CN116655797A - 一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体以及应用，所述纳米抗体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的VHH链。通过本发明所公开的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于人源抗体和带有人源抗体Fc片段(标签)的重组蛋白的纯化和检测。

Description

一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及一种针对人源抗体Fc片段的纳米抗体及其应用，属于生物技术或生物医学领域技术领域。
背景技术
抗体(Antibody)是一种由机体免疫系统针对外源物质(如细菌、病毒的蛋白)所产生的一种球状蛋白质，因此又被称为免疫球蛋白(Ig)。抗体通常由B细胞产生，在机体的免疫系统中行使多种生理学功能。抗体有多种类型，其中由B细胞分化而来的浆细胞所分泌的IgG型抗体是最普遍、最重要的一种类型，通常存在于脊椎动物的体液中，在成人的血液中含量能达到约10g/L。通常人们所说的抗体，即是指IgG型抗体。抗体是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过二硫键结合形成的、对称的Y型结构，Y型结构的两臂末端是抗原结合的部位，被称为Fab片段，Y型的柄部被称为Fc片段。
由于抗体能够高效、特异地与体内和体外的各种抗原蛋白结合，使得抗体不仅能应用于调节免疫系统功能，还可以应用于各种高灵敏的检测方法。目前，抗体药物是生物技术药物最重要的组成部分，抗体试剂也是医学诊断和生物学研究中最常用到的试剂之一。因此，抗体相关的生物产品具有极高的应用前景和商业价值。抗体可以通过多种途径获得，例如：动物或人的血液、细胞培养、注射杂交瘤细胞的鼠的腹水等，但这均需要有效的方法进行纯化，以获得具有应用价值的抗体产品。目前最常用的抗体纯化方法是利用特殊蛋白质与抗体的Fc片段之间的高亲和力进行亲和层析。在进行抗体产品的工业生产的过程中，亲和层析是其中最为关键的一步，也是整个生产中耗费最高的部分。
目前，纯化抗体普遍使用ProteinA或ProteinG偶联的交联琼脂糖进行亲和层析。但是，使用ProteinA/G进行抗体纯化，首先要进行ProteinA/G的表达和纯化，而Protein A/G通常表达量较低，这就大大增加了抗体亲和层析的成本。在科研方面，有大量蛋白质采用融合人源Fc片段进行表达，以便识别和纯化，这都需要获得针对人源抗体Fc片段的抗体。
因此，人们一直在努力探究新的方法来克服这些困难，针对人Fc片段的新型纳米抗体将有可能解决这一难题。纳米抗体是来源于骆驼科动物或软骨鱼的特殊抗体。研究表明，骆驼体内存在一种天然缺失轻链只含重链的抗体，称为重链抗体。克隆重链抗体的可变区可得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体。VHH抗体的晶体直径仅有2.5nm，长4nm，因此又被称为纳米抗体。纳米抗体的大小只有传统IgG型抗体的十分之一，是天然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体能被单基因编码，可以很容易的利用微生物进行生产，并具有很高的产率。
发明内容
发明目的：为了解决上述技术问题，本发明筛选获得Anti-Fc的纳米抗体，并建立基于抗人源Fc片段纳米抗体的亲和层析方法，用于替代ProteinA/G，以降低实验室和工业化在纯化人源抗体和含人源抗体Fc片段的融合蛋白时的成本。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种针对人源抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，包括：所述纳米抗体具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列的VHH链，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:2。
且所述抗体包含框架区与互补决定区，其中所述互补决定区包括:
CDR1:Gly Ser Thr Leu Arg Asp Tyr Asp Met Ala
CDR2:Cys Ile Glu Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asn
CDR3:Ala Val Arg His His Gly Cys Ser Arg Tyr Ser Arg Asp Phe Glu Tyr
本发明还提供了一种DNA分子，其编码上述针对人源抗体Fc片段的纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种表达载体，其包含上述DNA分子的核苷酸序列。
本发明还提供了一种宿主细胞，其表达上述针对人源抗体Fc片段的纳米抗体。
本发明还提供了所述针对人源抗体Fc片段的纳米抗体在分离纯化人源抗体中的应用。
本发明还提供了所述针对人源抗体Fc片段的纳米抗体在分离纯化含人源抗体Fc标签的融合蛋白中的应用。
本发明最后还提供了所述人源抗体Fc片段纳米抗体在检测人源抗体Fc片段中的应用。
本发明的有益效果：
本发明采用人源抗体Fc片段免疫新疆双峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立针对人源抗体Fc片段的纳米抗体基因文库，将人源抗体Fc片段偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库，从而获得了针对人源抗体Fc的高亲和力和高特异性的纳米抗体的基因，将此基因转入大肠杆菌中，建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株，根据序列比对软件分析各个克隆株的基因序列，获得针对人源抗体Fc片段的纳米抗体VHH链的氨基酸序列，并证明该纳米抗体可以和人源抗体Fc片段特异性结合，从而用于对人源抗体和偶联人源抗体Fc片段的重组蛋白的纯化。
附图说明
图1是对所构建的噬菌体展示纳米抗体文库进行插入率检测的菌落PCR的电泳图，其中泳道1是DNA分子marker，泳道2-25是所构建的针对人源抗体Fc片段的纳米抗体文库中随机挑取得克隆PCR检测电泳图；
图2是表达的针对人源抗体Fc片段的纳米抗体，经镍树脂亲和层析纯化后的SDS-PAGE电泳图，泳道1是蛋白marker，泳道1-4是经镍树脂亲和层析纯化后的纳米抗体。
图3是以人源抗体Fc片段的纳米抗体为核心材料对人源抗体的富集和对偶联人源化Fc片段蛋白的纯化的示意图。附图标记：1.人源血清或含人源抗体Fc片段及人源抗体Fc片段融合蛋白的蛋白裂解液；2.抗人源抗体Fc片段的纳米抗体；3.人源抗体；4.人源抗体Fc片段及人源抗体Fc片段融合蛋白。
具体实施方式
下面结合附图进一步描述本发明的具体实施方案。
本发明采用人源抗体Fc片段免疫新疆双峰驼，经过7次免疫之后提取该双峰驼外周血淋巴细胞并建立人源抗体Fc片段特异的纳米抗体文库。将人源抗体Fc片段偶联在酶标板上，展示正确的空间结构，使得人源抗体Fc片段的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选人源抗体Fc片段免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：针对人源抗体Fc片段的纳米抗体文库的构建：
(1)将1mg人源抗体Fc片段(源自于康宁杰瑞)抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共连续免疫7次，免疫过程中刺激B细胞表达特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100ml并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶PstⅠ及NotⅠ酶切20ugpMECS噬菌体展示载体及10ugVHH并连接两种片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建人源抗体Fc片段纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小约为1.2×108；于此同时，通过菌落PCR检测所建文库的插入率，图1显示菌落PCR结果，随机的选取24颗克隆做菌落PCR，结果显示插入率达到95％以上。
实施例2：针对人源抗体Fc片段的纳米抗体筛选过程：
(1)取200uL重组TG1细胞至2×TY培养基中培养，期间加入40uL辅助噬菌体VCSM13侵染TG1细胞，并培养过夜以扩增噬菌体，次日利用PEG/NaCl沉淀噬菌体，离心收集扩增噬菌体；(2)将溶解在100mMpH8.2NaHCO3中的人源抗体Fc片段200ug偶联在酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照；(3)第二天加入100ul的3％BSA，室温封闭2h；(4)2h后，加入100ul扩增噬菌体(2×1011tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌体展示基因库)，室温作用1h；(5)用PBS+0.05％Tween-20洗5遍，以洗掉结合的噬菌体；(6)用终浓度为25mg/ml的胰蛋白酶将于人源抗体Fc片段特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并收集噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复3轮，逐步的到富集。
实施例3：用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆：
(1)从上述3轮筛选后细胞培养板中，挑选175个单菌落分别接种于含100ug/mL氨苄青霉素的TB培养基的96深孔板中，并设置空白对照，37℃培养至对数期后，加入终浓度为1mM的IPTG，28℃培养过夜；(2)利用渗透胀破法获得粗提抗体，并将抗体转移至经抗原包被的ELISA板上，室温放置1h；(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Mouseanti-HAtagantibody(鼠抗HA抗体，购自科文斯)，在室温放置1h；(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入100ul经1:2000稀释后的Anti-mousealkaline phosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自于西格玛)，在室温放置1h；(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，反应5-10min后于酶标仪上405波长处，读取吸收值；(6)当样品孔OD值大于对照孔5倍以上时，判定为阳性克隆孔；(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100ug/ul氨苄青霉素的LB培养基中以便提取质粒并进行测序。
根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把FR1、FR2、FR3、FR4、CDR1、CDR2、CDR3序列相同的株视为同一克隆株，而序列不同的株视为不同克隆株，最终获得1株人源抗体Fc片段特异性纳米抗体。其抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4区，构成整个VHH。
实施例4：人源抗体Fc片段特异性纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中的表达及纯化
(1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒点转化到大肠杆菌WK6中，并将其涂布在LB+amp+glucose即含有氨苄青霉素和葡萄糖的培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5ml含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜培养菌种至330mLTB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD600nm值达到0.6-0.9时，加入1MIPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收集大肠杆菌，利用渗透胀破法，获得抗体粗提液；(5)通过镍柱亲和层析法纯化出抗体，获得高纯度的纳米抗体，如图2所示。
实施例5：针对人源抗体Fc片段的纳米抗体在分离纯化人源抗体和含人源抗体Fc片段的融合蛋白中的应用
如图3所示，将纳米抗体固定在固态的介质表面，向其中加入人源血清或含人源抗体Fc片段及人源抗体Fc片段融合蛋白的蛋白裂解液，室温放置2h。用PBS洗去未结合的蛋白，能特异性结合的蛋白是含有人源Fc片段的蛋白，再用洗脱液将结合的蛋白洗脱，即可分离纯化出人源抗体或含人源抗体Fc片段的纳米抗体。
实施例6：针对人源抗体Fc片段纳米抗体在检测人源抗体Fc片段中的应用
将人源抗体Fc片段纳米抗体首先包被在ELISA板上，加入不同梯度浓度的抗原人源Fc片段标准品(如1ng/ml至1mg/ml)，平行操作加入待检测人源抗体Fc片段的样品，在室温放置1h。用PBST洗去未结合的抗原，再加入生物素标记的另一种人源抗体Fc片段纳米抗体，室温放置1h。用PBST洗去未结合的抗体，再加入偶联辣根过氧化物酶的亲和素，室温放置1h。用PBST洗去未结合的亲和素，加入辣根过氧化物酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸光值。首先将各浓度梯度的人源Fc片段标准品的吸收值作出浓度标准曲线，然后将待检测样品的吸收值读数带入浓度标准曲线，即可判断待检测样品中人源抗体Fc片段的含量。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应当了解，在本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种针对人源抗体FC片段的纳米抗体，其特征在于，包括：所述纳米抗体具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的VHH链。
2.一种DNA 分子，其特征在于，其编码权利要求1所述的针对人源抗体Fc片段的纳米抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求2所述DNA分子。
4.一种宿主细胞，其特征在于，其表达权利要求1所述针对人源抗体Fc片段的纳米抗体。
5.权利要求1所述的针对人源抗体Fc片段的纳米抗体在分离纯化人源抗体中的应用。
6.权利要求1所述的针对人源抗体Fc片段的纳米抗体在分离纯化含人源抗体Fc片段的融合蛋白中的应用。
7.权利要求1所述的针对人源抗体Fc片段纳米抗体在检测人源抗体Fc片段中的应用。
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