必要である。
バイパス手術後の神経学的合併症の評価に有用であることが示された（Ｍｉｃｈ
ｅｔｔｉら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．４４：７３１−７４３ １９８０；Ｐ
ｅｒｓｓｏｎら、Ｓｔｒｏｋｅ １８：９１１−９１８、１９８７；Ｉｎｇｅｂ
ｒｉｇｈｔｓｅｎら、Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．５
９：１０３−１０４、１９９５；Ｗｅｓｔａｂｙら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓ
ｕｒｇ ６１：８８−９２、１９９６）。Ｓ１００の血清学的測定も、追跡調査
や、悪性黒色腫の患者の予後情報を得るのに有用であることが示された（Ｈｅｎ
ｚｅら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １９４：２０８−２１２、１９９７；Ｂｕｅ
ｒら、Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、７５：１３７３−１３７６、１９９７）。様々
な障害が、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの総量の変化またはＳ１００の異な
るアイソフォーム間の比の変化に関連し得る。それ故、Ｓ１００αβおよびＳ１
００ββの総量の測定、並びに、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの相異なるア
イソフォームの測定のための、正確な方法が必要である。
【０００５】 ＷＯ９８／０１４７１は、Ｓ１００の総量を測定する方法を開示する。この方
法は、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの個々のアイソフォームの量の情報は得
られないという大きな欠点をもつ１ステップを含み、Ｓ１００αβおよびＳ１０
０ββに対する応答は同一ではなく、従って本発明に記載のアッセイにより総Ｓ
１００（すなわちＳ１００αβとＳ１００ββの合計）がより正確に測定される
。本発明に記載の方法により、Ｓ１００の総量はより正確に測定される。なぜな
ら、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββは、２つの別々のステップで定量され、個
々のステップでアイソフォームＳ１００αβおよびＳ１００ββの特異的定量が
なされるからである。本発明に記載の方法により、２つのアイソフォームＳ１０
０αβおよびＳ１００ββの濃度の正確な情報が得られる。
法は、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββの個々のアイソフォームの量の情報は得
られないという大きな欠点をもつ１ステップを含み、Ｓ１００αβおよびＳ１０
０ββに対する応答は同一ではなく、従って本発明に記載のアッセイにより総Ｓ
１００（すなわちＳ１００αβとＳ１００ββの合計）がより正確に測定される
。本発明に記載の方法により、Ｓ１００の総量はより正確に測定される。なぜな
ら、Ｓ１００αβおよびＳ１００ββは、２つの別々のステップで定量され、個
々のステップでアイソフォームＳ１００αβおよびＳ１００ββの特異的定量が
なされるからである。本発明に記載の方法により、２つのアイソフォームＳ１０
０αβおよびＳ１００ββの濃度の正確な情報が得られる。
【０００６】 （発明の要約） 本発明は、Ｓ１００に対するモノクローナル抗体、並びに、Ｓ１００αβおよ
びＳ１００ββの総量の測定およびＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測
定（すなわちＳ１００αβまたはＳ１００ββのいずれかに特異的）のためのイ
ムノアッセイの設計を提供する。
びＳ１００ββの総量の測定およびＳ１００の異なるアイソフォームの特異的測
定（すなわちＳ１００αβまたはＳ１００ββのいずれかに特異的）のためのイ
ムノアッセイの設計を提供する。
【０００７】 本発明は、脳傷害患者の対応、神経変性疾患、並びに、悪性黒色腫、神経膠腫
およびある軟組織腫瘍の患者の追跡調査における、総Ｓ１００の血清学的測定お
よびＳ１００の異なるアイソフォームの測定に有用である。
およびある軟組織腫瘍の患者の追跡調査における、総Ｓ１００の血清学的測定お
よびＳ１００の異なるアイソフォームの測定に有用である。
【０００８】 （具体的な実施例の説明） 本発明は、Ｓ１００に対する新規モノクローナル抗体、並びに、血清、血漿、
脳脊髄液または他の体液中のＳ１００を定量するためのイムノアッセイの設計を
提供する。
脳脊髄液または他の体液中のＳ１００を定量するためのイムノアッセイの設計を
提供する。
【０００９】 該方法は、Ｓ１００の特異的エピトープに対するモノクローナル抗体の確立、
総Ｓ１００の定量のためのイムノアッセイ、Ｓ１００αβに特異的なイムノアッ
セイ、およびＳ１００ββに特異的なイムノアッセイの設計におけるこれらの抗
体の使用を含む。
総Ｓ１００の定量のためのイムノアッセイ、Ｓ１００αβに特異的なイムノアッ
セイ、およびＳ１００ββに特異的なイムノアッセイの設計におけるこれらの抗
体の使用を含む。
【００１０】 イムノアッセイは、免疫（非競合的）アッセイフォーマット用に設計されるが
、これに限定されない。本発明に記載の抗体は、競合的アッセイフォーマットに
も使用し得る。該イムノアッセイは、Ｓ１００の捕獲および検出に、Ｓ１００β
の特異的エピトープに対するモノクローナル抗体を使用するが、これに限定され
ない。本発明では、モノクローナル抗体が好ましいが、本発明に記載のアッセイ
に、ポリクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、本発明により提供されるモノ
クローナル抗体と実質的に同じ結合特異性をもつタンパク質またはＤＮＡ断片を
使用してもよい。
、これに限定されない。本発明に記載の抗体は、競合的アッセイフォーマットに
も使用し得る。該イムノアッセイは、Ｓ１００の捕獲および検出に、Ｓ１００β
の特異的エピトープに対するモノクローナル抗体を使用するが、これに限定され
ない。本発明では、モノクローナル抗体が好ましいが、本発明に記載のアッセイ
に、ポリクローナル抗体、ペプチド、タンパク質、本発明により提供されるモノ
クローナル抗体と実質的に同じ結合特異性をもつタンパク質またはＤＮＡ断片を
使用してもよい。
【００１１】 さらに、該イムノアッセイは、サンプル中のＳ１００を吸着させるための、Ｓ
１００モノクローナル抗体を含む固相を使用するが、これに限定されない。固相
は、マイクロタイタープレートのウェル、プラスチックチューブ、ビーズ、磁気
粒子またはその他であり得る。固相は、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン
等から製造し得る。捕獲抗体は、物理的吸着、共有結合またはビオチン−アビジ
ン橋を介して、またはその他により（これに限定されない）、当業者に一般的な
既知の方法を使用して、固相に結合させ得る。
１００モノクローナル抗体を含む固相を使用するが、これに限定されない。固相
は、マイクロタイタープレートのウェル、プラスチックチューブ、ビーズ、磁気
粒子またはその他であり得る。固相は、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン
等から製造し得る。捕獲抗体は、物理的吸着、共有結合またはビオチン−アビジ
ン橋を介して、またはその他により（これに限定されない）、当業者に一般的な
既知の方法を使用して、固相に結合させ得る。
【００１２】 本発明では、多種多様の標識が、Ｓ１００の検出に適している。特に関心が高
い酵素としては、加水分解酵素、特にエステラーゼおよびグリコシダーゼ、並び
に酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼを含む。また、放射性標識（例えば１２
５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ等）、蛍光化合物（例えばフルオレセインおよびそ
の誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ランタ
ニド誘導体等）並びに化学発光剤（例えばルシフェリン、ルミノール、アクリジ
ニウムエステル等）も適している。
い酵素としては、加水分解酵素、特にエステラーゼおよびグリコシダーゼ、並び
に酸化還元酵素、特にペルオキシダーゼを含む。また、放射性標識（例えば１２
５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３Ｈ等）、蛍光化合物（例えばフルオレセインおよびそ
の誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ランタ
ニド誘導体等）並びに化学発光剤（例えばルシフェリン、ルミノール、アクリジ
ニウムエステル等）も適している。
【００１３】 本発明に記載のアッセイは、任意の２エピトープアッセイ型式；２ステップの
フォワードサンドイッチアッセイ、１ステップのサンドイッチアッセイまたはバ
ックワードサンドイッチアッセイで実施できる。
フォワードサンドイッチアッセイ、１ステップのサンドイッチアッセイまたはバ
ックワードサンドイッチアッセイで実施できる。
【００１４】 本発明に記載のアッセイの実施において、サンプル（好ましくは１〜１０００
μＬ）を、捕獲抗Ｓ１００ＭＡｂを含む試験容器中でインキュベートする。好ま
しい構成では、サンプルは、血清、血漿または脳脊髄液からなる。本発明に従っ
て、サンプルおよびＳ１００ＭＡｂを、Ｓ１００抗原の捕獲Ｓ１００ＭＡｂへの
結合が可能な条件下でインキュベートする。好ましい構成では、捕獲抗体をビオ
チン−ストレプトアビジン橋を介して固相に固定させる。固相に結合した抗体に
吸着したＳ１００抗原の検出のため、Ｓ１００の独立的エピトープに対して指向
させた標識モノクローナル抗体を加え、抗体のＳ１００抗体複合体への結合が可
能な条件下で試験容器中でインキュベートする。洗浄後、標識を、使用する標識
に適切な系で検出する。
μＬ）を、捕獲抗Ｓ１００ＭＡｂを含む試験容器中でインキュベートする。好ま
しい構成では、サンプルは、血清、血漿または脳脊髄液からなる。本発明に従っ
て、サンプルおよびＳ１００ＭＡｂを、Ｓ１００抗原の捕獲Ｓ１００ＭＡｂへの
結合が可能な条件下でインキュベートする。好ましい構成では、捕獲抗体をビオ
チン−ストレプトアビジン橋を介して固相に固定させる。固相に結合した抗体に
吸着したＳ１００抗原の検出のため、Ｓ１００の独立的エピトープに対して指向
させた標識モノクローナル抗体を加え、抗体のＳ１００抗体複合体への結合が可
能な条件下で試験容器中でインキュベートする。洗浄後、標識を、使用する標識
に適切な系で検出する。
【００１５】 本発明は、捕獲抗体として使用するＳ１００の異なるアイソフォームに特異的
な抗体、並びに、検出抗体として使用する、エピトープが、該捕獲抗体のエピト
ープと重複していない抗体を提供する（実施例２．３ｂ参照）。捕獲および検出
抗体の選択に応じて、好ましい特異性をもつイムノアッセイ、すなわち、Ｓ１０
０αβを特異的に定量するアッセイ、およびＳ１００ββを特異的に定量するア
ッセイを設計し得る。
な抗体、並びに、検出抗体として使用する、エピトープが、該捕獲抗体のエピト
ープと重複していない抗体を提供する（実施例２．３ｂ参照）。捕獲および検出
抗体の選択に応じて、好ましい特異性をもつイムノアッセイ、すなわち、Ｓ１０
０αβを特異的に定量するアッセイ、およびＳ１００ββを特異的に定量するア
ッセイを設計し得る。
【００１６】 本発明に記載のモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０
：３、Ｓ２１：４、Ｓ２３：２、およびＳ３５：２は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｃｅｎｔ
ｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、ソールズベリー、ウィルトシャー州ＳＰ４ ０ＪＧ、英国）に寄託され、ＥＣ
ＡＣＣ信託番号９８０８２６１９、９８０８２６１８、９８０８２６１７および
９８０８２６１６をそれぞれ割当てられた。これらの寄託は、１９９８年８月２
６日になされた。また本発明は、実施例２．３ｂに概略を示した阻害試験により
測定したところ問題の抗体の結合を＞７５％阻害することから示されるように、
ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ３５：２、Ｓ２３：２、およびＳ２１：４
により産生される抗体と同じ結合特異性をもつ、抗体、抗体断片またはペプチド
も含んでいる。
：３、Ｓ２１：４、Ｓ２３：２、およびＳ３５：２は、ＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｃｅｎｔ
ｒｅ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ
、ソールズベリー、ウィルトシャー州ＳＰ４ ０ＪＧ、英国）に寄託され、ＥＣ
ＡＣＣ信託番号９８０８２６１９、９８０８２６１８、９８０８２６１７および
９８０８２６１６をそれぞれ割当てられた。これらの寄託は、１９９８年８月２
６日になされた。また本発明は、実施例２．３ｂに概略を示した阻害試験により
測定したところ問題の抗体の結合を＞７５％阻害することから示されるように、
ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ３５：２、Ｓ２３：２、およびＳ２１：４
により産生される抗体と同じ結合特異性をもつ、抗体、抗体断片またはペプチド
も含んでいる。
【００１７】 本発明を、ここで以下の非制限的な実施例および添付の図面を参照してより詳
細に記載する。
細に記載する。
【００１８】 （実施例１） ハイブリドーマの確立およびＳ１００特異的モノクローナル抗体の産生 Ｓ１００ββは、例えば、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、英国；Ｃａ
ｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国；Ｈｙ
Ｔｅｓｔ、フィンランド、などのいくつかの業者から市販で入手できる。市販で
入手できるＳ１００ββは、モノクローナル抗体の確立のために免疫原として使
用し得る。Ｓ１００ββはまた、文献で入手できる方法に従って、ヒトまたはウ
シ脳から単離してもよい（Ｍｏｏｒｅ、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：
５３−７４、１９８２）。
ｌｂｉｏｃｈｅｍ、米国；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国；Ｈｙ
Ｔｅｓｔ、フィンランド、などのいくつかの業者から市販で入手できる。市販で
入手できるＳ１００ββは、モノクローナル抗体の確立のために免疫原として使
用し得る。Ｓ１００ββはまた、文献で入手できる方法に従って、ヒトまたはウ
シ脳から単離してもよい（Ｍｏｏｒｅ、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：
５３−７４、１９８２）。
【００１９】 好ましい手順では、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、リビアジュバント中１０〜５０μ
ｇのＳ１００ββを用いて腹腔内免疫化した。免疫化と、同抗原またはＳ１００
ββ／Ｓ１００αβの混合物を用いた６０〜９０日間中の３〜４回の追加免疫の
後に、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、記載のようにＰ３×６３Ａｇ８骨髄腫細
胞と融合させた（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１：１７８−１８１、１９８３）。
ｇのＳ１００ββを用いて腹腔内免疫化した。免疫化と、同抗原またはＳ１００
ββ／Ｓ１００αβの混合物を用いた６０〜９０日間中の３〜４回の追加免疫の
後に、免疫化マウス由来の脾臓細胞を、記載のようにＰ３×６３Ａｇ８骨髄腫細
胞と融合させた（Ｌｉｎｄｈｏｌｍら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒｇｙ ａ
ｎｄ Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１：１７８−１８１、１９８３）。
【００２０】 マウスＩｇＧ＋Ｍに対するアフィニティー精製ポリクローナル抗血清で被膜し
たマイクロタイターウェル中で、ハイブリドーマ上清をスクリーニングすること
により、Ｓ１００と反応する抗体を産生するハイブリドーマを選抜した（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓ Ｌａｂ、米国）。次いで、ウェルをＳ１００
ββ抗原と共にインキュベートし、洗浄後、結合したＳ１００抗原をポリクロー
ナルウサギ抗Ｓ１００およびＨＲＰ標識ブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ ＡＳ、デ
ンマーク）と共にインキュベートすることにより検出した。
たマイクロタイターウェル中で、ハイブリドーマ上清をスクリーニングすること
により、Ｓ１００と反応する抗体を産生するハイブリドーマを選抜した（Ｊａｃ
ｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓ Ｌａｂ、米国）。次いで、ウェルをＳ１００
ββ抗原と共にインキュベートし、洗浄後、結合したＳ１００抗原をポリクロー
ナルウサギ抗Ｓ１００およびＨＲＰ標識ブタ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ ＡＳ、デ
ンマーク）と共にインキュベートすることにより検出した。
【００２１】 Ｓ１００ββおよびＳ１００αβとは反応性を示すが、Ｓ１００ααには陰性
である抗体を産生するクローンを、限界希釈により２回クローン化した。モノク
ローナル抗体は、ローラーボトル中、ＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清中１０４細胞
／ｍＬの接種による、ハイブリドーマクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により産
生し、１０〜１４日間増殖させた。次いで、モノクローナル抗体を、製造業者の
薦めによりプロテインＡ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ、ダラム、英国
）アフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から精製した。
である抗体を産生するクローンを、限界希釈により２回クローン化した。モノク
ローナル抗体は、ローラーボトル中、ＤＭＥＭ、５％ウシ胎児血清中１０４細胞
／ｍＬの接種による、ハイブリドーマクローンのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養により産
生し、１０〜１４日間増殖させた。次いで、モノクローナル抗体を、製造業者の
薦めによりプロテインＡ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ、ダラム、英国
）アフィニティークロマトグラフィーにより培養培地から精製した。
【００２２】 ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、Ｓ２１：４、Ｓ２３：２、およびＳ３５：
２によりそれぞれ産生されるＳ１０、Ｓ２１、Ｓ２３およびＳ３５モノクローナ
ル抗体（ＭＡｂ）を、本発明に記載のイムノアッセイの設計用に選抜した。
２によりそれぞれ産生されるＳ１０、Ｓ２１、Ｓ２３およびＳ３５モノクローナ
ル抗体（ＭＡｂ）を、本発明に記載のイムノアッセイの設計用に選抜した。
【００２３】 （実施例２） 抗体の性質決定 ２．１ アイソタイプの定量 抗体のアイソタイプは、マウスＩｇＧ＋Ａ＋Ｍ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．Ｉ
ｎｃ、カリフォルニア州、米国）に対する抗体で被膜したマイクロタイタープレ
ートに、確立された抗体を吸着させた後に測定した。次に、マウスＩｇＧ１、マ
ウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、マウスＩｇＡおよびマウ
スＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．Ｉｎｃ、カリフォルニア州、米国）に特異
的なＨＲＰ標識抗体と共にインキュベートすることと、ＯＰＤ基質と共にインキ
ュベートすることと、４５０ｎｍのＯＤを測定することにより、アイソタイプを
検出した。本発明に記載の全抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプであることが判明し
た。
ｎｃ、カリフォルニア州、米国）に対する抗体で被膜したマイクロタイタープレ
ートに、確立された抗体を吸着させた後に測定した。次に、マウスＩｇＧ１、マ
ウスＩｇＧ２ａ、マウスＩｇＧ２ｂ、マウスＩｇＧ３、マウスＩｇＡおよびマウ
スＩｇＭ抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂ．Ｉｎｃ、カリフォルニア州、米国）に特異
的なＨＲＰ標識抗体と共にインキュベートすることと、ＯＰＤ基質と共にインキ
ュベートすることと、４５０ｎｍのＯＤを測定することにより、アイソタイプを
検出した。本発明に記載の全抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプであることが判明し
た。
【００２４】 ２．２ Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααとの反応性 確立されたＳ１００ＭＡｂ：ｓのＳ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００
ααとの反応性は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で、マイクロタイタープレートの
ウェルに吸着させたＳ１００ＭＡｂを用いて、精製Ｓ１００抗原と共にインキュ
ベートし、結合したＳ１００をポリクローナルウサギ抗Ｓ１００次いでＨＲＰブ
タ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ ＡＳ、デンマーク）で検出することにより測定した
。
ααとの反応性は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で、マイクロタイタープレートの
ウェルに吸着させたＳ１００ＭＡｂを用いて、精製Ｓ１００抗原と共にインキュ
ベートし、結合したＳ１００をポリクローナルウサギ抗Ｓ１００次いでＨＲＰブ
タ抗ウサギＩｇ（Ｄａｋｏ ＡＳ、デンマーク）で検出することにより測定した
。
【００２５】 Ｓ１００ＭＡｂ溶液を室温で一晩インキュベートすることにより、Ｓ１００Ｍ
Ａｂをヌンク・マキシソープ・イムノプレート（Ｎｕｎｃ ＡＳ、デンマーク）
のウェル内に被膜させた（２００μＬ／ウェル、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４中１
０μｇ ＭＡｂ／ｍＬ）。洗浄後、３００μＬ／ウェルの５０ｍＭトリス（ｐＨ
７．８）、０．１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、６０ｇ／Ｌソルビトールと共にインキュベー
トすることにより、非特異的結合を遮断した。
Ａｂをヌンク・マキシソープ・イムノプレート（Ｎｕｎｃ ＡＳ、デンマーク）
のウェル内に被膜させた（２００μＬ／ウェル、０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４中１
０μｇ ＭＡｂ／ｍＬ）。洗浄後、３００μＬ／ウェルの５０ｍＭトリス（ｐＨ
７．８）、０．１ｇ／Ｌ ＢＳＡ、６０ｇ／Ｌソルビトールと共にインキュベー
トすることにより、非特異的結合を遮断した。
【００２６】 ＥＩＡでは、５０μＬのＳ１００ββ、Ｓ１００αβ、またはＳ１００αα（
５０μｇ／Ｌ）、（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．英国）、および１００
μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ、０．５ｇ／ＬウシＩｇ、０．１ｇ／Ｌメチルイソチアゾロン、ｐＨ７．
７５）を、二回繰り返しで、Ｓ１００ＭＡｂ被膜マイクロタイターウェル内でイ
ンキュベートした。常に振盪しながら１時間インキュベートした後、ウェルを２
回洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１／３０００に希
釈した、１００μＬのウサギ抗ヒトＳ１００（Ｄａｋｏ ＡＳ、デンマーク）を
加え、１時間インキュベートを続けた。さらに洗浄した後、結合ウサギ抗Ｓ１０
０を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で１／５００に希釈したＨＲＰブタ抗ウサギＩｇ（
Ｄａｋｏ ＡＳ）と共に１時間インキュベートし、洗浄後、１００μＬの３，３
’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｅｌｉｓａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、レキシントン、ケンタッキー州、米国）と共にインキュベー
トした後にＯＤ６２０ｎｍを測定することにより決定した。
５０μｇ／Ｌ）、（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓ．Ｉｎｃ．英国）、および１００
μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ
ＢＳＡ、０．５ｇ／ＬウシＩｇ、０．１ｇ／Ｌメチルイソチアゾロン、ｐＨ７．
７５）を、二回繰り返しで、Ｓ１００ＭＡｂ被膜マイクロタイターウェル内でイ
ンキュベートした。常に振盪しながら１時間インキュベートした後、ウェルを２
回洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中で１／３０００に希
釈した、１００μＬのウサギ抗ヒトＳ１００（Ｄａｋｏ ＡＳ、デンマーク）を
加え、１時間インキュベートを続けた。さらに洗浄した後、結合ウサギ抗Ｓ１０
０を、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で１／５００に希釈したＨＲＰブタ抗ウサギＩｇ（
Ｄａｋｏ ＡＳ）と共に１時間インキュベートし、洗浄後、１００μＬの３，３
’、５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（Ｅｌｉｓａ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ、レキシントン、ケンタッキー州、米国）と共にインキュベー
トした後にＯＤ６２０ｎｍを測定することにより決定した。
【００２７】 免疫測定法型式での選択Ｓ１００ＭＡｂ：ｓの反応性を、図１に示す。これら
の結果は以下の通りである： Ａ群のＳ３５ＭＡｂ（実施例２．４参照）は、Ｓ１００αβでは到達可能だが
、Ｓ１００ααおよびＳ１００ββでは到達できないエピトープを認識する。
の結果は以下の通りである： Ａ群のＳ３５ＭＡｂ（実施例２．４参照）は、Ｓ１００αβでは到達可能だが
、Ｓ１００ααおよびＳ１００ββでは到達できないエピトープを認識する。
【００２８】 Ｂ群のＳ２１ＭＡｂは、Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの両方では到達可能
だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
【００２９】 Ｃ群のＳ２３ＭＡｂは、Ｓ１００ββおよびＳ１００αβでは等価に到達可能
だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
だが、Ｓ１００ααでは到達できないエピトープを認識する。
【００３０】 Ｅ群のＳ１０ＭＡｂは、Ｓ１００ββのみでは到達可能だが、Ｓ１００ααお
よびＳ１００αβでは到達できないエピトープを認識する。
よびＳ１００αβでは到達できないエピトープを認識する。
【００３１】 ２．３ エピトープ性質決定 可能なサンドイッチ組合せの決定（実施例２．３ａ）、並びにＳ１００ββお
よびＳ１００αβの結合の阻害（実施例２．３ｂ）により、異なるＳ１００ＭＡ
ｂの抗原性ドメイン間の構造的関係が性質決定された。
よびＳ１００αβの結合の阻害（実施例２．３ｂ）により、異なるＳ１００ＭＡ
ｂの抗原性ドメイン間の構造的関係が性質決定された。
【００３２】 ２．３ａ 異種Ｓ１００ＥＩＡの用量反応曲線 Ｓ１００ＥＩＡ：ｓは、上記のようにマイクロタイターウェルに被膜させたＳ
１００ＭＡｂ、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｓ１００
ＭＡｂを用いて設計した。Ｓ１００ＭＡｂ：ｓは、Ｎａｋｏｎｅ（Ｎａｋｏｎｅ
およびＫａｗａｏｉ、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２２：１０
８４−１０８９、１９７４）の手順に従って、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国）で標識した。
１００ＭＡｂ、およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識Ｓ１００
ＭＡｂを用いて設計した。Ｓ１００ＭＡｂ：ｓは、Ｎａｋｏｎｅ（Ｎａｋｏｎｅ
およびＫａｗａｏｉ、Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２２：１０
８４−１０８９、１９７４）の手順に従って、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、米国）で標識した。
【００３３】 Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの用量反応曲線は、以下のように決定した：
５０μＬのＳ１００ββまたはＳ１００αβ（０〜１００μｇ／Ｌ）＋１００μ
Ｌのアッセイ緩衝液を、二回繰り返し、ＭＡｂ被膜ウェル中で１時間、常に振盪
しながらインキュベートした。洗浄後、１００μＬのＨＲＰ Ｓ１００ＭＡｂ（
２μｇ／ｍＬ）を加え、１時間インキュベートし続けた。洗浄し、１００μＬ
ＴＭＢ基質と共にインキュベートした後、ＯＤを、ＥＬＩＳＡ解読器で６２０ｎ
ｍで測定した。
５０μＬのＳ１００ββまたはＳ１００αβ（０〜１００μｇ／Ｌ）＋１００μ
Ｌのアッセイ緩衝液を、二回繰り返し、ＭＡｂ被膜ウェル中で１時間、常に振盪
しながらインキュベートした。洗浄後、１００μＬのＨＲＰ Ｓ１００ＭＡｂ（
２μｇ／ｍＬ）を加え、１時間インキュベートし続けた。洗浄し、１００μＬ
ＴＭＢ基質と共にインキュベートした後、ＯＤを、ＥＬＩＳＡ解読器で６２０ｎ
ｍで測定した。
【００３４】 ２．３ｂ Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの結合の阻害 本発明に記載の異なる抗体のエピトープ間の３次元関係を推定するため、阻害
試験を実施した。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が阻害される
場合、２つの抗体のエピトープは、三次元構造で重複しているか、または近接し
ている。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が影響を受けない場合
、２つの抗体のエピトープは互いに異なる。
試験を実施した。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が阻害される
場合、２つの抗体のエピトープは、三次元構造で重複しているか、または近接し
ている。第二抗体の、第一抗体と抗原間の複合体への結合が影響を受けない場合
、２つの抗体のエピトープは互いに異なる。
【００３５】 Ｓ１００ββおよびＳ１００αβの、Ｓ１００ＭＡｂへの結合の阻害は、マイ
クロタイタープレート中、５０μＬ Ｓ１００ββまたはＳ１００αβ（５０μ
ｇ／Ｌ）＋１００μＬのＳ１００ＭＡｂ（５μｇ／ｍＬ）を３０分間インキュベ
ートすることにより試験し、対照として、５０μＬ Ｓ１００抗原＋１００μＬ
ＰＢＳ−１％ＢＳＡを、同じように事前にインキュベートした。事前にインキ
ュベートした後、１００μＬを、試験するＳ１００ＭＡｂで被膜した別のマイク
ロタイタープレートに移し、１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＳ１
００抗原を、ウサギ抗ヒトＳ１００およびＨＲＰ ＳｗＡＲと共にインキュベー
トすることにより検出した。
クロタイタープレート中、５０μＬ Ｓ１００ββまたはＳ１００αβ（５０μ
ｇ／Ｌ）＋１００μＬのＳ１００ＭＡｂ（５μｇ／ｍＬ）を３０分間インキュベ
ートすることにより試験し、対照として、５０μＬ Ｓ１００抗原＋１００μＬ
ＰＢＳ−１％ＢＳＡを、同じように事前にインキュベートした。事前にインキ
ュベートした後、１００μＬを、試験するＳ１００ＭＡｂで被膜した別のマイク
ロタイタープレートに移し、１時間インキュベートした。洗浄後、結合したＳ１
００抗原を、ウサギ抗ヒトＳ１００およびＨＲＰ ＳｗＡＲと共にインキュベー
トすることにより検出した。
【００３６】 阻害は、ＰＢＳ−１％ＢＳＡと共に事前にインキュベートしたＳ１００抗原と
比較した、Ｓ１００ＭＡｂで事前にインキュベートしたＳ１００抗原の結合の減
少％として計算した。
比較した、Ｓ１００ＭＡｂで事前にインキュベートしたＳ１００抗原の結合の減
少％として計算した。
【００３７】 阻害は、捕獲および阻害抗体として全ての抗体を用いて実施した。選択したＭ
Ａｂ：ｓの阻害のいくつかの結果を、図２に示す。Ｓ３５ＭＡｂ（図２Ａ）は、
それ自体、Ｓ３４、およびＳ７２によってのみ阻害された。ＭＡｂ（図２Ｂ）は
、それ自体、Ｓ５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ２１、Ｓ４９、Ｓ５０、Ｓ５３、Ｓ５４
、Ｓ５５、Ｓ５９、Ｓ６０、Ｓ６２、Ｓ６７、Ｓ６６、Ｓ７７、およびＳ８３に
より阻害された。Ｓ２３ＭＡｂ（図２Ｃ）は、それ自体によってのみ阻害され、
すなわち独特なエピトープは認識するが、任意の他の確立されたＭＡｂ：ｓによ
っては認識されない。Ｓ２５ ＭＡｂ（図２Ｄ）は、それ自体、Ｓ１１、Ｓ２５
、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ４４、Ｓ５８、およびＳ６５により阻害された。
Ｓ３６ ＭＡｂ（図２Ｅ）は、それ自体、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ５８、お
よびＳ６５により阻害された。さらに、Ｓ３６ＭＡｂは、部分的に、Ｓ１１、Ｓ
２５およびＳ４４により阻害された。Ｓ１０ＭＡｂ（図２Ｆ）は、それ自体、Ｓ
１２およびＳ１３によってのみ阻害された。
Ａｂ：ｓの阻害のいくつかの結果を、図２に示す。Ｓ３５ＭＡｂ（図２Ａ）は、
それ自体、Ｓ３４、およびＳ７２によってのみ阻害された。ＭＡｂ（図２Ｂ）は
、それ自体、Ｓ５、Ｓ１６、Ｓ１８、Ｓ２１、Ｓ４９、Ｓ５０、Ｓ５３、Ｓ５４
、Ｓ５５、Ｓ５９、Ｓ６０、Ｓ６２、Ｓ６７、Ｓ６６、Ｓ７７、およびＳ８３に
より阻害された。Ｓ２３ＭＡｂ（図２Ｃ）は、それ自体によってのみ阻害され、
すなわち独特なエピトープは認識するが、任意の他の確立されたＭＡｂ：ｓによ
っては認識されない。Ｓ２５ ＭＡｂ（図２Ｄ）は、それ自体、Ｓ１１、Ｓ２５
、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ４４、Ｓ５８、およびＳ６５により阻害された。
Ｓ３６ ＭＡｂ（図２Ｅ）は、それ自体、Ｓ２８、Ｓ３６、Ｓ４３、Ｓ５８、お
よびＳ６５により阻害された。さらに、Ｓ３６ＭＡｂは、部分的に、Ｓ１１、Ｓ
２５およびＳ４４により阻害された。Ｓ１０ＭＡｂ（図２Ｆ）は、それ自体、Ｓ
１２およびＳ１３によってのみ阻害された。
【００３８】 ２．４ 抗原ドメイン 精製Ｓ１００アイソフォームとの反応性（実施例２．２）、Ｓ１００の結合の
阻害（実施例２．３ｂ）、および異なる抗体組合せの用量反応（実施例２．３ａ
）に基づいて、異なるエピトープ群のＡ〜Ｅ群（表１）に抗体を区分した。同じ
エピトープ群に属する抗体、すなわち、重複したエピトープを有する抗体は、互
いに＞７５％阻害した。異なるエピトープ群に属する抗体、すなわち互いに別々
のエピトープをもつ抗体は互いに＜４０％阻害した。異なる亜群への分離は、ど
の抗体が抗原と最初に反応するか、およびどの抗体が形成された抗原−抗体複合
体と反応するかに応じて阻害が異なる場合、すなわち部分的な阻害（４０〜７５
％）が起こる場合に実施した。
阻害（実施例２．３ｂ）、および異なる抗体組合せの用量反応（実施例２．３ａ
）に基づいて、異なるエピトープ群のＡ〜Ｅ群（表１）に抗体を区分した。同じ
エピトープ群に属する抗体、すなわち、重複したエピトープを有する抗体は、互
いに＞７５％阻害した。異なるエピトープ群に属する抗体、すなわち互いに別々
のエピトープをもつ抗体は互いに＜４０％阻害した。異なる亜群への分離は、ど
の抗体が抗原と最初に反応するか、およびどの抗体が形成された抗原−抗体複合
体と反応するかに応じて阻害が異なる場合、すなわち部分的な阻害（４０〜７５
％）が起こる場合に実施した。
【００３９】
【表１】
【００４０】 （実施例３） アッセイの特異性は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｔｄ、英国か
ら得た、精製Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααを用いた用量反応
曲線の決定により確認した。
ら得た、精製Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααを用いた用量反応
曲線の決定により確認した。
【００４１】 凍結乾燥抗原を、蒸留水で復元し、１μｇ／μＬの濃度とした。
【００４２】 抗原の純度は、製造業者の指示に従って、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐｈａｓｔ
ｓｙｓｔｅｍを使用して８〜２５％ポリアクリルアミドゲル上での還元および非
還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、クーマシーブリリアントブルー
で染色した。染色の評価を基に、抗原の純度は＞９５％純粋と推定された。
ｓｙｓｔｅｍを使用して８〜２５％ポリアクリルアミドゲル上での還元および非
還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより試験し、クーマシーブリリアントブルー
で染色した。染色の評価を基に、抗原の純度は＞９５％純粋と推定された。
【００４３】 ３．１ Ｓ１００ββを特異的測定のためのアッセイ Ｓ１００αβおよびＳ１００ααと有意な反応性を示さずＳ１００ββに特異
的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せた、Ｅ群の抗体を使用して設
計した。好ましい構成では、Ｓ１０ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡ
ｂまたはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せた、Ｅ群の抗体を使用して設
計した。好ましい構成では、Ｓ１０ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡ
ｂまたはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
【００４４】 実施例３．１ Ｓ１００ββに特異的なＥＩＡの開発 Ｓ１０ＭＡｂを、標準的な手順を使用して、ビオチンＮＨＲＳカプロン酸エス
テル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）でビオチン標識し、捕獲抗
体として使用した。
テル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）でビオチン標識し、捕獲抗
体として使用した。
【００４５】 Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂを、Ｎａｋｏｎｅ手順の修飾形に従って、Ｈ
ＲＰ，Ｖ型（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）と結合させた。
ＲＰ，Ｖ型（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）と結合させた。
【００４６】 ビオチン標識Ｓ１０ＭＡｂおよびＨＲＰ結合Ｓ２３またはＳ２１ＭＡｂを、以
下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した。
下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した。
【００４７】 アッセイ手順： １． ストレプトアビジン被膜マイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅ
ｍｓ Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（Ｐ
ＢＳ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬの
ビオチンＳ１０ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
ｍｓ Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（Ｐ
ＢＳ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬの
ビオチンＳ１０ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
【００４８】 ２． 振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００４９】 ３． ３回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５
）で洗浄する。
）で洗浄する。
【００５０】 ４． １００μＬ ＨＲＰ Ｓ２３ＭＡｂ（または１００μＬ ＨＲＰ Ｓ２
１ＭＡｂ）（アッセイ緩衝液中２μｇ／ｍＬ）を加える。
１ＭＡｂ）（アッセイ緩衝液中２μｇ／ｍＬ）を加える。
【００５１】 ５． 振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００５２】 ６． ６回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５
）で洗浄する。
）で洗浄する。
【００５３】 ７． １００μＬ ＴＭＢ（ＥＬＩＳＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を加
える。
える。
【００５４】 ８． ３０分間±５分間インキュベートする。
【００５５】 ９． ＥＬＩＳＡ解読器でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００５６】 Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααの用量反応曲線を図３に示す
。用量反応曲線に基づくと、本実施例に記載のアッセイは、Ｓ１００ββに特異
的であり、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααに対してそれぞれ＜５％および＜２
％の交差反応性を示す。
。用量反応曲線に基づくと、本実施例に記載のアッセイは、Ｓ１００ββに特異
的であり、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααに対してそれぞれ＜５％および＜２
％の交差反応性を示す。
【００５７】 ３．２ Ｓ１００αβを特異的測定のためのアッセイ Ｓ１００ββおよびＳ１００ααと有意な反応性を示さずＳ１００αβに特異
的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せたＡ群の抗体を使用して設計
した。好ましい構成では、Ｓ３５ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡｂ
またはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
的なアッセイを、Ｃ群またはＢ１群の抗体と組合せたＡ群の抗体を使用して設計
した。好ましい構成では、Ｓ３５ＭＡｂを捕獲抗体として使用し、Ｓ２３ＭＡｂ
またはＳ２１ＭＡｂを検出抗体として使用した。
【００５８】 実施例３．２ Ｓ１００αβに特異的なＥＩＡの開発 Ｓ３５ＭＡｂは、標準的な手順を使用し、ビオチンＮＨＲＳカプロン酸エステ
ル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）でビオチン標識して、捕獲抗
体として使用した。Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂは、Ｎａｋｏｎｅ手順の改
変法を使用し、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）と
結合させた。
ル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）でビオチン標識して、捕獲抗
体として使用した。Ｓ２３ＭＡｂまたはＳ２１ＭＡｂは、Ｎａｋｏｎｅ手順の改
変法を使用し、ＨＲＰ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ、米国）と
結合させた。
【００５９】 ビオチン標識Ｓ３５ＭＡｂおよびＨＲＰ結合Ｓ２３またはＳ２１ＭＡｂを、以
下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した： １．ストレプトアビジン被膜マイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（ＰＢ
Ｓ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬのビ
オチンＳ３５ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
下のプロトコルに従って２部位ＥＩＡに使用した： １．ストレプトアビジン被膜マイクロタイタープレート（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ
ｓ Ｏｙ、ヘルシンキ、フィンランド）に、５０μＬのＳ１００標準物質（ＰＢ
Ｓ中０〜１００μｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ ＢＳＡ、ｐＨ７．２）＋１００μＬのビ
オチンＳ３５ＭＡｂ（アッセイ緩衝液中２μｇ／Ｌ）を加える。
【００６０】 ２．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００６１】 ３．３回、５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）
で洗浄する。
で洗浄する。
【００６２】 ４．１００μＬ ＨＲＰ Ｓ２３ＭＡｂ（または１００μＬ ＨＲＰ Ｓ２１
ＭＡｂ）を、アッセイ緩衝液中で２μｇ／ｍＬだけ加える。
ＭＡｂ）を、アッセイ緩衝液中で２μｇ／ｍＬだけ加える。
【００６３】 ５．振盪しながら１時間±１０分間インキュベートする。
【００６４】 ６．５ｍＭトリス緩衝液、０．０５％Ｔｗｅｅｎ４０（ｐＨ７．７５）で６回
洗浄する。
洗浄する。
【００６５】 ７．１００μＬ ＴＭＢ（ＥＬＩＳＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）を加え
る。
る。
【００６６】 ８．３０分間±５分間インキュベートする。
【００６７】 ９．ＥＬＩＳＡ解読器でＯＤ６２０ｎｍを測定する。
【００６８】 Ｓ１００ββ、Ｓ１００αβおよびＳ１００ααの用量反応曲線を図５に示す
。３．３に記載の抗体に基づき、Ｓ１００αβに特異的で、Ｓ１００ββおよび
Ｓ１００ααにそれぞれ＜１０％および＜２％の交差反応性を示すイムノアッセ
イを設計し得る。
。３．３に記載の抗体に基づき、Ｓ１００αβに特異的で、Ｓ１００ββおよび
Ｓ１００ααにそれぞれ＜１０％および＜２％の交差反応性を示すイムノアッセ
イを設計し得る。
【００６９】 実施例３．１および３．２のアッセイの結果を要約すると、総Ｓ１００、すな
わちＳ１００αβおよびＳ１００ββの合計が得られる。
わちＳ１００αβおよびＳ１００ββの合計が得られる。
【００７０】 （文献） Ｂｕｅｒ Ｊ，Ｐｒｏｂｓｔ Ｍ，Ｆｒａｎｚｋｅ Ａ，Ｄｕｅｎｓｉｎｇ Ａ
，Ｄｕｅｎｓｉｎｇ Ｓ， Ｈａｉｎｄｌ Ｊ， Ｖｏｌｋｅｎａｎｄｔ Ｍ，
Ｗｉｔｔｋｅ Ｆ，Ｈｏｆｆｍａｎ Ｒ，Ｇａｎｓｅｒ Ａ，Ａｔｚｐｏｄｉ
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ｏｅｎｉ Ｒ，Ｂｕｒｇ Ｇ．１９９７．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ １９４：２
０８−２１２． Ｉｎｇｅｂｒｉｇｔｓｅｎ Ｔ．，Ｒｏｍｎｅｒ Ｂ，Ｋｏｎｇｓｔａｄ Ｐ．
，Ｌａｎｇｂａｋｋ Ｂ．，１９９５．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ
．Ｐｓｙｃｈ．５９：１０３−１０４． Ｉｓｏｂｅ Ｔ，Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ．，１９７８．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．８９：３７９−３８８． Ｉｓｏｂｅ Ｔ，Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ．１９８１．Ｅｕｒ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．１１６：７９−８６． Ｉｓｏｂｅ Ｔ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，Ｏｋｕｙａｍａ Ｔ．１８４．Ｊ
Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．４３：１４９４−１４９６． Ｋａｔｏ Ｋ．，Ｋｉｍｕｒａ Ｓ．１９８５．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ ８４２：１４６−１５０． Ｌｉｎｄｈｏｌｍ Ｌ．，Ｈｏｌｍｇｒｅｎ Ｊ，Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ
，Ｆｒｅｄｍａｎ Ｐ，Ｎｉｌｓｓｏｎ Ｏ，Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｂ，Ｍｙｒｖｏ
ｌｄ Ｈ，Ｌａｇｅｒｇａｒｄ Ｔ．１９８３．Ｉｎｔ Ａｒｃｈ Ａｌｌｅｒ
ｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１：１７８−１８１． Ｍｉｃｈｅｔｔｉ Ｆ．，Ｍａｓｓａｒｏ Ａ，Ｒｕｓｓｏ Ｇ．，Ｒｉｇｏｎ
Ｏ．１９８０．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ ４４：７３１−７４３． Ｍｏｏｒｅ ＢＷ．１９６５．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．１９：７３９−７４４． Ｍｏｏｒｅ ＢＷ．１９８２．Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：５３−７
４． Ｎａｋａｅ ＰＫ，Ｋａｗａｏｉ Ａ，１９７４．Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃ
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Ｅｓｓｃｈｅｒ Ｔ．，Ｐａｈｌｍａｎ Ｓ．１９８７．Ｓｔｒｏｋｅ １８：
９１１−９１８． Ｗｅｓｔａｂｙ Ｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｐ，Ｐａｒｒｙ ＡＪ，Ｂｌｏｍｑｕｉ
ｓｔ Ｓ，Ｓｏｌｅｍ ＪＯ，Ａｌｌｉｎｇ Ａ，Ｐｉｌｌａｉ Ｒ．，Ｔａｇ
ｇａｒｔ ＤＰ，Ｇｒｅｂｅｎｉｋ Ｃ，Ｓｔａｈｌ Ｅ．１９９６．Ａｎｎ
Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６１：８８−９２． Ｚｉｍｍｅｒ ＤＢ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＥＨ，Ｌａｎｄａｒ Ａ ａｎｄ Ｓ
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．
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９１１−９１８． Ｗｅｓｔａｂｙ Ｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｐ，Ｐａｒｒｙ ＡＪ，Ｂｌｏｍｑｕｉ
ｓｔ Ｓ，Ｓｏｌｅｍ ＪＯ，Ａｌｌｉｎｇ Ａ，Ｐｉｌｌａｉ Ｒ．，Ｔａｇ
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Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ６１：８８−９２． Ｚｉｍｍｅｒ ＤＢ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ ＥＨ，Ｌａｎｄａｒ Ａ ａｎｄ Ｓ
ｏｎｇ Ｗ．１９９５．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ ３７：４１７−４２９
．
【図１】 図１は免疫測定法における、選択されたＳ１００ＭＡｂの、精製Ｓ１００ββ
、Ｓ１００αβ、およびＳ１００ααとの反応性を示す。この反応性は実施例２
．２に記載のように測定される。
、Ｓ１００αβ、およびＳ１００ααとの反応性を示す。この反応性は実施例２
．２に記載のように測定される。
【図２】 図２は、実施例２．３ｂに記載の、選択されたＳ１００ＭＡｂ：ｓの阻害を示
す。
す。
【図３】 図３は、実施例３．１に記載のように設計された、捕獲抗体としてビオチンＳ
１０ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００ββに
特異的なアッセイのステップを示す。
１０ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００ββに
特異的なアッセイのステップを示す。
【図４】 図４は、実施例３．２に記載のように設計された、捕獲抗体としてビオチンＳ
３５ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００αβに
特異的なアッセイのステップを示す。
３５ＭＡｂを、検出抗体としてＨＲＰＳ２３ＭＡｂを使用した、Ｓ１００αβに
特異的なアッセイのステップを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 GA03 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA91X AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 CA40 DA76 EA50 FA72 GA26
Claims (14)
- 【請求項１】 サンプル中のＳ１００αβおよびＳ１００ββの総量を定量
する方法であって、 ａ）サンプルの一部分取と、Ｓ１００ββでは到達可能だがＳ１００ααおよ
びＳ１００αβでは５％以下の範囲でしか到達できないＳ１００のエピトープを
認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを、該抗体のＳ１００
ββへの結合およびそれとの複合体形成を可能とする条件下で接触させ； ｂ）上記抗体に結合した抗原の量を測定し、それによりサンプル中のＳ１００
ββの量を測定し； ｃ）サンプルの一部分取と、Ｓ１００αβでは到達可能だがＳ１００ααおよ
びＳ１００ββでは５％以下の範囲でしか到達できないＳ１００のエピトープを
認識するモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを、該抗体のＳ１００
αβへの結合およびそれとの複合体形成を可能とする条件下で接触させ；および ｄ）上記抗体に結合した抗原の量を測定し、それによりサンプル中のＳ１００
αβの量を測定することを含む、上記方法。 - 【請求項２】 請求項１のステップａ）およびｂ）を含む、サンプル中のＳ
１００ββの量を定量する方法。 - 【請求項３】 Ｓ１００ββでは到達できるがＳ１００ααおよびＳ１００
αβでは５％以下の範囲でしか到達できないＳ１００のエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを含む、Ｓ１００ββの量をアッ
セイするためのキット。 - 【請求項４】 モノクローナル抗体が、ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１
９を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３により産生される抗体である、
請求項３に記載のキット。 - 【請求項５】 モノクローナル抗体が捕獲抗体で、キットはさらに検出抗体
を含む、請求項３または４に記載のキット。 - 【請求項６】 検出抗体が、ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１７を付与さ
れたハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２により産生される、抗体またはその抗原結
合断片である、請求項５に記載のキット。 - 【請求項７】 請求項１に記載のステップｃ）およびｄ）を含む、サンプル
中のＳ１００αβの量を定量する方法。 - 【請求項８】 Ｓ１００αβでは到達できるがＳ１００ααおよびＳ１００
ββでは５％以下の範囲でしか到達できないＳ１００のエピトープを認識するモ
ノクローナル抗体、またはその抗原結合断片とを含む、Ｓ１００αβの量をアッ
セイするためのキット。 - 【請求項９】 モノクローナル抗体が、ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１
６を付与されたハイブリドーマ細胞系Ｓ３５：２により産生される抗体である、
請求項８に記載のキット。 - 【請求項１０】 モノクローナル抗体が捕獲抗体で、キットはさらに検出抗
体を含む、請求項８または９に記載のキット。 - 【請求項１１】 検出抗体が、ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１７を付与
されたハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２により産生される抗体またはその抗原結
合断片である、請求項１０に記載のキット。 - 【請求項１２】 ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１９を付与されたハイブ
リドーマ細胞系Ｓ１０：３。 - 【請求項１３】 ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１６を付与されたハイブ
リドーマ細胞系Ｓ３５：２。 - 【請求項１４】 ＥＣＡＣＣ信託番号９８０８２６１７を付与されたハイブ
リドーマ細胞系Ｓ２３：２。
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|---|---|---|---|
| JP2000567573A Expired - Fee Related JP4527286B2 (ja) | 1998-08-28 | 1999-08-27 | サンプル中のＳ１００αβおよびＳ１００ββの総量を定量する方法、サンプル中のＳ１００ββの量を定量する方法、サンプル中のＳ１００αβの量を定量する方法、Ｓ１００ββの量をアッセイするためのキット、Ｓ１００αβの量をアッセイするためのキット、ハイブリドーマ細胞系Ｓ１０：３、ハイブリドーマ細胞系Ｓ３５：２、及びハイブリドーマ細胞系Ｓ２３：２ |
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