JPS63258897A - 抗ｒ−バインダモノクロナ−ル抗体とその製法および用途 - Google Patents

抗ｒ−バインダモノクロナ−ル抗体とその製法および用途

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JPS63258897A
JPS63258897A JP62093233A JP9323387A JPS63258897A JP S63258897 A JPS63258897 A JP S63258897A JP 62093233 A JP62093233 A JP 62093233A JP 9323387 A JP9323387 A JP 9323387A JP S63258897 A JPS63258897 A JP S63258897A
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Yoshio Wakatsuki
若月　芳雄
Masami Inada
稲田　雅美
Hiroyuki Kudo
寛之 工藤
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Eisai Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は抗Ｒ−バインダモノクロナール抗体とその製法
および用途に関する０本発明は特にＲ−バインダの測定
に生化学的、医学的意義が見出される分野において有効
であるので、主として臨床的な診断の分野において利用
される。
（２）従来技術と問題点 内因子（ＩＦ）、トランスコバラミンＩＩ　（ＴＣｌｌ
）およびＲ−バインダ（Ｒ−ｂｉｎｄｅｒ）は生体内に
おいてビタミンＢ１２と結合し、ビタミンＢ１２の搬送
および貯蔵に関与する重要物質であり、とりわけＲ−バ
インダはさらにビタミンＢ１２同族体の中から非生理的
なものを選択的に排除している可能性のあることが知ら
れている。しかし、最近は癌の発生時におけるＲ−バイ
ンダの挙動について多大の注目を集めており単に生化学
的な面ばかりでなく、医学的見地からもその解明が急が
れている。Ｒ−バインダについてはすでにいくつかの従
来知見があり、後記文献３）〜１１）に示されるごとく
である。
Ｒ−バインダは血液中のほか各種の体液中にあり、免疫
組織学的な検索によれば消化器系では唾液腺粘液腺細胞
および導管上皮、食道粘液腺細胞、肝内胆管上皮、胆の
う上皮、膵管上皮に認められ、さらに大腸小腸粘膜の円
柱上皮、杯細胞にも陽性である。呼吸器系では上気道付
属上皮、肺内細気管支粘液腺が陽性を示し、泌尿器系で
は腎尿細管、前立腺上皮、子宮頚腺、卵管上皮、乳腺上
皮、皮膚汗腺に陽性である。このように広く分布し、ビ
タミンＢ１２と結合する性質を有する蛋白であることは
知られているが、実際には分子量と等電点の異なる多種
類の糖蛋白より構成されているので、どのような種類の
Ｒ−バインダをどのような方法で測定すれば、その測定
結果が生化学的な、あるいは医学的な意義を持つかは前
記したごとく、いまだ十分に解明されていない、この原
因として、一群のＲ−バインダのうち特定の疾患で増加
してくるＲ−バインダを単独に定量することが従来方法
ではいまだ不可能であることがあげられる。
例えばＲ−バインダの測定方法として５７ＣＯ−コバラ
ミンを用いる方法が従来から行なわれているが、この方
法は完全ではない、すなわちＲ−バインダは生体中では
さまざまなビタミンＢ１２同族体と結合しているので５
７ＣＯ−コバラミンで測定した場合には、コバラミンと
結合したＲ−バインダのみが測定され、コバラミン同族
体と結合した他のＲ−バインダは測定されないという結
果になる。
このような実情にかんがみ、本発明者はＲ−バインダの
測定を臨床的な診断分野に応用せしめることを目的とし
て、そのために必要な測定方法および測定試薬の技術的
内容の開示を本解明が解決すべき問題点としてとりあげ
た。
（３）問題点を解決するための手段 本発明者は、種々の検討の結果、Ｒ−バインダで免疫し
た動物の脾細胞とミエローマ細胞との融合によって得ら
れ、スクリーニングされたハイブリドーマより生産され
、分子量６０〜８０Ｋ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法）のＲ−バインダと特異的に結合すること
を特徴とする新規な抗Ｒ−バインダモノクロナール抗体
を用意し、該抗体を利用すれば前記問題点が解決される
ことを見出し、本発明を完成した。また本発明者は上記
スクリーニングにおいて本発明者が考案したクローン間
サブトラクション法を利用することによりＲ−バインダ
の特定アイソザイムを認識する抗Ｒ−バインダモノクロ
ナール抗体を製造することに成功した。
従って本発明は上記によって示される新規なモノクロナ
ール抗体の提供ならびにその製法およびその用途である
免疫学的な測定方法と測定試薬の開示を要旨とするもの
である。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明に係るＲ−バインダの起源としては唾液、乳汁、
血清、胃液、胆汁をはじめ、胃粘膜や腸粘膜等いづれも
利用可能であり、しかも目的により健常でも癌性でもよ
い、また起源臓器が異なってもＲ−バインダの抗原決定
基には共通のものもあり、該共通抗原決定基を認識する
ような抗体を本発明では利用している。また癌の診断に
おいては、特異性を高めるために癌組織由来で、かつ正
常組織にはない抗原決定基を有するＲ−バインダを特異
的に認識する抗体をサブトラクション法で作成し、利用
することができる。癌組織由来のＲ−バインダは例えば
唾液由来のＲ−バインダとも共通の抗原決定基を有する
ので、唾液由来のＲ−バインダを認識し、かつ上述の共
通抗原決定基をも認識するような抗体によっても検出す
ることができる。この事実は、とりわけ６０〜８０Ｋ（
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バ
インダを測定対象とする場合に明瞭に成立する。従って
本発明は、８０〜８０にのＲ−バインダを測定対象とす
ることを前提として、動物の免疫に使用するＲ−バイン
ダはどのような起源のまたどのような種類のものであっ
てもよい０通常は後記文献１）および２）に記載のＡ１
１ｅｎの方法に従ってヒト唾液より調製したＲ−バイン
ダを使用すればよい、しかし後記実施例２に示されるよ
うにヒト胃癌細胞株ＫＡＴＯＨＩＩｒの培養細胞や培養
上清から調製したＲ−バインダや、あるいは切除前の癌
腫部分および健常部分から各々調製したＲ−バインダを
使用することもできる。
免疫に使用する動物はウサギ、マウス等いづれでもよい
が、抗血清を得るためにはウサギの使用がよく、また免
疫化脾細胞を得るためにはマウスの使用がよい、免疫は
常法に従って行なえばよく１例えばフロイント完全アジ
ュバントと共にＲ−バインダでマウスを免疫し、さらに
２週間隔で数回追加免疫し、最後にブーストをかけ、３
日目に脾細胞を摘出すればよい。
ミエローマ細胞としては細胞融合用に開発された骨髄腫
細胞系のものを使用すればよく、例えばＭＳ−１，５Ｐ
−２等使用すればよい。
脾細胞とミエローマ細胞との細胞融合に使用する融合剤
は一般に平均分子量が約１０００〜６０００であるポリ
エチレングリコールが従来から使用されており１本発明
においては例えば分子量１５００を用いればよい、また
その最適濃度は分子量、に応じて４０〜５０％が望まし
く、例えばポリエチレングリコール１５００にそのＩｇ
当り胎児好手血清不合のＲＰＭＩ−１８４０を１１加え
て溶解し、用時３７℃に加温して使用すればよい。
細胞融合は常法に従って行ない、概略以下のごとくであ
る。
脾細胞およびミエローマ細胞を４：ｌ〜１０：１の比率
で混合し、遠心分離してペレットに形成せしめ、ここに
融合剤を細胞数１〜２　Ｘ　１Ｇ８個当り１１の割合で
滴下し、遠心分離して融合剤を除き、好手血清含有のＲ
ＰＭＩ−１８４０の培地に懸濁し、融合を完了する。最
後に常法によりＨＡＴセレクションを行ない、融合細胞
（ハイブリドーマ）を親細胞から分離する。
次にハイブリドーマに対し適当な方法でスクリーニング
を行ない、抗Ｒ−バインダ抗体の生産が陽性であるハイ
ブリドーマを選択する。後記実施例ではスクリーニング
のためにＥＩＡ法、免疫沈降法および蛍光抗体法が用い
られている。
また、ここ、でスクリーニングの方法としては本発明者
が独自に考案したクローン間サブトラクション法を行な
うと便利である。すなわち、ある種の疾患では特定のア
イソザイムが増加するので、通常はこれを電気泳動等に
より半定量しているが、この方法を行なうためにはこの
特定のアイソザイムのみを抽出して精製し、その抗血清
を作成する困難な作業が必要である。そこで本発明者は
基本骨格となる分子に対するポリクローナル抗体を用意
し、これを用いてアイソザイムの含有パターンの異なる
複数の免疫原を固相化し、これらすべての免疫原に対し
てハイブリドーマをスクリーニングし、交叉反応を示さ
ないクローンのみを選択する方法を試みた０本発明者は
この方法をクローン間のサブトラクション法と命名した
が、ＥＩＡ法を例にして具体的操作をもって示せば次の
ごとくになる。まず、例えば唾液由来の免疫原を用いて
これのポリクローナル抗体を用意する。これをサンドイ
タチ型ＥＩＡ法の第１抗体として用い、正常細胞由来、
癌細胞由来、癌細織由来等々の抗原を固相化してそれぞ
れのプレートをあらかじめ作成する０次に、これら抗原
を免疫原して常法によりそれぞれ対応するバイブドーマ
を別に作成し、その各培養上清について上記各プレート
によるスクリーニングを行なう、その結果、複数の抗原
を共通して認識するよう場合には該当するハイブリドー
マは除外し、残余のハイブリドーマのみを選択して使用
するようにする。このようにすれば、従来方法における
困難な作業を伴なわずに所定の目的を達成することがで
きる。ところでこのサブトラクション法は特定のアイソ
ザイムに対するモノクロナール抗体の作成方法として本
発明に限らず他の例にも一般に応用可能である。
免疫沈降法および蛍光抗体法を利用するスクリーニング
は具体的には次のように行なうことができる。すなわち
、抗原Ｒ−バインダはコバラミンと結合する性質を有す
るので、各種由来の抗原に　ｃｏ−Ｂ１゜を加えてこれ
と結合せしめ１次にスクリーニングしようとするハイブ
リドーマの培養上清を加え、生成する免疫複合体を固相
化した抗マウス抗体を用いて分離し、そのγ線をカウン
トする。これはスクリーニングの簡便法であり、補助的
に利用することができる。
次に上記のようにしてスクリーニングされた陽性ハイブ
リドーマの中から分子量６０〜８０Ｋ（ＳＯ５−ボアク
リルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バインダと特異的に
結合する抗体（以下、本発明の目的抗体と呼ぶ）を生産
するバイブリドーマのみを免疫沈降を利用してスクリー
ニングする。
すなわち、例えばラクトパーオ￥シダーゼ法で１２５Ｉ
をラベルしたＲ−バインダ（１２５Ｉ−Ｒ−バインダ）
を前記陽性ハイブリドーマの培養上清に加え、さらにプ
ロティンＡセファロースを用いて免疫沈降を行なった後
、　１０％５Ｏ５−ポリアクリルアミド電気泳動法を行
ない、分子量６０〜８０にの位置にラジオオートグラフ
ィーのバンドが現われたときに１本発明の目的抗体の生
産が陽性であると判定してスクリーニングを行なう、こ
こで、８０〜８０にの数値範囲は厳密に該範囲に限定さ
れるものではなく、採用する抗原に応じて変動があるも
のの、大部分の場合において該範囲内に収束されるので
実用的な意味において該範囲が一応の目安として提示さ
れ。また該分子量の範囲のＲ−バインダはセファデック
スＧ２００を用いるゲル濾過により分子量を測定すると
１３０〜１５０　Ｋであると示される。しかし、これは
本発明において単に参考として示されるにとどまる。
次に本発明の目的抗体を生産するハイブリドーマを適当
な方法で分別番培養しモノクローン細胞株を作成する。
その方法としては限界希釈法を行えばよい０例えば胎児
好手血清を補充し、かつＢＡＬＢ／Ｃマウスの胸腺細胞
をフィーダーとして補充したＲ　ＰＭ　Ｉ　−１１３４
０培地で細胞懸濁液を希釈し、組織培養平板で培養し、
細胞増殖の認められたウェルの培養上清について前記ク
リーニングを行ない、抗体産生の有無をチェックする。
この限界希釈によるクローニング操作を２回以上繰返え
せばよい、後記実施例においては唾液由来Ｒ−バインダ
から５５−Ｄ、４２−Ｃ＊ｌ＊ＫＡＴＯＨ−ｍ細胞由来
Ｒ−バインダからＷＫ−１、Ｈ−１２、Ｂ−３なる識別
表示をもってそれぞれ命名されるモノクローン細胞株が
得られ、工業技術院微生物工業研究所に寄託申請した。
またこれらの細胞株を生体外培養して得られたムモノク
ロナール抗体について免疫グロブリンの存在を確認した
ところ、５５−Ｄ、４２−Ｃ，ＷＫ−１，Ｈ−１２、Ｂ
−３においてそれぞれＩｇＧ１．ＩｇＧ３、ＩｇＧ３、
ＩｇＧ３、ＩｇＧ３であった。
次に得られた陽性ハイブリドーマは生体外培養または生
体内培養によって増殖せしめる。生体外培養は他の免疫
グロブリンを含まない純粋外モノクロナール抗体を得る
ことのできる方法であり、本発明に係る陽性ハイブリド
ーマを適当な栄養培地、例えば、胎児好手血清を補充し
たＲ　Ｐ’Ｍ　Ｉ　−１８４０培地中で適当時間培養す
ればよい、生体外培養はわずかに他の免疫グロブリンを
夾雑する結果となるものの非常に多量のモノクロナール
抗体を生産することのできる方法であり、例えばあらか
じめＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスにブリスタン（２，６，
１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与
して２日以上経過後、本発明に係る陽性ハイブリドーマ
を腹腔内投与し、２〜３週を要して腹水腫瘍としてマウ
スの体内に増殖・定着せしめればよい、当該培養後に腹
水および、または血清を採取し、塩析、クロマトグラフ
ィー等の分離精製操作をおこなえば、本発明モノクロナ
ール抗体を得ることができる０例えば採取した腹水につ
いて抗体活性を免疫沈降法によって確認し、クロマトグ
ラフィーによって免疫グロブリンの分画をおこない、陽
性フラクションをプールすればよい。
本発明モノクロナール抗体はＲ−バインダにおける６０
〜８０Ｋ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
）の蛋白抗原を特異的に認識する。従って該抗原の測定
が生化学的、医学的に特別の意義を有する場合に、その
免疫学的な測定のための方法と試薬の提供を可能にする
。免疫学的測定方法とは酵素免疫測定法、放射免疫測定
法、受身赤血球凝集法等の総称であり、−例として二抗
体サンドイツチ法を利用する酵素免疫測定法について示
せば次のごとくになる。
測定系全体の構成要素は、固相、固相コート用の抗Ｒ−
バインダ抗体（第１抗体）、抗Ｒ−バインダモノクロナ
ール抗体（第２抗体）、酵素標識抗体、基質、標準抗原
または被検試料である。ここで固相としてはエンザイム
ノアッセイ用のマイクロタイタープレートのウェルを用
いればよい、また固相コート用の第１抗体は抗血清から
用意すればよい６例えばヒト唾液より精製したＲ−バイ
ンダで免疫した家兎の抗血清を硫安分画し、ＤＥＡＥ−
セルロースで１ｇ０分画し、精製抗体として用意する。
後記実施例ではＲａｂαｈＨの表示をもって用意される
。
酵素標識抗体はすでに市販されているものを適宜入手し
て使用すればよい０例えばＨＲＰＯ（Ｈｏｒｓｅ　ｒａ
ｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｔｉｄａｇｅ）で標識したヒツジＦ
　（ａｂ）２抗マウスＩｇＧ抗体（ＴＡＧ；Ｎｏ。
４５５０）が後記実施例において使用される。基質は選
択された酵素に応じて用意し、ベルキオキシグーゼが選
択されたときは、オルトフェニレニンジアミン等を用意
すればよい、標準抗原は唾液由来あるいは胃癌組織由来
培養細胞等、適当に選択した起源由来のＲ−バインダを
使用して濃度既知の溶液を用意すればよい、測定操作は
二抗体サンドイツチ法を利用する酵素免疫測定法の通常
の手順に従えばよい、すなわち、第１抗体をコートした
ウェルに標準抗原または被検試料を加えてインキュベー
トし、続いて第２抗体として陽性ハイブリドーマの培養
上清を加えてインキュベートし、次に酵素標識抗体を加
えてインキユベーし、最後に基質を加えてインキュベー
トし１反応を停止せしめてから基質の分解量を測定すれ
ばよい。
本発明測定試薬は本発明測定方法の実施に直接使用する
試薬であり、測定方法におけると同一の目的を達成する
ものである。すなわち、本発明測定試薬は、本発明モノ
クロナール抗体を必須の成分として包含するものであり
、具体的には本発明モノクロナール抗体単独あるいは該
抗体に固相、第１抗体、標識抗体、基質、標準抗原等の
中から任意に選択したーまたはそれ以上の成分を組合せ
たセットである。ここで固相が第１抗体でコートされた
状態で提供されること、あるいは標識抗体が例えば酵素
と抗体に分離した状態で提供されること等は自由であり
、これらも本発明測定試薬の態様に含まれる。また測定
の実施の便益のために適当な希釈液、溶解液、反応停止
液等がセット中に添付されることも自由であり、本発明
を限定しない。
本発明測定方法は操作が単純簡明であり、多数の検体を
同時に処理することを可能にするので、臨床検査の場に
おいて実用性が高い、特に・　後記実施例によって示さ
れるごとく患者血柴を本発明方法によってスクリーニン
グすることによって消化器系癌の存在を高い確度で証明
することができる。しかし、本発明は消化器系癌の診断
にのみ限定されるものではなく、Ｒ−バインダが腫瘍マ
ーカーとなり、その消長の測定により癌疾患の診断が可
能となるすべての場合に広く応用することができる。
（４）実施例 以下に記載する実施例によって本発明をさらに具体的に
説明する。
実施例１ １）抗原の調製 文献ｌ）の記載に従った。すなわちコバラミンーセファ
ローズアフイニテイ力うムヲ作成し、ヒト唾液１０１０
０ＯよりＲ−バインダ２５０４　ｇを精製した。なお、
唾液を１００ＯＯＧで３０分間遠心分離し、その上清を
Ｗａｔｍａｎ　８８５で濾過したものを別に粗抗原とし
て用意した。
ｉｉ）抗血清抗体の作成 ｉ）で得た精製Ｒ−バインダを用い常法により家兎を免
疫し、抗血清を得た。硫安分画し、ＤＥＡＥ−セルロー
ズでクロマトグラフィーを行い、ＩｇＧ分画を精製した
。得られた抗体をＲａｂαｈＲと略記する。
ｉ）ハイブリドーマの作成 １！令（７）ＢＡＬＢ／Ｃマウスにｉ）で得た精製Ｒ−
バインダをフロイント完全７ジユバンドと共に免疫し、
２適間隔でフロイント完全アジュバントと共に数回追加
免疫し、精製Ｒ−バインダでブースト後、３日目に牌臓
を摘出し、その脾細胞とエミローマ細胞ＭＳ−１とを混
合し、分子量１５００のポリエチレングリコールを加え
、細胞融合した。
ＨＡＴセレクションを行ない、ハイブリドーマを得た。
■）スクリーニング 得られたハイブリドーマについて下記（ａ）のＥＬＩＳ
Ａ法によるスクリーニングおよび下記（ｂ）の免疫沈降
反応によるスクリーニングを行ない、抗体生産陽性のハ
イブリドーマを選択した。
（ａ）ＥＬＩＳＡ法 ＦａｌｃｏｎポリエチレンＵ底に５０倍希釈したＲａｂ
αｈＲを５０＃Ｌｕ入れ、−夜装置し。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ　　（以下Ｔ−ＰＢ
Ｓと略記する）にて３回洗浄し、１％牛血清アルブミン
／ＴＢＳ　（以下Ｂ−ＴＢＳと略記する）１００ＩＬｆ
Ｌを加えて室温２時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄する。
ここにｉ）で用意した唾液由来の粗抗原５０ＩＬ文を加
え、室温２時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、ｉｉ）で
得られたハイブリドーマの培養上清を加え、室温２時間
放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄する。ここにＨＲＰＯ標識し
たＧｏａｔ　　Ｆ（ａｂ）２ａＭＩｇＧ（γ”Ｌ）　　
（ＴＡＧ；Ｎｏ、４５５０）ヲ１５００倍に希釈した液
５０終見を加え、室温２時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗節
し、オルトフェニレンジアミン基質液２００終りを加え
、３０分後に２ＮＨ２Ｓ　０４２５１Ｌｌを加えて反応
を停止し、ＯＤ　５００を測定する。
（ｂ）免疫沈降反応 ｉ）で用意した唾液由来の粗抗原に５７ｃ。
−Ｂ１２を加えて室温３０分間放置し、４℃で２４〜４
８時間透析して未結合の　Ｃｏ−Ｂ１２を除去する６次
に　Ｃｏ−８１２でラベルされた抗原２０ＩＬｌに対し
ｉｉ）で得られたハイブリドーマの培養上清１００経文
を加え、エッペンドルフミクロチューブ内で４℃１夜放
置する。ここにＲａｂａＭＩ　ｇ　（Ａ＋ａ＋Ｍ）（Ｃ
ＰＬＨＮｏ、３２１１−０２３１）を１００倍に希釈し
た液４０ｐ文を加え、ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ　ｔｙｐｅ
　５ｈａｋｅｒテ室温１時間インキュベートする。さら
に１％５ＡＣ（Ｈｏｅｃｈｓｔ：　ＰＡＮＳＯＲＢＩＮ
）４０　ｇ　ｌを加え４℃で一夜放置する。　　１５０
００　ｒ　ｐｍで１０分間遠心分離し、得られるペレッ
トについてカウントする。なお、陰性対照としてはＭｏ
ｗｓモノクロール抗ＤＮＰ抗体、正常マウス血清を用い
、陽性対照としてはＲａｂαｈＲを１０倍および１００
倍に希釈したものを用いた。
ν）クローニング ｉＶ）でスクリーニングされたハイブリドーマについて
限界希釈法を２回以上繰返してクローニングした。その
結果、抗Ｒ−バインダモノクロナール抗体産生細胞株５
５−Ｄ、同４２−Ｃによって、表示される細胞株が得ら
れ、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託申請した。
Ｖｉ）目的抗体の確認 得られた細胞株の培養上清中に分子量８０〜８０にのＲ
−バインダを認識するモノクロナール抗体（本発明の目
的抗体）が存在するかを５ＤＳ−ポリアクリルアミトゲ
、ルミ気泳動法によって確認した。すなわちｉ）の唾液
由来の精製Ｒ−バインダをラクト−ペルオキシダーゼ法
により１２５■ラベルし、培養上清に加え、さらにプロ
ティンＡセファロースを加えて抗原抗体複合体を分離し
た後に、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
い、オートラジオグラフィーを行った。その結果、いづ
れの細胞株についても分子量６０〜８０にの位置にバン
ドが現われた。
また、生体外培養し、硫安法で上清中のモノクロナール
抗体を沈澱し、ＰＢＳで透析して免疫グープリンの存在
を確認したところ５５−Ｄ、４２−Ｃについてはそれぞ
れＩｇＧ１．ＩｇＧ３であった。
実施例２ １）抗原の調製 ヒト胃癌細胞株ＫＡＴＯＨｍを用いた。該細胞株はＲＰ
ＭＩ−１８４０培地、ＭＥＭ培地、Ｆｅ２（各々４５％
、４５％、１０％）よりなる培地に維持されており、こ
れをＨａｎｋｓ液にて３回洗浄し、無血清培地にて７〜
１０日間培養した。その結果、分子量１３０〜１４０Ｋ
　（セファデックスＧ２００ゲル濾過）のＲ−バインダ
が培地中に生産され、細胞質中にも通常の維持培地中で
培養した場合に比べて１０倍濃度のＲ−バインダが生産
された。培養上清はＡｍ１ｃｏｎにて１０〜１００倍に
濃縮し、他方、細胞は５０倍容量のＰＢＳ（１ｍＭＰＭ
ＳＦおよび０．００１％チメロサール含有）にてソニケ
ーションし、　１００ＯＯＧで３０分間遠心分離して上
清を採取し、両者を合わせて胃癌細胞由来のＫｍ抗原と
した。なお、無血清培地はＭＥＭ培地あるいはＭ１８９
培地にインシュリン、トランスフェリン、必須アミノ酸
を終濃度でそれぞれ５ル８１謬１．５ルｇ／ｍｌ、１％
となるよう添加して調製した。
ｉｉ）ハイブリドーマの作成とスクリーニング実施例１
の１ｉ）および■）におけると同様に行った。ただし、
■）の（ａ）項および（ｂ）項において唾液由来の粗抗
原が使用される代わりに本実施例の１）の胃癌細胞由来
のＫｍ抗原が使用された。
ｉｉ）クローニングと目的抗体の確認 実施例１のＶ）およびＶｉ）におけると同様に行った。
ただし、■）において唾液由来の精製Ｒ−バインダが使
用される代わりに後記実験例１で示される胃癌組織由来
の粗抗原が使用されたつ抗Ｒ−バインダモノクロナール
抗体産生細胞株ＷＫ−１、同Ｈ−１２、同Ｂ−３が得ら
れ、寄託申請された。いづれも分子量、６０〜８０Ｋ（
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バ
インダを認識するモノクロナール抗体が存在し、ＷＫ−
１，Ｈ−１２、Ｂ−３についてはＩｇＧ３、Ｉ　ｇＧ３
、Ｉ　ｇＧ３の免疫グロブリンの存在が確認された。
実施例３ 本発明測定方法の一例を間接サンドイツチ法によるＥＩ
Ａ測定系で説明する。
実施例１　ｔｖ　ｉｉ　）で得たＲａｈａｈＲをＰＢＳ
で１００倍希釈し、エザイムノアッセイ用マルチプレー
トに１ウエルにつき５０ＩＬｌづつ注入し、インキュベ
ート後、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、１％Ｂ−ＰＢ３１００ｇ
文を加え、室温で１時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄する
。ここに標準抗原または被検試料５０μ見を加え室温で
２時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、次に細胞株５５−
Ｄの培養上清を１％Ｂ−ＰＢＳで３００倍に希釈したも
のを５０１ＬｆＬ加え、室温で２時間放置し、Ｔ−ＰＢ
Ｓで洗浄する。ＨＲＰＯ標識したＧｏａｔＦ（ａｂ）ｚ
　ａＭＩ　ｇＧ　（ｙ　４″Ｌ）　　（ＴＡＧ；Ｎｏ。
４５５０）を１％Ｂ−ＰＢＳテ１５００倍に希釈シタも
のを５０鉢見加え、室温で２時間放置し、Ｔ−ＰＢＳで
洗浄する。オルトフェニレンジアミン基質液２００ＩＬ
ｉを加え、室温で１５〜３０分放置後に２ＮＨ２ＳＯａ
　２５ｕ４を加えて反応を停止し、０Ｄ５ｏｏ値を測定
する。
実施例４ 実施例１の記載の要領で製造した本発明モノクロナール
抗体を本発明測定試薬とした。またさらに該抗体に実施
例１のｉｉ）記載の要望で製造したＲａｂαｈＲを組合
せてセットとなし、本発明測定試薬とした。
（５）発明の効果 以下の実験例によって本発明の詳細な説明する。
実験例１ 試料 抗体試料としてＲａｂａｈＲ１５５−Ｄ、ＷＫ−１，４
２−Ｃを用意した。抗原試料としては実施例１の唾液由
来の粗抗原（Ｓ）、実施例２の胃癌細胞由来のＫｍ抗原
（Ｋ）、胃癌組織由来の粗抗原（Ｇ）、健常粘膜由来の
粗抗原（Ｎ）、患者血清（Ｒ）、胆汁（Ｂ）を用意した
。なおＧおよびＮは以下のように調整した。
Ｂｏｒｒａａｎ　ｍ型の切除胃（未分化〜申分化型ｔｕ
ｂｕｌａｒ　ａｄｅｎｏ　ｃａｒｃｉｎｏｓａ）を用い
、癌腫は前体下部後壁に限局され、対側部（前壁部分）
は健常であるので、前壁の健常粘膜をスライドガラスで
スフレイピングにより採取し、癌組織は鋏で細切切除に
より採取した。それぞれ０．２５Ｍ５ｕｃｒｏｓｅ−↑
ｒｉｓ　ＨＣＩ（ＰＨ７−８）を湿重量の２倍加え、ブ
レンダーで解砕し、さらに４倍容量の０．１５ＭＮ託１
　（２ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭペプスタチン、０．００１
％メチルオレート含有）を加えてホモゲナイズし、４℃
で４８時間ゆるく攪拌し、２００００Ｇで１時間遠心分
離し、上清を採取し、癌組織由来をＧ、健常粘膜由来を
Ｎとした。
方法 各抗原試料を１２５Ｉでラベルし、所定の抗体試料にて
免疫沈降し１０％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を行い、オートラジオグラフィーをとった。
結果 結果を図１、図２２図３に示す、各図はオートラジオグ
ラフィーの様式図であり、タテ方向は分子量を表わす０
図１は抗体試料としてＲａｂｃｔｈＲのみを使用し、抗
原試料としてＳ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、Ｒ，Ｂを使用した結果を
示し、図２は抗原試料とてＧのみを使用し、抗体試料と
しテ５５−Ｄ（７）腹水培養上清（ａ）　、　ＷＫ　−
１（７）培養上清を１３倍に濃縮したもの（ｂ）、ＷＫ
−１の腹水培養上清（ｃ）、４２−Ｃの腹水培養上清（
ｄ）を使用した場合の結果を示し１図３は抗体試料とし
てＷＫ−１培養上清を使用し、抗原試料としてＳ、また
はＧを使用した場合の結果を示し、図のＳ２およびＧ２
はＳ！およびＧ１におけるよりもＷＫ−１の抗体量が２
倍に増加されたときの結果を示す。
図１より各抗原試料に共通のバンドが分子量６０〜８０
Ｋに現われるのが観察される。また図２、図３よりＳと
Ｇとは分子量６０〜８０Ｋにおいて免疫学的に交叉性が
あり、５５−Ｄはその共通抗原基を認識するが、ＷＫ−
１はＧ固有の抗原基のみを認識することが判明する。癌
の検出のためにはＧを選択的に認識するＷＫ−１がＪｌ
ｌ定系に使用されるのがよいが、分子量６０〜８０にの
ＷｈｏｌｅのＲ−バインダを測定しても目的を達成する
ことができるので、広範囲に抗原決定基を認識する５５
−Ｄを測定系に使用してもよいことが知られる。また例
えばＷＫ−１，Ｈ−１２，５５−Ｄを同時に使用すれば
検出感度が改善され、またＷＫ−１あるいはＨ−１２の
みを使用すれば陽性率が改善されることが期待される。
実験例２ 消化器系疾患血漿２３１例、肝胆膵系良性疾患患者血漿
５４例、健常者血漿２００例について実施例３に記載の
方法により測定を行った。なお、健常者血漿群の測定値
より平均値ＣＭ）および標準偏差（Ｓ　Ｄ）を求め、Ｍ
＋２ＳＤを陽性と陰性のカットオフ値とした。
結果 結果を以下に示す。
Ａ、胃癌 ａ）　陽性率（５Ｂ／１１４　、４１３％）ｂ）　ステ
ージＩ　（１７／３７．４８％）　、　ＩＩ　（９／１
４．６４％）　、　ｍ（１０／１Ｂ、５８％）　、　Ｉ
Ｔ（１５／３１．３８％）、不明例（５／１４　、３８
％）Ｃ）組織型 高分化型（６／１１　、５５％） 申分化型（１０／１８．５８％） 低分化型（１３／２１．６２％） ｄ）転移 肝転移例（８／１１　、５５％） 非転移例（１２／４５．２７％） Ｂ、膵癌（乳頭部癌、末端胆管癌を含む）陽性率（１７
／６４．２７％） Ｃ０胆道癌（膵乳頭癌を含まない） 陽性率（７／２０　、３５％） 結腸、直腸癌 陽性率（８／１５　、５３％） Ｄ、肝癌 陽性率（８／１３　、８２％） Ｅ１食道癌 陽性率（０／３．　０％） Ｆ、肝胆膵系良性疾患 偽陽性率（１３１５４，２４％） （８）文献 １）アレン、アール、エッチ０．ジェー、バイオロ、ケ
ミ、、　２４７巻２３号７８９５−７７０１（１９７２
）（Ａ１１ｅｎ、Ｒ，Ｈ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、　Ｖｏｌ　２４７．Ｎｏ。
２）アレン、アール、エッチ０．同誌、２４８巻２２号
（ＡＩＩｅｎ、Ｒ，Ｈ，、１ｂｉｄ、、　Ｖｏｌ、２４
９．Ｎｏ、２２７２２０３）ステンマン、ジェー、エッ
チ０．スカンジ。
ジェー、ヘマトロ、、１４．９１−９１−１Ｏ７（１９
７５）（Ｓｔｅｎ、　　Ｊ、Ｈ，、５ｃａｎｄ、　　Ｊ
、　　Ｈａｅｍａｔｏｌ、。
１４、９ｌ−１０７（１９７５）） ０バルクリス　ジー０．プログレス　イン　ガストロエ
ンテロロジー（アカデミツク　プレス）　１９８３．１
３３−１７２ （Ｈａｒｃｏｕｌｌｉｓ、　Ｇ、、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
　ｉｎＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　　（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ）１９８３、１３３−１７２
） ５）トスキス　ピー、ピー０９同書、１７３−１８８（
Ｔｏｓｋｅｓ、　　Ｐ、　　Ｐ、、　　１ｂｉｄ、　　
１７３−１８８）６）アレン、アール、エッチ６．　ヒ
トビタミンＢ１２トランスポートプロテインズ、プログ
レス　イン　へマトロジー（エルマー ビー、ブラウン編）９巻グルン　アンドストラットン　
ニューヨーク１３７５ （ＡＩｉｅｎ、　　Ｒ，Ｈ，、Ｈｕｓ＋ａｎ　　Ｖｉｔ
ａｍｉｎｅ　　Ｂ１２Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎＨｅｍａｔｏｌａｇ
ｙ（ｅｄ、　　Ｅｌｄｅｒ　　Ｂ、　　Ｂｒｏｗｎ）　
　Ｖｏｌ、！３゜Ｇｒｕｎｅ　＆　５ｔｒａｔｔｏｎ、
　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７５）７）ワックスマン、ニ
ス０．プリティ、ジェー。
ヘマト０．２７巻２２９（１９７４） （Ｗａｘｍａｎ、　Ｓ、、　　Ｂｒ１ｔ、　　Ｊ、　　
Ｈａｅｍａｔｏｌ、、　　Ｖｏｌ。
２７、２２１１１（１９７４）） ８）カーノル。アール０．ニュー、イング。
ジェー、メディ、、フェブ、８．２８２頁（１９７５）
（Ｃａｒｔｅｌ、　Ｒ，、Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍ
ｅｄ、、　Ｆｅｂ、８ｐｐ２８２（１９７５）） ９）ワックスマン、ニス１．キャンサー　リサ、。
３７．１９０８−１９１４（１９７７）（Ｗａｘｍａｎ
、Ｓ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　３７．　１９０
８−１９１４１０）ギムシング、ビー０．スカンジ、ジ
ェー、ヘマト口、、２１．２４３−２４９（１９７８）
（Ｇｉｍｓｉｎｇ、　Ｐ、、　５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｈ
ａｅｍａｔｏｌ、、　２１゜２４３−２４９（１９７Ｂ
）） １１）シェパード、ケイ９．ジェー、クリニ、パソロ、
、　３７．１３３１１１−１３３８（１１３８４）（Ｓ
ｈｅｐｐａｒｄ、　Ｋ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔ
ｈｏｌ、、　３７゜１３３８−１３３８（１９Ｂ４））
【図面の簡単な説明】
図１、図２、図３は免疫沈降法によるオートラジオグラ
フィーの模式図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）Ｒ−バインダで免疫した動物の脾細胞とミエロー
    マ細胞との融合によって得られ、スクリーニングされた
    ハイブリドーマより生産され、分子量６０〜８０Ｋ（Ｓ
    ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バイ
    ンダと特異的に結合することを特徴とする抗Ｒ−バイン
    ダモノクロナール抗体。
  2. （２）抗体サンドイッチ測定法を利用して各種抗原に対
    するハイブリドーマをスクリーニングし、Ｒ−バインダ
    の特定アイソザイムのみを認識する抗Ｒ−バインダモノ
    クロナール抗体を製造するにあたり、ポリクロナール抗
    体を第１抗体としてこれに該各種抗原をそれぞれ添加し
    て固相プレートを用意し、ここにハイブリドーマの培養
    上清をそれぞれ加えて抗体サンドイッチ測定法を行ない
    、複数の抗原を共通に認識する場合には該当するハイブ
    リドーマは除外し、残余のハイブリドーマのみを選択す
    ることを特徴とする抗Ｒ−バインダモノクロナール抗体
    の製法。
  3. （３）Ｒ−バインダの免疫学的測定方法において、Ｒ−
    バインダで免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞との
    ハイブリドーマより生産され、分子量６０〜８０Ｋ（Ｓ
    ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バイ
    ンダと特異的に結合することを特徴とする抗Ｒ−バイン
    ダモノクロナール抗体が使用されることを特徴とするＲ
    −バインダの測定方法。
  4. （４）測定方法が消化器系癌の診断方法である特許請求
    の範囲第３項記載の測定方法。
  5. （５）Ｒ−バインダの免疫学的測定試薬において、Ｒ−
    バインダで免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞との
    融合によって得られ、スクリーニングされたハイブリド
    ーマより生産され、分子量６０〜８０Ｋ（ＳＤＳ−ポリ
    アクリルアミドゲル電気泳動法）のＲ−バインダと特異
    的に結合することを特徴とする抗Ｒ−バインダモノクロ
    ナール抗体が成分となることを特徴とするＲ−バインダ
    の測定試薬。
  6. （６）測定試薬が消化器系癌の診断試薬である特許請求
    の範囲第５項記載の測定試薬。
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