KR101190573B1 - 혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규 Ａβ２２（ｐＥ）－４２ 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트 - Google Patents

혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규 Ａβ２２（ｐＥ）－４２ 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아밀로이드-베타 항체에 결합하는 특정배열의 펩티드를 탐색하였고, Aβ22(pE)-42 펩티드가 정상인에 비하여 알츠하이머병 환자의 혈청의 아밀로이드-베타 항체에 대한 면역도가 높은 것을 확인하였으므로, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드는 치매 진단용 키트의 유효성분으로 사용이 가능하며, 초기 진단이 어려운 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규 Ａβ２２（ｐＥ）－４２ 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트{The novel Aβ22(pE)-42 peptide that bind to amyloid-beta antibody specifically in blood and pharmaceutically composition for the diagnosis of dementia disease containing the same as an active ingredient}
본 발명은 혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규 Aβ22(pE)-42 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트에 관한 것이다.
우리나라뿐 아니라 전 세계적으로 고령화 사회가 되어가면서 노인성 질환에 많은 관심이 생기고 활발한 연구가 이루어지고 있다. 알츠하이머병은 퇴행성 질환이며 노인들에게서 가장 많이 나타나는 대표적인 치매 중 하나이며 질병의 특성상 환자 본인뿐만 아니라 가족의 정신적, 육체적 부담이 매우 심각하다. 알츠하이머병은 65~74세 10%, 75~84세 19%, 85세 이상에서는 47%가 발병하며 그 발병률이 해마다 늘어나 커다란 사회문제로 떠오르고 있다.
현재까지 알려진 알츠하이머병의 예방은 물론 확립된 조기 진단 방법은 알려진 바 없다. 의사들의 임상적 소견과 신경심리 검사에만 의존하여 진단을 해온 실정이며 이러한 결과로 질병이 상당히 진행된 후에야 진단을 받게 되고 치료에 있어 큰 어려움이 있었다. 또한 치료제 역시 아직 개발된 것이 없으며 단지 증상을 완화하는 약물들만 사용되고 있을 뿐이다.
현재 받아들여지고 있는 알츠하이머병의 기전은 ‘아밀로이드 가설’ 이다. 이것은 치매 환자의 내에 존재하는 아밀로이드-베타 및 이들이 축적되어 생기는 플라크(plaque)가 신경세포의 지속적인 사멸을 유도하고 뇌신경전달을 저해하여, 인지기능의 손상을 일으켜 병을 유발하는 것에 관한 것이다. 알츠하이머병으로 사망한 환자의 두뇌에서 관찰되는 노인성 플라크(senile plaque)와 신경원 섬유의 엉킴(neurofibrillary tangles)이 알츠하이머병의 병리학적 특성으로 나타난다. 이중 노인성 플라크는 세포 외부에 단백질과 죽은 세포 등이 축적되어 형성되는 것으로, 주 구성 성분은 아밀로이드-베타(Amyloid-beta, Aβ)라는 펩티드이다(Hardy, J. etal, Nat Neurosci. 1:355-358, 1998). 알츠하이머병 환자의 주요 특징인 인지 작용의 점진적 상실은 비정상적으로 축적된 아밀로이드-베타에 의해 유발되는 것으로 보이며, 아밀로이드-베타는 아밀로이드 전구 단백질(amyloidprecursor protein: 이하 "APP"라 칭함)로부터 단백질분해(proteolysis) 과정을 통해 생성된다. 전구 물질인 APP가 β-세크레타제(BSCE) 및 γ-세크라타제에 의해 분해되어 아밀로이드-베타가 생성되게 된다(Craven, R.,Nat Rev. Neurosci. 2: 533, 2001; David, H. S. et al., Nat Rev. Neurosci. 2: 595-598, 2001; Yankner, B. A., Neuron 16: 921-932, 1996; Selkoe, D. J., Nature 399: A23-A31, 1999). 혈액으로부터 진단지표를 개발하려는 노력은 활발하게 이루어지고 있으며, 최근에는 알츠하이머병의 병인에 핵심적인 역할을 한다고 알려져 있는 아밀로이드 단백질 (Amyloid-beta, Aβ42 및 Aβ40) 수준을 알츠하이머병을 진단하는 기준으로 이용하고 있다.
알츠하이머병 동물의 경우, 혈장과 뇌척수액의 Aβ42, Aβ40 수준이 연령에 비례하여 증가하다가, 인지장애가 시작되면 감소하므로 혈장에서의 아밀로이드 단백질 수준을 진단 지표로서의 중요성과 발병예측 정도에 대한 기준으로 삼는 것은 아직까지 논란이 되고 있다. 인체 내의 아밀로이드 항체에 대해서는 정상인과 알츠하이머병 환자 모두에게서 뇌, 혈액 및 뇌척수액 등에 존재함이 알려져 있지만 그 양이나 특성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.
최근에 아밀로이드-베타 항체를 이용하여 체내의 아밀로이드-베타 단백질의 양을 예측하는 알츠하이머병의 조기 진단 및 예방법의 개발이 많은 주목을 받고 있다. 이 방법의 경우 알츠하이머병 환자의 혈액에서 정상인에 비해 특이적으로 증가하는 항체와 특이적으로 결합하는 특정 배열의 아밀로이드-베타 항원을 찾는 것이 매우 중요하다.
이에, 본 발명자들은 아밀로이드-베타 항체에 결합하는 특정배열의 펩티드를 탐색하였고, Aβ22(pE)-42펩티드가 정상인에 비하여 알츠하이머병 환자의 혈청의 아밀로이드-베타에 대한 면역도가 높은 것을 확인함으로써, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드를 치매 진단용 키트의 유효성분으로 사용이 가능하며, 초기 진단이 어려운 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈액 내 아밀로이드-베타 항체에 특이적으로 결합하는 신규한 Aβ22(pE)-42 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 피검체 유래 혈액을 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;및
2) 상기 기판 위에 아밀로이드-베타 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은,
1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
2) 상기 기판에 Aβ22(pE)-42 펩티드를 처리한 후 세척하는 단계; 및
3) 상기 기판 위에 Aβ22(pE)-42 펩티드의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서, 아밀로이드-베타 항체에 결합하는 특정배열의 펩티드를 탐색하였고, Aβ22(pE)-42펩티드가 정상인에 비하여 경도인지장애 환자의 혈청의 아밀로이드-베타 항체에 대한 면역도가 높은 것을 확인하였으므로, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드는 치매 진단용 키트의 유효성분으로 사용이 가능하며, 초기 진단이 어려운 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 Aβ22(pE)-42 펩티드의 아밀로이드-베타 항체에 대한 면역도 분석을 나타낸 도이다:
Normal: 정상인;
MCI(mild cognitive impairment): 경도인지장애;
sevAD: 심각한(severe) 알츠하이머병;
proAD: 거의 확실한(probable) 알츠하이머병;및
Negative con: 음성 대조군.
도 2는 상기 도 1의 분석에 대한 정량적 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트를 제공한다.
상기 펩티드는 아밀로이드-베타(amyloid-beta) 항체에 결합하는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 치매는 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI), 알츠하이머병 및 뇌 아밀로이드 혈관병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 치매는 뇌의 기질적 병 때문에 후천적으로 기억, 언어, 판단력 등의 여러 영역의 인지기능이 떨어져 일상 생활이나 대인 관계에 지장을 초래할 만큼 지적 기능이 저하된 상태를 일컫는다. 치매의 예로서, 경도인지장애, 알츠하이머병 및 뇌 아밀로이드 혈관병이 있으며, 아밀로이드의 생성과 축적이 상기 질환의 원인이 될 수 있으므로, 본 발명의 펩티드를 상기 질환의 진단에 적용할 수 있다.
상기 펩티드는 발색효소, 발색물질 또는 형광분자에 결합된 것일 수 있고, 상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것일 수 있고, 상기 발색물질은 콜로이드 골드(colloid gold)인 것일 수 있으며, 상기 형광분자는 폴리 L-리신-플루오레세인 이소티오시안산(poly L-lysine-flourescein isothiocynate, FITC), 로다민-B-이소티오시안산(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 또는 Cy2, Cy3 및 Cy5로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
특히, 검출수단으로서 이차항체-신호물질의 복합체를 사용할 경우, 신호물질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 형광분자(예를 들어, Cy3, Cy5, FITC, GFP(green fluorescent protein), RFP(red fluorescent protein), 텍사스레드(Texas Red) 등), 발광물질, 방사성 동위원소, 효소(예를 들어, HRP(horse raddish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타 갈락토시다제(β-galactosidase), 루시퍼라제(luciferase) 등)등이 사용될 수 있다.
본 발명의 치매 진단용 키트는 항원-항체 결합반응, 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합 반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 치매를 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블랏팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.
상기 키트는,
1) 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드가 코팅된 반응기;
2) 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;
3) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액;
4) 각 반응단계에 사용할 세척액; 및
5) 효소반응 정지용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
상기 2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (colloid gold), 형광분자 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명자들은 아밀로이드-베타 항체에 대한 Aβ22(pE)-42 펩티드의 면역도를 확인하고자, 정상인 (48명), 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI) (49명), 거의 확실한(probable) 알츠하이머병 (11명) 및 심각한(severe) 알츠하이머병 (62명)의 혈장에서 항체를 분리하였다.
단백질 칩을 이용하여 면역도를 측정한 실험 결과, 정상인에 비해 경도인지장애와 알츠하이머병 환자의 혈액에서 아밀로이드-베타 항체에 대한 Aβ22(pE)-42펩티드의 면역도가 증가되는 것을 확인하였다(도 1 참조). 구체적으로 Aβ22(pE)-42펩티드가 경도인지장애 환자(143%, p＜0.01), 거의 확실한(probable) 알츠하이머병 환자(146%, p＜0.01) 및 심각한(severe) 알츠하이머병 환자(148%, p＜0.001)에서 정상인보다 면역도가 특이적으로 증가함을 확인하였다(도 2 참조).
이에, Aβ22(pE)-42 펩티드가 정상인에 비하여 경도인지장애 환자의 혈청의 아밀로이드-베타 항체에 대한 면역도가 높은 것을 확인하였으므로, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드는 치매 진단용 키트의 유효성분으로 사용이 가능하며, 초기 진단이 어려운 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 Aβ22(pE)-42 펩티드를 이용하여 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법을 제공한다.
1) 피검체 유래 혈액을 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;및
2) 상기 기판 위에 아밀로이드-베타 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은 Aβ22(pE)-42 펩티드를 이용하여 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법을 제공한다.
1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
2) 상기 기판에 Aβ22(pE)-42 펩티드를 처리한 후 세척하는 단계; 및
3) 상기 기판 위에 Aβ22(pE)-42 펩티드의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 구체적으로 포유동물이며, 보다 구체적으로는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드와 아밀로이드-베타 항체의 부착 정도는 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이에, Aβ22(pE)-42펩티드가 정상인에 비하여 알츠하이머병 환자의 혈청의 아밀로이드-베타 항체에 대한 면역도가 높은 것을 확인하였으므로, 상기 Aβ22(pE)-42 펩티드는 치매의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것 일뿐 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 항원-항체 분리
정상인 (48명), 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI) (49명), 거의 확실한(probable) 알츠하이머병 (11명) 및 심각한(severe) 알츠하이머병 (62명)의 혈장을 분리 완충용액(dissociation buffer)(TBS buffer, 1.5% BSA, 0.2M glycine-acetate, pH 2.5)에 1:500으로 희석한 후 20분간 상온에 방치하였다. Amicon Ultra-0.5ml 10K Ultracel (Millipore, lreland) 필터에 희석시킨 혈장을 넣고 상온에서 8000g로 20분 동안 원심분리하였다. 새로운 Amicon tube에 필터를 뒤집어서 옮긴 후, 1000g로 2분 동안 원심분리한 후, 1M 트리스 버퍼(Tris buffer)(pH 9.0)를 이용하여 pH 7.0으로 조절하였다.
< 실시예 2> 단백질 칩 분석
TBS-글리세롤 완충용액(TBS-glycerol buffer)(30% 글리세롤, pH 7.4)에 6X His-항체(His-antibody)(abcam, UK)를 1 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 단백질 칩 (proteogen, south Korea)위에 1 ㎕씩 로딩(loading)한 뒤, 4℃에서 하룻밤 또는 37℃에서 3시간 방치하였다. 3M 종이(3M paper)를 이용하여 칩 위의 6X His-항체를 제거한 뒤 세척 용액(washing buffer)(TBS buffer, 0.1% tween 20)로 10분씩 3번 약하게 씻어주었다. 증류수로 칩에 남아있는 세척 용액을 10분 동안 약하게 흔들어 주면서 씻어내고, 1,500rpm에서 3분간 원심 분리하여 남아있는 액체를 제거하였다. 차단 용액 (Blocking buffer)(TBS buffer, 0.1% tween20, 3% BSA)을 넣고, 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들어 주면서 처리한 후 위와 동일한 방법으로 세척하고 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 칩 위에 Aβ22(pE)-42 펩티드: pyrEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(서열번호 1)(Peptide 2.0 Inc, www.peptide2.com)(TBS-glycerol buffer, 3% BSA)를 1 ㎕씩 로딩한 뒤, 37℃에서 1시간 방치한 후 액체를 제거하였다. 상기 <실시예 1>에서 분리한 항체를 항체 희석 완충용액(TBS-glycerol buffer, 3% BSA)에 1:4 비율로 희석하여 칩 위에 1 ㎕씩 로딩한 뒤, 37℃에서 1시간 방치하였다. 1시간 후에 액체를 제거하였고, 칩 위에 2차 항체 (Anti-human IgG, cy5)를 항체 희석 완충제에 1:5000 비율로 희석하여 1 ㎕씩 로딩한 뒤, 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 후에 액체를 제거하였고, 칩 스캐너(chip scanner)를 이용하여 결과를 확인하였다.
단백질 칩을 이용하여 면역도를 측정한 실험 결과, 정상인에 비해 경도인지장애와 알츠하이머병 환자의 혈액에서 아밀로이드-베타 항체에 대한 Aβ22(pE)-42펩티드의 면역도가 증가되는 것을 확인하였다(도 1). 구체적으로 Aβ22(pE)-42펩티드가 경도인지장애 환자(143%, p＜0.01), 거의 확실한(probable) 알츠하이머병(146%, p＜0.01), 심각한(severe) 알츠하이머병(148%, p＜0.001)에서 정상인보다 면역도가 특이적으로 증가함을 확인하였다(도 2).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드를 유효성분으로 포함하는 치매 진단용 키트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 아밀로이드-베타(amyloid-beta) 항체에 결합하는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 치매는 경도인지장애(mild cognitive impairment, MCI), 알츠하이머병 및 뇌 아밀로이드 혈관병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 발색효소, 발색물질 또는 형광분자에 결합된 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 발색물질은 콜로이드 골드(colloid gold)인 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 형광분자는 폴리 L-리신-플루오레세인 이소티오시안산(poly L-lysine-flourescein isothiocynate, FITC), 로다민-B-이소티오시안산(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC) 또는 Cy2, Cy3 및 Cy5로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 키트는
    1) 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드가 코팅된 반응기;
    2) 기질과의 반응에 의해서 발색을 나타내는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체;및
    3) 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 2차 항체 접합체의 표지체가 HRP (horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소 (alkaline phosphatase), 콜로이드 골드 (colloid gold), 형광물질 (fluorescein) 및 색소 (dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethyl bezidine), ABTS [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD (o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치매 진단용 키트.
  11. 1) 피검체 유래 혈액을 서열번호 1로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;및
    2) 상기 기판 위에 아밀로이드-베타 항체의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법.
  12. 1) 피검체 유래 혈액을 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;
    2) 상기 기판에 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드를 처리한 후 세척하는 단계; 및
    3) 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 Aβ22(pE)-42 펩티드의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 치매에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 치매 진단의 정보를 제공하기 위한 아밀로이드-베타 항체 검출 방법.
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