CN109206520A - 用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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CN109206520A CN201710549795.5A CN201710549795A CN109206520A CN 109206520 A CN109206520 A CN 109206520A CN 201710549795 A CN201710549795 A CN 201710549795A CN 109206520 A CN109206520 A CN 109206520A
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体公开了一种用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用。所述融合蛋白由TALE、核酸酶N和2‑5个串联的ERT2融合而成，所述TALE连接在ERT2的C端，所述核酸酶N连接在TALE的C端，即(ERT2)n‑TALEN。本发明利用2‑5个串联的ERT2和TALEN的融合开发并优化了一系列药物诱导系统。通过将带有不同功能结构域的TALEN与2‑5个串联的ERT2相融合，实现了严格有效的药物诱导的基因组编辑，可为潜在的目的基因组位点的基因功能的动态调控提供简单而多样化的技术基础。

Description

用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种药物诱导型基因组编辑系统。
背景技术
从靶向基因组编辑到转录调控，TALE蛋白已被广泛应用于不同领域。Tal蛋白包括一系列的重复区域，每个重复区域包含33-34个氨基酸。中间重复可变的双氨基酸序列区域(repeat variable diresidues，RVDs)决定了最先结合的碱基。简单的一对一的“Tal密码”连接在一起决定了Tal阵列与DNA结合的特异性，因此当TAL与基因或表观调控相关的效应因子融合时，可以靶向到特定基因位点发挥作用。
当TAL与核酸酶如Fork1连接时，TALENs可以产生双链断裂缺口，进而通过易错非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)或精确地同源修复(homologydirected repair，HDR)实现对基因的编辑。当TALE与转录激活结构域(activator domain，AD)如VP64融合时，靶向启动子序列的Tal阵列可以介导特异性地基因转录激活。许多生物过程是受到高度动态的分子反应来调控的。因此，为了更精确的理解这些过程，条件的和可诱导的调控系统显得尤为必要。现阶段一种广泛应用的药物诱导技术是通过配体结合激发雌激素受体蛋白(ER)从细胞质到细胞核的转运过程(Metzger，D.，Clifford，J.，Chiba，H.&Chambon，P.Conditional site-specific recombination in mammalian cells using aligand-dependent chimeric Cre recombinase.Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America92，6991-6995，1995)。在没有激素配体的情况下，ER与热激蛋白(hsp90)结合定位于细胞质中。一旦配体与ER结合，ER与hsp90解离，并转运到细胞核中。
ERT2是一种带有三个氨基酸突变G400V/M543A/L544A的人为突变体，与ER相比，其对合成的雌激拮抗剂(4-OHT)更为敏感，并且不会与内源的ER配体β-雌二醇结合，这一特性对降低背景活性是至关重要的(Feil，R.，Wagner，J.，Metzger，D.&Chambon，P.Regulationof Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-bindingdomains.Biochemical and biophysical research communications237，752-757，1997)。ERT2与Cre重组酶的融合已经被广泛应用到条件性和可诱导的基因组工程中，这一应用有利于研究者从时空顺序上更精确地解析分子功能。
不仅如此，CN103772506A公开了一种“转录激活子样效应因子(TALE)-功能基团-雌激素受体(ER)”功能蛋白及其应用，所述“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白由转录激活子样效应因子、雌激素受体和功能基团依次连接而成，或者由转录激活子样效应因子、功能基团和雌激素受体依次连接而成。所述功能基团选自转录激活因子(Activation Domain，AD)、核酸酶、甲基化酶、去甲基化酶、重组酶中的一种或两种以上的组合。实际应用的时候，通过在细胞质中引入他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OH-tamoxifen，4-OHT)来控制上述功能蛋白在特定时间进入细胞核。然而，上述技术方案经实验验证，由于其功能蛋白中只含有一个ER元件，导致其存在背景活性高的问题。且由于TALE、功能基团和ER三者间的连接关系，使得所述功能蛋白在实现药物诱导的基因组编辑方面的效果并不理想。
进一步地，有研究发现，将Cre与两个ERT2融合可以有效地降低背景活性(Matsuda，T.&Cepko，C.L.Controlled expression of transgenes introduced by in vivoelectroporation.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America104，1027-1032，2007)。然而，若采用该技术方案中两个ERT2的连接形式对CN103772506A的所述方案进行改进，仍然无法保证实现高效的药物诱导的基因组编辑和低背景活性目的，并且ERT2与TALE或功能蛋白的不正确的连接方式可能导致功能蛋白活性丧失。
因此，亟需研发一种可以实现高效而严格控制的药物诱导型基因组编辑系统，以满足上述需求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种新的用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明首先提供了用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白，所述融合蛋白包括TALE、核酸酶N和2-5个串联的ERT2。
本发明研究发现，当将2-5个ERT2进行串联后，与TALEN连接，能更好地实现药物调控下的基因组编辑，即当体系中引入他莫昔芬(tamoxifen，TAM)或者4-羟基-他莫昔芬(4-OHT)时，基因组编辑事件的发生效率显著增高。
作为优选，所述融合蛋白由TALE、核酸酶N和2-5个串联的ERT2融合而成。更为优选，所述TALE连接在串联的ERT2的C端，所述核酸酶N连接在TALE的C端，即(ERT2)n-TALEN，n＝2-5。本发明研究发现，将2-5个串联的ERT2结构域连接在TALEN的N端可实现更严格的调控。
在本发明的具体实施方式中，通过实验验证了使用2个串联的ERT2融合TALE和核酸酶N(即2ERT2-TALEN)的效果。对于本领域技术人员来说，在该实验结论的基础上，可以根据本领域常规技术知识毫无疑义的推知，当将2个串联的ERT2替换为3-5个串联的ERT2也可具有相同/相似的技术效果。
进一步地，各元件之间通过3～20个氨基酸的linker相连，linker通常为构象自由的序列，例如连续的Gly-Ser。
应当理解的是，所述融合蛋白由于linker的自由性，其编码基因并不局限于特定的核苷酸序列。
进一步地，所述TALE为针对靶序列的特异TALE蛋白，核酸酶N为FokI核酸内切酶，二者组合得到类转录激活因子效应物核酸酶。应用中，为提高基因组编辑效率，通常使用成对的TALEN(TALE蛋白分别靶向基因组编辑位点两侧正义链和反义链)以使核酸内切酶FokI形成二聚体。
需要说明的是，对靶序列的选择与对TALE的设计可依据本领域常规技术手段进行，本发明对此不作限定。
进一步地，所述ERT2为带有三个氨基酸突变G400V/M543A/L544A的雌激素受体(Feil，R.，Wagner，J.，Metzger，D.&Chambon，P.Regulation of Cre recombinaseactivity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains.Biochemical andbiophysical research communications237，752-757，1997)。其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
应当理解的是，由上述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID NO.1所示蛋白质具有相同功能(实现药物诱导)的蛋白质也属于本发明的保护范围。
第二方面，本发明提供了前述融合蛋白在药物诱导型基因组编辑中的应用。利用分别靶向基因组编辑位点两侧正义链和反义链的融合蛋白，实现药物诱导型的基因组编辑。在细胞质内表达所述融合蛋白，在特定需要时间，在动物体内或细胞生长环境中引入他莫昔芬(tamoxifen，TAM)和/或4-羟基-他莫昔芬(4-OHT)和/或上述两者的衍生物，则细胞质内的融合蛋白将进入细胞核，TALE将识别目标DNA并与其结合，核酸酶将发挥基因组编辑作用。
第三方面，为了更好的发挥所述融合蛋白的功能，本发明还提供了所述融合蛋白的编码基因。
应当理解的是，所述融合蛋白由于linker的自由性，其编码基因并不局限于特定的核苷酸序列。
进一步地，含有所述编码基因的载体也属于本发明的保护范围。
所述载体可以是DNA载体、RNA载体、蛋白质载体、慢病毒载体、腺病毒载体或普通质粒载体等。
在本发明的实验研究中，使用慢病毒pRRL.sin-18.ppy作为载体。
在前述研究基础上，本发明提供了所述系统在药物诱导型基因组编辑中的应用。所述应用可体现在多种方面，只要使用本发明所述的系统进行药物诱导型基因组编辑，均属于本发明的保护范围。
第四方面，基于对前述融合蛋白及其编码基因的功能研究，本发明提供了一种利用药物诱导进行基因组编辑的方法，将分别含有靶向基因组编辑位点两侧正义链和反义链的融合蛋白的编码基因的成对质粒转染至细胞或组织，表达融合蛋白，在特定需要时间，利用4-OHT和/或TAM处理，诱导融合蛋白进入细胞核，发挥基因组编辑作用。
优选地，在转染至人胚肾细胞系(如人胚肾细胞系293T)时，成对质粒中每种质粒的转染量均为100ng～400ng/2×105个细胞，优选均为200ng/2×105个细胞。
当成对质粒中一种质粒的转染量为400ng～600ng/2×105个细胞时，另一种质粒的转染量需小于100ng/2×105个细胞。
研究过程中发现，在没有经过4-OHT的处理的情况下，2ERT2-TALEN在较大量转染时(如400ng～600ng/2×105个细胞)表现出较高的背景活性。但这种背景可以在不影响药物诱导效果的情况通过降低TALEN质粒的转染量来消除。同时，这一效果也可以通过降低成对的2ERT2-TALEN中的其中一个的转染量来实现。
需要说明的是，当转染细胞不同时，质粒的转染量需根据实际情况进行调整。针对其他细胞时的转染量并不局限为上述转染量所涉及的范围。
进一步地，当所述基因组编辑方法用于对特定基因位点进行同源重组时，在转染质粒的同时还需转染供体质粒，使处于供体质粒上、下游同源臂之间的外源DNA序列以同源重组的方式整合至基因组中的特定位点，实现外源基因的打靶。
本发明涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明利用2-5个串联的ERT2和TALEN的融合开发并优化了一系列药物诱导系统。通过将带有不同功能结构域的TALEN与2-5个串联的ERT2相融合，实现了严格有效的药物诱导的基因组编辑，可为潜在的目的基因组位点的基因功能的动态调控提供简单而多样化的技术基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中的载体示意图。
图2为本发明实施例2中的TLR报告体系检测基因组编辑效率图。
图3为本发明实施例3中的基因组编辑效率检测图。
图4为本发明对比例1中的基因组编辑效率检测图。
图5为本发明对比例2中的基因组编辑效率检测图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 HIT TALEN系统的构建
本实施例用于说明本发明所述的用于基因组编辑的药物诱导型系统的构建。
构建方法：
1)ERT2元件从质粒pAd-CreER(由芝加哥大学T.C.He实验室馈赠)扩增得到。
2)分别在一对靶向人AAVS1位点的两个TALENs质粒的N端(TALEN质粒来自FengZhang实验室，Addgene plasmids#35431和#35432)融合两个串联的ERT2，得到2ERT2-TALEN(图1)。
将这种2ERT2-TALEN的设计命名为可诱导的TALEN技术(hybrid drug inducibleTALEN technology，HIT TALEN)。
实施例2 HIT TALEN系统的应用一
本实施例用于说明实施例1所述HIT TALEN系统的应用。
1、实验材料
含有TLR报告系统的多克隆细胞系TALEN-TLR-293T(通过慢病毒感染293T细胞后，用2μg/mL的嘌呤霉素筛选五天后获得)，转染试剂Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)，4-OHT(Sigma)。
2、实验方法
TALEN-TLR-293T细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)，2mM GlutaMAX(ThermoFisher)，100U/mL penicillin和100μg/mL streptomycin)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。瞬时转染采用的是Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)，按照生产商所提供的步骤操作，每次实验每孔所转染的DNA总量保持一致。将200ng的每种2ERT2-TALEN质粒共转或与400ng的供体质粒(Addgene plasmid#31475)共同转染TLR细胞系，转染24h后，分别添加200nM的4-OHT和等量的溶剂到实验组和对照组的培养基。细胞经过药物处理48h后通过流式细胞分析和高内涵分析检测GFP阳性细胞的百分比和mCherry阳性细胞的百分比。
3、实验结果
如图2所示，高内涵成像分析结果(图2a)和流式细胞分析结果(图2b)均表明，基因组编辑事件(NHEJ和HDR)仅在用4-OHT处理细胞中可被检测到，而无药物处理组和空白细胞对照组均未发现发生基因组编辑后的阳性细胞，证明HIT TALEN系统可以实现严格调控的药物诱导的基因组编辑。
实施例3 HIT TALEN系统的应用二
本实施例用于说明实施例1所述HIT TALEN系统的应用。
1、实验材料
人胚肾细胞系293T，转染试剂Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)，4-OHT(Sigma)。
2、实验方法
人胚肾细胞系293T培养在含有10％胎牛血清(FBS)，2mM GlutaMAX(ThermoFisher)，100U/mL penicillin和100μg/mL streptomycin)的DMEM(的，培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。瞬时转染采用的是Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)，按照生产商所提供的步骤操作，每次实验每孔所转染的DNA总量保持一致。
将200ng的每种2ERT2-TALEN质粒共转293T细胞，转染24h后，分别添加200nM的4-OHT和等量的溶剂到实验组和对照组的培养基中。细胞经过药物处理48h后，提取各组细胞基因组DNA，通过Surveyor实验分析基因组编辑事件发生的频率。
将200ng的每种2ERT2-TALEN质粒与400ng的供体质粒(在同源臂中间含有Puromycin抗性基因和GFP基因)共转293T细胞，转染24h后，细胞以200个/皿的密度传代到10cm的细胞培养皿中。实验组的培养基中加入4-OHT，对照组的细胞培养基中加入等量的溶剂，培养7天后，在细胞培养基中加入2μg/mL嘌呤霉素继续培养2周。在加入嘌呤霉素前后分别统计形成的GFP阳性克隆和总克隆数。提取嘌呤霉素筛选后存活的单克隆细胞的基因组DNA，以基因组DNA为模板，用特异的引物扩增GFP和Puro的片段，PCR产物通过电泳和sanger测序检测。
3、实验结果
图3a所示为Surveyor实验结果，研究表明，当两个2ERT2-TALEN质粒转染量低于100ng时，不能检测到基因组编辑事件，随着质粒转染浓度的增加，基因组编辑效率逐渐增加，当质粒转染量增加到200ng时，可实现较高效率的基因组编辑，同时保持“零”背景活性。证明HIT TALEN技术可以实现高效零背景的药物诱导的基因组编辑。
图3b所示为评估由HDR介导的2ERT2-TALENs诱导的基因组的精确编辑。结果表明，在人AAVS1位点实现正确打靶的阳性克隆只在经过药物诱导的细胞中出现，而无药处理组合只转染了供体质粒的对照组均没有检测到阳性克隆，证明HIT TALEN系统可以实现严格控制的药物诱导的基因打靶。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于，将两个串联的ERT2替换为单个的ERT2。
替换后，按照实施例3的实验方法进行相同surveyor实验进行比较。
经试验对比后发现：
(1)当TALEN对的转染量提高到500ng时，融合一个或2个ERT2的TALEN均可以实现基因组编辑。
(2)4-OHT处理不能提高融合一个ERT2的TALEN的基因组编辑效率，加药与否产生的基因组编辑效率没有显著差异。
(3)4-OHT处理可以显著提高融合2个ERT2的TALEN的基因组编辑效率，且效率高于只融合一个ERT2的TALEN(图4)。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于，将转染量替换为降低单一2ERT2-TALEN，同时保持另一个2ERT2-TALEN的转染量为500ng。
结果表明，当降低单一2ERT2-TALEN的量至100ng以下，同时保持另一个2ERT2-TALEN仍为500ng时，可以消除背景活性，即不加药组不再出现基因组编辑产生的条带(图5a，5c)，当2个2ERT2-TALEN的转染量均为500ng时，无4-OHT处理组仍可检测到较高的背景活性(图5b，5c)，降低另一个2ERT2-TALEN的转染量至100ng以下时也观察到了同样的结果，说明转染量的提高会显著增加不加药时的背景活性，而这种背景是可以通过优化转染条件而去除的，证明HIT TALEN技术可以有效的实现药物诱导的基因组编辑，同时保持“零”背景(图5)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用
<130> KHP171111921.4TQ
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 313
<212> PRT
<213> ERT2
<400> 1
Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp Pro Ser Pro Leu Met Ile
1 5 10 15
Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln
20 25 30
Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu
35 40 45
Tyr Asp Pro Thr Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu
50 55 60
Thr Asn Leu Ala Asp Arg Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys
65 70 75 80
Arg Val Pro Gly Phe Val Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu
85 90 95
Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg
100 105 110
Ser Met Glu His Pro Val Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu
115 120 125
Asp Arg Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp
130 135 140
Met Leu Leu Ala Thr Ser Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly
145 150 155 160
Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val
165 170 175
Tyr Thr Phe Leu Ser Ser Thr Leu Lys Ser Leu Glu Glu Lys Asp His
180 185 190
Ile His Arg Val Leu Asp Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met
195 200 205
Ala Lys Ala Gly Leu Thr Leu Gln Gln Gln His Gln Arg Leu Ala Gln
210 215 220
Leu Leu Leu Ile Leu Ser His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met
225 230 235 240
Glu His Leu Tyr Ser Met Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp
245 250 255
Leu Leu Leu Glu Ala Ala Asp Ala His Arg Leu His Ala Pro Thr Ser
260 265 270
Arg Gly Gly Ala Ser Val Glu Glu Thr Asp Gln Ser His Leu Ala Thr
275 280 285
Ala Gly Ser Thr Ser Ser His Ser Leu Gln Lys Tyr Tyr Ile Thr Gly
290 295 300
Glu Ala Glu Gly Phe Pro Ala Thr Ala
305 310

Claims (10)

1.用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括TALE、核酸酶N和2-5个串联的ERT2。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由TALE、核酸酶N和2-5个串联的ERT2融合而成。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述TALE连接在串联的ERT2的C端，所述核酸酶N连接在TALE的C端。
4.权利要求1～3任一项所述的融合蛋白在药物诱导型基因组编辑中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，利用分别靶向基因组编辑位点两侧正义链和反义链的融合蛋白，实现药物诱导型的基因组编辑。
6.权利要求1～3任一项所述融合蛋白的编码基因。
7.含有权利要求6所述编码基因的载体。
8.一种利用药物诱导进行基因组编辑的方法，其特征在于，将分别含有靶向基因组编辑位点两侧正义链和反义链的融合蛋白的编码基因的成对质粒转染至细胞或组织，表达融合蛋白，在特定需要时间，利用4-OHT和/或TAM和/或它们的衍生物处理，诱导融合蛋白进入细胞核，发挥基因组编辑作用。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在转染至人胚肾细胞系时，成对质粒中每种质粒的转染量为100ng～400ng/2×105个细胞，优选200ng/2×105个细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在转染至人胚肾细胞系时,成对质粒中一种质粒的转染量为400ng～600ng/2×105个细胞时，另一种质粒的转染量需小于100ng/2×105个细胞。
CN201710549795.5A 2017-07-07 2017-07-07 用于基因组编辑的药物诱导型融合蛋白及其编码基因与应用 Pending CN109206520A (zh)

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