NO881610L

NO881610L - Antistoff og fremgangsmaate for dets fremstilling og anvendelse, saerlig for diagnose.

Info

Publication number: NO881610L
Application number: NO881610A
Authority: NO
Inventors: Yoshio Wakatsuki; Masami Inada; Hiroyuki Kudo
Original assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1987-04-17
Filing date: 1988-04-14
Publication date: 1988-10-18
Also published as: DK207488A; JPS63258897A; DK207488D0; FI881631A; FI881631A0; EP0287012A3; NO881610D0; EP0287012A2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et anti-R-bindermonoklonalt antistoff, en fremgangsmåte for fremstilling av dette og en anvendelse derav. Den foreliggende oppfinnelse er særlig effektiv ved assaybestemmelse av en R-binder for biokjemiske og medisinske mål og anvendes således hovedsakelig innenfor klinisk diagnostisering.

Intrinsik faktor (IF), transkobalamin II (TCII) og R-bindere er viktige substanser som binder til vitamin og deltar i transport og lagring derav in vivo. Det er spesielt kjent at R-bindere selektivt kan fjerne ikke-fysiologiske material-er fra vitamin B.~homologer. I tillegg har nylig rollen til R-bindere i utvikling av cancer tiltrukket oppmerksom-heten. Det er således sterkt påkrevet å oppklare makanismen derav ikke bare fra det biokjemiske synspunkt, men også fra det medisinske synspunkt. Som vist i referanser 3 til 11 er noen undersøkelser vedrørende R-bindere tidligere rapportert og disse litteraturhenvisninger er:

3) Stenman. J.H., Scand. J. Haematol., 14,91107 (1975)

4) Harcoullis. G., Progress in Gastroenterology (Academic Press) 1983, 133-172

5) Toskes. P.P., ibid. 173-188

6) Allen. R. H., Human Vitamine B^ Transport proteins, Pregress in Hematology(ed. Eimer B. Brown) Vol. 9,

Grune & Stratton, New York 1975

7) Waxman. S., Brit. J. Haematol., Vol. 27, 229 (1974)

8) Carmel. R., New Eng. J. Med., Feb; 6 pp282 (1975)

9) Waxman. S., Cancer Res., 37, 1908-1914 (1977)

10) Gimsing. P., Scand. J. Haematol., 21, 243.249 (1978) og

11) Sheppard, K., J. Clin. Pathol., 37, 1336.1338

R-bindere forekommer i blod og forskjellige andre kroppsvæsk-er. Immunohistologiske undersøkelser tyder på at de forekommer i fordøyelsessystemet inklusive spyttkjertlenes slim-hinner, ledningsepitelium, esofaguskjertel-slimhinneceller, lever-gallegangepitelium, galleblæreepitelium, pankreatisk gangepitelium, tarm- og tarm-søyle-epiteliumceller og beger-slimceller, i åndedrettssystemet inklusive øvre åndedretts-kanalepitelium og intrapulmonær bronkial-kjertelslimhinne, og i urinveissystemet inkluderende nyrepapillært, prostatisk epitelium, livmorhalskjertler, egglederepitelium, roamma-kjertelepitelium og svettekjertler. Det er kjent at R-bindere er proteiner som har en vid utbredelse som beskrevet ovenfor og binder til vitamin B^-

R-bindere omfatter imidlertid et antall sukkerproteiner som er forskjellig med hensyn til molekylærvekt og isoelektrisk punkt fra hverandre i praksis. Det er ikke tilstrekkelig etablert hittil hvorledes R-binderne kunne bli assaybestemt for å oppnå data som er verdifulle fra et biokjemisk og medisinsk synspunkt. Dette er pga. at det har vært umulig selektivt å assaybestemme en R-binder somøker ved en spesi-fikk sykdom i forhold til forskjellige andre R-bindere. F.eks. er en konvensjonell prosess for assaybestemmelse av

57

R-bindere ved anvendelse av -Co-cobalamin ikke fullsten-dig tilfredsstillende. Ettersom R-bindere binder til forskjellige vitamin B1Phomologer in vivo kan nemlig assay-

57

bestemmelsen under anvendelse av -cobalaminet bare gi data vedrørende begrensede R-bindere som binder til cobalamin og dem som binder til vitamin B-12 homologer kan ikke derved assaybestemmes.

Under disse forhold er det i sammenheng med den foreliggende oppfinnelse forsøkt å anvende R-binderassaybestemmelser til klinisk diagnose og teknisk klargjøre en assaybestemmelses-metode og et assaybestemmelsesreagens nødvedig derfor.

Som resultat av omfattende undersøkelser ble det i oppfin-nelsens sammenheng funnet at det ovennevnte problem kan løses ved anvendelse av et nytt anti-R-bindermonklonatantistoff som frembringes av hybridomer oppnådd ved cellefusjon av dyre-miltceller immunisert ved en R-binder og myelomceller etterfulgt av screening og som spesifikt binder til en R-binder med en molekylvekt 60 til 80 K (som bestemt ved SDS polyakrylamidgel elektroforese), slik at den foreliggende oppfinnelse ble fullført. Ved oppfinnelsen lyktes det videre å fremstille et anti-R-bindermonoklonalt antistoff som gjenkjenner et spesifikt isozym av en R-binder ved å anvende en inter-klonal subtraksjonsmetode utviklet i forbindelse med oppfinnelsen idet nevnte screeningtrinn. Det er følgelig et hovedformål for den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe det ovennevnte nye monoklonale antistoff, en fremgangsmåte for fremstilling av dette, en immunoassaybestemmelsesmetode ved anvendelse av dette og et immunoassaybestemmelsesreagens.

Oppfinnelsen tilveiebringer et anti-R-binder monoklonalt antistoff og en fremgangsmåte for fremstilling av dette. Det nevnte anti-R-binder monoklonale antistoff fremstilles fra hybridomer oppnådd ved immunisering av et dyr med en R-binder, gjennomføring av cellefusjon med animalske miltceller fra dyret og myelomceller, og gjennomføring av screening for å danne hybridomene, idet det nevnte antistoff er blitt spesifikt bundet til en R-binder med molekylvekt 60-80 K, bestemt i henhold til SDS polyakrylamidgelelektroforese.

Det foretrekkes at screeningstrinnet gjennomføres ved seleksjon av en hybridom som gjenkjenner et enkelt isozym av en R-binder alene ut fra hybridomer avledet fra R-bindere av forskjellige opprinnelser, ved gjennomføring av sandwich-immunoassaybestemmelsen, hvori prøver av hver hybridom-dyrkingssupernatant tilsettes fastfaseplate fremstilt ved binding av den nevnte R-binder av forskjellige opprinnelser til et polyklonalt antistoff anvendt som det primære antistoff.

Det anti-R-binder monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen kan anvendes for en fremgangsmåte for assaybestemmelse av en R-binder ved immunoassaybestemmelse og deretter som et immunossaybestemmelsesreagens for en R-binder, særlig for diagnose av en cancer i et fordøyelsesorgan.

R-binderen i henhold til den forleiggende oppfinnelse kan skrive seg fra en hvilken som helst kilde som f.eks. spytt, melk, blodserum, mavesaft, galle- og mave- eller innvolls-slimhinne. Enten en normal eller cancerøs kilde kan selekteres i avhengighet av formålet. R-bindere viser en felles antigendeterminant uansett opprinnelsene. Et antistoff som gjenkjenner den nevnte felles antigendeterminant anvendes således ved den foreliggende oppfinnelse.

Ved diagnose av cancer fremstilles et antistoff, som spesifikt gjenkjenner en R-binder som skriver seg fra et cancerøst vev og med en antigendeterminant som ikke er tilstede i et normalt vev, ved subtraksjon for derved å øke spesifisiteten. En R-binder som skriver seg fra et cancerøst vev har en antigendeterminant som er felles med f.eks. tilsvarende for en R-binder som skriver seg fra spytt. Den førstnevnte kan således detekteres ved anvendelse av et antistoff som gjenkjenner R-binderen som skriver seg fra spytt så vel som den felles antigen-determinant. Dette faktum er spesielt tydelig ved assaybestemmelse av en R-binder med molekylvekt 60 til 80 K som bestemt ved hjelp av SDS polyakrylamidgelelektroforese). R-binderen som skal assaybestemmes ved den foreliggende oppfinnelse har således en molekylvekt på 60 til 80 K. En hvilken som helst R-binder som skriver seg fra en hvilken som helst kilde kan anvendes for immunisering av dyreceller. Generelt kan en R-binder fremstilt fra humant spytt i henhold til Allens metode (se litteraturhenvisninger 1 og 2) anvendes for dette. Alternativt kan det anvendes en R-binder fremstilt fra dyrkingsceller eller dyrkingssuper-natant av en human mavecancerstamme KATOH III, som beskrevet i det følgende eksempel 2, eller dem som er fremstilt fra kirurgisk fjernet karsinom eller vanlig del av en kirurgisk fjernet mave anvendes. Henvisninger for dette er: 1) Allen.R.H., J.Biol.Chem., Vol.247, No 23 7695-7701

(1972), og

2) Allen.R.H., ibid., Vol. 249, No. 22 7220-7227 (1974)

Dyret som skal immuniseres kan velges fra f.eks. kaniner og mus. Kaniner foretrukkes. for oppnåelse av et antiserum, mens mus foretrekkes for oppnåelse av immuniserte miltceller. Immuniseringen kan gjennomføres på en konvensjonell måte. F.eks. immuniseres en mus med en R-binder sammen med Freunds komplette tilsetningsmiddel, underkastes boosterinjeksjon flere ganger med mellomrom på to uker og underkastes til slutt boosterinjeksjon og miltceller fra dyret tas ut tre døgn deretter.

Som myelomceller kan celler utviklet for cellefunksjon, som f.eks. NS-1 eller SP-2, anvendes.

Som fusjonsmiddel anvendt ved cellefusjonen av miltceller med myelomceller, er polyetylenglykol med gjennomsnitlig molekylvekt omtrent 1000 til 6000 blitt anvendt. Ved den foreliggende oppfinnelse kan polyetylenglykol med molekylvekt 1500 anvendes for dette. Den optimale konsentrasjon derav er foretrukket 40 til 50% avhengig av molekylvekten. F.eks. kan1 g polyetylenglykol oppløses pr. ml av et føtalt kalveserum RPMI-1640 medium og oppvarmes til 37°C for bruk.

Cellefusjonen kan gjennomføres på en konvensjonell måte som følger.

Miltceller blandes med myelomceller i forhold 4:1 itl 10:1 og blandingen sentrifugeres og sammensettes til pellets. Deretter tilsettes et fusjonsmiddel dråpevis dertil i en mengde på 1 ml pr. 1 til 2x10 8 celler. Den oppnådde blanding sentrifugeres for derved å fjerne fusjonsmidlet og suspender-es deretter iet RPMI-1640 medium inneholdende føtalt kalveserum slik at fusjonen fullføres. Til slutt gjennomføres HAT seleksjon på konvensjonell måte for derved å separere de fusjonerte celler (hybridomer) fra foreldrecellene.

Deretter underkastes hybridomene screening på en passende måte for derved å selektere dem som er positive ved anti R-binder produksjonen. I de eksempler som beskrives i det følgende blir EIA, immunoutfelling og fluorescerende antistoffmetoder anvendt ved screeningen.

I dette sereeningtrinn er det fordelaktig å anvende en inter-klonal subtraksj onsmetode utviklet i sammenheng med oppfinnelsen. Ved dette blir et spesielt isozym somøker ved en bestemt sykdom delvis assaybestemt generelt ved f.eks. elektroforese. En omstendelig prosedyre er imidlertid nød-vendig for fremstilling av et antiserum for det spesielle isozym, dvs. selektiv ekstraksjon av isozymet alene etterfulgt av rensing av dette. Det ble derfor utviklet en prosess som omfatter fremstilling av et polyklonalt antistoff for det grunnleggende skjelett molekyl, det ble fremstilt faste faser av et antall immunogener som er forskjellige med hensyn til isozymholdig mønster, det ble foretatt screening av en hybridom for hvert immunogen og det ble selektert et klon som ikke viste noen kryssing. Den ovennevnte prosess ble betegnet "interclonal subraction". Denne kan gjennom-føres i f.eks. EIA på følgende måte. Først fremstilles et polyklonalt antistoff ved å anvende et immunogen som skriver seg fra spytt. Ved å anvende dette antistoff som det primære antistoff i sandwich EIA, blir forskjellige antigener som skriver seg fra f.eks. normale celler, cancerøse celler eller cancerøst vev sammensatt hver til en fast fase. Deretter blir hvert antigen immunisert og hybridomer tilsvarende dertil fremstilles separat. Dyrkingssupernatanten av hybri-domen underkastes screening med bruk av hver fastfaseplate oppnådd i det foregående. En hybridom som gjenkjenner et flertall antigener felles fjernes og de resterende selekteres. Formålet kan således oppnås uten å gjennomføre noen omstendelig prosedyre som følger den konvensjonelle metode. Denne subtraksjonsmetode er tilgjengelig ved fremstilling av et monoklonalt antistoff for et spesielt isozym, ikke bare ved den foreliggende, men også i andre tilfeller. Screening ved immunoutfelling og fluorescerende antistoffmetoder kan gjennomføres på følgende måter. Ettersom en antigen binder ville binde seg til cobalamin, tilsettes 57-Co-B^2til antigener som skriver seg fra forskjellige

kilder og får binde seg dertil. Deretter blir dyrkingssupernatantene av hybridomene som skal screenes tilsatt dertil.

De således dannede immunokomplekser separeres ved anvendelse av et fastfase- antimus-antistoff og gamma-strålene derav telles. Dette er en forenklet screeningmetode tilgjengelig som hjelp.

Blant de positive hybridomer screenet på denne måte blir dem som frembringer et antistoff som spesifikt binder til en R-binder med molekylvekt 60 til 80 K (som bestemt ved hjelp av SDS plyakrylamidgel-elektroforese), og som ved den foreliggende oppfinnelse skal benevnes det tilsiktede antistoff, selektert ved immunoutfelling.

Et hybridom bedømmes nemlig som positivt ved fremstilling av det tilsiktede antistoff ved den foreliggende oppfinnelse, når dets radioautografiske mønster viser et bånd tilsvarende en molekylvekt på 60 til 80 K ved f.eks. tilsetning av 1 25 I-R-binder til dyrkingssupernatanten av den nevnte positive hybridom i laktoperoksidasemetoden, blandingen underkastes immunoutfelling ved anvendelse av protein A sefarose og analysering av samme med 10% SDS polyakrylamidgelelektroforese. Molekylvekten er ikke strengt begrenset av det ovenfor definerte område, dvs. 60 til 80 K og noen variasjon iakttas i avhengighet av det anvendte antigen. Ettersom molekylvekten faller innenfor dette området i de fleste tilfeller er den imidlertid gitt som en standard fra det prak-tiske synspunkt. Molekylvekten av en R-binder som faller innenfor det ovennevnte område viste seg å være 130 til 150 K ved gelfiltrering med Sephadex G200, idet idette nevnes her bare som referanse.

Deretter blir hybridomene som fremstiller det tilsiktede antistoff ved den foreliggende oppfinnelse passende separert og dyrket for derved å gi monoklonale cellestammer. Dette kan gjennomføres ved begrenset fortynningsanalyse. F.eks. fortynnes en cellesuspensjon med et RPMI-1640 medium supplert med føtalt kalveserum og BALB/C muse-brissel (thymus) celler som en fødeblanding, og dyrkes deretter på en vev-dyrkings-plate. Dyrkingssupernatantene fra brønner som viser former-ing underkastes den ovennevnte screening for derved å under-søke nærvær av antistoffet. Denne begrensede fortynnings-kloning kan gjentas minst to ganger. I eksemplene beskrevet i det følgende ble monoklonale cellestammer 55-D og 42-C oppnådd fra en R-binder som skriver seg fra spytt mens stammer "K-1, H-12 og B-3 ble oppnådd fra dem som skrev seg fra KATOH-III celler. Disse stammer er deponert hos Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology. Videre ble nærvær av immunoglobulin i de monoklonale antistoffer oppnådd ved dyrking av disse stammer in vitro undersøkt. Som et resultat ble det funnet at monoklonale antistoffer frembragt av 55-D, 42-C, WK-1, H-12 og B-3 inneholdt henholdsvis IgG1, IgG3, IgG3, IgG3, og IgG3.

De således oppnådde positive hybridomer formeres ved dyrking in vitro eller in vivo. Et rent monoklonalt antistoff fritt for et hvert annet immunoglobulin kan oppnås ved dyrking av en positiv hybridom in vitro. En positiv hybridom fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan således dyrkes i et passende medium som f.eks. et RPMI-1640 medium' supplert med føtalt kalveserum i en passende tidsperiode. På den annen side kan en stor mengde av et monoklonalt antistoff, selv om det eventuelt er forurenset med en liten mengde andre immunoglobulin-er, fremstilles ved dyrking av en positiv hybridom in vivo. F.eks. tilføres pristan (2,6,10,14-tetrametylpentadekan) intraperitonealt til en BALB/C mus. Etter to døgn eller mer blir positive hybridomer fremstilt i samsvar med oppfinnelsen intraperitonealt tilført dyret og fiksert og formert deri som askites (bukvattersott) fluid tumor i løpet av to eller tre uker. Deretter ble bukvattersottfluidet og/eller serum fra dyret samlet og det monoklonale antistoff fremstilt i samsvar med oppfinnelsen oppnås derfra ved isolering og rensing ved f.eks. utsalting eller kromatografering. F.eks. bekreftes antistoffaktiviteten av det samlede bukvattersottfluid ved immunoutfelling. Deretter fraksjoneres immunoglobulin ved kromatografering og positive fraksjoner samles.

Det monoklonale antistoff fremstilt i samsvar med oppfinnelsen gjenkjenner spesifikt et proteinantigen av en R-binder med molekylvekt 60 til 80 K (som bestemt ved SDS polyakrylamidgelelektroforese). En immunosaasybestemmelsesmetode og et immunoassaybestemmelsesreagens kan således oppnås ved å anvende dette, når antigenet skal assaybestemmes for et biokjemisk eller medisinsk formål. Immunoassaybestemmelse in-kluderer f.eks. enzymimmunosassaybestemmelse, radioimmuno-assaybestemmelse og passiv hemagglutinasjon. F.eks. kan enzym immunoassaybestemmelse ved hjelp av den dobbelte antistoff-sandwichmetode gjennomføres på følgende måte.

Hele assaybestemmelsesystemet omfatter en fast fase, et R-binderantistoff for belegning av den faste fase (det primære antistoff), et anti-R-binderantistoff (det sekundære antistoff), et enzymmerket antistoff, et substrat og et standard substrat eller en prøve som skal assaybestemmes. Som den faste fase kan anvendes brønner i en mikrotiterplate for immunoassaybestemmelse. Det primære antistoff for belegning av den faste fase kan fremstilles fra- et antiserum. F.eks. blir kaninantiserum immunisert med en R-binder renset fra humant spytt fraksjonert med ammoniumsulfat og deretter IgG-fraksjonert med DEAE-sefarose for derved å gi et renset antistoff. I eksempler som skal beskrives i det følgende er i dette forkortet til Rab hR. Som enzymmerket antistoff kan det anvendes et passende som fås i handelen. F.eks. ble saue-F(ab)2antimus IgG antistoff merket med pepperrot-peroksidase (HROP) (TAG; NO 4550) anvendt i eksempler som skal beskrives i det følgende. Substratet kan passende selekteres i avhengighet av det anvendte enzym. Det vil si at når peroksidase selekteres som enzym kan o-fenylendiamin anvendes som substrat. Som standardantigen kan anvendes en oppløsning med en kjent konsentrasjon av en R-binder som skriver seg fra en passende kilde som f.eks. spytt eller celler fra dyrking av cancerøst mavevev. Assaybestemmelsen kan_gjennomføres på en konvensjonell enzymimmunoassaybestem-melsesmåte ved hjelp av den dobbelte antistoff-sandwichmetode. Mer detaljert blir standard antigen eller den prøve som skal assaybestemmes tilsatt en brønn belagt med det primære antistoff og inkubert deri. Deretter blir dyrkingssupernatanten fra positive hybridomer tilsatt dertil som det sekundære antistoff og inkubert deri. Videre tilsettes det enzymmerkede antistoff dertil og inkuberes deri. Endelig tilsettes substratet dertil og inkuberes deri. Etter opphørt reaksjon blir mengden av spaltet substrat bestemt.

Assaybestemmelsesreagenset i samsvar med oppfinnelsen er direkte tilgjengelig ved assaybestemmelsesmetoden i samsvar med oppfinnelsen og kan således oppnå det samme formål som assaybestemmelsesmetoden. Assaybestemmelsesreagenset i samsvar med oppfinnelsen omfatter nemlig det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen som en essensiell komponent. Mer spesielt omfatter det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen eventuelt sammen med en eller flere komponenter valgt blant fast fase, primært antistoff, enzymmerket antistoff, substrat og standard antistoff slik at dette utgjør et sett. Den faste fase kan tilveiebringes i en tilstand belagt med det primære antistoff eller det merkede antistoff kan oppdeles i f.eks. et enzym og et antistoff om dette er nødvendig. Settet kan ytterligere omfatte f.eks. passende fortynningsmiddel, oppløsning eller reaksjons-stansende middel for å lette utførelsen av assaybestemmelsen.

Assaybestemmelsesmetoden i samsvar med oppfinnelsen er meget nyttig i praksis på området med klinisk undersøkelse, ettersom den lett kan gjennomføres og gjør det mulig samtidig å behandle et antall prøver. Den er særlig nyttig ved under-søkelse av cancer i et fordøyelsesorgan ved screening av plasma fra en pasient med stor grad av nøyaktighet. Assaybestemmelsesmetoden i samsvar med oppfinnelsen er ikke begrenset til diagnostisering av den ovennevnte cancer, men har bred anvendelse i alle tilfeller hvori en R-binder er tilgjengelig som en tumormarkør og cancerdiagnose kan oppnås ved anvendelse av denne.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av figurene 1, 2 og 3 som er modellriss av resultater av radioautografi ved immunoutfelling.

I det følgende refereres utførelseseksempler.

Eksempel 1

i) Fremstilling av antigen:

Denne prosedyre ble gjentatt i henhold til referanse 1. Dvs. at en kobalamin/sefarose-affinitetskolonne ble fremstilt og 250^ug av en R-binder ble renset fra humant spytt. Separat ble humant spytt sentrifugert ved 10000 g i 30 minutter og supernatanten ble filtrert gjennom et Whatman N85-papir for derved å gi et rått antigen.

ii) Fremstilling av antiserumantistoff:

En kanin ble immunisert med den rensede R-binder fremstilt i i) for derved å gi et antiserum. Dette antiserum ble fraksjonert med ammoniumsulfat og kromatografert med DEAE-cellulose for derved å rense en IgG-fraksjon. Det således oppnådde antistoff anvendes forkortet i det følgende som Rab hR.

iii) Fremstilling av hybridom:

En 8 uker gammel BALB/C-mus ble immunisert med den rensede R-binder oppnådd i i) sammen med Freunds komplette tilsetningsmiddel. Booster-injeksjon med R-binder og Freunds komplette tilsetningsmiddel ble gjennomført flere ganger med mellomrom på 2 uker. Deretter ble dyret tilslutt underkastet booster-injeksjon med den rensede R-binder og milten ble tatt ut tre døgn deretter. Miltceller ble blandet med myelomceller NS-1 og cellefusjonen ble gjennomført ved tilsetning av polyetylenglykol med en molekylvekt på 1500 til blandingen.

Etter gjennomført HAT-seleksjon ble de tilsiktede hybridomer oppnådd.

iv) Screening:

De således oppnådde hybridomer ble underkastet følgende ELISA screening (a) og immunoutfellingsscreening (b) for derved å selektere hybridomer som var positive ved antistoffremstil-1 ingen.

(a) ELISA

50^ Rab«.hR fortynnet 50 ganger ble innført i en Falcon polyetylenkolbe med U-formet bunn og fikk stå deri over natten. Den ble deretter vasket med 0,05% "Tween 20"/PBS, i det følgende forkortet til T-PBS, tre" ganger. 100^1 1% bovint serumalbumin/TBS, i det følgende forkortet benevnt B-TBS, ble tilsatt dertil og den resulterende blanding fik stå ved romtemperatur i to timer og deretter vasket med TPBS. Deretter ble 50^,ul av det rå antigen som skrev seg fra spytt som fremstilt under i) tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i to timer. Etter vasking med TPBS ble dyrkingssupernatanten av hybridomene oppnådd under ii) tilsatt dertil og blandingen fikk stå ved romtemperatur i to timer og deretter vasket med TPBS.

507ul av HRPO-merket geit F(ab)2*MIgG<+>L)(TAG; Nr.;4550) fortynnet 1500 ganger ble tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i to timer. Den ble deretter vasket med T-PBS og 200^ul o-fenylendiamin-substratoppløsning ble tilsatt dertil. 30 minutter deretter ble 25/Ul 2 N H2S0^ tilsatt dertil for derved å stanse reaksjonen og OD^qq av reaksjonsblandingen ble bestemt. ;(b) Immunoutfelling;57qq g ble tilsatt det rå antigen som skrev seg fra spytt som fremstilt under i) og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i tredve minutter og deretter dialysert ved 4°C i 24 til 48 timer for derved å fjerne ;ubundet 57- n . Til 20,ul av57 nD antigen lo—" i 2 ;ble det tilsatt 100^ul av dyrkingssupernatanten av hybridomene som oppnådd under iii) og blandingen fikk stå ved 4°C over natten i et Eppendorf mikrorør. Deretter ble 407ul Rab Mig (A + G + M) (CPL; nr. 321 1-023D fortynnet 100 ganger tilsatt dertil og blandingen ble inkubert i en ende-til-ende-type rystemikser ved romtemperatur i en time. 407ul 1% SAC (PANS0RBIN, fremstilt av Hoechst) ble videre tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk stå over natten ved 4°C. Den ble deretter sentrifugert ved 15000 omdreininger pr. minutt i 10 minutter og de således oppnådde pellets ble talt. Mowe monoklonalt anti-DNP antistoff og normalt museserum ble anvendt som negative kontroller, mens RabothR fortynnet 10 og 100 ganger ble" anvendt som positive kontroller. ;v) Kloning:;Hybridomene screenet under iv) ble klonet ved gjentatt be-grensende fortynningsanalyser to ganger. Som et resultat ble det oppnådd anti-R-binder monoklonalt antistoff-produserende cellestammer 55-D og 42-C. Disse stammer er deponert i Fermentation Research Institute. ;vi) Identifisering av det tilsiktede antistoff:;Nærværet av det tilsiktede antistoff i samsvar med oppfinnelsen, som kunne gjenkjenne en R-binder med molekylvekt 60 til 80 K, i dyrkingssupernatanten undersøkt ved hjelp av SDS-polyakrylamidgel-elektroforese. Dvs. at den rensede R-binder som "skrev seg fra spytt som fremstilt under i) ble merket med 1 25 ;I ved hjelp av laktoperoksidase-metoden. Den merkede R-binder ble tilsatt dyrkingssupernatanten og protein A sefarose ble videre ansatt dertil for derved å separere antigen/ antistoffkomplekser. Deretter ble det gjennomført SDS polyakrylamidgel-elektroforese og radioautografi. Som et resultat viste hver cellestamme et bånd tilsvarende en molekylvekt på 60 til 80 K. ;Separat ble hver cellestamme dyrket in vitro og det monoklonale antistoff i supernatantene ble utfelt ved anvendelse av ammoniumsulfat og dialysert mot PBS. Som et resultat ble det funnet at supernatantene oppnådd fra 55-D og 42-C inneholdt henholdsvis IgG1 og IgG3. ;Eksempel 2;i) Fremstilling av antigen:;En human mave-kreftcellestamme KATOH III ble anvendt. Denne stamme, som var blitt opprettholdt i et medium omfattende 45% av et RPMI-1640-medium, 45% av et MEM-medium og 10% FCS, ble vasket tre ganger med Hanks oppløsning og dyrket i et serum-fritt medium i 7 til 10 døgn. Som et resultat ble det i mediet fremstilt en R-binder med en molekylvekt 130 til 140 K (som bestemt ved hjelp av Sephadex G 200 gelfiltrering). Denne R-binder var også tilstede i cytoplasmaet ved en konsentrasjon 10 ganger så høy som den som oppnås i det konvensjonelle opprettholdelsesmedium. Dyrkingssupernatanten ble konsentrert til 100 ganger med "Amicon". På den annen side ble cellene ultralydbehandlet i PBS inneholdende 1 mM PMSF og 0,001% timerosal i et volum 50 ganger så stort som cellene. Den oppnådde blanding ble sentrifugert ved 10000 G i 30 minutter og supernatanten ble samlet. Disse supernatanter ble kombinert til å gi K III antigen som skrev seg fra mavekreftceller. Det serumfri medium nevnt ovenfor ble fremstilt ved å tilsette insulin, trasferin og essensielle aminosyrer til et MEM eller M199 medium til å gi den endelige konsentrasjon på henholdvis 5^ug/ml, 5/Ug/ml og 1%. ;ii) Fremstilling og screening av hybridom:;Prosedyrene i iii) og iv) i eks. 1 ble gjentatt, ved unntagelse av at det rå antigen som skrev seg fra spytt som anvendt (a) og (b) i iv) ble erstattet med K III antigenet som skrev seg fra mavekreftceller som fremstilt under ovennevnte i). ;III) Kloning og identifisering av det tilsiktede antistoff: Prosedyrene i v) og vi) i eks. 1 ble gjentatt, med unntagelse av den rensede R-binder anvendt i vi) ble erstattet med et rått antigen som skrev seg fra mavekreftvev som blir beskrevet i forsøkseksempel 1 i det følgende. Det ble således oppnådd anti-R-binder monoklonalt antistoff-produserende cellestammer "K-1, H-12 og B-3. Disse stammer er deponert. Hver stamme inneholdt et monoklonalt antistoff som gjenkjente en R-binder med en molekylvekt 60 til 80 K (som bestemt ved hjelp av SDS plyakrylamidgel-elektroforese) og WK-1, H-12 og B-3 inneholdt hvert IgG3. ;Eksempel 3;Et eksempel på assaybestemmelsesmetoden i samsvar med oppfinnelsen skal nå beskrives i forbindelse med et EIA-system ved den inndirekte sandwichmetode. ;Rah hR oppnådd i ii) i eks. 1 ble fortynnet 100 ganger med PBS. 50^,ul porsjoner av oppløsningen ble pipettert inn i brønner i en enzym-immunoassaybestemmelses-multiplate og inkubert deri. Etter vasking med T-PBS, ble 100/ul 1% B-PBS tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 1 time og vasket med T-PBS. Deretter ble 50^ul av et standard antigen eller en prøve som skal assaybestemmes tilsatt dertil og den oppnådde blanding fikk stå ved .romtemperatur i 2 timer. Etter vasking med T-PBS ble 50^ul av dyrkingssupernatanten av 55-D fortynnet 300 ganger med 1% B-PBS tilsatt dertil og den resulterende blanding fikk stå ved romtemperatur i 2 timer. Etter vasking med T-PBS ble 50/ul HRPO-merket gjeit F(ab)2MIgG (jf<+>L) (TAG; Nr. ;4550) fortynnet 1500 ganger med 1% B-PBS tilsatt dertil og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 2 timer og vasket med T-PBS. 200^ul av en o-fenylendiamin substratoppløsning ble tlsatt dertil og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 15 til 30 minutter. Deretter ble 25/Ul 2 N H2S0i|tilsatt dertil for å stanse reaksjonen og OD^q<q>av reaksjonsblandingen ble bestemt. ;Eksempel 4;Det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen, fremstilt på samme måte som beskrevet i eks. 1, ble anvendt som assaybestemmelses-reagens ved oppfinnelsen. Separat ble det monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen kombinert med RabfXhR fremstilt i henhold til ii) i eks. 1 for derved å tilveiebringe et ytterligere assaybestemmelses-reagens i samsvar med oppfinnelsen i form av et sett. ;(5) Virkninger av oppfinnelsen:;For å illustrere virkningene av oppfinnelsen gis følgende forsøkseksempler. ;Forsøkseksempel 1;Prøve:;Rab*hR, 55-D,, WK-1 pg 42-C ble fremstilt som antistoff-prøver mens det rå antigen (S) som skrev seg fra spytt som beskrevet i eks. 1, K III antigenet (K) som skrev seg fra cancerøse maveceller som beskrevet i eks. 2, et rått antigen

(G) som skrev seg fra cancerøst mavevev, et rått antigen (N) som skrev seg fra normalt mavevev, et pasientserum (R) og

galle (B) ble fremstilt som antigenprøver. G og N ble fremstilt på følgende måte. En kirurgisk utkuttet mave av

Borrman III-type (udifferensierte eller moderat differensierte tabulære adenokarsinomer) ble anvendt. Karsinomene ble iakt-tatt utelukkende på den nedre/bakre vegg av maven og den mot-satte del, dvs. forveggen var normal. En normal slimhinne på bakveggen ble skrapet ut på en glassplate mens det cancerøse vev ble samlet ved kutting med saks. Til hvert material oppnådd på denne måte ble det tilsatt 0,25 m sukrose-tris HC1 (pH 7-6) som veide dobbelt så mye som den fuktige substans og den resulterende blanding ble malt i en mikser. 0,15 m NaCl inneholdende 2 mM PMSSF, 1 mM pepstatin og 0,001% metyloleat, med et volum fire ganger så stort som materialet, ble ytterligere tilsatt dertil og blandingen ble sakte omrørt ved 4°C i 48 timer og sentrifugert ved 20000 G i en time. Etter samling av hver supernatant ble prøven G som skrev seg fra det cancerøse vev og prøven N som skrev seg fra den normale slimhinne oppnådd.

Metode:

Hver antigenprøve ble merket med<1>25I, immunoutfelt ved å anvende en passende antistoffprøve og underkastes SDS-polyakrylamidgel-elektroforese etterfulgt av radioautografi.

Resultat:

Figurene 1, 2 og 3 viser resultatene. Hver figur viser data oppnådd ved radioautografi hvori ordinaten refererer til molekylvekt. Fig. 1 viser et tilfelle hvor Rab hR alene ble anvendt som antistoffprøve, og S, G, N, R og B ble anvendt som-antigenprøver. Fig. 2 viser et tilfelle hvori G alene ble anvendt som antigenprøve og bukvattersott-væske-dyrkingssupernatanten av 55-D (a), dyrkingssupernatanten av WK-1 konsentrert 13 (b), bukvattersott-væske-dyrkingssupernatanten av WK-1 (c) og bukvattersokk-væske-dyrkingssupernatanten av 42-C (d) ble anvendt som antistoffprøver. Fig. 3 viser et tilfelle hvori dyrkingssupernatanten av WK-1 ble anvendt som antistoffprøve og S eller G ble anvendt som antigenprøve. I fig. 3 viser S.-, og G^ resultatene oppnådd når antistoff-innholdet i WK-1 ble doblet sammenlignet med S-1 og G-1. Fig. 1 viser et bånd felles for alle antigenprøver ved 60 til 80 K. Figurene 2 og 3 antyder at S og G viser immunologisk kryssing med hverandre ved en molekylvekt på 60 til 80 K og at 55-D gjenkjenner den felles antigengruppe mens WK-1 utelukkende gjenkjenner den inherente. Det er således funnet at WK-1, som selektivt gjenkjenner G, foretrukket anvendes ved påvisning av cancer, selv om 55-D, som gjenkjenner en lang rekke antigendeterminanter, også kan anvendes for dette, ettersom det ovennevnte formål kan oppnås ved assaybestemmelse av hele R-binderen med molekylvekt 60 til 80 K. Videre kan deteksjonsfølsomheten forbedres ved f.eks. samtidig å anvende WK-1, H-12 og 55-D og positivitetsforholdet kan forbedres ved å anvende WK-1 eller H-12 alene.

Forsøkseksempel 2

231 fordøyelsessykaom-plasmaprøver, 54 lever/bukspyttkjertel godartet sykdomsplasmaprøves og 200 normale plasmaprøver ble assaybestemt i henhold til metodne angitt i eks. 3. Midler (M) og standard avvik (SD) ble bestemt fra data på den

normale plasmagruppe og verdien av M + 2SD ble anvendt som grenseverdien mellom positivitet og negativitet.

Resultat:

resultatene er som følger:

A. Mavekreft.

a) positivitetsforhold: 55/114, 49%

b) trinn I: 17/37, 46%; trinn II: 9/14,64%; trinn III 10/18, 56%; trinn IV: 15/31, 36%; og ukjent: 5/14, 36%, c) vev sterkt differensiert: 6/11, 55%;

moderat differensiert: 10/18, 56%; og lite differensiert: 13/21, 62%.

d) metastase metastasering til lever: 6/11, 55%; og

umetastasisering: 12/45, 27%.

B. Bukspyttkjertelcancer inklusive mamilær og terminal gallegangcancer

positivitetsforhold: 17/64, 27%

C. Gallecancer unntatt bukspyttkjertel-mamillær cancer positivitetsforhold: 7/20, 35%

colon/rekturneancer

positivitetsforhold: 8/15, 53%.

D. Levercancer

posotivitetsforhol: 8/13, 62%

E. Esofaguscancer

positivitetsforhold: 0/3, 0%

F. Lever/bukspyttkjertel godartet lidelse pseudopositivitetsforhold: 13/54, 24%

Claims

1. Et anti-R-binder monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er blitt fremstilt fra hybridomer oppnådd ved immunisering av et dyr med en R-binder, gjennomføring av cellefusjon med animalske miltceller fra dyret og myelomceller, og gjennomføring av screening for å danne hybridomene, idet antistoffet er spesifikt bundet til en R-binder med molekylvekt 60 - 80 K, bestemt i henhold til SDS-polyakrylamidgel-elektroforese.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et anti-R-binder monoklonalt antistoff, karakterisert ved at trinnene med immunisering av et dyr med en R-binder, gjennomføring av cellefusjon med animalske miltceller fra dyret og myelomceller og gjennomføring av screening for å danne hybridomene, idet antistoffet er spesifikt bundet til en R-binder med molekylvekt 60 - 80 K, bestemt i henhold til SDS-polyakrylamidgel-elektrof orese.

3. Fremgangsmåte som er angitt i krav 2, karakterisert ved det ytterligere trinn med å selektere en hybridom som gjenkjenner et enkelt isozym av en R-binder alene ut fra hybridomer avledet fra R-bindere med forskjellige opprinnelse, ved gjennomføring av sandwich-immunoassaybestemmelse, hvor prøver av hver hybridomdyrkings-supernatant tilsettes fastfaseplater fremstilt ved binding av den nevnte R-binder av forskjellige opprinnelse til et polyklonalt antistoff anvendt som det primære antistoff.

4. Anvendelse av anti-R-binder-monoklonalt antistoff som angitt i krav 1, for assaybestemmelse av en R-binder.

5. Anvendelse som angitt i krav 4, for diagnose av cancer i et fordøyelsesorgen.

6. Immunoassaybestemmelsesreagens for en R-binder omfattende det anti-R-binder-monoklonale antistoff som angitt i krav 1.

7. Anvendelse av immunoassaybestemmelsesreagenset som angitt i krav 6, som et diagnostisermiddel for cancer i et fordøy-elsesorgan .