CN104693248A - 肺炎支原体的甘油糖脂抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了由肺炎支原体产生的新型甘油糖脂。所述甘油糖脂可用作肺炎支原体所致疾病的诊断用标记物。

Description

肺炎支原体的甘油糖脂抗原
本申请是申请日为2007年6月13日，题为“肺炎支原体的甘油糖脂抗原”的中国专利申请200780030006.1的分案申请。
技术领域
本发明涉及甘油糖脂抗原物质，其具有分离自肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)的新型结构。
背景技术
支原体是不具有细胞壁、最简单且最小的微生物群。肺炎支原体是支原体的一种，是支原体肺炎的病原微生物。特别是在小儿肺炎中，难以对支原体肺炎与由肺炎双球菌或衣原体感染导致的肺炎进行区分，而且对肺炎双球菌或衣原体感染有效的抗生素对肺炎支原体是无效的。由于误诊、误用抗生素而导致严重症状的事例并不罕见。因此，人们需要准确地判断感染并诊断疾病。
然而，对于利用肺炎支原体提取混合物作为抗原的现有肺炎支原体检测方法而言，其问题在于特异性低，并且由于提取物批次之间的差异很难保持重复性等。
现已报道肺炎支原体是支原体肺炎、哮喘和神经疾病的病原物质。然而，其致病机理尚未得到阐明(日本特开2005-110545号公报；The Journal ofEmergency Medicine,2006,30,4,371-375；Cytokine&Growth Factor Reviews,2004,15,2-3,157-168；和Brain and Development,2005,27,6,431-433)。
发明内容
在上述环境下，需要制定出准确判断肺炎支原体感染的方法以及准确诊断与此类微生物相关的疾病的方法。特别是，需要高特异性的肺炎支原体检测方法。
为了阐明肺炎支原体的致病原因，本发明人等从肺炎支原体的膜脂组分中分离了具有抗原性的糖脂，将其纯化并尝试对其进行结构分析。结果，成功地分离出可能具有重要生理活性的新型糖脂，并且测定了其绝对结构。而且，还证实在患有神经疾病的患者体内发现了本发明糖脂抗原的抗体。
因此，本发明提供了：以下化合物(本发明的甘油糖脂)；包含所述化合物的组合物、诊断剂或试剂盒，以及将使用这些的肺炎支原体作为病原的疾病的诊断方法：
(1).由下述通式表示的化合物或其盐：
在上式中：R1＝OH时R2＝H，R1＝H时R2＝OH；且每个R3可独立地选自饱和或不饱和的任意烃基。
(2).如(1)所述的化合物，其中，R3是-(CH2)nCH3(其中，n是12、14、16或18)。
(3).如(1)所述的化合物，该化合物为3-O-[(β-D-吡喃半乳糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油；或3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油；或其盐。
(4).一种组合物，其包含(1)～(3)中任意一项所述的化合物。
(5).肺炎支原体所致疾病的诊断剂，其包含(1)～(3)中任意一项所述的化合物。
(6).如(5)所述的诊断剂，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(7).肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒，其包含(1)～(3)中任意一项所述的化合物或(4)所述的组合物。
(8).如(7)所述的诊断用试剂盒，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(9).肺炎支原体所致疾病的诊断方法，包含以下步骤：
使(1)～(3)中任意一项所述的化合物或(4)所述的组合物与来自受试者的样品相接触；和
免疫检测或测定所述样品中的对(1)～(3)中任意一项所述化合物的抗体。
(10).如(9)所述的诊断方法，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(11).如(5)～(10)中任一项所述的诊断剂、诊断试剂盒或诊断方法，其中，所利用的(1)～(3)中任一项所述化合物的在非还原末端具有半乳糖。
(12).如(5)～(10)中任一项所述的诊断剂、诊断试剂盒或诊断方法，其中，所利用的(1)～(3)中任一项所述化合物在非还原末端具有葡萄糖。
(13).针对下述通式所示化合物或其盐的抗体：
式中：R1＝OH时R2＝H，R1＝H时R2＝OH；且每个R3可独立地选自饱和或不饱和的任意烃基。
(14).如(13)所述的抗体，其中，R3是-(CH2)nCH3(其中，n是12、14、16或18)。
(15).如(13)所述的抗体，其是以下化合物抗体：
3-O-[(β-D-吡喃半乳糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油；3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油；或其盐。
(16).如(13)～(15)中任意一项所述的抗体，其是单克隆抗体。
(17).一种组合物，其包含(13)～(16)中任意一项所述的抗体。
(18).肺炎支原体所致疾病的诊断剂，其包含(13)～(16)中任意一项所述的抗体。
(19).如(18)所述的诊断剂，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(20).肺炎支原体的检测用试剂盒，其包含(13)～(16)中任意一项所述的抗体或(17)所述的组合物。
(21).肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒，其包含(13)～(16)中任意一项所述的抗体或(17)所述的组合物。
(22).如(21)所述的试剂盒，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(23).检测是否存在肺炎支原体的方法，包含以下步骤：
使(13)～(16)中任一项所述的抗体或(17)所述的组合物与样品相接触；和
免疫检测或测定样品中的抗原物质与(13)～(16)中任意一项所述抗体之间的结合。
(24).肺炎支原体所致疾病的诊断方法，包含以下步骤：
使(13)～(16)中任意一项所述的抗体或(17)所述的组合物与来自受试者的样品相接触；和
免疫检测或测定样品中的抗原物质与(13)～(16)中任意一项所述抗体之间的结合。
(25).如(24)所述的方法，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
本发明还提供以下肺炎支原体所致疾病的诊断剂的制造方法：
(25).一种肺炎支原体所致疾病的诊断剂的制造方法，包括使(1)～(3)中任一项所述的化合物或(4)所述的组合物与适合的支持物或载体相结合的步骤。
(26).如(25)所述的制造方法，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
(27).肺炎支原体所致疾病的诊断剂的制造方法，包括使(13)～(16)中任意一项所述的抗体或(16)所述的组合物与适合的支持物或载体相结合的步骤。
(28).如(27)所述的制造方法，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
由于本发明的甘油糖脂是肺炎支原体的主要抗原，因此，能够成为高敏感性且准确地检测肺炎支原体的分子基础。由此，通过使用糖脂，能够开发出肺炎支原体所致疾病的准确诊断方法、诊断试剂和诊断试剂盒。
附图说明
图1为表示本发明的3-O-[(β-D-吡喃半乳糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油(1)和3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油的结构的图。
图2为对实施例1提取的脂质样品，使用薄层层析(TLC)展开，并使用苔黑酚(Orcinol)试剂染色的图。
图3为对实施例1获得的脂质组分，在DMSO-d6100％中进行测量的DQF-COSY谱。
图4为实施例1获得的脂质组分的图谱，其中使用ESI-MS测量法分析获得所述图谱。
图5表示通过TLC展开肺炎支原体的脂质组分，并(a)：使用苔黑酚试剂进行染色的结果，和(b)：使用TLC-免疫染色法检测所述组分与来自Guillain-Barre综合症患者的血清之间的反应的结果的图。如(b)所示，糖脂抗原点被染色，这说明Guillain-Barre综合症患者保持对糖脂抗原的抗体。
图6为在实施例3中，通过使用Glcβ-6Galβ-3DAG的ELISA法调查的患病组和未患病组的分值分布。
图7为在实施例3中，将使用Glcβ-6Galβ-3DAG的ELISA法获得的试验结果，以敏感度对假阳性率的值表示的ROC曲线(接受者操作特性曲线)。
图8(a)为利用免疫层析法的试纸条的平面图；图8(b)为图8(a)所示的利用免疫层析法的试纸条的纵向剖面图。图中的数字分别代表以下物品：
1粘性板；2浸渍部件；3膜载体；31捕获位点；4吸收用部件；5样品添加用部件。
图9为在HTLC板上展开提取自肺炎支原体菌体的脂质混合物，以及通过化学合成制备的Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG，并使其与山羊血清反应的结果的照片。右图显示通过使用所得的山羊血清进行免疫染色而获得的结果。左图显示对展开化合物的HTLC板进行苔黑酚染色而获得的结果。
图10为ELISA的结果，其显示Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG抗原分别与经硫酸铵分级纯化的单克隆抗体的反应性。单克隆抗体与GalGL和GulGL均发生反应。
具体实施方式
本发明人等从肺炎支原体的抗原物质中成功地分离/纯化出具有极高抗原性的主要化合物。此外，还对所述化合物进行了结构分析并鉴定出新型的甘油糖脂。
1.本发明的甘油糖脂
在本发明的一个实施方式中，提供从肺炎支原体的抗原物质中最新分离出来、并确定了结构的甘油糖脂。
本发明提供的甘油糖脂是肺炎支原体产生，并由以下结构式表示的甘油糖脂或其盐：
式中，R1＝OH时R2＝H，R1＝H时R2＝OH；且每个R3可独立地选自饱和或不饱和的任意烃基。
优选R3是表示为-(CH2)nCH3(其中，n为12、14、16或18)的饱和烃。
特别优选地，本发明提供的甘油糖脂是以下结构式表示的甘油糖脂或其盐：
对于上述结构式而言，在情况(1)下表示3-O-[(β-D-吡喃半乳糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油(3-O-[(β-D-Galactopyranosyl)-(1,6)-(β-D-galactopyranosyl)]-1,2-di-O-acyl-sn-glycerol)(在本说明书中，有时缩写为“Galβ-6Galβ-3DAG”)，而在情况(2)下则表示3-O-[(β-D-吡喃葡糖基)-(1,6)-(β-D-吡喃半乳糖基)]-1,2-二-O-酰基-sn-甘油(3-O-[(β-D-Glucopyranosyl)-(1,6)-(β-D-galactopyranosyl)]-1,2-di-O-acyl-sn-glycerol)(在本说明书中，有时缩写为“Glcβ-6Galβ-3DAG”)。其中，所述酰基是棕榈酰基(palmitoryl)或硬脂酰基(stearoyl)。
在本说明书中，“本发明的甘油糖脂”是指以上述结构式表示的甘油糖脂及其盐。作为盐，可以使用与生理上可接受的酸(例如无机酸、有机酸)或碱(例如碱金属盐)等的盐，并且特别优选生理上可接受的酸加成盐。此类盐的实例包括与无机酸(例如盐酸、磷酸、氢溴酸和硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐。
本发明的甘油糖脂是肺炎支原体产生的糖脂，并可用作检测肺炎支原体或诊断肺炎支原体所致疾病的标记物。例如，使用与本发明的甘油糖脂特异结合的抗体时，可通过免疫学方法进行肺炎支原体的检测或肺炎支原体所致疾病的诊断。
2.通过检测本发明甘油糖脂的自体抗体来诊断肺炎支原体所致疾病的方法
根据本发明的一个实施方式，可提供诊断肺炎支原体所致疾病的方法，其中将肺炎支原体所致疾病表征为在来自受试者的样品中存在抗甘油糖脂的抗体。此方法包括使本发明的甘油糖脂与来自受试者的样品相接触的步骤。
作为本发明的方法中使用的抗甘油糖脂抗体的测定法，只要所述测定法能够测定来自受试者的样品中的抗甘油糖脂抗体即可，没有特别限定。其典型实例包括基于抗原-抗体反应的免疫学测定法。可在本发明中使用的免疫学测定法包括以下步骤：使本发明的甘油糖脂与来自受试者的样品相接触的步骤；以及检测由本发明的甘油糖脂与来自受试者的样品中的抗甘油糖脂抗体形成的免疫复合物的存在的步骤。
在本说明书中使用的术语“肺炎支原体所致疾病”是指由肺炎支原体感染而导致的疾病。肺炎支原体所致疾病的典型的表征为，在来自患病患者的生物样品中检测到本发明的甘油糖脂或其盐、或针对本发明甘油糖脂的自体抗体。肺炎支原体所致疾病的实例包括但不限于支原体肺炎、哮喘、神经疾病等。
在本说明书中使用的术语“受试者”是指可能被肺炎支原体感染的哺乳动物(例如，人、猴、牛、马、羊、兔、大鼠、小鼠等)，优选人，且最优选被肺炎支原体感染的人、可能患有肺炎支原体所致疾病的人，或患有肺炎支原体所致疾病的人。
在本说明书中使用的术语“样品”或“生物样品”包括收集自受试者的体液(例如全血、血浆、血清、关节液、脊髓液、唾液、羊水、尿液、汗液、胰腺液和滑液等)、组织、细胞等。
本发明的根据来自受试者的样品中检测自体抗体而进行的肺炎支原体所致疾病的诊断及预知方法，是通过使用来自患病受试者和非患病对照体的生物样品来确认。可从受试者获取可能包含自体抗体的生物样品(例如血清)，其中所述受试者是指疑患有特定疾病的受试者或具有易患所述疾病的体质的受试者。从非患病对照体获取相同种类的体液。
根据本发明，可将本发明的对甘油糖脂抗原的反应性的自体抗体的测定，应用于疾病(例如支原体肺炎)的初期诊断中。进而，自体抗体水平的监测可用于预先确认疾病的进程中。
3.抗甘油糖脂抗体的测定方法
可使用任意的多种方法检测样品(例如来自受试者的血清样品)中对本发明甘油糖脂的自体抗体。此类方法包括免疫测定，其实例包括但不限于：Western印记、放射性免疫测定、ELISA(固相酶联免疫测定法)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、凝集试验、补体结合试验、免疫放射分析、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定等。
此类免疫测定，可通过在发生特异性抗原-抗体结合的条件下使来自受试者的样品与本发明的甘油糖脂抗原或包含所述抗原的组合物相接触，并检测自体抗体的免疫性结合或测定其结合量的方法来实施。在特定的实施方式中，可将通过组织切片进行的此类自体抗体的结合，例如用于检测自体抗体的存在中。在此情况下，如果检测到自体抗体则说明存在疾病。将血清样品中的自体抗体水平与来自未患病受试者的同类血清样品中存在的自体抗体水平进行比较。
可使用多种方法进行免疫测定。例如，进行此类免疫测定的方法的一个实例包括：将本发明的甘油糖脂拴在固体支持物上，并检测与所述甘油糖脂特异结合的抗甘油糖脂抗体。
更具体地说，检测样品中的抗甘油糖脂抗体的方法例如包括以下的步骤：
(1)使固定在固相上的本发明的甘油糖脂与生物样品中的抗甘油糖脂抗体反应，从而形成免疫复合物的步骤(一次反应)；
(2)使步骤(1)中生成的免疫复合物与经标记的抗人免疫球蛋白抗体反应，从而形成免疫复合物的步骤(二次反应)；
(3)从固相分离未形成免疫复合物的经标记的抗人免疫球蛋白抗体的步骤；
(4)测量在固相生成的免疫复合物中的标记量或标记活性的步骤；和
(5)将步骤(4)中测量得到的测量值与预先使用已知浓度的抗甘油糖脂抗体绘制的分析曲线进行比较的步骤。
根据需要，可在步骤(1)和步骤(2)之间追加对一次反应后的固相进行清洗的步骤。另外，步骤(1)和步骤(2)可同时进行。本发明的对生物样品中的抗甘油糖脂抗体进行的测定中，可在二次反应中使用生物素化的抗人免疫球蛋白抗体等进行反应。在此情况下，可使二次反应中生成的免疫复合物(包含本发明的甘油糖脂、抗甘油糖脂抗体和生物素化的抗人免疫球蛋白抗体的复合物)与(链霉)亲和素标记的抗体反应，并测定所生成的免疫复合物中的亲和素标记的抗体的量即可。另外，在二次反应中，可使用与抗甘油糖脂抗体反应的(经标记的)适配体(Aptamer)来代替(经标记的)抗人免疫球蛋白抗体。
所述一次反应可在水性介质(例如容器中的液相)或干式介质(例如固相支持物)中进行。固定本发明的甘油糖脂的固相的实例包括：聚苯乙烯板，例如微滴定板；玻璃制或合成树脂制的粒状物(珠)；玻璃制或合成树脂制的球状物(球)；乳胶；磁性粒子；各种膜，例如硝酸纤维素膜；合成树脂制成的试管；和硅胶板等。所述二次反应也可以在水性介质或干式介质中进行。作为测量通过二次反应在固相生成的免疫复合物中标记物量或活性的方法，例如包括吸光度法(比色法)、荧光法、发光法和放射活性法等。当所述标记物是酶时，使所述酶的底物与所述酶反应，测定生成物，由此可测定免疫复合物中的酶活性。酶的底物和该酶之间的反应优选在水性介质中进行。
根据上述方法被判断为肺炎支原体感染或被诊断为患有肺炎支原体所致疾病的受试者可接受适合的处理或治疗。
4.包含本发明甘油糖脂的组合物、诊断剂和诊断用试剂盒
在本发明的一个实施方式中，提供包含本发明甘油糖脂的组合物。在另一个实施方式中，本发明提供肺炎支原体所致疾病的诊断剂，其包含本发明的甘油糖脂。进而在另一个实施方式中，本发明提供肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒，其包含本发明的甘油糖脂或本发明的上述组合物。
包含本发明甘油糖脂的组合物，可包含适合的载体、赋形剂、缓冲剂、稀释剂等。例如，以制备对本发明甘油糖脂的抗体为目的，可将本发明的组合物向动物，例如向小鼠、大鼠、兔等施用。或者，也可以将本发明的组合物用于检测样品中的本发明甘油糖脂的抗体(例如抗-Galβ-6Ga1β-3DAG抗体或抗-Glcβ-6Galβ-3DAG抗体)中。或者，本发明的组合物也可用作肺炎支原体所致疾病的诊断剂。此外，本发明的组合物也可包含在肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒中。
可以根据上述抗甘油糖脂抗体的测定方法，使用包含本发明甘油糖脂的本发明的诊断剂和试剂盒。本发明的试剂盒可进一步包含用于上述二次反应的经生物素等标记的抗人免疫球蛋白抗体等。在本发明的试剂盒中，可将本发明的甘油糖脂固定到固相支持物上，所述固相支持物例如可以举出：聚苯乙烯板，例如微滴定板；玻璃制或合成树脂制的粒状物(珠)；玻璃制或合成树脂制的球状物(球)；乳胶；磁性粒子；各种膜，例如硝酸纤维素膜；合成树脂制成的试管；和硅胶板等。本发明的试剂盒还可包含作为进行反应的液相使用的缓冲溶液等。本发明的试剂盒还可包含厂商制成的使用说明书。
在一个实施方式中，本发明还提供肺炎支原体所致疾病的诊断剂的制造方法，所述方法包括将本发明的甘油糖脂或包含本发明甘油糖脂的组合物与适合的支持物或载体相结合的步骤。载体的实例包括不溶性多糖类，例如琼脂糖、葡聚糖和纤维素等；合成树脂，例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺和硅酮；以及玻璃等。
5.本发明的甘油糖脂的抗体及其应用
在一个实施方式中，本发明提供与本发明的甘油糖脂特异结合的抗体。本发明的抗体对肺炎支原体特有的甘油糖脂(本发明的甘油糖脂)具有反应特异性，因此，在使用此抗体时能够对分析物中的甘油糖脂进行免疫测定。本发明的抗体可用于肺炎支原体所致疾病的诊断。
(I)本发明抗体的制备
可通过以下步骤获得本发明的抗体：使用来自肺炎支原体的本发明的甘油糖脂作为抗原免疫动物；并从所述动物分离血清或采集所述动物的产生抗体的细胞，对其进行永生化培养，并从其培养物中回收产物。下文描述了本发明抗体的制备方法的一个实例，但本发明并不限于此。只要将本发明的肺炎支原体的甘油糖脂作为抗原，也可以使用其他方法进行制备。
(1)多克隆抗体的制备
例如，将单磷酸脂质、弗氏完全佐剂和矿物油加入到根据下文实施例中所述的方法获得的肺炎支原体的脂质提取物中并加以混合，再向混合物中添加包含0.1％(v/v)吐温80的PBS(磷酸缓冲生理盐水)，并将所得混合物乳化。
随后，向动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠和羊)皮下或腹内施用所述乳化产物。若在首次免疫后的2～3周时使用常规方法进行追加免疫，则可获得高滴度的抗血清。末次免疫一周后，采集血液并分离血清。对血清进行热处理以使补体失活后，通过硫酸铵盐析、离子交换层析等的与普通抗体的精制相同的方法，获得免疫球蛋白组分。另外，优选在末次免疫后通过酶免疫测定等方法确定血液中抗体滴度的增加。
通过上述方式获得的抗体与肺炎支原体的甘油糖脂特异结合。在本说明书中所述的抗体与抗原(例如本发明的甘油糖脂)的“特异结合”是指所述抗体与抗原的结合亲和力实质上大于抗体与其他物质(例如，除本发明的甘油糖脂之外的其他甘油糖脂)的结合亲和力。在本文中所述的“实质上大于的结合亲和力”是指利用期望的测量设备，足以从其规定的抗原清楚地检测出的程度的高亲和力，通常，是指结合常数(Ka)至少为107M-1，优选至少108M-1，更优选109M-1，进一步优选1010M-1、1011M-1、1012M-1或更高，例如是指最高1013M-1或更高的结合亲和力。
使用本发明的纯化甘油糖脂代替肺炎支原体的脂质提取物时，可获得对本发明的甘油糖脂具有反应特异性的多克隆抗体。
(2)单克隆抗体的制备
可根据Koehler和Milstein的方法(Nature,495-492,1975)获得单克隆抗体。即，将能够产生抗甘油糖脂抗体的哺乳动物的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合以制备杂交瘤，克隆产生目的抗体的杂交瘤，并培养所述杂交瘤从而在培养溶液中获得单克隆抗体。下面将对每个步骤进行详细阐述。
(i)动物的免疫和抗体产生细胞的制备
可使用甘油糖脂免疫动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠和羊等)，并由所述动物制备脾细胞、淋巴结细胞和外周血等，从而获得抗甘油糖脂的抗体。可以按照与上述(1)相同的方式，使用甘油糖脂免疫动物。
为了获得对本发明甘油糖脂具有反应特异性的单克隆抗体，可使用经纯化的本发明甘油糖脂免疫动物，也可以使用由甘油糖脂混合物免疫的动物的抗体产生细胞制备杂交瘤，并从所得杂交瘤进行选择，由此获得产生对本发明甘油糖脂具有反应特异性的单克隆抗体的杂交瘤株。根据本发明，不必获得免疫动物所需量的本发明的甘油糖脂，只要有能够通过酶免疫法检测出程度的微量的本发明甘油糖脂即可。
(ii)杂交瘤的制备
从接受甘油糖脂免疫的动物采集抗体产生细胞，并将所述细胞与骨髓瘤细胞融合。可将来自不同哺乳动物的细胞系作为用于细胞融合的骨髓瘤细胞使用。然而，优选所用细胞系与在抗体产生细胞的制备中使用的细胞系来自同种动物。此外，出于在细胞融合后区分未融合细胞和融合细胞的目的，优选使用具有标记的骨髓瘤细胞，这样只有杂交瘤能够增殖，非融合的骨髓瘤细胞不能生存。例如，8-氮鸟嘌呤抗性株缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，并且其核酸合成依赖于从头合成途径。就此类骨髓瘤与正常抗体产生细胞的融合细胞(杂交瘤)而言，即便从头合成途径在包含次黄嘌呤、氨喋呤、胸腺嘧啶的培养基(HAT培养基)中受到氨喋呤的抑制，由于存在次黄嘌呤和胸腺嘧啶，它们还可能通过来自淋巴细胞的补救途径进行核酸合成，因此能够增殖。与此相比，就8-氮鸟嘌呤抗性骨髓瘤细胞而言，由于从头合成途径也受到氨喋呤的抑制，因此不能进行核酸合成，从而导致细胞死亡，而且作为正常细胞的抗体产生细胞也不能长时间培养。因此，只有通过抗体产生细胞和骨髓瘤细胞间的细胞融合而产生的杂交瘤细胞能够在HAT培养基中增殖，所以能够在由融合细胞和非融合细胞组成的组中选择出融合细胞(Science,145卷,709页,1964年)。优选使用不分泌固有免疫球蛋白的株系作为骨髓瘤细胞，这样可以更易于从杂交瘤的培养上清中获得目的抗体。
例如，可根据以下方式进行获得杂交瘤的细胞融合。从经免疫的动物中取出脾脏，并将其悬浮在RPMI1640培养基中以制备细胞悬液。将所述脾细胞与对数生长期的鼠骨髓瘤细胞(例如，SP2/0细胞(ATCC CRL-1581，氮鸟嘌呤抗性，不分泌IgG))混合，使脾细胞与骨髓瘤细胞的比例成为10:1～1:1。将所得混合物进行离心沉淀后，向沉淀物中加入平均分子量为1000～6000的聚乙二醇直至最终浓度为30％～50％，从而使细胞融合。可通过向细胞混合物施加脉冲电来替代添加聚乙二醇而进行细胞融合。
在融合处理后培养细胞，例如在包含10％(v/v)胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基等中进行培养后，将细胞悬浮在如HAT培养基等的选择培养基中，并分份注入96孔微滴定板等中而进行培养，从而仅增殖杂交瘤。
(iii)筛选产生对甘油糖脂具有反应特异性的抗体的杂交瘤
以上获得的杂交瘤是杂交瘤的混合物，其产生针对多个抗原或抗原决定位点的多种单克隆抗体。因此在其中选择产生对本发明甘油糖脂具有反应特异性的单克隆抗体(例如对Galβ-6Ga1β-3DAG或Glcβ-6Galβ-3DAG具有反应特异性的单克隆抗体)的株系。此外，在结合本发明甘油糖脂的单克隆抗体中，优选选择产生对强抗原性的抗原决定位点具有单克隆抗体的株系。
产生对甘油糖脂单克隆抗体的株系，可通过将其作为抗原使用的酶免疫法筛选。此类方法的实例包括ELISA法，即，预先将抗原固定到微滴定板等；向其中加入杂交瘤培养溶液；再加入由酶、荧光物、发光物等标记的二次抗体，并进行温育；并通过结合的标记物检测抗体。关于此方法，也可以将抗体固定，并依次向其中加入抗原和经标记的二次抗体而进行温育。下文中对ELISA法有更详细的描述。
尚未获得纯化的本发明甘油糖脂时，可使用高效薄层层析(HPTLC)层析板分离肺炎支原体的脂质组分，向层析板中依次添加杂交瘤培养溶液和经标记的二次抗体，温育并检测经标记的二次抗体结合的位点。如果此位点与在HPTLC中展开的本发明甘油糖脂的位置一致，则可以认为所述杂交瘤产生了本发明甘油糖脂的单克隆抗体。在获得对本发明甘油糖脂的单克隆抗体后，可通过使用所述单克隆抗体的亲和层析等，从脂质组分中精制本发明的甘油糖脂。
在确定含有产生目的单克隆抗体的杂交瘤时，可从含有所述杂交瘤的孔中的细胞，通过有限稀释法等，进行克隆。
(iv)单克隆抗体的制备
在适合的培养基中培养上述方式获得的杂交瘤时，可在培养上清中获得本发明的单克隆抗体。此外，可根据常规方法通过硫酸铵盐析、离子交换层析、利用蛋白质A或蛋白质G的亲和层析、或固定抗原的免疫吸附层析等纯化单克隆抗体。
通过这种方式获得的本发明甘油糖脂的单克隆抗体与本发明的甘油糖脂特异结合。因此，优选此类单克隆抗体不与含唾液酸的糖脂(神经节苷脂)、血小板活化因子(1-烷基-2-乙酰甘油-3-磷酸胆碱)或其部分脱酰化产物、卵磷脂或其部分脱酰化产物、或糖脂(例如鞘磷脂等)和磷脂发生交叉反应，以上物质存在于未受肺炎支原体感染的健康人的血清中。
可直接使用本发明的单克隆抗体，也可以使用其片段。在对抗体进行片段化时，为了抗原-抗体的结合必须保留抗体中抗原结合位点(Fab)，因此，可使用由不破坏抗原结合位点的蛋白酶(例如纤溶酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)处理抗体而获得的包含抗原结合位点(Fab)的片段。抗体片段的实例包括Fab、Fab'2和CDR等。此外，在本发明中也可以使用人源化抗体、多功能抗体、单链抗体(ScFv)等。对抗体的类型没有特别的限制，包括具有任意同种型的抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE等。优选的同种型是IgG或IgM，从易于纯化等观点来看更优选IgG。
此外，测定出本发明单克隆抗体的编码基因的碱基序列或抗体的氨基酸序列时，可使用基因工程的方法制备包含抗原结合位点(Fab)的片段。
6.包含本发明抗甘油糖脂抗体的组合物、诊断剂和诊断用试剂盒
在一个实施方式中，本发明提供了包含本发明抗甘油糖脂抗体的组合物。本发明的组合物可包含适合的载体、赋形剂、缓冲剂、稀释剂等。载体的实例包括不溶性多糖，例如琼脂糖、葡聚糖、纤维素等；合成树脂，例如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅酮等；和玻璃等。
可将本发明的组合物用于检测样品中的本发明的甘油糖脂。或者，也可通过在生物样品中检测本发明的甘油糖脂，从而将本发明的组合物用于肺炎支原体所致疾病的诊断中。
因此，本发明还提供用于诊断肺炎支原体所致疾病的试剂或试剂盒，其中可将所述肺炎支原体所致疾病表征为在来自受试者的样品中存在本发明的甘油糖脂。所述试剂或试剂盒包含本发明的抗甘油糖脂抗体或包含所述抗体的组合物。
因此，本发明还提供肺炎支原体所致疾病的诊断剂的制造方法，所述方法包含将本发明的抗体或包含本发明抗体的组合物与适合的支持物或载体相结合的步骤。
依照免疫测定法使用本发明的试剂盒。根据需要，通过免疫学方法检测受试者中的甘油糖脂或肺炎支原体时，本发明的试剂盒可包含对本发明甘油糖脂具有反应特异性的抗体和经标记的二次抗体，其中，经标记的二次抗体是指，用标记物对采用上述抗体的制备中使用的免疫动物以外的动物而制备的上述免疫动物的球蛋白抗体进行标记的二次抗体。
此类试剂盒的具体实例可以举出包括微滴定板；封闭剂，例如BSA(牛血清白蛋白)；本发明的甘油糖脂(标准物)；本发明的抗体；过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体；过氧化氢溶液；OPD；用于洗涤的缓冲溶液的试剂盒。优选抗体类、肺炎支原体的甘油糖脂等为冻干产物的形式，或溶于可稳定保存它们的溶剂中。本发明的试剂盒还可包含厂商制成的使用说明书。
(测定法)
可用于本发明的免疫测定法的实例包括使用抗体的普通免疫学方法，例如ELISA法和免疫染色法等。例如，可按照以下方式测定待分析溶液中的甘油糖脂：使待分析溶液与结合了抗甘油糖脂抗体的固相接触，从而使待分析溶液中的甘油糖脂与所述抗体结合，从所述固相分离除去未吸附的组分；随后，使标记物标记的肺炎支原体甘油糖脂接触所述固相，并使所述待分析溶液中包含的甘油糖脂与经标记的甘油糖脂进行竞争反应，检测与固相结合的标记物或未和固相结合的标记物。
此外，可按照以下方式测定待分析物中的甘油糖脂：使待分析溶液和标记物标记的甘油糖脂接触结合了抗甘油糖脂抗体的固相；使待分析溶液中包含的甘油糖脂和经标记的甘油糖脂对抗体进行竞争反应；并检测与固相结合的标记物或未与固相结合的标记物。此时，可使用无标记的标准甘油糖脂代替标记的甘油糖脂，并在待分析物中的甘油糖脂与标准甘油糖脂发生竞争反应后，进一步使标记物标记的抗甘油糖脂抗体与固相接触，并检测与固相结合的标记物或未与固相结合的标记物。在此情况下，也可以使用经标记的二次抗体。
进一步，使待分析溶液中的甘油糖脂与固相结合，使其与经标记的抗甘油糖脂抗体接触，并检测与固相结合的标记物或未与固相结合的标记物。
已知免疫学测量法中的多个其他实施方案，并且可在本发明中应用任意的此类方法。此外，除使用固相的上述方法之外，也可采用在免疫测定半抗原和抗原时使用的方法，例如液相法，其中待分析物中的甘油糖脂与经标记的甘油糖脂对抗体进行竞争反应，使用聚乙二醇、葡聚糖、二次抗体等将抗体结合的抗原与游离抗原彼此分离，并检测游离标记抗原的标记物。
上述固相的实例包括，例如琼脂糖珠，乳胶粒子，聚苯乙烯、尼龙等的微滴定板孔等常见的材料和形态(颗粒、微粒、试管、微滴定板、试纸条等)。固相与抗体或甘油糖脂结合后，优选使用BSA(牛血清白蛋白)或明胶等进行封闭。标记物的实例包括：可通过酶反应显色的酶，例如过氧化物酶、碱性磷酸酶；放射性同位素；和荧光色素，例如异硫氰酸荧光素等。
作为色素，对于过氧化物酶可使用4-氯-1-萘酚、O-苯二胺(OPD)或3,3'-二氨基联苯胺等，而对于碱性磷酸酶可使用对硝基苯磷酸酯等。
另外，由于本发明的甘油糖脂特有于肺炎支原体中，因此，可通过使用上述方法测定待分析物中的甘油糖脂，并且将甘油糖脂的存在与否或其存在量与待分析物中肺炎支原体的存在与否或其存在量相联系，由此可检测出肺炎支原体。
在上述甘油糖脂的测定法或肺炎支原体的检测法中，可使用血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、关节液或细胞培养基(上清)等作为待分析物。
除上述方法之外，还可以通过以下方式检测肺炎支原体：直接使用生物体组织或细胞，或对其进行甘油糖脂的固定处理后，使其与标记物标记的抗甘油糖脂抗体反应，使经标记的抗体与受肺炎支原体感染的生物体组织或细胞结合，并测定标记物。作为固定处理的方法，可以举出使用福尔马林、戊二醛、多聚甲醛等的方法。也可以通过以下方式检测标记物：用无标记的抗甘油糖脂抗体代替标记物标记的抗甘油糖脂抗体与预先经固定处理的生物体组织或细胞反应；同时或此后使用标记物标记的二次抗体进行反应，并使受肺炎支原体感染的生物体组织或细胞与经标记的二次抗体结合，由此测定标记物，其中，经标记的二次抗体是指，用标记物对采用上述抗体的制备中使用的免疫动物以外的动物而制备的上述免疫动物的球蛋白抗体进行标记的二次抗体。。
在使用本发明的抗体对样品中的甘油糖脂进行免疫测定时，例如，若使用对Galβ-6Galβ-3DAG和Glcβ-6Galβ-3DAG均有反应特异性的抗体，则可测定出Galβ-6Galβ-3DAG和Glcβ-6Galβ-3DAG，若使用对Galβ-6Galβ-3DAG或Glcβ-6Galβ-3DAG具有反应特异性的抗体，则能够选择性地测定Galβ-6Galβ-3DAG或Glcβ-6Galβ-3DAG。在测定Galβ-6Galβ-3DAG或Glcβ-6Galβ-3DAG时，可将按实施例中所述方式获得的Galβ-6Galβ-3DAG或Glcβ-6Galβ-3DAG作为标记物使用。
下面，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限于此。
实施例
(实施例1)
1.糖脂的分离和纯化
按照以下方式在PPLO培养基中培养肺炎支原体(Mac株)。在37℃温度下，在液体培养基中培养肺炎支原体，其中所述液体培养基是通过向PPLO液体基本培养基(Difco制)中添加10％牛血清、10％青霉素、0.0002％酚红和1％葡萄糖而获得的。通过培养基pH值的变化确认微生物的生长，此后进行离心分离(16000×g，1小时)。将此操作重复一次以提供用于脂质提取的样品。对200L微生物样品(湿体积)，添加氯仿和甲醇的混合溶剂以提取脂质组分。
2.脂质的提取
将样品悬浮于甲醇中并使其静置4小时。向其中添加双倍量的氯仿，用超声破碎菌体，并将所得混合物再静置4小时。以3000rpm进行离心分离，收集并浓缩上清液以提供脂质组分样品。
对该脂质样品，通过填充了硅胶的柱层析，并使用氯仿和甲醇进行分离、纯化。在第一阶段，使用氯仿与甲醇混合比(氯仿：甲醇)分别为9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9或0:10的溶剂产生10种组分。在第二和第三阶段中，对各个组分进一步进行相同的柱层析以对其进行进一步的分离。在第一阶段获得了分别包含33mg、79mg、2mg、5mg、2mg、4mg、4mg、2mg、6mg、0mg化合物(均不能回收)的10种组分。在第二阶段，对所述组分之一的79mg进一步分级，由此获得6种组分。对其中的第二组分，在第三阶段进行进一步分级，由此获得6种组分。在所获得组分中，第四组分包含糖脂1和糖脂2，其产量为15mg。
图2为对脂质样品使用薄层层析(TLC)展开并使用苔黑酚染色的图。第1道显示从纯化之前的菌体提取的脂质组分；第2～10道显示通过第一柱层析分离的各个组分；第11道显示通过3个纯化阶段获得的目的糖脂组分。
3.NMR分析
将所得糖脂组分溶于DMSO-d6:D2O＝98:2的溶液中，并在60℃测定1H-NMR。没有观察到鞘氨醇信号，但清楚地观察到甘油部分的质子，由此确认所述组分为甘油脂。有两个来自脂肪酸的峰，大多数为饱和脂肪酸，而只有少数不饱和脂肪酸。因此，确认所述脂质部分为二酰基甘油(DAG)。在所述糖部分中，观察到均为β-型的1个葡萄糖和3个半乳糖的异头质子。认为葡萄糖具有非还原末端，而两个半乳糖在6位具有取代基。基于上述数据，认为Galβ-6Galβ-3DAG和Glcβ-6Galβ-3DAG的骨架混合在一起。为了核实所述骨架，通过使用Gal-DAG比较6位化学位移，由此检查具有非还原末端的糖是否与具有还原末端的半乳糖的6位结合。此外，在不包括D2O的100％DMSO-d6中进行测量并进行-OH质子的鉴定时，观察到在具有还原末端的半乳糖的2位、3位和4位的-OH信号，但没有观察到6位的-OH信号。基于上述事由，确认具有非还原末端的糖与6位结合。
图3显示在100％DMSO-d6中测定的DQF-COSY谱，其中描述了-OH质子的归属。表1显示在DMSO-d6:D2O＝98:2、60℃的条件下测定的各个质子的归属数据。
(表1)
4.质谱分析
通过ESI-MS测量法对获得的脂质组分进行分析。其质谱图显示于图4中。阳性模式在添加钠的条件下测定，并观察到相当于分子离子的m/z 915(M+23)和943(M’+23)峰。此结果是由脂肪酸组成间的差异造成的，认为前者为C16:0/16:0(100％)，后者为C16:0/18:0(30％)。对这些分子片段进行MS/MS时，观察到脂肪酸、糖部分和甘油部分从己醣-己醣-二酰基甘油骨架脱离后的片段。因此，观察到与此骨架一致的结果。在阴性模式的情况下也观察到m/z 891(M-1)和919(M’-1)的分子离子峰，并且在其MS/MS测定中也获得了同样一致的结果。
将1H-NMR分析结果与质谱分析的结果组合考虑时，可确认所述结构为Galβ-6Galβ-3DAG和Glcβ-6Galβ-3DAG的结构。
5.通过与化学合成产物的数据比较进行结构的确定
为了确定所述结构，通过化学合成的方式立体选择性且位置选择性地合成各个骨架。在与测定天然产物相同的条件(DMSO-d6:D2O＝98:2；60℃)下进行1H-NMR测定，并对其图谱进行分析并互相比较。结果发现合成产物的图谱与天然产物的图谱相符，从而确认了其绝对结构。
表2显示天然产物和合成产物中各个质子的归属数据。图谱的ppm值与偶合常数(J Hz)相互对应，形状也相同。
(表2)
现已在多种植物、细菌等中发现甘油糖脂，但尚未报道具有β-型糖结合，且其中2个糖具有1-6结合的结构。结构式1和式2表示的糖酯具有新型结构。
(实施例2)
(在来自神经疾病患者的样品中的本发明糖脂抗原的抗体)
参照TLC-免疫染色法，对包含结构式1和结构式2所示糖脂抗原的肺炎支原体脂质组分，进行与来自Guillain-Barre综合症患者的血清反应的试验。在TLC板上展开从肺炎支原体提取的脂质组分，并使来自Guillain-Barre综合症的血清与其反应。使用过氧化物酶标记的抗人IgG、IgM和IgA的混合物检测反应，并使用化学显色进行可视化。图5表示通过TLC展开肺炎支原体的脂质组分，并(a)：使用苔黑酚试剂进行染色的结果，和(b)：使用TLC-免疫染色法检测所述组分与来自Guillain-Barre综合症患者的血清之间的反应的结果的图。
如图5(b)所示，在结构式1和结构式2所示的糖脂抗原的斑点上发现荧光。因此证明Guillain-Barre综合症患者具有针对于这些糖脂抗原的抗体。
这个试验结果说明结构式1和结构式2所示糖脂抗原及其抗体可用作肺炎支原体所致疾病的检测标记物。
(实施例3)
分别使用通过合成制备的Glcβ-6Galβ-3DAG和Galβ-6Galβ-3DAG，制备两种ELISA试剂盒，并测量人的待分析物中对这些抗原的IgM抗体滴度。将来自患有支原体肺炎患者的40份血清作为待分析物进行检测，从而检查所述ELISA法作为肺炎支原体的诊断法是否有效。同样检测来自健康人的40份血清以比较分值。
抗原板的制备：制备5μg/mL的Glcβ-6Galβ-3DAG(甲醇：乙腈溶液)。在每个ELISA用免疫板(平底)上分别撒入50μL此溶液，并通过除去溶剂制备固定了Glcβ-6Galβ-3DAG的板。以相同的方法制备Galβ-6Galβ-3DAG的板。
ELISA法的实验方案：在测量孔中展开封闭溶液(100μL/孔)，并在室温下温育1小时后，对其进行清洗，在每个孔中分别加入100μL待测的分析物溶液，并在室温下温育2小时(进行双重测定)。此后，对其进行清洗，随后在每个孔中分别加入100μL过氧化物酶标记的IgM抗体溶液，并在室温下温育2小时。此后，对其进行清洗，向所述孔加入作为显色物的TMB溶液，并反应15分钟。此后，使用1N硫酸水溶液终止反应，并测定吸光度。
测定结果：基于使用对照获得的标准曲线对吸光度进行任意的记分，并将分析物的抗体滴度相互比较。在使用Glcβ-6Galβ-3DAG的ELISA测定结果中，来自健康人的样品的所有得分均为2.5或以下，且其中一半的得分小于1。与此相比，来自支原体肺炎患者的血清的所有得分均为1或以上，28％的得分为2.5以下，72％的得分大于2.5。将所述结果表示在ROC曲线(敏感度：假阳性率)时，ROC曲线下面积为0.95。经评估认为此测定法鉴定疾病的能力非常高。
就使用Galβ-6Galβ-3DAG的ELISA测定结果而言，其鉴定疾病的能力低，即使在健康人的情况下也检测出高得分。
图6显示了使用Glcβ-6Galβ-3DAG的ELISA测定结果，并显示了患病组和无病组(健康人)的得分分布。图7是ROC曲线，其中通过敏感度与假阳性率的比值表示此测定的结果。
试验结果显示通过Glcβ-6Galβ-3DAG和Galβ-6Galβ-3DAG的抗体测定法，能够鉴定由肺炎支原体感染导致的支原体肺炎。而且，两种抗原糖脂在能力上存在差异，并且在单独使用其中一个时可能产生不同的结果。认为使用Glcβ-6Galβ-3DAG诊断支原体肺炎较为理想。
(实施例4)免疫层析法
(1)胶体金溶液的制备
使用Biocell Research Laboratories(Cardiff,U.K.)制造的可商购的胶体金(粒径40nm)溶液，而不改变其浓度。
(2)胶体金标记的糖脂抗原溶液的制备
使用肺炎支原体的糖脂抗原GlcGL制备胶体金标记物。将1ml GlcGL抗原(10μg/ml)与由上述(1)获得的1ml胶体金溶液混合，并将所得混合物在室温下静置30分钟以使该抗原与胶体金颗粒表面结合后，向其中添加10％牛血清白蛋白(下文中称为“BSA”)直至胶体金溶液的最终浓度变为1％，并封闭胶体金的残余表面，从而制备胶体金标记的抗原(下文中称为“胶体金标记的抗原”)溶液。将所述溶液离心分离(8000×G，10分钟)以沉淀胶体金标记的抗原，并使用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)清洗3次。除去其中的上清液，从而获得胶体金标记的抗原。将该胶体金标记的抗原悬浮于包含1％蔗糖和0.5％BSA的50mM Tris-HCl缓冲液(pH值7.4)中，从而获得胶体金标记的抗原溶液。
(3)测定抗肺炎支原体特异性抗体用免疫层析法试纸条的制备
根据以下流程，制备图8所示的免疫层析法试纸条。
(3-1)抗肺炎支原体特异性抗体与胶体金标记抗原的复合物的捕获部位
将带状细长的硝酸纤维素膜(宽度：5mm，长度：36mm)作为展开层析介质的层析展开用膜载体3。
将4μl包含2mg/ml抗人IgM的抗体的溶液，涂覆在该层析展开用膜载体3上，涂覆方式为从层析展开的起始点一侧末端至7.5mm的位置，以线性方式涂覆。将其在室温下干燥3天，并由此获得抗肺炎支原体抗体与胶体金标记抗原的复合物的捕获部位31。
(3-2)胶体金标记抗体浸渍部件
将条带状的玻璃纤维无纺布(5mm×15mm)浸渍在40μl胶体金标记的抗原溶液中。将其在室温下干燥，由此获得胶体金标记抗体浸渍部件2。
(3-3)免疫层析法试纸条的制备
除上述层析展开用膜载体3和胶体金标记抗体浸渍部件2之外，还准备了作为样品添加用部件5的棉布和作为吸收用部件4的滤纸。使用这些部件制备如图8所示的免疫层析法试纸条。
(4)试验
使用分析物的稀释溶液稀释来自肺炎患者的血清，使每份分析物均具有不同的浓度，从此获得试验样品。使用微量吸管将试验样品(40μl)滴加到上述(3)中获得的试纸条的样品添加用部件5上，进行层析展开，并在室温下静置10分钟后，用肉眼观察上述捕获部位31中捕获的抗肺炎支原体特异性抗体与胶体金标记抗原的复合物的捕获量。用肉眼观察与捕获量成比例增减的紫红色的显色水平，并区分为如下4阶段来判断捕获量：-(无显色)；±(弱显色)；+(清晰显色)；和++(显著显色)。结果示于表3中。
(表3)
(实施例5)抗肺炎支原体糖脂的多克隆抗体的制备
将使用20％山羊血清培养的1ml肺炎支原体菌体进行10倍稀释(10ml)，并向其中添加10mL弗氏完全佐剂。将所得混合物在400rpm进行研磨以获得乳液。对每只山羊使用10mL上述制备的乳液进行皮下免疫，一个月后使用10mL所述乳液进行追加免疫。进而，每一个月使用在20％山羊血清中培养的肺炎支原体菌体对山羊进行追加免疫。根据常规方法从上述经免疫的山羊的血液中分离血清。使用所得血清进行TLC免疫染色试验，并确认与特异性抗原糖脂的反应性。
TLC免疫染色试验：
根据常规方法进行试验操作。在HTLC板上展开从肺炎支原体菌体提取的脂质混合物以及通过化学合成制备的Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG，并使其与获得的山羊血清反应。使用过氧化物酶标记的抗羊IgG抗体检测反应，并使用Konica免疫染色试剂盒进行可视化，从而检测由过氧化物酶引发的反应。结果显示于图9中。右图显示使用所得山羊血清进行免疫染色的结果。左图显示对展开所述化合物的HTLC板进行苔黑酚染色的结果。
如图9所示，在对应于Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG的斑点上发现显色，确认所制备的山羊血清具有对上述物质的反应性。
(实施例6)抗GGL的单克隆抗体的制备
(1)杂交瘤的制备
向每只7周龄的雌性BALB/c小鼠的皮下，注射0.5ml包含肺炎支原体菌体的乳液。在首次免疫后的第二周和第三周，向所述每只小鼠皮下和腹内注射0.5ml使用上述方法制备的乳液。
在末次免疫4天后，从所述小鼠取出脾脏，并使用RPMI1640培养基制备细胞悬液。将2×108个脾细胞与对数生长期的小鼠SP2/0骨髓瘤细胞(2×107)混合。将混合物离心后获得沉淀，并一边温和振荡一边用1分钟向沉淀物添加1ml 45％的聚乙二醇(PEG4000，和光纯药(株)制)。然后，在37℃下将此混合物振荡温育2分钟。接着，用1分钟向此混合物中添加1mlRPMI1640培养基，进一步，用3分钟再添加8ml培养基。
在将上述细胞混合物离心后，将细胞悬浮在50ml包含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基中，并将其分份注入4个96孔微板，每孔注入量为100μl(100μl/孔)，并在二氧化碳培养箱(5％二氧化碳，37℃)中进行培养。24小时后，使用HAT培养基(包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶的10％(V/V)FCS培养基)替换所述培养基，并继续将所述细胞在二氧化碳培养箱(5％二氧化碳，37℃)中进行培养。在第4天，向其中添加新鲜的HAT培养基，每孔添加量为100μl(100μl/孔)。在第7天，使用HT培养基(从HAT培养基中除去氨喋呤的培养基)替换所述培养基，并在次日替换为包含10％(V/V)FCS的RPMI1640培养基后，检查是否有克隆形成。
(2)产生抗体的杂交瘤的选择
通过有限稀释法的方式重复克隆产生抗体的杂交瘤。以利用肺炎支原体菌体为抗原的ELISA进行筛选，由此获得反应性杂交瘤株G1E6和M2F8。
(3)单克隆抗体的获得
随后，在包含10％(V/V)FCS的RPMI1640培养基中培养杂交瘤株G1E6和M2F8。通过收集培养上清获得包含单克隆抗体的培养溶液。通过硫酸铵分级纯化单克隆抗体，并对其进行ELISA(下述)，其中，ELISA是将Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG作为抗原使用。所述单克隆抗体与GalGL和GulGL均发生反应。结果显示于表10中。
ELISA法：
使用溶剂(甲醇：乙腈＝2:1)制备所合成的Galβ1-6Galβ-3DAG和Glcβ1-6Galβ-3DAG(分别为5μg/ml)的溶液。将所得溶液分别注入到96孔微板(50μl/孔)中，并在化学槽中风干，随后真空处理15小时，由此分别制备附有抗原糖脂的ELISA板。根据常规方法进行ELISA测定方案。首先，将350μl封闭溶液(使用水将Nacalai Tesque,Inc.生产的Blocking One稀释5倍而获得)分份注入各个孔，并在30℃下静置1小时。此后，使用含0.05％吐温20的PBS(350μl/孔)清洗5次。随后，将5倍稀释的137C培养上清(作为稀释液，使用由0.05％吐温20的PBS将Blocking One稀释20倍而得到的溶液)分份注入各个孔(100μl/孔)，并在30℃下静置2小时。此后，使用0.05％吐温20的PBS(350μl/孔)清洗5次。随后，将5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP[ZYMED Laboratories,cat.#81-6520]溶液或羊抗IgM[ZYMEDLaboratories,cat.#61-6820]溶液(作为稀释液，使用由0.05％吐温20的PBS将Blocking One稀释20倍而得到的溶液)分份注入各个孔(100μl/孔)，并在30℃下静置1小时。此后，使用含0.05％吐温20的PBS(350μl/孔)清洗5次，并将显色底物(TMB溶液)分份注入到各个孔中(100μl/孔)。随后在30℃下静置30分钟，将1N H2SO4分份注入到各个孔中(50μl/孔)，混合以终止显色反应，并测定吸光度(450nm/620nm)。
工业实用性
本发明的甘油糖脂是肺炎支原体的主要抗原，因此成为高敏感性且准确地检测此类微生物的分子基础。由此，能够利用此类糖脂，开发出准确诊断肺炎支原体所致疾病的方法。本发明的甘油糖脂可作为诊断肺炎支原体所致疾病的标记物使用。

Claims (18)

1.一种化合物或其盐，所述化合物由下述通式表示：
式中，当R1＝OH时R2＝H，当R1＝H时R2＝OH，且一个R3是-(CH2)14CH3，另一个R3是-(CH2)14CH3或-(CH2)16CH3。
2.一种诊断剂，其是肺炎支原体所致疾病的诊断剂，其中，包含权利要求1所述的化合物。
3.如权利要求2所述的诊断剂，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
4.一种诊断用试剂盒，其是肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒，其中，包含权利要求1所述的化合物。
5.如权利要求4所述的诊断用试剂盒，其中所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
6.权利要求1所述的化合物在制造肺炎支原体所致疾病的诊断剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
8.如权利要求2～7中任意一项所述的诊断剂、诊断用试剂盒或应用，其中，所述的化合物在非还原末端具有半乳糖。
9.如权利要求2～7中任意一项所述的诊断剂、诊断用试剂盒或应用，其中，所述的化合物在非还原末端具有葡萄糖。
10.一种抗体，其是由合成制备的下述通式所示的化合物或其盐制备的并且特异性结合下述通式所示化合物或其盐的抗体：
式中，当R1＝OH时R2＝H，当R1＝H时R2＝OH，且一个R3是-(CH2)14CH3，另一个R3是-(CH2)14CH3或-(CH2)16CH3。
11.一种单克隆抗体，其是特异性结合下述通式所示化合物或其盐的抗体：
式中，当R1＝OH时R2＝H，当R1＝H时R2＝OH，且一个R3是-(CH2)14CH3，另一个R3是-(CH2)14CH3或-(CH2)16CH3。
12.一种诊断剂，其是肺炎支原体所致疾病的诊断剂，其中，包含权利要求10或11所述的抗体。
13.如权利要求12所述的诊断剂，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
14.一种检测用试剂盒，其是肺炎支原体的检测用试剂盒，其包含权利要求10或11所述的抗体。
15.一种诊断用试剂盒，其是肺炎支原体所致疾病的诊断用试剂盒，其中，包含权利要求10或11所述的抗体。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
17.权利要求10或11所述的抗体在制造肺炎支原体所致疾病的诊断剂中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述疾病是支原体肺炎、哮喘或神经疾病。
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