KR101488536B1 - 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 항원 - Google Patents

미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 항원 Download PDF

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에무 바이오 테크 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 미코플라스마·뉴모니애가 생산되는 신규 글리세로형 당지질을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명의 글리세로형 당지질은 미코플라스마·뉴모니애를 병원(病原)으로 하는 질환의 진단용 마커로서 사용할 수 있다.

Description

미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 항원{Glyceroglycolipid antigen of mycoplasma pneumoniae}
본 발명은 미코플라스마·뉴모니애(Mycoplasma pneumoniae)로부터 단리된 신규 구조인 글리세로형 당지질 항원물질에 관한 것이다.
미코플라스마는 세포벽을 갖지 않아, 가장 단순하고 작은 미생물군이다. 그 일종인 미코플라스마·뉴모니애는, 미코플라스마 폐렴의 원인 미생물이다. 미코플라스마 폐렴은, 특히 소아의 폐렴에 있어서 폐렴 쌍구균이나 클라미디아 감염에 의한 것과의 구별이 어려워, 그들에 대한 항생물질은 미코플라스마에는 무효하다. 이 진단을 잘못하여, 잘못된 항생물질의 사용에 의해, 심각한 증상에 빠지는 경우도 드물지 않다. 따라서, 정확한 감염의 판단 및 병의 진단을 행하는 것이 요구되고 있다.
그러나, 현행의 미코플라스마·뉴모니애 검출법은, 미코플라스마·뉴모니애의 추출 혼합물을 항원으로서 이용한 것으로, 특이성이 낮은 것, 및 추출물의 로트간의 차이에 의해 재현성이 유지되지 않는 것 등의 문제가 있다.
또한, 미코플라스마·뉴모니애는 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환의 원인물질로서도 보고되어 있다. 그러나, 그 질환 발증의 메커니즘은 아직 해명되어 있 지 않다(일본국 특허공개 제2005-110545호 공보; The Journal of Emergency Medicine, 2006, 30, 4, 371-375.; Cytokine & Growth Factor Reviews, 2004, 15, 2-3, 157-168.; Brain and Development, 2005, 27, 6, 431-433.).
발명의 개시
상기와 같은 상황하에서, 미코플라스마·뉴모니애의 감염의 정확한 판단방법 및 이 미생물에 관련된 질환의 정확한 진단방법이 확립되는 것이 요망되고 있다. 특히, 특이성이 높은 미코플라스마·뉴모니애 검출법이 요망되고 있다.
본 발명자 등은, 미코플라스마·뉴모니애의 병원성을 해명하기 위해, 미코플라스마·뉴모니애의 막지질 분획으로부터 항원성을 갖는 당지질을 분리, 정제하여, 구조해석을 시도하였다. 그 결과, 중요한 생리활성을 가질 가능성이 있는 신규한 당지질을 분리하는 것에 성공하여, 그 절대구조를 결정하였다. 또한, 본 발명의 당지질 항원에 대한 항체가, 신경질환의 환자에게 발견되는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은, 이하의 화합물(본 발명의 글리세로형 당지질), 이를 함유하는 조성물, 진단제, 또는 키트, 및 이들을 사용한 미코플라스마·뉴모니애를 병원(病原)으로 하는 질환의 진단방법을 제공한다.
(1) 하기 일반식으로 표시되는 화합물:
Figure 112009001803814-pct00001
(식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 포화, 불포화를 불문하는 임의의 탄화수소기로부터 독립적으로 선택 가능하다.)
또는, 그의 염.
(2) R3가 -(CH2)nCH3(단, n은 12, 14, 16, 또는 18이다)인 상기 (1)에 기재된 화합물.
(3) 이하의 화합물:
3-O-[(β-D-갈락토피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤,
3-O-[(β-D-글루코피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤, 또는 그의 염인 상기 (1)에 기재된 화합물.
(4) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물을 함유하는 조성물.
(5) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물을 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
(6) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (5)에 기재된 진단제.
(7) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 상기 (4)에 기재된 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
(8) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (7)에 기재된 진단용 키트.
(9) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 상기 (4)에 기재된 조성물을 피험자 유래의 시료와 접촉시키는 공정, 및
상기 시료 중의 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물에 대한 항체를 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단방법.
(10) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (9)에 기재된 진단방법.
(11) 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물을 이용한 상기 (5)~(10) 중 어느 하나에 기재된 진단제, 진단 키트, 또는 진단방법.
(12) 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물을 이용한 상기 (5)~(10) 중 어느 하나에 기재된 진단제, 진단 키트, 또는 진단방법.
(13) 하기 일반식으로 표시되는 화합물에 대한 항체:
Figure 112009001803814-pct00002
(식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 포화, 불포화를 불문하는 임의의 탄화수소기로부터 독립적으로 선택 가능하다.)
또는, 그의 염.
(14) R3가 -(CH2)nCH3(단, n은 12, 14, 16, 또는 18이다)인 상기 (13)에 기재된 항체.
(15) 이하의 화합물에 대한 항체:
3-O-[(β-D-갈락토피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤,
3-O-[(β-D-글루코피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤, 또는 그의 염
인 상기 (13)에 기재된 항체.
(16) 단일클론항체인 상기 (13)~(15) 중 어느 하나에 기재된 항체.
(17) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체를 함유하는 조성물.
(18) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체를 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
(19) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (18)에 기재된 진단제.
(20) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 (17)에 기재된 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애 검출용 키트.
(21) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 (17)에 기재된 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
(22) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (21)에 기재된 키트.
(23) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 (17)에 기재된 조성물을 시료와 접촉시키는 공정, 및
상기 시료 중의 항원물질과 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체의 결합을 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애의 존재를 검출하기 위한 방법.
(24) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 (17)에 기재된 조성물을 피험자 유래의 시료와 접촉시키는 공정, 및
상기 시료 중의 항원물질과 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체의 결합을 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단방법.
(25) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (24)에 기재된 방법.
본 발명은 또한 이하의 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제의 제조방법을 제공한다.
(25) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 화합물 또는 상기 (4)에 기재된 조성물을 적절한 지지체 또는 담체와 결합시키는 공정을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제의 제조방법.
(26) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (25)에 기재된 제조방법.
(27) 상기 (13)~(16) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 상기 (16)에 기재된 조성물을 적절한 지지체 또는 담체와 결합시키는 공정을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제의 제조방법.
(28) 상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 상기 (27)에 기재된 제조방법.
본 발명의 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애의 주요한 항원이기 때문에, 미코플라스마·뉴모니애를 고감도·정확하게 검출하기 위한 분자기반이 될 수 있다. 따라서, 이 당지질을 이용하여 미코플라스마·뉴모니애가 원인인 병의 정확한 진단법, 진단제 및 진단 키트의 개발이 가능하다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 3-O-[(β-D-갈락토피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤(1), 및 3-O-[(β-D-글루코피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤(2)의 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 추출한 지질시료에 대해서, 박상(薄相) 크로마토그래피(TLC)에 의해 지질시료를 전개하고, 오르시놀 시약으로 염색한 도면이다.
도 3은 실시예 1에서 얻어진 지질 분획에 대해서, DMSO-d6 100% 중에서 측정한 DQF-COSY 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 1에서 얻어진 지질 분획에 대해서, ESI-MS 측정에 의한 분석으로 얻어진 스펙트럼 차트이다.
도 5는 미코플라스마·뉴모니애의 지질 분획을 TLC 전개하고, (a): 오르시놀 시약으로 염색한 결과, 및 (b): 길랭-바레 증후군 환자 혈청과의 반응을 TLC-Immunostaining법으로 검출한 결과를 나타내는 도면이다. (b)에 나타내는 바와 같이, 당지질 항원의 스폿이 발색되어 있어, 이는 길랭-바레 증후군의 환자가 당지질 항원에 대한 항체를 보유하고 있는 것을 나타낸다.
도 6은 실시예 3에서, Glcβ-6Galβ-3DAG를 사용한 ELISA법으로 조사한 질환군과 비질환군의 스코어값의 분포를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 3에서, Glcβ-6Galβ-3DAG를 사용한 ELISA법에 의한 실험결과를, 감도 대 위양성률의 값으로 표시한 ROC 곡선(Receiver Operating Characteristic curve)이다.
도 8의 a는 면역 크로마토법 테스트 스트립의 평면도, b는 a에서 나타내어진 면역 크로마토법 테스트 스트립의 세로 단면도를 나타낸다. 도면 중의 부호는, 각각 이하를 표시한다.
1 점착 시트; 2 함침 부재; 3 막 담체; 31 포착부위; 4 흡수용 부재; 5 시료 첨가용 부재.
도 9는 미코플라스마·뉴모니애 균체로부터 추출한 지질 혼합물, 및 화학합성에 의해 제작한 Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG를 HTLC 플레이트에 전개하여, 얻어진 염소 혈청을 반응시킨 결과를 나타내는 사진이다. 오른쪽 도면은, 얻어진 염소 혈청을 사용하여 면역염색한 결과이다. 왼쪽 도면은, 화합물을 전개한 HTLC 플레이트를 오르시놀 염색한 결과이다.
도 10은 Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG를 항원과 황산암모늄 분획으로 정제한 단일클론항체와의 반응성을 나타내는 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다. 단일클론항체가 GalGL 및 GulGL의 어느 것과도 반응하였다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자 등은, 미코플라스마·뉴모니애의 항원물질 중으로부터, 특히 항원성이 강한 주요한 화합물의 단리·정제에 성공하였다. 또한 그 구조해석을 행하여, 신규 글리세로형 당지질을 동정하였다.
1. 본 발명의 글리세로형 당지질
일 실시형태에 있어서, 본 발명은 미코플라스마·뉴모니애의 항원물질로부터 새롭게 단리되어, 구조 결정된 글리세로형 당지질을 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애가 생성하는, 이하의 구조식으로 표시되는 글리세로형 당지질:
Figure 112009001803814-pct00003
(식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 포화, 불포화를 불문하는 임의의 탄화수소기로부터 독립적으로 선택 가능하다.)
또는, 그의 염이다. 바람직하게는 R3는 -(CH2)nCH3(n은 12, 14, 16, 또는 18이다)로 표시되는 포화 탄화수소이다.
특히 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공되는 글리세로형 당지질은, 하기의 구조식:
Figure 112009001803814-pct00004
으로 표시되는 글리세로형 당지질, 또는 그의 염이다.
상기 구조식에 있어서, (1)의 경우는 3-O-[(β-D-갈락토피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤(3-O-[(β-D-Galactopyranosyl)-(1,6)-(β-D-galactopyranosyl)]-1,2-di-O-acyl-sn-glycerol)(본 명세서 중, 「Galβ-6Galβ-3DAG」라고 약칭하는 경우가 있다.)이고, (2)의 경우는 3-O-[(β-D-글루코피라노실)-(1,6)-(β-D-갈락토피라노실)]-1,2-디-O-아실-sn-글리세롤(3-O-[(β-D-Glucopyranosyl)-(1,6)-(β-D-galactopyranosyl)]-1,2-di-O-acyl-sn-glycerol)(본 명세서 중, 「Glcβ-6Galβ-3DAG」라고 약칭하는 경우가 있다.)이다. 단, 아실(acyl)기는, 팔미토일(palmitoyl)기 또는 스테아로일(stearoyl)기이다.
본 명세서 중, 「본 발명의 글리세로형 당지질」이라고 하는 경우, 상기 구조식으로 표시되는 글리세로형 당지질 및 그의 염을 가리키는 것으로 한다. 염으로서는, 생리학적으로 허용되는 산(예, 무기산, 유기산)이나 염기(예, 알칼리금속염) 등과의 염이 사용되고, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이와 같은 염으로서는, 예를 들면 무기산(예, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산)과의 염, 또는 유기산(예, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 구연산, 사과산, 옥살산, 안식향산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산)과의 염 등이 포함된다.
본 발명의 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애가 생산하는 당지질로서, 미코플라스마·뉴모니애의 검출, 또는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단을 위한 마커로서 유용하다. 예를 들면, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 사용함으로써, 면역학적 수법을 사용하여 미코플라스마·뉴모니애의 검출, 또는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단을 행할 수 있다.
2. 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 자기항체를 검출하는 것에 의한, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단방법
본 발명의 일 실시형태에 의하면, 피험자 유래의 시료 중 항글리세로형 당지질 항체의 존재에 의해 특징지어지는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단방법이 제공된다. 이 방법은, 본 발명의 글리세로형 당지질을 피험자 유래의 시료와 접촉시키는 공정을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서 사용하는 항글리세로형 당지질 항체의 측정방법으로서는, 피험자 유래의 시료 중 항글리세로형 당지질 항체의 측정을 가능하게 하는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 전형적으로는, 항원항체반응을 토대로 하는 면역학적 측정법을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 사용하는 면역학적 측정법은, 피험자 유래의 시료와 본 발명의 글리세로형 당지질을 접촉시키는 공정, 및 피험자 유래의 시료 중 항글리세로형 당지질 항체와 본 발명의 글리세로형 당지질과의 면역 복합체의 존재를 검출하는 공정을 포함한다.
본 명세서 중 「미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환」이란, 미코플라스마·뉴모니애의 감염에 의해서 일어나는 질환을 의미한다. 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환은, 전형적으로는, 본 발명의 글리세로형 당지질 또는 이들의 염, 또는 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 자기항체가, 당해 질환의 환자 유래의 생체시료 중에서 검출됨으로써 특징지어진다. 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 예로서는, 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서 중 「피험자」란, 미코플라스마·뉴모니애에 감염되어 있을 우려가 있는 포유동물(예를 들면, 사람, 원숭이, 소, 말, 양, 토끼, 랫트, 마우스 등을 포함한다)을 의미하는데, 바람직하게는 사람이고, 가장 바람직하게는 미코플라스마·뉴모니애에 감염되어 있는 사람, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환을 앓고 있을 우려가 있는 사람, 또는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환을 앓고 있는 사람을 의미하는 것으로 한다.
본 명세서 중, 「시료」 또는 「생체시료」란, 피험자로부터 채취된 체액, 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 관절액, 뇌척수액, 타액, 양수, 뇨, 땀, 췌장액, 활액 등, 및 조직, 세포 등을 포함하는 것으로 한다.
본 발명의, 피험자에 유래하는 시료 중 자기항체의 검출을 토대로 하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단 및 예지(豫知)방법은, 이와 같은 질환을 갖는 피험자 및 질환이 없는 대조로부터의 생체시료의 사용에 의해 확인된다. 자기항체를 함유할 가능성이 있는 생체시료, 예를 들면 혈청은, 특정 질환의 존재가 의심되는 피험자 또는 질환을 발증하는 소인(素因)이 의심되는 피험자로부터 얻어진다. 동일한 체액이, 질환을 갖지 않는 대조로부터 얻어진다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 글리세로형 당지질 항원에 대해 반응성의 자기항체의 측정을, 질환, 예를 들면 미코플라스마 폐렴의 초기진단에 사용할 수 있다. 또한, 자기항체 레벨의 모니터링은 질환의 진행을 예지적으로 명확하게 하기 위해 사용할 수 있다.
3. 항글리세로형 당지질 항체의 측정방법
시료, 예를 들면 피험자 유래의 혈청시료 중 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 자기항체의 검출은 임의의 다수의 방법으로 실행할 수 있다. 이와 같은 방법에는 면역측정법(immunoassay)이 있고, 이것에는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯, 방사성 면역측정법(radioimmunoassay), ELISA(고상 효소 면역측정법), 「샌드위치」 면역측정법, 면역 침강 측정법, 침강반응, 겔 확산 침강반응, 면역 확산 측정법, 응집 측정법, 보체 결합 측정법, 면역방사 계수측정법(immunoradiometric assay), 형광 면역측정법, 프로테인 A 면역측정법 등이 포함된다.
이와 같은 면역측정법은, 피험자 유래의 시료를, 본 발명의 글리세로형 당지질 항원 또는 그것을 함유하는 조성물과 특이적인 항원-항체 결합이 일어나는 조건하에 접촉시켜, 자기항체에 의한 면역 특이적 결합을 검출 또는 그의 양을 측정하는 것으로 되는 방법에 의해서 실시된다. 특정의 태양에 있어서는, 조직 절편에 의한 이와 같은 자기항체의 결합을, 예를 들면 자기항체의 존재를 검출하기 위해 사용하는 것이 가능하고, 이 경우, 자기항체의 검출은 질환상태인 것을 나타낸다. 혈청시료 중에 있어서의 자기항체의 레벨을, 질환을 갖지 않는 피험자로부터의 동종의 혈청시료 중에 존재하는 레벨과 비교한다.
면역측정법은 다양한 방법으로 실시할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 측정법을 실시하기 위한 하나의 방법은, 본 발명의 글리세로형 당지질의 고체 지지체 상으로의 계류(繫留) 및 그것에 특이적으로 결합하는 항글리세로형 당지질 항체의 검출을 포함한다.
시료 중의 항글리세로형 당지질 항체의 측정방법은, 보다 구체적으로는, 예를 들면 이하와 같은 공정을 포함한다:
(1) 고상에 고정화한 본 발명의 글리세로형 당지질과 생체시료 중의 항글리세로형 당지질 항체를 반응시켜, 면역 복합체를 형성시키는 공정(1차 반응),
(2) (1)의 공정에서 생성된 면역 복합체와 표지화 항인간 면역글로불린 항체를 반응시켜, 면역 복합체를 형성시키는 공정(2차 반응),
(3) 면역 복합체를 형성하지 않는 표지화 항인간 면역글로불린 항체를 고상으로부터 분리하는 공정,
(4) 고상에 생성된 면역 복합체 중의 표지량 또는 표지활성을 측정하는 공정,
(5) 미리 기지 농도의 항글리세로형 당지질 항체를 사용하여 작성한 검량선과, (4)의 측정으로 얻어진 측정값을 비교하는 공정.
상기 (1)의 공정과 (2)의 공정 사이에, 필요에 따라서 1차 반응 후의 고상을 세정하는 공정을 추가해도 된다. 또한, (1) 및 (2)의 공정을 동시에 행해도 된다. 또한, 본 발명의 생체시료 중의 항글리세로형 당지질 항체의 측정에 있어서는, 2차 반응에서 비오틴화 항인간 면역글로불린 항체 등과 반응시켜도 된다. 이 경우, 2차 반응에 의해 생성된 면역 복합체(본 발명의 글리세로형 당지질, 항글리세로형 당지질 항체, 및 비오틴화 항인간 면역글로불린 항체를 함유하는 복합체)와 (스트렙트) 아비딘 표지화 항체를 반응시켜, 생성된 면역 복합체 중의 아비딘 표지화 항체량을 측정하면 된다. 또한, 2차 반응에 있어서, (표지화) 항인간 면역글로불린 항체 대신에, 항글리세로형 당지질 항체와 반응하는 (표지화) 앱타머를 사용하는 것도 가능하다.
1차 반응은, 수성 매체 중(예를 들면, 웰 내의 액상 중)에서 행해져도 되고 건식 매체 중(예를 들면, 고상 지지체 상)에서 행해져도 된다. 본 발명의 글리세로형 당지질이 고정화되는 고상으로서는, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트 등의 폴리스티렌 플레이트, 유리제 또는 합성수지제 입상물(비즈), 유리제 또는 합성수지제 구상물(볼), 라텍스, 자성입자, 니트로셀룰로오스막 등의 각종 멤브레인, 합성수지제 시험관, 실리카겔 플레이트 등을 들 수 있다. 2차 반응에 대해서도, 수성 매체 중에서 행해져도 되고 건식 매체 중에서 행해져도 된다. 2차 반응에 의해 고상 상에 생성된 면역 복합체 중의 표지의 양 또는 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면 흡광도법(비색법), 형광법, 발광법, 방사활성법 등을 들 수 있다. 표지가 효소인 경우, 효소의 기질을 당해 효소와 반응시켜, 생성된 물질을 측정함으로써, 면역 복합체 중의 효소활성을 측정할 수 있다. 효소의 기질과 당해 효소의 반응은, 수성 매체 중에서 행해지는 것이 바람직하다.
상기의 방법으로 미코플라스마·뉴모니애에 감염되어 있는 것으로 판정 또는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환을 앓고 있는 것으로 진단된 피험자는, 적절한 처치 또는 치료를 받을 수 있다.
4. 본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는 조성물, 진단제, 및 진단용 키트
본 발명은 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제를 제공한다. 본 발명은 또 다른 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질 또는 본 발명의 상기 조성물을 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는 조성물은, 적절한 담체, 부형제, 완충제, 희석제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 항체를 제작할 목적으로 마우스, 랫트, 토끼 등의 동물에 투여하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은 시료 중의 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 항체(예를 들면 항Galβ-6Galβ-3DAG 항체 또는 항Glcβ-6Galβ-3DAG 항체)를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트에 포함시킬 수 있다.
본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는 상기 본 발명의 진단제 및 키트는, 상기에서 설명한 항글리세로형 당지질 항체의 측정방법에 따라서 사용된다. 본 발명의 키트는, 상기에서 설명한 2차 반응을 위한 비오틴 등으로 표지한 항인간 면역글로불린 항체 등을 추가적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 키트에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질은, 예를 들면 마이크로타이터 플레이트 등의 폴리스티렌 플레이트, 유리제 또는 합성수지제 입상물(비즈), 유리제 또는 합성수지제 구상물(볼), 라텍스, 자성입자, 니트로셀룰로오스막 등의 각종 멤브레인, 합성수지제의 시험관, 실리카겔 플레이트 등의 고상 지지체에 고정화되어 있어도 된다. 본 발명의 키트는 또한, 반응을 행하기 위한 액상으로서 사용하기 위한 완충액 등을 포함하고 있어도 된다. 또한, 본 발명의 키트에는, 제조업자에 의한 취급 설명서 등이 포함되어 있어도 된다.
본 발명은 또한, 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질 또는 본 발명의 글리세로형 당지질을 함유하는 조성물을 적절한 지지체 또는 담체에 결합시키는 공정을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제의 제조방법을 제공한다. 담체로서는, 예를 들면 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성 다당류, 예를 들면 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지 또는 유리 등을 사용할 수 있다.
5. 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 항체 및 그의 사용
본 발명은 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는, 미코플라스마·뉴모니애 고유의 글리세로형 당지질(본 발명의 글리세로형 당지질)에 대해 반응 특이성을 갖기 때문에, 이것을 사용하여 검체 중의 글리세로형 당지질을 면역학적으로 측정할 수 있다. 본 발명의 항체는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단에 사용할 수 있다.
(I) 본 발명의 항체의 조제
본 발명의 항체는, 미코플라스마·뉴모니애 유래의 본 발명의 글리세로형 당지질을 항원으로서 동물을 면역하고, 그 동물로부터 혈청을 분리하거나, 또는 그 동물의 항체 생산세포를 채취하여, 영속적으로 배양 가능하게 하고, 그 배양물로부터 회수함으로써 얻어진다. 이하에, 본 발명의 항체의 조제법을 예시하지만, 이것에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질을 항원에 사용한다면, 기타 방법으로 조제해도 된다.
(1) 다중클론항체의 조제
예를 들면, 후술하는 실시예에 기재되는 바와 같이 하여 얻어진 미코플라스마·뉴모니애의 지질 추출물에, 모노포스페이트 리피드, 프로인트 완전 애쥬번트, 및 미네랄 오일을 첨가하여 혼합하고, 추가적으로 0.1%(v/v) Tween 80을 포함하는 PBS(인산완충 생리식염수)를 첨가하여 유화한다.
다음으로, 얻어진 유화물을 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 양 등의 동물의 피하 또는 복강내에 투여한다. 초회 면역 후, 2~3주째에 통상의 방법으로 추가 면역을 행하면, 역가가 높은 항혈청이 얻어진다. 최종 면역으로부터 1주 후에 혈액을 채취하고, 혈청을 분리한다. 이 혈청을 열처리하여 보체를 비활성화시킨 후, 황산암모늄에 의한 염석, 이온 교환 크로마토그래피 등의 통상의 항체의 정제와 동일한 방법으로 면역글로불린 분획을 취득한다. 또한, 최종 면역 후에, 효소 면역측정법 등에 의해 혈중 항체가의 상승을 확인해 두는 것이 바람직하다.
상기와 같이 하여 얻어지는 항체는, 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질에 대해 특이적으로 결합한다. 본 명세서 중, 항체가 어느 항원(예를 들면, 본 발명의 글리세로형 당지질)에 대해 「특이적으로 결합한다」란, 그 항체가 다른 물질(예를 들면, 본 발명의 글리세로형 당지질 이외의 다른 글리세로형 당지질)에 대한 그 친화성보다도, 그 항원에 대해 실질적으로 높은 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 여기서, 「실질적으로 높은 친화성」이란, 목적하는 측정장치에 의해서, 그 특정의 항원으로부터 구별하여 검출하는 것이 가능한 정도로 높은 친화성을 의미하고, 전형적으로는, 결합상수(Ka)가 적어도 107 M-1, 바람직하게는 적어도 108 M-1, 보다 바람직하게는 109 M-1, 더욱 보다 바람직하게는 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 그보다 높은, 예를 들면 최고 1013 M-1, 또는 그보다 높은 것인 결합 친화성을 의미한다.
미코플라스마·뉴모니애의 지질 추출물 대신에, 정제한 본 발명의 글리세로형 당지질을 사용하면, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 다중클론항체가 얻어진다.
(2) 단일클론항체의 조제
단일클론항체는, 쾰러와 밀스테인의 방법(Nature, 495~492페이지, 1975년)에 의해서 얻어진다. 즉, 글리세로형 당지질에 대한 항체를 생산하는 포유동물의 항체 생산세포와 골수종(미엘로마) 세포를 융합시켜서 하이브리도마를 제작하고, 목적의 항체를 생산하는 하이브리도마를 클로닝하여, 이 하이브리도마를 배양함으로써 배양액 중에 단일클론항체가 얻어진다. 이하, 공정별로 나누어 설명한다.
(i) 동물의 면역 및 항체생산세포의 조제
글리세로형 당지질에 대한 항체를 생산하는 세포는, 글리세로형 당지질로 마우스, 랫트, 토끼, 기니피그, 양 등의 동물을 면역하고, 그 동물로부터 비장세포, 림프절세포, 말초혈액 등을 조제함으로써 얻어진다. 상기 동물을 글리세로형 당지질로 면역하기 위해서는, (1)과 동일하게 행하면 된다.
본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 단일클론항체를 얻기 위해서는, 정제한 본 발명의 글리세로형 당지질로 동물을 면역해도 되지만, 글리세로형 당지질 혼합물로 면역한 동물의 항체생산세포를 사용하여 하이브리도마를 조제하고, 얻어진 하이브리도마로부터 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 단일클론항체를 생산하는 주(株)를 선택해도 된다. 이 방법에 의하면, 동물의 면역에 필요한 양의 본 발명의 글리세로형 당지질을 얻을 필요가 없어, 효소면역법에 의한 검출이 가능한 정도의 미량의 본 발명의 글리세로형 당지질이 있으면 된다.
(ii) 하이브리도마의 제작
글리세로형 당지질로 면역한 동물로부터 항체생산세포를 채취하여, 골수종 세포와의 세포융합을 행한다. 세포융합에 사용하는 골수종 세포에는 각종 포유동물의 세포주를 이용할 수 있으나, 항체생산세포의 조제에 사용한 동물과 동종의 동물의 세포주를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 골수종 세포주는, 세포융합 후에 미융합세포와 융합세포를 구별할 수 있도록 하기 위해, 미융합의 골수종 세포가 생존할 수 없고 하이브리도마만이 증식할 수 있도록, 마커를 갖는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 8-아자구아닌 내성주는, 하이포크산틴-구아닌-포스포리보실트랜스퍼라아제(HGPRT)를 결손하고 있어, 핵산합성은 de novo 합성경로에 의존하고 있다. 이와 같은 골수종 세포와 정상 항체생산세포의 융합세포(하이브리도마)에서는, 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함하는 배지(HAT 배지) 중에서, 아미노프테린에 의해 de novo 합성경로가 저해되어도, 티미딘, 하이포크산틴이 존재하고 있기 때문에, 림프구 유래의 샐비지 회로에 의해 핵산합성할 수 있어, 증식이 가능하다. 이에 대해, 8-아자구아닌 내성의 골수종 세포는, 아미노프테린에 의해 de novo 합성경로도 저해되므로, 핵산합성할 수 없어 사멸하고, 또한 정상세포인 항체생산세포도 장기배양은 불가능하다. 따라서, 항체생산세포와 골수종 세포의 융합에 의해서 생성된 하이브리도마만이 HAT 배지에서 증식할 수 있기 때문에, 비융합세포로부터 융합세포를 선택할 수 있다(사이언스 제145권 709페이지, 1964년). 또한, 골수종 세포로서, 고유의 면역글로불린을 분비하지 않는 주를 사용하는 것이, 하이브리도마의 배양 상청으로부터 목적의 항체를 취득하는 것이 용이해지는 측면에서 바람직하다.
하이브리도마를 얻기 위한 세포융합은, 예를 들면 이하와 같이 하여 행한다. 면역동물로부터 비장을 적출하고, RPMI1640 배지에 현탁하여 세포 부유액을 조제한다. 이 비장세포와, 대수 증식기에 있는 마우스 골수종 세포, 예를 들면 SP2/0 세포(아자구아닌 내성, IgG 비분비: ATCC CRL-1581)를, 비장세포와 골수종 세포가 10:1~1:1 정도가 되도록 혼합하고, 원심한 후, 침사(sedimentation)에 평균분자량 1,000~6,000의 폴리에틸렌글리콜을, 최종농도가 30~50%가 되도록 첨가하여 세포를 융합시킨다. 폴리에틸렌글리콜을 첨가하는 대신에, 세포 혼합액에 전기펄스를 인가함으로써 융합시켜도 된다.
융합처리를 행한 세포는, 예를 들면 10%(v/v) 소 태아 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI1640 배지 등에서 배양한 후, HAT 배지 등의 선택배지에 부유시키고, 96 웰의 마이크로타이터 플레이트 등에 분주하여 배양을 행하고 하이브리도마만을 생육시킨다.
(iii) 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마의 검색
상기와 같이 하여 얻어진 하이브리도마는, 복수의 항원 또는 항원결정 부위에 대한 각각의 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마의 혼합물이기 때문에, 이들 중에서 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 단일클론항체(예를 들면, Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG에 대해 반응 특이성을 갖는 단일클론항체)를 생산하는 주를 선택한다. 또한, 본 발명의 글리세로형 당지질에 결합하는 단일클론항체 중, 항원성이 강한 항원결정 부위에 대한 단일클론항체를 생산하는 주를 선택하는 것이 바람직하다.
글리세로형 당지질에 대한 단일클론항체를 생산하는 주는, 이들을 항원으로서 사용하는 효소면역법으로 선택할 수 있다. 이와 같은 방법으로서 ELISA법, 즉 항원을 마이크로타이터 플레이트 등에 고상화해 두고, 여기에 하이브리도마 배양액을 첨가하여, 추가적으로 효소, 형광물질, 발광물질 등으로 표지한 2차 항체를 첨가하여 인큐베이트하고, 결합한 표지물질에 의해서 항체를 검출하는 방법을 들 수 있다. 이때, 항체를 고상화하여, 여기에 항원, 표지 2차 항체를 순차 첨가하여 인큐베이트해도 된다. 또한, ELISA법에 대해서는 나중에 상세하게 기술한다.
정제된 본 발명의 글리세로형 당지질이 얻어지지 않은 경우에는, 미코플라스마·뉴모니애의 지질 분획을 고속 박층 크로마토그래피(HPTLC) 플레이트를 사용하여 분리하고, 이 플레이트에 하이브리도마의 배양액, 표지 2차 항체를 순차 첨가하여 인큐베이트하여, 표지물질이 결합하는 위치를 검출한다. 이 위치가 본 발명의 글리세로형 당지질(예를 들면, Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG)이 HPTLC에 의해서 전개되는 위치와 동일하면, 그 하이브리도마는 그 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 단일클론항체를 생산하는 것으로 인정된다. 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 단일클론항체가 얻어진다면, 이것을 사용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 등에 의해서, 지질 분획으로부터 본 발명의 글리세로형 당지질을 정제하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마를 포함하는 것이 확인되었다면, 그 하이브리도마가 포함되어 있던 웰의 세포로부터 한계희석법 등으로 클로닝을 행한다.
(iv) 단일클론항체의 조제
상기와 같이 하여 얻어진 하이브리도마를 적당한 배지 중에서 배양하면, 그 배양상청 중에 본 발명의 단일클론항체가 얻어진다. 또한, 통상의 방법에 의해, 황산암모늄 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 프로테인 A 또는 프로테인 G를 사용한 친화성 크로마토그래피, 또는 항원을 고정화한 면역 흡착 크로마토그래피 등에 의해서 단일클론항체를 정제할 수 있다.
이렇게 하여 얻어지는 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 단일클론항체는, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 특이적으로 결합한다. 따라서, 바람직하게는 그와 같은 단일클론항체는, 미코플라스마·뉴모니애에 감염되어 있지 않은 건강한 정상인의 혈청 중에 존재하는 시알산 함유 당지질(강글리오시드), 혈소판 활성화 인자(1-알킬-2-아세틸글리세로-3-포스포콜린) 또는 그의 부분 탈아실화물, 포스파티딜콜린 또는 그의 부분 탈아실화물, 또는 스핑고미엘린 등의 당지질 및 인지질과는 교차 반응을 나타내지 않는다.
본 발명의 단일클론항체는, 그대로 사용하는 것도 가능하지만, 프래그먼트화한 것을 사용하는 것도 가능하다. 항체의 프래그먼트화시, 항체의 항원결합 부위(Fab)가 보존되어 있는 것이 항원과 항체의 결합에 필수이기 때문에, 항원결합 부위를 분해하지 않는 프로테아제(예를 들면 플라스민, 펩신, 파파인)로 항체를 처리하여 얻어지는 항원결합 부위(Fab)를 포함하는 프래그먼트는 사용할 수 있다. 항체 프래그먼트의 예로서는, Fab, Fab'2, CDR 등을 들 수 있다. 또한, 인간화 항체, 다기능 항체, 단일사슬 항체(ScFv) 등도 본 발명에 있어서 사용할 수 있다. 항체의 클래스는, 특별히 한정되지 않고, IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE 등 중 어느 아이소 타입을 갖는 항체도 포함한다. 바람직하게는, IgG 또는 IgM이고, 정제의 용이성 등을 고려하면, 보다 바람직하게는 IgG이다.
또한, 본 발명의 단일클론항체를 코드하는 유전자의 염기서열 또는 항체의 아미노산 서열이 결정된다면, 유전자 공학적으로 항원결합 부위(Fab)를 포함하는 프래그먼트를 제작하는 것이 가능하다.
6. 본 발명의 항글리세로형 당지질 항체를 함유하는 조성물, 진단제, 및 진단용 키트
본 발명은, 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대한 항체를 함유하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 적절한 담체, 부형제, 완충제, 희석제 등을 포함할 수 있다. 담체로서는, 예를 들면 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성 다당류, 예를 들면 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지 또는 유리 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은, 시료 중의 본 발명의 글리세로형 당지질을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은, 생체시료 중의 본 발명의 글리세로형 당지질을 검출하는 것에 의한, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 피험자 유래의 시료 중 본 발명의 글리세로형 당지질의 존재에 따라 특징지어지는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환을 진단하기 위한 약제 또는 키트를 제공하고, 이 약제 또는 키트는, 본 발명의 항글리세로형 당지질 항체를 포함하거나, 또는 이 항체를 함유하는 조성물을 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 적절한 지지체 또는 담체에 결합시키는 공정을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 키트는, 면역측정법에 따라서 사용된다. 본 발명의 키트는, 필요에 따라서, 면역학적 방법으로 피검체 중의 글리세로형 당지질 또는 미코플라스마·뉴모니애를 검출할 때, 본 발명의 글리세로형 당지질에 대해 반응 특이성을 갖는 항체와, 이 항체의 조제에 사용한 면역동물 이외의 동물을 사용하여 조제한 상기 면역동물의 면역글로불린에 대한 항체를 표지물질로 표지화한 2차 항체를 포함하고 있어도 된다.
구체적인 키트의 일례로서, 마이크로타이터 플레이트, BSA(소 혈청 알부민) 등의 블로킹 시약, 본 발명의 글리세로형 당지질(표준물질), 본 발명의 항체, 퍼옥시다아제 표지한 항마우스 IgG 항체, 과산화수소수, OPD, 세정용 완충액으로 되는 키트를 들 수 있다. 항체류, 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 등은, 동결 건조품으로서, 또는 이들을 안정하게 보존할 수 있는 용매에 용해해 두는 것이 바람직하다. 본 발명의 키트는, 추가적으로 제조업자에 의한 취급설명서를 포함하고 있어도 된다.
(측정법)
본 발명에 있어서 사용되는 면역학적인 측정법으로서는, ELISA법, 면역염색법 등, 항체를 사용하는 통상의 면역학적 방법을 들 수 있다. 예를 들면, 항글리세로형 당지질 항체가 결합한 고상에 검체액을 접촉시켜서 검체액 중에 포함되는 글리세로형 당지질을 상기 항체에 결합시키고, 비흡착성분을 고상으로부터 분리 제거하고, 이어서 표지물질로 표지화한 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질을 상기 고상에 접촉시키고, 상기 검체액 중에 포함되는 글리세로형 당지질과 표지화한 글리세로형 당지질을 경합반응시켜서, 고상에 결합한 표지물질 또는 고상에 결합하지 않은 표지물질 중 어느 하나를 검출함으로써, 검체액 중의 글리세로형 당지질을 측정할 수 있다.
또한, 항글리세로형 당지질 항체가 결합한 고상에, 검체액과, 표지물질로 표지화한 글리세로형 당지질을 접촉시키고, 상기 검체액 중에 포함되는 글리세로형 당지질과 표지화한 글리세로형 당지질을 상기 항체에 대해 경합반응시켜, 고상에 결합한 표지물질 또는 고상에 결합하지 않은 표지물질 중 어느 하나를 검출함으로써 검체 중의 글리세로형 당지질을 측정할 수 있다. 이때, 표지화한 글리세로형 당지질 대신에 무표지의 표준 글리세로형 당지질을 사용하여, 검체 중의 글리세로형 당지질과 표준 글리세로형 당지질의 경합반응을 행한 후, 추가적으로 표지물질로 표지화한 항글리세로형 당지질 항체를 고상에 접촉시켜, 고상에 결합한 표지물질 또는 고상에 결합하지 않은 표지물질 중 어느 하나를 검출해도 된다. 이 경우도, 또한 표지화한 2차 항체를 사용해도 된다.
또한, 검체액 중의 글리세로형 당지질을 고상에 결합하고, 여기에 표지화한 항글리세로형 당지질 항체를 접촉시켜, 고상에 결합한 표지물질 또는 고상에 결합하지 않은 표지물질 중 어느 하나를 검출해도 된다.
기타, 면역학적 측정법에는 각종 태양이 알려져 있지만, 어떤 방법도 본 발명에 적용할 수 있다. 또한, 상기와 같은 고상을 사용하는 방법 이외에, 합텐, 항원의 면역측정에 사용되는 방법, 예를 들면 상기 항체에 대해 검체 중의 글리세로형 당지질과 표지화한 글리세로형 당지질을 경합반응시키고, 항체와 결합한 항원과 유리된 항원을, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 2차 항체 등을 사용하여 분리하여, 유리된 표지항원의 표지물질을 검출하는 액상법을 채용해도 된다.
상기 고상으로서는, 아가로오스 비즈, 라텍스 입자, 폴리스티렌, 나일론 등의 마이크로타이터 플레이트의 웰 등의 통상의 재료 및 형태(입자, 미립자, 시험관, 마이크로타이터 플레이트, 스트립 등)의 것을 들 수 있다. 고상에 항체 또는 글리세로형 당지질을 결합시킨 후, BSA(소 혈청 알부민)나 젤라틴 등을 사용하여 블로킹을 행하는 것이 바람직하다. 또한, 표지물질로서는, 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제 등, 효소반응에 의해 색소의 발색이 가능한 효소; 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 등의 형광색소 등을 들 수 있다.
색소는, 퍼옥시다아제에 대해서는 4-클로로-1-나프톨, O-페닐렌디아민(OPD) 또는 3,3'-디아미노벤지딘 등, 알칼리포스파타아제에 대해서는 p-니트로페닐포스페이트 등을 사용한다.
또한, 본 발명의 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애 고유이기 때문에, 상기의 방법으로 검체 중의 글리세로형 당지질을 측정하여, 글리세로형 당지질의 존재 여부 또는 그의 존재량과 검체 중의 미코플라스마·뉴모니애의 존재 여부 또는 그의 존재량을 관련지음으로써, 미코플라스마·뉴모니애를 검출하는 것도 가능하다.
상기 글리세로형 당지질의 측정법 또는 미코플라스마·뉴모니애의 검출법에 있어서, 검체로서는, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 뇨, 관절액 또는 세포배양액(상청) 등을 들 수 있다.
상기 방법 외에, 생체 조직 또는 세포를, 그대로 또는 글리세로형 당지질의 고정처리를 실시한 후, 표지물질로 표지화한 항글리세로형 당지질 항체와 반응시키고, 미코플라스마·뉴모니애가 감염된 생체조직 또는 세포에 표지화 항체를 결합시켜, 표지물질을 측정함으로써, 미코플라스마·뉴모니애를 검출하는 것도 가능하다. 고정처리의 방법으로서는, 예를 들면 포르말린, 글루타르알데히드, 파라포름알데히드 등을 사용하는 방법을 들 수 있다. 또한, 표지물질로 표지화한 항글리세로형 당지질 항체 대신에, 무표지 항글리세로형 당지질 항체를 고정처리한 생체조직 또는 세포와 반응시키고, 동시 또는 그 후에, 상기 항체의 조제에 사용한 면역동물 이외의 동물을 사용하여 조제한 상기 면역동물의 면역글로불린에 대한 항체를 표지물질로 표지화한 2차 항체를 반응시키고, 미코플라스마·뉴모니애가 감염된 생체조직 또는 세포에 표지화 2차 항체를 결합시켜, 표지물질을 측정해도 된다.
본 발명의 항체를 사용하여 시료 중의 글리세로형 당지질을 면역학적으로 측정할 때, 예를 들면 Galβ-6Galβ-3DAG 및 Glcβ-6Galβ-3DAG의 양쪽에 대해 반응 특이성을 갖는 항체를 사용하면, Galβ-6Galβ-3DAG 및 Glcβ-6Galβ-3DAG를 측정할 수 있고, Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG에 대해 반응 특이성을 갖는 항체를 사용하면, Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG를 선택적으로 측정할 수 있다. Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG의 측정시에는, 실시예의 기재와 같이 하여 얻어지는 Galβ-6Galβ-3DAG 또는 Glcβ-6Galβ-3DAG를 표준물질로서 사용할 수 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
1. 당지질의 분리·정제
Mycoplasma pneumoniae(Mac strain)의 PPLO 배지에서의 배양을 이하와 같이 행하였다. PPLO 액체 기초배지(Difco사제)에 10% 소 혈청, 10% 페니실린, 0.0002% 페놀 레드 및 1% 글루코오스를 첨가한 액체배지로 37℃에서 배양하였다. 배지의 pH 변화로 미생물의 증식을 확인한 후, 16,000×g으로 1시간 원심분리하였다. 이 조작을 다시 한번 반복하여 지질 추출용 시료로 하였다. 200 L(습윤상태의 용량)의 미생물 시료에 대해, 클로로포름과 메탄올의 혼합용매로 지질 분획을 추출하였다.
2. 지질의 추출
시료를 메탄올에 부유시켜서 4시간 융합시켰다. 거기에 배량의 클로로포름을 첨가하고, 초음파로 균체를 파쇄하여, 추가적으로 4시간 방치하였다. 3000 rpm으로 원심하여, 상청을 회수하고 농축하여, 지질 분획 시료로 하였다.
이 지질시료를 실리카겔을 충전한 칼럼 크로마토그래피로 클로로포름과 메탄올을 사용하여 분리·정제하였다. 제1단계로서, 클로로포름:메탄올의 혼합비를 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10으로 한 용매로 10의 프랙션으로 분획하였다. 또한 각각의 프랙션에 대해, 제2, 제3 단계로서 동일한 칼럼 크로마토그래피를 행하여 추가적으로 분리를 행하였다. 제1 단계에서는 각각 33 ㎎, 79 ㎎, 2 ㎎, 5 ㎎, 2 ㎎, 4 ㎎, 4 ㎎, 2 ㎎, 6 ㎎, 0 ㎎(아무것도 회수되지 않았다)의 화합물을 포함하는 10의 프랙션을 얻었다. 이 중의 하나의 분획 79 ㎎을 제2 단계에서 추가적으로 6개의 프랙션으로 분획하고, 그 중에서 2번째로 얻어진 프랙션을 추가적으로 제3 단계에서 6개의 프랙션으로 분획하여, 4번째로 얻어진 프랙션으로서 당지질 1 및 2를 얻었다. 수량은 15 ㎎이었다.
도 2는 박상 크로마토그래피(TLC)에 의해 지질시료를 전개하고, 오르시놀 시약으로 염색한 도면이다. 레인 1은 정제하기 전의 균체로부터 추출한 지질분획, 레인 2~10은 최초의 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리한 각각의 프랙션, 레인 11은 3단계의 정제를 행하여 얻은 목적 당지질 분획이다.
3. NMR 분석
얻어진 당지질 분획을 DMSO-d6:D20=98:2 용액에 용해하여, 60℃에서 1H-NMR을 측정하였다. 스핑고신의 시그날은 관찰되지 않고, 글리세롤 부분의 프로톤이 명쾌하게 관측되었기 때문에, 글리세로형의 지질인 것을 결정하였다. 지방산은 2개로 대부분 포화이고, 매우 조금 불포화를 포함하고 있었다. 따라서, 지질 부분은 디아실글리세롤(DAG라고 표기한다)이라고 결정하였다. 당부분은, 1개의 글루코오스와 3개의 갈락토오스 모두 β형 아노머릭 프로톤(anomeric proton)이 관찰되었다. 글루코오스는 비환원 말단, 갈락토오스의 2개는 6번 위치에 치환기를 가지고 있는 것으로 생각되었다. 이들의 정보로부터, Galβ-6Galβ-3DAG와 Glcβ-6Galβ-3DAG의 골격이 혼합되어 있다고 생각하였다. 이 골격의 검증으로서, 환원 말단의 갈락토오스 의 6번 위치에 비환원 말단의 당이 결합하고 있는지 여부를, Gal-DAG를 평품(評品)으로서, 6번 위치의 케미컬 시프트를 비교하였다. 또한, D2O를 포함하지 않는 DMSO-d6 100% 중에서 측정하여, -OH의 프로톤의 동정을 행한바, 환원 말단의 갈락토오스의 2, 3, 4번 위치의 -OH 시그날은 관찰되지만, 6번 위치의 -OH 시그날은 관찰되지 않았다. 이들에 의해 6번 위치에 비환원 말단의 당이 결합하고 있는 것을 결정하였다.
도 3은 DMSO-d6 100% 중에서 측정한 DQF-COSY 스펙트럼으로, -OH의 프로톤의 귀속을 기재하고 있다. 또한, 표 1은 DMSO-d6:D2O=98:2, 60℃에서 측정한 각 프로톤의 귀속 데이터이다.
Figure 112009001803814-pct00005
4. 질량분석
얻어진 지질 분획에 대해, ESI-MS 측정에 의한 분석을 행하였다. 그 스펙트럼 차트를 도 4에 나타낸다. 포지티브 모드는 나트륨 첨가 조건에서 측정하여, 분자 이온에 상당하는 피크 m/z 915(M+23)와 943(M'+23)이 관찰되었다. 이들은 지방산의 조성의 차이에 의한 것으로, 전자가 C16:0/16:0(100%), 후자가 C16:0/18:0(30%)이라고 예상되었다. 이들의 분자 프래그먼트에 대해 MS/MS를 행한바, 헥소오스-헥소오스-디아실글리세롤의 골격으로부터 지방산, 당부위, 글리세롤 부위가 이탈된 프래그먼트가 관찰되어, 이 골격에 모순되지 않는 결과가 얻어졌다. 또한 네거티브 모드에서도 분자 이온 피크 m/z 891(M-1)과 919(M'-1)가 관찰되어, 이들에 대한 MS/MS 측정에서도 동일한 모순되지 않는 결과가 얻어졌다.
1H-NMR 해석 및 질량분석의 결과를 합하여, Galβ-6Galβ-3DAG와 Glcβ-6Galβ-3DAG의 구조인 것을 결정할 수 있었다.
5. 화학합성품과의 데이터 비교에 의한 구조의 확정
구조를 확정하기 위해, 화학합성에 의해 입체 선택적이고 위치 선택적으로 각각의 골격을 합성하였다. 1H-NMR 측정을 천연물과 동등한 DMSO-d6:D2O=98:2, 60℃의 조건에서 행하고, 그 스펙트럼을 해석하여 비교하였다. 그 결과, 합성품의 스펙트럼은 천연물의 그것과 일치하였기에, 절대구조를 확정할 수 있었다.
표 2는 천연물(natural) 및 합성품(synthesized)의 각 프로톤의 귀속 데이터이다. 스펙트럼의 ppm값, 커플링 상수(J Hz)는 일치하고, 또한 형태도 동일하였다.
Figure 112009001803814-pct00006
글리세로형 당지질은, 식물 박테리아 등에서 다수 발견되고 있지만, β형 당결합으로 2당이 1-6 결합인 구조는 지금까지 보고가 없다. 구조식 1, 2로 나타내어지는 당지질은 신규 구조이다.
(실시예 2)
(신경질환 환자 유래의 시료 중의 본 발명의 당지질 항원에 대한 항체)
구조식 1 및 2로 표시되는 당지질 항원을 함유하는 미코플라스마·뉴모니애의 지질 분획에 대해, 길랭-바레 증후군 환자의 혈청을 반응시키는 실험을, TLC-Immunostaining법으로 검토하였다. 미코플라스마·뉴모니애로부터 추출한 지질 분획을 TLC 플레이트 상에 전개하고, 길랭-바레 증후군의 환자 혈청을 반응시켰다. 반응의 검출을 퍼옥시다아제 표지의 anti-human IgG, IgM, IgA의 혼합물로 행하고, 화학 발색에 의해서 가시화하였다. 도 5는 미코플라스마·뉴모니애의 지질 분획을 TLC 전개하고, (a): 오르시놀 시약으로 염색한 결과, 및 (b): 길랭-바레 증후군 환자 혈청과의 반응을 TLC-Immunostaining법으로 검출한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5(b)에 나타내는 바와 같이 구조식 1 및 2로 표시되는 당지질 항원의 스폿에 대해 발광이 확인되었기 때문에, 길랭-바레 증후군 환자가 이들 당지질 항원에 대한 항체를 보유하고 있는 것을 증명할 수 있었다.
이 실험결과는, 구조식 1 및 2로 나타내는 당지질 항원 및 그의 항체가, 미코플라스마·뉴모니애 감염이 원인인 질환의 진단 마커가 되는 것을 나타내는 것이다.
(실시예 3)
합성에 의해서 제작한 Glcβ-6Galβ-3DAG 및 Galβ-6Galβ-3DAG에 대해서, 각각을 사용한 2종류의 ELISA 키트를 제작하고, 인간 검체 중의 이들 항원에 대한 IgM 항체가를 조사하였다. 검체로서, 미코플라스마 폐렴 환자의 페어 혈청을 40검체 측정하고, 이 ELISA법이 미코플라스마 폐렴의 진단법으로서 유용한 방법인지를 검토하였다. 비교로서 건강한 정상인의 혈청도 40검체 측정하여, 스코어값을 비교하였다.
항원 플레이트의 제작: Glcβ-6Galβ-3DAG를 5 ㎍/mL(메탄올:아세토니트릴 용액)가 되도록 조제하고, 이 용액을 ELISA용 면역 플레이트(평저)에 50 μL씩 뿌려, 용매를 제거함으로써, Glcβ-6Galβ-3DAG를 고상화한 플레이트를 제작하였다. Galβ-6Galβ-3DAG에 대해서도 동일한 수법으로 플레이트를 제작하였다.
ELISA법의 프로토콜: 측정 웰에 블로킹액을 100 μL씩 전개하여 1시간 실온에서 인큐베이션시킨 후, 세정하고, 측정하는 검체용액을 100 μL씩 뿌려 2시간 실온에서 인큐베이션시켰다(측정은 2중으로 행하였다). 그 후 세정하고, 다음으로 퍼옥시다아제 표지한 IgM 항체 용액을 100 μL씩 뿌려 2시간 실온에서 인큐베이션시켰다. 그 후 세정한 후, TMB 용액을 발색 기질로서 첨가하여 15분간 반응시킨 후, 반응을 1N 황산수용액으로 정지하여, 흡광도를 측정하였다.
측정결과: 대조를 두어 표준곡선으로부터 흡광도를 임의로 스코어화하여 검체의 항체가를 비교 검토하였다. Glcβ-6Galβ-3DAG를 사용한 ELISA 측정의 결과, 건강한 정상인 샘플의 스코어는 모두 2.5 이하, 절반 수는 1 미만이었던 것에 대해, 미코플라스마 폐렴 환자의 혈청에서는 스코어가 모두 1 이상이고, 2.5 이하는 28%, 그 이상인 것이 72%였다. 이 결과를 감도 대 위양성률의 값으로 그리는 ROC 곡선에 표시한 바, 곡선 아래 면적이 0.95로 되어, 이 측정은 질환의 식별에 능력이 매우 높은 것으로 평가할 수 있었다.
한편, Galβ-6Galβ-3DAG를 사용한 ELISA 측정 결과에서는, 질환의 식별능이 그다지 없어, 건강한 정산인에서도 높은 스코어값이 검출되었다.
도 6은 Glcβ-6Galβ-3DAG를 사용한 ELISA 측정 결과로서, 질환군과 비질환군(건강한 정산인)의 스코어 분포를 나타낸다. 도 7은 이 측정결과를 감도 대 위양성률의 값으로 표시한 ROC 곡선이다.
이 실험결과는 Glcβ-6Galβ-3DAG 및 Galβ-6Galβ-3DAG를 사용한 항체 측정으로, 미코플라스마·뉴모니애의 감염에 의해서 발증하는 미코플라스마 폐렴의 질환 식별이 가능한 것을 나타내는 것이다, 추가적으로, 2종류의 항원 당지질에는 능력에 차이가 있어, 각각 단독으로 사용함으로써 다른 결과가 될 가능성이 있다. 미코플라스마 폐렴의 질환 진단에는 Glcβ-6Galβ-3DAG를 사용하는 것이 바람직할 것으로 생각된다.
(실시예 4) 면역 크로마토그래피
(1) 금 콜로이드 용액의 조제
금 콜로이드는, 40 ㎚의 입자 사이즈의 Biocell Research Laboratories(Cardiff, U.K.)의 시판품의 용액을 그대로의 농도로 사용하였다.
(2) 금 콜로이드 표지 당지질 항원용액의 조제
금 콜로이드 표지를 제작하기 위해 미코플라스마·뉴모니애의 당지질 항원 GlcGL을 사용하였다. 이 10 ㎍/㎖의 GlcGL 항원 1 ㎖와 상기 (1)의 금 콜로이드 용액 1 ㎖를 혼합하여 실온에서 30분간 정치하고 이 항원을 금 콜로이드 입자 표면에 결합시킨 후, 금 콜로이드 용액의 최종농도가 1%가 되도록 10% 소 혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 기재한다) 용액을 첨가하여, 이 금 콜로이드 입자의 잔여 표면을 블록하고, 금 콜로이드 표지항원(이하, 「금 콜로이드 표지항원」이라고 기재한다) 용액을 조제하였다. 이 용액을 원심분리(8000×G, 10분간)하여 금 콜로이드 표지항원을 침전시키고, 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)으로 3회 세정하여, 상청액을 제거하고 금 콜로이드 표지항원을 얻었다. 이 금 콜로이드 표지항원을 1% 사카로오스·0.5% BSA를 함유하는 50 mM 트리스 염산 완충액(pH 7.4)에 현탁하여 금 콜로이드 표지항체 용액을 얻었다.
(3) 항미코플라스마·뉴모니애 특이적 항체 측정용 면역 크로마토법 테스트 스트립의 제작
도 8에 나타내어지는 면역 크로마토법 테스트 스트립을 하기의 순서로 제작하였다.
(3-1) 항미코플라스마·뉴모니애 특이적 항체와 금 콜로이드 표지항원의 복합체의 포착 부위
폭 5 ㎜, 길이 36 ㎜의 가늘고 긴 띠형상의 니트로 셀룰로오스막을 크로마토그래프 매체의 크로마토 전개용 막 담체 3으로서 준비하였다.
항인간 IgM 항체 2 ㎎/㎖가 함유되어 되는 용액 4 ㎕를, 이 크로마토 전개용 막 담체 3에 있어서의 크로마토 전개 개시점측의 말단으로부터 7.5 ㎜의 위치에 라인형상으로 도포하고, 이것을 실온에서 3일간, 건조하여, 항미코플라스마·뉴모니애 항체와 금 콜로이드 표지항원의 복합체의 포착 부위 31로 하였다.
(3-2) 금 콜로이드 표지항체 함침 부재
5 ㎜×15 ㎜의 띠형상의 유리 섬유 부직포에, 금 콜로이드 표지항원 용액 40 ㎕를 함침시키고, 이것을 실온에서 건조시켜 금 콜로이드 표지항체 함침 부재 2로 하였다.
(3-3) 면역 크로마토법 테스트 스트립의 제작
상기 크로마토 전개용 막 담체 3, 상기 표지항체 함침 부재 2 외에, 시료 첨가용 부재 5로서 면직물과, 흡수용 부재 4로서 여지를 준비하였다. 그리고, 이들의 부재를 사용하여, 도 8에 나타내는 바와 같은 크로마토법 테스트 스트립을 제작하였다.
(4) 시험
폐렴 환자 혈청을 검체 희석액으로 희석하여, 각 농도로 조제하고, 피험시료로 하였다. 그리고, 피험시료 40 ㎕를 상기 (3)에서 얻어진 테스트 스트립의 시료 첨가용 부재 5에 마이크로 피펫으로 적하하여 크로마토 전개하고, 실온에서 10분 방치한 후, 상기 포착 부위 31에서 포착된 항미코플라스마·뉴모니애 특이 항체와 금 콜로이드 표지항원의 복합체의 포착량을 육안으로 관찰하였다. 포착량은, 그 양에 비례하여 증감하는 적자색의 정색(呈色) 정도를 육안으로, -(착색 없음), ±(미약한 착색), +(명확한 착색), +(현저한 착색)의 4단계로 구분하여 판정하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112009001803814-pct00007
(실시예 5) 항미코플라스마·뉴모니애 당지질 다중클론항체의 제작
염소 20% 혈청으로 배양한 미코플라스마·뉴모니애 균체 1 ㎖를 10배의 10 ㎖로 희석하고, 여기에 프로인트 완전 애쥬번트를 10 ㎖ 첨가하여, 이것을 400 rpm으로 그라인드하여 에멀젼을 얻었다. 상기의 방법으로 조제한 에멀젼을, 염소 피하에 한마리당 10 ㎖ 피하 면역하고, 1개월 후에 10 ㎖ 추가 면역하였다. 추가적으로, 1개월 간격으로 염소 20% 혈청으로 배양한 미코플라스마·뉴모니애 균체로 면역을 추가하였다. 상기와 같이 하여 면역한 염소의 혈액으로부터, 통상의 방법으로 혈청을 분리하였다. 이 혈청을 사용하여 TLC 면역염색 실험을 행하고, 특이 항원 당지질과의 반응성을 확인하였다.
TLC 면역염색 실험:
실험조작은 일반법에 따랐다. 미코플라스마·뉴모니애 균체로부터 추출한 지질 혼합물, 및 화학합성에 의해 제작한 Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG를 HTLC 플레이트에 전개하여, 얻어진 염소 혈청을 반응시켰다. 반응의 검출을 퍼옥시다아제 표지한 anti-Goat IgG로 행하고, 코니카 면역염색 키트를 사용하여 퍼옥시다아제에 의한 반응을 가시화하여 검출하였다. 그 결과를 도 9에 나타낸다. 오른쪽 도면이 얻어진 염소 혈청을 사용하여 면역염색한 결과이다. 또한 왼쪽 도면은 화합물을 전개한 HTLC 플레이트를 오르시놀 염색한 결과이다.
도 9에 나타내는 바와 같이 Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG에 상당하는 스폿에 대해 발색이 확인되었기 때문에, 제작한 염소 혈청은 이들에 대한 반응성을 갖는 것을 확인하였다.
(실시예 6) 항GGL 단일클론항체의 제작
(1) 하이브리도마의 제작
미코플라스마·뉴모니애 균체를 포함하는 에멀젼을, 7주령의 암컷 BALB/c 마우스의 피하에 한마리당 0.5 ㎖ 주사하였다. 초회 면역 후 2주째와 3주째에, 상기의 방법으로 조제한 에멀젼을 한마리당 0.5 ㎖를 피하와 복강내에 주사하였다.
최종 면역의 4일 후에 마우스로부터 비장을 적출하고, RPMI1640 배지를 사용하여 세포 부유액을 조제하였다. 이 2×108개의 비장세포와 대수 증식기에 있는 마우스 골수종 SP2/0 세포(2×107개)를 혼합하고, 원심한 후, 침사에 45% 폴리에틸렌글리콜(PEG4000(와코순약(주)제) 1 ㎖를 1분에 걸쳐서 완만하게 진탕하면서 첨가한 후, 37℃하에서 진탕하면서 2분간 인큐베이트하였다. 여기에, RPMI1640 배지 1 ㎖를 1분간에 걸쳐서 첨가하고, 추가적으로 8 ㎖를 3분간에 걸쳐서 첨가하였다.
상기 세포 혼합액을 원심한 후, 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI1640 배지 50 ㎖에 부유시키고, 96 웰 마이크로 플레이트 4장에, 1웰당 100 ㎕씩 분주하여, 탄산가스 인큐베이터(5% 탄산가스, 37℃) 중에서 배양하였다. 24시간 후, 배지를 HAT 배지(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 함유, 10%(V/V) FCS 배지)로 교환하고, 계속해서 탄산가스 인큐베이터(5% 탄산가스, 37℃)에서 배양하였다. 4일째에, 새로운 HAT 배지를 1웰당 100 ㎕ 추가하였다. 7일째에 HT 배지(HAT 배지에서 아미노프테린을 제거한 것)로 교환하고, 그 익일에 10%(V/V) FCS를 포함하는 RPMI1640 배지로 교환한 후, 콜로니 형성의 유무를 체크하였다.
(2) 항체 생산 하이브리도마의 선택
항체를 생산하는 하이브리도마에 대해서 한계희석법으로 클로닝을 반복하고, 미코플라스마·뉴모니애 균체를 항원에 사용한 ELISA에 의해 스크리닝을 행하여, 반응하는 하이브리도마 G1E6 및 M2F8주를 얻었다.
(3) 단일클론항체의 획득
계속해서, G1E6 및 M2F8주를 10%(V/V) FCS를 포함하는 RPMI1640 배지 중에서 배양하고, 그 배양 상청을 회수함으로써, 단일클론 항체를 포함하는 배양액을 얻었다. 황산암모늄 분획에 의해 정제한 단일클론항체를, Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG를 항원으로 한 ELISA(하기)를 행하여, 단일클론항체가 GalGL 및 GulGL의 어느 것과도 반응하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다.
ELISA법:
합성한 Galβ1-6Galβ-3DAG 및 Glcβ1-6Galβ-3DAG 각각 5 ㎍/㎖를 메탄올:아세토니트릴=2:1의 용매로 조제하여, 이 용액을 96웰 마이크로 플레이트의 1웰당 50 ㎕씩 첨가하고, 케미컬 후드 내에서 풍건한 후 15시간 진공 처리하여, 항원 당지질을 첩부(貼付)한 ELISA 플레이트를 각각 제작하였다. ELISA 측정 프로토콜은 일반법에 따랐다. 먼저 350 ㎕의 블로킹액(나칼라이 테스크사제 블로킹 원을 물로 5배 희석한 것)을 각 웰에 분주하고, 30℃에서 1시간 정치한 후, 350 ㎕/well의 0.05% Tween20 in PBS로 5회 세정하였다. 그 후, 5배 희석한 137C 배양 상청(희석액으로서 블로킹 원을 0.05% Tween20 in PBS로 20배 희석한 것을 사용)을 각 웰에 100 ㎕씩 분주하고, 30℃에서 2시간 정치하였다. 그 후, 350 ㎕/well의 0.05% Tween20 in PBS로 5회 세정하고, 다음으로 5000배 희석한 Goat anti-mouse IgG-HRP[ZYMED Laboratories, cat. #81-6520], 또는 Goat-anti-IgM[ZYMED Laboratories, cat. #61-6820] 용액(희석액으로서 블로킹 원을 0.05% Tween20 in PBS로 20배 희석한 것을 사용)을 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여, 30℃에서 1시간 정치하였다. 그 후, 350 ㎕/well의 0.05% Tween20 in PBS로 5회 세정하고, 발색기질(TMB 용액;)을 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여, 30℃에서 30분간 정치한 후, 1NH2S04를 각 웰에 50 ㎕씩 분주하고 혼화하여 발색을 멈추고, 흡광도(450 ㎚/620 ㎚)를 측정하였다.
본 발명의 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애의 주요한 항원이기 때문에, 이 미생물을 고감도로 또한 정확하게 검출하기 위한 분자 기반으로 된다. 따라서, 이 당지질을 이용하여 미코플라스마·뉴모니애가 원인인 병의 정확한 진단법의 개발이 가능하다. 본 발명의 글리세로형 당지질은, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 마커로서 사용할 수 있다.

Claims (34)

  1. (1) 하기 일반식으로 표시되는 화합물:
    Figure 112014057395873-pct00020
    (식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 한쪽 이상이 -(CH2)14CH3이고, 다른 쪽이 -(CH2)14CH3 또는 -(CH2)16CH3이다.)
    또는, 그의 염.
  2. 제1항에 있어서,
    미코플라스마·뉴모니애 유래의 단리된 천연화합물인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    합성화합물인 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 함유하는 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 진단제.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 진단용 키트.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 조성물을 피험자 유래의 시료와 접촉시키는 공정, 및
    상기 시료 중의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물에 대한 항체를 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
    을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 유래로 하는 항원에 대한 항체의 검출방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 피험자가 앓고 있을 우려가 있는 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 검출방법.
  11. 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  12. 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 이용한 미코플라스마·뉴모니애를 유래로 하는 항원에 대한 항체의 검출방법.
  13. 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  14. 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 이용한 미코플라스마·뉴모니애를 유래로 하는 항원에 대한 항체의 검출방법.
  15. 하기 일반식으로 표시되는 화합물에 특이적으로 결합하는 항체:
    Figure 112014057395873-pct00021
    (식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 한쪽 이상이 -(CH2)14CH3이고, 다른 쪽이 -(CH2)14CH3 또는 -(CH2)16CH3이다.)
    또는, 그의 염.
  16. 제15항에 있어서,
    단일클론항체인 항체.
  17. 제15항 또는 제16항의 항체를 함유하는 조성물.
  18. 제15항 또는 제16항의 항체를 함유하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 진단제.
  20. 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애 검출용 키트.
  21. 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 키트.
  23. 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 시료와 접촉시키는 공정, 및
    상기 시료 중의 항원물질과 제15항 또는 제16항의 항체의 결합을 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
    을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애의 존재를 검출하기 위한 방법.
  24. 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 피험자 유래의 시료와 접촉시키는 공정, 및
    상기 시료 중의 항원물질과 제15항 또는 제16항의 항체의 결합을 면역학적으로 검출 또는 측정하는 공정,
    을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 유래로 하는 항원의 검출방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 피험자가 앓고 있을 우려가 있는 질환이 미코플라스마 폐렴, 천식, 신경질환인 방법.
  26. 상기 화합물이 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  27. 상기 화합물이 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체를 이용한 미코플라스마·뉴모니애의 존재를 검출하기 위한 방법.
  28. 상기 화합물이 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단제.
  29. 상기 화합물이 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체를 이용한 미코플라스마·뉴모니애의 존재를 검출하기 위한 방법.
  30. 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  31. 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물을 포함하는 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  32. 상기 화합물이 갈락토오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  33. 상기 화합물이 글루코오스를 비환원 말단에 갖는 제15항 또는 제16항의 항체 또는 상기 항체를 함유하는 조성물을 포함하는, 미코플라스마·뉴모니애를 병원으로 하는 질환의 진단용 키트.
  34. 하기 일반식으로 표시되는 합성에 의해 단리된 화합물:
    Figure 112014057395873-pct00022
    (식 중, R1=OH일 때, R2=H이고, R1=H일 때, R2=OH이다. R3는 -(CH2)nCH3(단, n은 12, 14, 16, 또는 18)이다)
    또는, 그의 염.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101488536B1 (ko) * 2006-06-14 2015-02-10 에무 바이오 테크 가부시키가이샤 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 항원
JP5252468B2 (ja) * 2007-06-27 2013-07-31 エム バイオ テック株式会社 マイコプラズマニューモニエ特異抗原糖脂質の合成方法
CN102448488B (zh) 2009-06-04 2014-10-15 独立行政法人产业技术综合研究所 支原体感染症用疫苗
KR101190573B1 (ko) * 2011-10-07 2012-10-18 대한민국 혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규 Ａβ２２（ｐＥ）－４２ 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트
RU2484095C1 (ru) * 2011-12-30 2013-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Технофарма" НАНОАНТИТЕЛА aMh1, aMh2, СВЯЗЫВАЮЩИЕ АНТИГЕН MYCOPLASMA HOMINIS, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ MYCOPLASMA HOMINIS
RU2562158C2 (ru) * 2013-12-02 2015-09-10 федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России) Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица, продуцирующая модифицированные наноантитела, узнающие микоплазму m.hominis, фармацевтическая композиция на ее основе и способ ее использования для терапии микоплазмозов
JP6655302B2 (ja) * 2015-05-29 2020-02-26 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体
CN110338138B (zh) * 2019-06-19 2021-04-06 山东省农业科学院奶牛研究中心 一种牛支原体感染豚鼠的动物模型构建方法及其应用
JP2019207248A (ja) * 2019-07-29 2019-12-05 デンカ生研株式会社 被検対象の検出方法並びにそのための免疫測定器具及びモノクローナル抗体

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006117582A (ja) * 2004-10-21 2006-05-11 Fancl Corp インターロイキン４産生抑制剤とその利用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
JP2005110545A (ja) 2003-10-06 2005-04-28 Meiji Seika Kaisha Ltd 呼吸器感染症起因菌の迅速検出法およびそのキット
KR101488536B1 (ko) * 2006-06-14 2015-02-10 에무 바이오 테크 가부시키가이샤 미코플라스마·뉴모니애의 글리세로형 당지질 항원

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006117582A (ja) * 2004-10-21 2006-05-11 Fancl Corp インターロイキン４産生抑制剤とその利用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Biochemistry and Cell Biology. Vol. 68, No. 1, pp. 59-64 (1990) *
Biochemistry and Cell Biology. Vol. 68, No. 1, pp. 59-64 (1990)*
Journal of the Science of Food and Agriculture. Vol. 54, No. 1, pp. 35-41 (1991) *
Journal of the Science of Food and Agriculture. Vol. 54, No. 1, pp. 35-41 (1991)*
帶大硏報. Vol. 17, pp. 13-19 (1990) *
帶大硏報. Vol. 17, pp. 13-19 (1990)*

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Publication number Publication date
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