CN116693663A - 识别猴痘病毒核心蛋白a29l的单克隆纳米抗体、应用及单克隆纳米抗体文库 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体、应用及单克隆纳米抗体文库，涉及猴痘病毒单克隆抗体制备技术领域。本发明提供的单克隆纳米抗体为A6、B8、G9、H9、E12共5条，这5条单克隆纳米抗体重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑15所示。本发明还提供了用于筛选获得上述单克隆纳米抗体的单克隆纳米抗体文库以及文库的构建方法和应用方法。本发明提供的纳米抗体对于猴痘病毒核心蛋白A29L具有非常高的亲和力和特异性，热稳定性强。
Description
技术领域
本发明涉及猴痘病毒单克隆抗体制备技术领域，特别涉及识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库、构建方法、单克隆纳米抗体及应用。
背景技术
猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)是一种正痘病毒，外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200-400nm；外部有脂蛋白膜，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链DNA基因体。
猴痘病毒蛋白A29L是细胞内成熟病毒(IMV)表面包膜蛋白，与牛痘病毒VACV、A27同源，此蛋白能与细胞表面上的硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate)作用使病毒跟细胞结合并且可催化细胞融合。因为该蛋白为病毒表面包膜蛋白，针对其的特异性单克隆抗体，可用于通过结合A29L蛋白来识别猴痘病毒，最终达到检测血清或者其他待测样本中的猴痘病毒的目的。
噬菌体展示技术是利用噬菌粒载体或噬菌体载体，将多肽或蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或者蛋白与特定的噬菌体衣壳蛋白融合表达，展示在噬菌体表面的一种技术。纳米抗体是一种在羊驼外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，这种单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
针对猴痘病毒，利用噬菌体展示技术展示获得高亲和力的单克隆纳米抗体，具有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明提供了识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，应用及单克隆纳米抗体文库。本发明通过利用噬菌体展示技术，构建能够展示单克隆纳米抗体的噬菌体文库，再以A29L蛋白为靶点蛋白，通过淘选/筛选的方法对该文库进行体外富集淘选和单克隆高通量ELISA筛选，最终获得了5条特异性识别猴痘核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，并最终通过抗体配对ELISA检测的方法，验证了这些抗体能够识别A29L蛋白上的不同抗原决定簇，可用于开发开发针对于猴痘病毒检测的双抗夹心法酶联免疫试剂盒。具体通过以下技术实现。
一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，为单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12；所述单克隆纳米抗体A6的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；
所述单克隆纳米抗体B8的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.4-6所示；
所述单克隆纳米抗体G9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.7-9所示；
所述单克隆纳米抗体H9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.10-12所示；
所述单克隆纳米抗体E12的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13-15所示。
优选地，所述单克隆纳米抗体A6的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单克隆纳米抗体B8的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述单克隆纳米抗体G9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述单克隆纳米抗体H9的重链的氨基酸序列如SEQID NO.19所示；所述单克隆纳米抗体E12的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
更优选地，所述单克隆纳米抗体A6的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ IDNO.21-22所示；
所述单克隆纳米抗体B8的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-24所示；
所述单克隆纳米抗体G9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25-26所示；
所述单克隆纳米抗体H9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27-28所示；
所述单克隆纳米抗体E12的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29-30所示。
优选地，编码所述单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12的基因序列如SEQ IDNO.31-35所示。
本发明还提供了上述单克隆纳米抗体在ELISA方法检测猴痘病毒中的应用。
优选的，在应用时采用双抗体夹心ELISA方法检测猴痘病毒，以所述单克隆纳米抗体H9作为(酶标板的)包被抗体，以生物素标记的单克隆纳米抗体B8作为生物素标记抗体进行检测。
本发明还提供了一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库，该文库用于筛选获得上述的单克隆纳米抗体，具体是通过提取经过猴痘病毒免疫后的天然羊驼PBMCs细胞的总RNA，采用反转录和PCR扩增的方法获得抗体可变区VHH的基因序列，将基因序列连接到噬菌体表达载体上，转化至感受态细胞中得到。
一种本发明提供的上述单克隆纳米抗体文库的构建方法，包括以下步骤：
S1、提取经过猴痘病毒免疫后的天然羊驼PBMCs细胞的总RNA，反转录得到cDNA；
S2、以步骤S1的cDNA为模板，PCR扩增获得抗体可变区VHH的基因序列，电泳回收300-500bp大小的目的片段；
S3、将步骤S2回收的目的片段和噬菌体表达载体用SfiI和NotI双酶切，在T4连接酶作用下将目的片段连接至噬菌体表达载体上，得到重组噬菌体表达载体；
S4、将步骤S3的噬菌体表达载体转入到感受态细胞中，培养过夜得到单克隆纳米抗体文库。
本发明还提供了上述单克隆纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛选识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体的应用，将构建成功的纳米抗体文库通过辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，以猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与猴痘病毒核心蛋白A29L特异性结合的阳性孔混合液，然后采用夹心ELISA法对所述阳性孔混合液进行检测，用猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原，选择抗原组OD600值大于0.5，且对照组OD600值小于0.15的克隆定为阳性克隆，去除错误抗体序列和重复抗体序列，得到高特异性识别猴痘病毒核心蛋白A29L的VHH纳米抗体。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种能够特异性识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，还提供了识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库。该纳米抗体对于猴痘病毒核心蛋白A29L具有非常高的亲和力、检测灵敏度、特异性和热稳定性；检测灵敏度达到9.375pg/mL，。
附图说明
图1为实施例1的羊驼PBMCs细胞的总RNA的(1％)琼脂糖凝胶电泳检测图；
图2为实施例1的获得的PCR扩增后的抗体可变区VHH DNA片段的(1％)琼脂糖凝胶电泳检测图；
图3为实施例3的培养基上清用ProteinA树脂进行纯化的结果；
图4为实施例5绘制的标准曲线；
图5、6分别为实施例6绘制的抗体样品和空白对照的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本专利的权利要求书和说明书的内容中，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。本专利中，术语“重链可变区”或“VH”是指抗体重链靠近N端的氨基酸序列和组成变化较大的区域。术语“CDR”或称“互补决定区”是指抗体特异性识别抗原的区域。抗体的重链可变区和轻链可变区中分别有三个互补决定区。
实施例1：识别猴痘病毒A29L的特异性驼源纳米抗体文库的构建，纳米抗体的体外富淘选和筛选
1、驼源VHH噬菌体纳米抗体文库的构建
(1)动物免疫：购买2岁龄的雄性羊驼一只，免疫猴痘病毒核心蛋白A29L(AntibodySystem公司，货号EVV13401)。将500μg猴痘病毒核心蛋白A29L与弗式不完全佐剂乳化后，对羊驼进行皮下多点注射。间隔2周免疫一次，每次免疫后7-10天对羊驼进行静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，五轮免疫后，取血50mL，采用的骆驼外周血单个核细胞分离液kit(天津灏洋公司，货号LDS1078)分离骆驼血液中的PBMCs细胞。将细胞加入1mltrizol溶液(Invitvogen，货号15596018)中裂解，使用Thermo公司的PureLinkTM RNA小提试剂盒(货号12183020)提取细胞的总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。
(2)选取天然羊驼PBMCs细胞的总RNA作为模板，使用的III 1st StrandcDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme公司，货号R312-02)反转录获得cDNA；
(3)以cDNA为模板，使用Max Super-Fidelity DNA Polymerase(Vazyme公司，货号：P505-d3)PCR扩增获得抗体可变区VHH的基因序列：取cDNA 2μl，10×PCR Buffer5μl，MgSO4(50mM)2μl，dNTP(10mmol/L)1μl，F引物(10μmol/L)1μl，扩增引物(10μmol/L)1μl，DNA聚合酶0.1μl，无菌纯水37.9μl至50μl，涡旋混匀，短暂离心后，进行PCR扩增反应。
反应条件为：94℃变性2min后；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，30个循环；68℃延伸5min。
扩增引物核苷酸序列为：
正向引物(如SEQ ID NO.41所示)：5’-gtcctggctgctcttctacaagg-3’；
反向引物(如SEQ ID NO.42所示)：5’-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3’。
1％琼脂糖凝胶电泳后回收300-500bp大小的目的片段，如图2所示。
(4)将回收后的目的片段和载体pCANTAB5E(Amersham biosciences公司，噬菌体展示系统)用SfiI和NotI双酶切后，在T4连接酶(NEB公司)的作用下，16℃过夜，使目的片段连接在载体pCANTAB5E上；
SfiI和NotI酶切的反应液体系如下表1所示：
表1SfiI和NotI酶切的反应液体系
连接反应体系如下表2所示：
表2连接反应体系
(5)将连接产物通过电转化转入TG1电转感受态细胞(Lucigen公司)中，铺在2YT-Amp-Glucose固体培养基(配方同下)上，37℃培养过夜。
所述2YT固体培养基的配方为：1.6％(W/V)Tryptone，1％(W/V)Yeast Extract，0.5％(W/V)NaCl，溶于1L蒸馏水中。
所述2YT-Amp-Glucose培养基的配方为：在2YT固体培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素和2％葡萄糖。
(6)刮取培养基上的菌落，混合均匀后，将菌液加入15％甘油水溶液，保存于-80℃；取菌液接种到2YT-Amp-Glucose培养基中，37℃培养1-2h，直至OD600＝0.4-0.6。
加入辅助噬菌体(市售)，37℃培养45min-1h；3000-5000rpm离心菌液，弃上清，用同等体积的2YT-Amp-Kan培养基，重悬菌体，30℃培养过夜；次日，离心将上清转入新的离心管中；加入1/4体积的5×PEG/NaCl溶液，充分混匀后，放置冰上或者4℃环境中，静置1-2h；然后离心弃上清，将沉淀用大约PBS重悬，最终获得单克隆纳米抗体文库，4℃或-20℃保存。
所述2YT-Amp-Kan培养基的配方为：在2YT培养基中加入100μg/ml的氨苄青霉素和50μg/ml的卡那霉素。
实施例2：单克隆纳米抗体的免疫管固相淘选
1、免疫管固相淘选
所用的实验试剂及原料如下表3所述。
表3实验试剂及材料
| 材料 | 货号 | 品牌(采购来源) |
| 96-well plate | 42592 | Costar |
| Tween 20 | P2287 | Sigma |
| Tris | RES3098T-B7 | Sigma |
| Glycine(甘氨酸) | G8200 | Solarbio |
| PEG | 181986 | Sigma |
| PBS | C10010500BT | Life |
| 酪蛋白 | S12003-100g | shyuanye |
| 脱脂牛奶 | 6342932 | BD |
具体步骤如下：
(1)包被免疫管：抗原蛋白猴痘蛋白A29L(50μg/ml in CBS缓冲液)，1ml每管，共两管，4℃过夜；对照管加入1ml PBS缓冲液；用5ml PBST缓冲液洗涤免疫管3次；
(2)封闭：5ml 5％脱脂牛奶/PBST，或者1％酪蛋白/PBST，30℃封闭1h；然后用5mlPBS缓冲液洗涤1次；
(3)孵育：每个免疫管中加入1ml，总量为1012(各管加入总量一致)的驼源单克隆纳米抗体文库(噬菌体文库)，30℃孵育2h；
(4)洗涤：5ml PBST洗涤5-8次；
(5)洗脱：每个免疫管中加入1ml的Gly-HCl(pH＝2.2)洗脱噬菌体文库，室温振荡孵育6-8min左右；然后加入Tris-HCl(pH＝9.6)中和溶液至pH＝7.0-8.0。
2、测定洗脱后噬菌体的滴度
(1)培养大肠杆菌TG1(购自Lucigen公司)直到OD600＝0.4-0.6；取10μL稀释的洗脱后噬菌体和190μL大肠杆菌TG1，混合。
(2)混合物在37℃孵育30min后，倒到2×YT-A(含Amp 100μg/ml)固体培养基上，37℃培养过夜，测试结果如表5所示。
3、洗脱后噬菌体的扩增
(1)直接吸取500-600μl洗脱后的噬菌体溶液，加入到10ml的对数期的大肠杆菌TG1菌液中，37℃静置30min，220rpm，37℃培养30min-1h。
(2)将菌液加入到30ml 2YT-Amp-Glucose培养基中，37℃，220rpm培养至OD600＝0.4-0.6左右。
(3)在菌液中加入辅助噬菌体，加入的量为0.6×液体体积×5×108×30pfu，37℃静置30min后，220rpm，培养45min-1h。
(4)3000-5000rpm离心菌液，弃上清，用同等体积的2YT-Amp-Kan培养基，重悬菌体；30℃，220rpm，培养过夜；次日，8000rpm，4℃，离心20min，将上清转入新的离心管中；加入1/4体积的5×PEG/NaCl溶液，充分混匀后，放置冰上或者4℃环境中，静置1-2h；然后8000rpm，4℃，离心30min，弃上清，将沉淀用大约1ml PBS重悬；最后8000rpm-10000rpm，4℃，离心10min，将上清转入到新的离心管中。
4、测试扩增后的噬菌体滴度
测试方法同第2步。将上述步骤1-3重复2轮，进行富集淘选，淘选方式过程如下表4所示，淘选结果(即滴度测试结果)如下表5所示。
表4富集淘选方式
| 轮数 | 包被抗原(μg/mL) | 封闭液 | 洗涤次数 |
| 1 | A29L(50) | 5％脱脂牛奶/PBST | 5 |
| 2 | A29L(50) | 5％酪蛋白/PBST | 6 |
| 3 | A29L(50) | 5％脱脂牛奶/PBST | 6 |
表5富集淘选结果
5、多克隆噬菌体ELISA检测
(1)包被免疫板：抗原蛋白A29L(4μg/ml in CBS缓冲液)，100μl，4℃过夜；对照孔包被100μl PBS缓冲液。300μl PBST缓冲液洗涤3次；
(2)封闭：300μl 5％脱脂牛奶/PBST 30℃封闭1h，300μl PBST缓冲液洗涤2-3次；
(3)孵育：用PBS缓冲液稀释每一轮扩增后的噬菌体，初始浓度为1012pfu/ml，稀释倍数以3倍递增；每孔中加入100μl稀释后的扩增噬菌体，30℃孵育1h；
(4)洗涤：300μl PBST缓冲液洗涤4-6次；
(5)二抗：加入100μl二抗稀释液(anti-M13-HRP，1:5000)，30度孵育1h；
(6)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次；
(7)显色：加入100μl显色液TMB避光显色3-8min，加入100μl 2M HCl终止反应，酶标仪读数(450nm-620nm)；
多克隆噬菌体ELISA检测结果如下表6所示。
表6多克隆噬菌体ELISA检测结果
6、单克隆噬菌体ELISA筛选
(1)选取合适的轮数(R3)，将其洗脱噬菌体稀释到合适的浓度，侵染对数期的大肠杆菌TG1，铺板；
(2)次日，从板上挑取192个单克隆噬菌体，接入2块96深孔板(每孔中加入600μl2YT-Amp-Glucose培养基)中，37℃，250rpm振荡培养2h，至菌液OD600＝0.4-0.6；
每孔吸取100μl菌液至细胞培养板中，每孔加入无菌甘油(终浓度为20％-25％)，混匀后于-20℃保存。
(3)在剩余的96深孔板(Nest公司)中加入辅助噬菌体(NEB公司)，加入的量＝0.6×液体体积×5×108×30pfu；37℃静置30min，250rpm，37℃振荡培养45min-1h。
(4)将96深孔板，4000rpm离心5min，弃上清；每孔用600μl 2YT-Amp-Kan培养基重悬菌液，30℃，250rpm，振荡培养过夜。
(5)次日，将96深孔板4000rpm离心10-15min，取上清进行ELISA实验；
(6)包被免疫板：取100μl抗原蛋白A29L(4μg/ml in CBS)，4℃过夜；对照孔包被100μl PBS；用300μl PBST洗涤3次。
(7)封闭：取300μl 5％脱脂牛奶/PBST，30℃封闭1h；用300μl PBST洗涤2-3次
(8)孵育：每孔中加入100μl上清噬菌体。30℃孵育1h。
(9)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次。
(10)二抗：加入100μl二抗稀释液(anti-M13-HRP，1:5000)，30℃孵育1h
(11)洗涤：300μl PBST洗涤4-6次。
(12)显色：加入100μl显色液TMB避光显色3-8min，加入100μl 2M HCl终止反应.酶标仪读数(450nm-620nm)
单克隆噬菌体ELISA检测结果如下表7-10。表7为第三轮1-48号单克隆(R3P1)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果，表8为第三轮49-96号单克隆(R3P1)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果；表9为第三轮97-144号单克隆(R3P2)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果，表10为第三轮145-192号单克隆(R3P2)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果；
表7 1-48号单克隆(R3P1)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果
表8 49-96号单克隆(R3P1)的D600(抗原组)及OD600(对照组)结果
表9 97-144号单克隆(R3P2)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果
表10 145-192号单克隆(R3P2)的OD600(抗原组)及OD600(对照组)结果
将上述表7-10中，OD600(抗原组)大于0.5且OD600(对照组)小于0.15的克隆定为阳性克隆，将阳性克隆进行测序。排除掉错误抗体序列和重复抗体序列，最终得到了5条高亲和力的单克隆纳米抗体，即高特异性VHH纳米抗体，分别命名为为单克隆纳米抗体(MPVX-VHH-R3P2-)A6、B8、G9、H9或E12。
经过测序，单克隆纳米抗体的A6、B8、G9、H9、E12的氨基酸序列如SEQ ID NO.36-40所示。
所述单克隆纳米抗体A6的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.1-3所示；恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21-22所示；
所述单克隆纳米抗体B8的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.4-6所示；恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-24所示；
所述单克隆纳米抗体G9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.7-9所示；恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25-26所示；
所述单克隆纳米抗体H9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.10-12所示；恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27-28所示；
所述单克隆纳米抗体E12的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13-15所示；恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29-30所示。
实施例3：单克隆纳米抗体的A6、B8、G9、H9、E12的重组表达
将筛选得到的5条纳米抗体的基因序列(SEQ ID NO.31-35所示)亚克隆至PATX2载体(ATAGENIX公司)中，酶切位点EcoR1/Not1，C端添加人源IgG1Fc。转染Xten CHO细胞，转染72h后，离心去除细胞，将培养基上清用ProteinA树脂(12％ Non-reduced SDS-PAGE)进行纯化，如图3所示。
实施例4：单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9、E12的筛选和鉴定
利用双抗夹心ELISA实验方法，将实施例2中筛选出的5条单克隆纳米抗体的A6、B8、G9、H9、E12作为包被抗体，分别标记为包被R3P2-A6、包被R3P2-B8、包被R3P2-G9、包被R3P2-H9和包被R3P2-E12；并且分别按照常规方法将单克隆纳米抗体的A6、B8、G9、H9、E12进行生物素标记制成生物素标记抗体，分别标记为生物素标记R3P2-A6、生物素标记R3P2-B8、生物素标记R3P2-G9、生物素标记R3P2-H9和生物素标记R3P2-E12。
本实施例中，使用包被抗体包被酶标板的具体方法为：
(1)使用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6，0.05M)将包被抗体包被在酶标板上，包被浓度2μg/mL，100μL/孔，4℃孵育过夜；洗涤液洗板；
(2)用含有3％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2，0.05M)进行封闭，得到用5种包被抗体包被的酶标板。
本实施例中，对单克隆纳米抗体进行生物素标记的具体方法为：
(1)生物素使用N,N-二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg/mL，得到生物素溶液；
将单克隆纳米抗体溶解于磷酸盐缓冲液中，并用碳酸盐缓冲液调至pH＝8.5，终浓度1-10mg/ml，得到抗体溶液；所用的碳酸盐缓冲液(CBS缓冲液)的pH＝9.0。
(2)按每mg抗体溶液加5μL生物素溶液的比例，将生物素溶液和单克隆纳米抗体溶液于室温避光搅拌2h.
(3)收集反应物使用PBS缓冲液透析过夜，中途更换PBS缓冲液3-4次；
(4)收集透析完毕的产物，即得到生物素标记抗体。
交叉组合测试全部5条单克隆纳米抗体，挑选出夹心信号最佳的1组组合(表11中的字体加粗和加下划线数据)。最终选取R3P2-H9为最佳包被抗体，R3P2-B8为最佳生物素标记抗体。
表11 5株单克隆纳米抗体的Elisa鉴定结果(OD450和OD620的差值)
实施例5：实施例4的最佳包被抗体和最佳生物素标记抗体的灵敏度测试
利用实施例4获得的最佳包被抗体(R3P2-H9)和最佳生物素标记抗体(R3P2-B8)，进行双抗夹心法酶联免疫检测方法的条件研究。通过正交试验方法，综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值，选择包被抗体R3P2-H9的包被浓度为2μg/mL，生物素标记抗体R3P2-B8的检测浓度为0.05μg/mL。
1、使用碳酸盐缓冲液(pH＝9.6，0.05M)将包被抗体R3P2-H9进行包被，包被浓度2μg/mL，100μl/孔，4℃孵育过夜；洗涤液洗板；用含有3％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH＝7.2，0.05M)进行封闭。
标准品工作液：将标准品依次进行倍比稀释操作得到共计7个标准点600pg/mL、300pg/mL、150pg/mL、75pg/mL、37.5pg/mL、18.75pg/mL、9.375pg/mL，最后再以100μL磷酸盐缓冲液为零标准(即不含标准品)，加入到酶标板中，共计8个标准点，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板。
2、将用磷酸盐缓冲液(含0.1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20)稀释的经生物素标记抗体R3P2-B8(稀释后终浓度0.05μg/mL，100μl/孔)加入到酶标板中，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板。
3、加入用磷酸盐缓冲液(含0.1％牛血清白蛋白、0.05％Tween-20)稀释的亲和素标记的辣根过氧化物酶(jackson immunoresearch，货号016-030-084)溶液(辣根过氧化物酶的终浓度0.1μg/mL)，常温条件孵育1h，然后用洗涤液洗板。
4、加入TMB显色液，常温显色10min；加50μL 2M盐酸终止显色，然后分别于波长450nm和620nm下测定吸光值，OD450减去OD620为校正后的吸光值。以A29L蛋白浓度为横坐标，吸光值的校正值(OD450-OD620)为纵坐标作图，标准曲线见图4所示，标准曲线方程为y＝0.0042x+0.163，R2＝0.9974。
以吸光值平均值大于三倍空白对照吸光值平均值的最低A29L蛋白浓度为双抗夹心法酶联免疫检测方法的灵敏度。实验结果显示，基于抗A29L蛋白VHH第一抗体和第二抗体所建立的双抗夹心法酶联免疫检测方法，检测灵敏度达到9.375pg/mL。
实施例6：实施例4的最佳包被抗体和最佳生物素标记抗体的热稳定性测试
将实施例4的最佳包被抗体R3P2-H9和最佳生物素标记抗体R3P2-B8放置于37℃保温箱中，并于第14天取样。通过双抗夹心法酶联免疫检测方法，对A29L标准品蛋白进行检测。以未经处理的包被抗体R3P2-H9和生物素标记抗体R3P2-B8(即未进行保温放置14d处理，而是始终在-20℃环境中保存)，作为空白对照。对37℃处理14天的抗体样品和空白对照，分别建立的标准曲线。
如图5、6所示，本发明提供的抗A29L第一抗体和第二抗体，在37℃处理14天后，抗体观察无明显沉淀或变质，浓度无明显下降，双抗夹心法酶联免疫检测信号无明显下降，结果显示信号降低小于5％。这说明本发明提供的抗A29L第一抗体和第二抗体热稳定性强。
以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，为单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12；所述单克隆纳米抗体A6的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；
所述单克隆纳米抗体B8的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.4-6所示；
所述单克隆纳米抗体G9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.7-9所示；
所述单克隆纳米抗体H9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.10-12所示；
所述单克隆纳米抗体E12的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNO.13-15所示。
2.根据权利要求1所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，所述单克隆纳米抗体A6的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述单克隆纳米抗体B8的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
所述单克隆纳米抗体G9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述单克隆纳米抗体H9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
所述单克隆纳米抗体E12的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
3.根据权利要求2所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，所述单克隆纳米抗体A6的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21-22所示；
所述单克隆纳米抗体B8的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23-24所示；
所述单克隆纳米抗体G9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25-26所示；
所述单克隆纳米抗体H9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27-28所示；
所述单克隆纳米抗体E12的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29-30所示。
4.根据权利要求1所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，编码所述单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12的基因序列分别如SEQ ID NO.31-35所示。
5.权利要求1-4任一项所述的单克隆纳米抗体在ELISA方法检测猴痘病毒中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用双抗体夹心ELISA方法，以所述单克隆纳米抗体H9作为包被抗体，以生物素标记的单克隆纳米抗体B8作为生物素标记抗体进行检测。
7.一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库，其特征在于，用于筛选获得权利要求1-4任一项所述的单克隆纳米抗体；是通过提取经猴痘病毒免疫后的天然羊驼PBMCs细胞的总RNA，采用反转录和PCR扩增的方法获得抗体可变区VHH的基因序列，将基因序列连接到噬菌体表达载体上，转化至感受态细胞中得到。
8.一种权利要求7所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取经过猴痘病毒免疫的天然羊驼PBMCs细胞总RNA，反转录得到cDNA；
S2、以步骤S1的cDNA为模板，PCR扩增获得抗体可变区VHH的基因序列，电泳回收300-500bp大小的目的片段；
S3、将步骤S2的目的片段和噬菌体表达载体用SfiI和NotI双酶切，在T4连接酶作用下将目的片段连接至噬菌体表达载体上，得到重组噬菌体表达载体；
S4、将步骤S3的噬菌体表达载体转入到感受态细胞中，培养过夜得到单克隆纳米抗体文库。
9.权利要求7所述的单克隆纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛选获得猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体的应用，其特征在于，将构建成功的纳米抗体文库通过辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，以猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原通过吸附-洗脱的方法进行淘选，筛选出与猴痘病毒核心蛋白A29L特异性结合的阳性孔混合液；然后采用夹心ELISA法对所述阳性孔混合液进行检测，用猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原，选择抗原组OD600值大于0.5，且对照组OD600值小于0.15的克隆定为阳性克隆，去除错误抗体序列和重复抗体序列，得到高特异性识别猴痘病毒核心蛋白A29L的VHH纳米抗体。
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