TW202334399A - 表現ｉｌ－１０之多供體ｃｄ４＋ｔ細胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供藉由對來自至少兩個不同T細胞供體之CD4 +T細胞進行基因修飾而產生的多供體CD4 IL - 10細胞群。另外提供產生多供體CD4 IL - 10細胞的方法及使用多供體CD4 IL - 10細胞達成免疫耐受、治療GvHD、細胞及器官移植、癌症、自體免疫及發炎疾病及其他免疫病症的方法。

Description

表現IL-10之多供體CD4+T細胞及其用途
本發明係關於CD4 +T細胞及其用途，且特定言之，係關於表現IL-10之多供體CD4 +T細胞及其用途。
調控T細胞屬於小但重要的T細胞亞群，其維持針對自身及非病原性抗原的免疫耐受性且維持免疫穩態。調控T細胞存在兩種主要群體 - CD4 +、FOXP3 +CD25 +T細胞(FOXP3 +細胞)及1型調控T (Tr1)細胞。在器官及胰島移植、移植物抗宿主疾病(GvHD)及各種自體免疫及發炎疾病的各種臨床前模型中，FOXP3 +與Tr1細胞均下調病原性T細胞反應。
Tr1細胞在臨床研究中已顯示為有效的。經選殖之抗原特異性自體Tr1細胞投與正患有中度至重度克羅恩氏病(Crohn's disease)之患者引起客觀、暫時的緩解(Desreumaux等人, Gastroenterology .2012;143(5):1207-1217.e2.)。另外，同種異體造血幹細胞移植(同種異體HSCT)之後，富含Tr1細胞之供體源同種異體特異性CD4 +T細胞群授受性轉移至白血病患者引起免疫系統快速重建且防止微生物及病毒感染，而不出現重度GvHD。在有反應的患者中，達成長期緩解及耐受性(＞7年)，從而治癒(Bacchetta等人, Front Immunol. 2014; 5:16)。
儘管此等結果令人鼓舞，但生產大規模療法用的供體源或自體Tr1細胞用於未滿足之醫療需求高的患者並非總是可行的，極其繁瑣且亦無法產生大量的純Tr1細胞。
最近，Locafaro及同事藉由用含有人類IL-10基因的雙向慢病毒載體轉導來自單供體之純化CD4 +T細胞而規避了一些此等問題。所得單供體CD4 IL - 10群體共享天然存在之Tr1細胞的主要功能。如同Tr1細胞，單供體CD4 IL - 10細胞產生高含量的IL-10且使同種異體CD4 +T細胞與同種異體CD8 +T細胞的增殖均下調。另外，其對正常骨髓細胞(包括抗原呈遞細胞APC)與骨髓性白血病細胞均具有細胞毒性。在人源化異種GvHD模型中，此等單供體CD4 IL - 10細胞顯示可有效減少人源化異種GvHD模型的GvHD，同時保留移植物抗白血病(GvL)活性。參見Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269及WO 2016/146,542。
儘管可生產高度純化的單供體CD4 IL - 10細胞用於治療用途，但另存在顯著的侷限性，因為不同個別批次之間存在定性及定量的差異，除白血球層品質不同之外，此很可能與不同供體之間的內在差異相關。
本發明提供使用多供體CD4 IL - 10細胞群的基於Tr1之新穎療法。多供體CD4 IL - 10細胞係指CD4 +T細胞，其獲自至少兩個不同T細胞供體且接著經基因修飾以包含編碼IL-10的外源聚核苷酸。T細胞供體為第三方供體，其既不為將用多供體CD4 IL - 10細胞治療的宿主，亦不為HSC或器官移植供體。多供體CD4 IL - 10細胞不具有同種異體抗原特異性，亦即，其在投與之前尚未用宿主細胞預致敏或刺激。
本申請人證明，多供體CD4 IL - 10細胞的細胞介素產生概況、免疫抑制能力及細胞毒性能力類似於單供體CD4 IL - 10細胞。另外，其在活體內比單供體CD4 IL - 10細胞更有效地預防CD4 +T細胞介導的異種GvHD，但其本身不誘導GvHD。總體而言，此等多供體CD4 IL - 10細胞在活體外與活體內的功能特性類似於或優於單供體CD4 IL - 10細胞。
基於此等結果，本申請人主張：多供體同種異體CD4 IL - 10細胞可用於GvHD、細胞及器官移植、自體免疫疾病及發炎疾病治療目的。
另外，藉由使用第三方T細胞及消除同種異體特異性的要求，多供體CD4 IL - 10細胞使得基於Tr1的細胞療法可供遺傳背景不同的較大患者群體使用。
相應地，在第一態樣中，本發明提供CD4 +T細胞群，其已經基因修飾以包含編碼IL-10的外源聚核苷酸，其中CD4 +T細胞係獲自至少兩個不同T細胞供體(多供體CD4 IL - 10細胞)。
在一些實施例中，CD4 +T細胞係獲自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。在一些實施例中，群體中的CD4 +T細胞總共具有六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種不同HLA單倍型。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞具有A*02或A*24對偶基因。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此不匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此不匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此不匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此不匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此不匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此間不匹配。
在一些實施例中，CD4 +T細胞皆未永生化。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼IL-10之聚核苷酸區段，該區段可操作地連接至表現控制元件。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10。在一些實施例中，IL-10為病毒IL-10。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10變異體，該人類IL-10之序列具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸修飾。在一些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸修飾係在相應胺基酸位置經病毒IL-10之胺基酸取代。在一些實施例中，人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 8或9之序列。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，表現控制元件驅動所編碼之IL-10的組成性表現。在一些實施例中，表現控制元件驅動活化的CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，表現控制元件驅動組織特異性或CD4 +T細胞特異性表現。
在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物的序列。在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸具有SEQ ID NO: 5之序列。
在一些實施例中，選擇標記物為截斷的EGFR多肽。在一些實施例中，選擇標記物為截斷的人類EGFR多肽。
在一些實施例中，外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含慢病毒載體序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。
在一些實施例中，群體內的至少70% CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，群體內的至少90% CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，群體內的至少95%、98%或99% CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，IL-10的表現量與選擇標記物的表現量線性相關。在此情況下，IL-10表現量可根據選擇標記物之表現量測定。
在一些實施例中，以10 6個CD4 +T細胞/mL培養基計，經基因修飾的CD4 +T細胞組成性表現至少100 pg IL-10。在一些實施例中，以10 6個CD4 +T細胞/mL計，經基因修飾的CD4 +T細胞組成性表現至少200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL計，經基因修飾的CD4 +T細胞表現至少1或2 ng IL-10。在一些實施例中，用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL計，經基因修飾的CD4 +T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。在一些實施例中，經基因修飾之CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少5倍之量表現IL-10。在一些實施例中，經基因修飾之CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少10倍之量表現IL-10。
在一些實施例中，群體內的至少70% CD4 +T細胞表現來自外源聚核苷酸的選擇標記物。在一些實施例中，群體內的至少90% CD4 +T細胞表現來自外源聚核苷酸的選擇標記物。在一些實施例中，群體內的至少95%、98%或99% CD4 +T細胞表現來自外源聚核苷酸的選擇標記物。
在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現CD49b。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現LAG-3。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現TGF-β。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現IFN-γ。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現顆粒酶B (GzB)。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現穿孔素。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現CD18。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現CD2。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現CD226。在一些實施例中，經基因修飾的CD4 +T細胞表現IL-22。
在一些實施例中，CD4 +T細胞在來自宿主的周邊血液單核細胞(PBMC)存在下尚未失能。在一些實施例中，CD4 +T細胞在重組IL-10蛋白存在下尚未失能，其中CD4 +T細胞不表現重組IL-10蛋白。在一些實施例中，CD4 +T細胞在來自宿主的DC10細胞存在下尚未失能。
在一些實施例中，CD4 +T細胞存在於冷凍懸浮液中。在一些實施例中，CD4 +T細胞存在於液體懸浮液中。在一些實施例中，液體懸浮液先前已冷凍。
在本發明之另一態樣中，提供一種醫藥組合物，其包含： (i)本文所述之CD4 +T細胞群；其懸浮於 (ii)醫藥學上可接受之載劑。
在又另一態樣中，本發明提供一種製備多供體CD4 IL - 10細胞的方法，該方法包含以下步驟： (i)將獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞彙集；及 (ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾該等經彙集的CD4 +T細胞， 藉此獲得經基因修飾的CD4 +T細胞。
在一個態樣中，本發明提供一種製備多供體CD4 IL - 10細胞的方法，該方法包含以下步驟： (i)獲得來自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞；及 (ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞，且接著 (iii)彙集經基因修飾的CD4 +T細胞， 藉此獲得經基因修飾的CD4 +T細胞。
在一些實施例中，在步驟(i)之後且在步驟(ii)之前，在步驟(ii)之後，在步驟(ii)之後且在步驟(iii)之前，或在步驟(iii)之後，該方法進一步包含以下步驟： 在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育原代CD4 +T細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在來自Miltenyi Biotec的T細胞TransAct TM存在下培養。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在來自STEMCELL Technologies的ImmunoCult人類T細胞Activator TM存在下培養。
在一些實施例中，該方法包含進一步在IL-2存在下培育原代CD4 +T細胞。在一些實施例中，使用病毒載體將外源聚核苷酸引入原代CD4 +T細胞中。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為嵌合病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為腺相關病毒載體。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO: 1之序列之IL-10的區段。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。
在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物的區段。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的EGFR多肽。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的人類EGFR多肽。
在一些實施例中，該方法在步驟(ii)之後進一步包含以下步驟： 分離出表現該選擇標記物之該等經基因修飾的CD4 +T細胞，藉此產生經富集的經基因修飾之CD4 +T細胞群。
在一些實施例中，富集群體中至少70%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，富集群體中至少90%、95%或98%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10。在一些實施例中，富集群體中至少70%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現選擇標記物。在一些實施例中，富集群體中至少90%、95%或98%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟。在一些實施例中，培育經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟係在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下、在IL-2存在下執行。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍經基因修飾之CD4 +T細胞的後續步驟。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02或A*24對偶基因。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自一或多個冷凍儲備液。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，周邊血液單核細胞獲自白血球層或血球分離術。
在另一態樣中，本發明提供治療患者的方法，其包含以下步驟 將本發明之多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與需要免疫耐受之患者。
在一些實施例中，該方法進一步包含將多供體CD4 IL - 10細胞之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防患者的病原性T細胞反應或降低病原性T細胞反應的嚴重程度。
在一些實施例中，多供體CD4 IL -10細胞或醫藥組合物預防發炎或自體免疫反應或降低發炎或自體免疫反應的嚴重程度。
在一些實施例中，該方法進一步包含將來自造血幹細胞(HSC)供體的單核細胞投與患者的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物與來自HSC供體的單核細胞同時投與。在一些實施例中，在多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與之前或之後，投與來自HSC的單核細胞。在一些實施例中，單核細胞存在於PBMC中。在一些實施例中，單核細胞存在於骨髓中。在一些實施例中，單核細胞存在於臍帶血中。在一些實施例中，單核細胞已自PBMC、骨髓或臍帶血中分離出來。
在一些實施例中，該方法進一步包含以下步驟： 將造血幹細胞(HSC)供體的HSC投與該患者 該步驟發生於多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與之前或之後。
在一些實施例中，HSC供體與患者為部分的HLA錯配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物藉由移植的造血幹細胞來預防GvHD或降低GvHD嚴重程度。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防存在於所移植之造血幹細胞群中之淋巴細胞的病原反應或降低該病原反應的嚴重程度。
在一些實施例中，患者患有癌症。在一些實施例中，患者具有贅生性細胞。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD13、I類HLA及CD54。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD112、CD58或CD155。
在一些實施例中，患者患有癌症。在一些實施例中，癌症為實體或血液贅瘤。在一些實施例中，患者患有選自由以下組成之群的癌症：腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、成人之腦/CNS腫瘤、兒童之腦/CNS腫瘤、乳癌、男性乳癌、原發部位不明癌、卡斯特曼氏疾病(Castleman Disease)、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏腫瘤家族(Ewing Family Of Tumors)、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、妊娠期滋養層疾病、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、腎臟癌、喉及下咽癌、白血病、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML，包括骨髓肉瘤及皮膚白血病)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、兒童之慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、淋巴瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童之非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、腦垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤 - 成人軟組織癌、皮膚癌、皮膚癌 - 基底及鱗狀細胞、皮膚癌 - 黑色素瘤、皮膚癌 - 梅克爾細胞(Merkel Cell)、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms Tumor)。
在一些實施例中，癌症為骨髓癌。在一些實施例中，癌症為AML或CML。
在一些實施例中，患者患有發炎或自體免疫疾病。在一些實施例中，發炎或自體免疫疾病係選自由以下組成之群：1型糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、自體免疫肝炎、白斑病、斑禿、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、多發性硬化症、全身狼瘡、發炎性腸病、艾迪森氏病(Addison's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌無力、自體免疫血管炎、惡性貧血、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、乳糜瀉(celiac disease)及乳糜瀉(celiac disease)。
在一些實施例中，發炎或自體免疫疾病為克羅恩氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎或類風濕性關節炎。
在一些實施例中，患者患有涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。在一些實施例中，患者患有2型糖尿病、神經退化性疾病、心血管或發炎性腸病。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，患者患有過敏性或異位性疾病。在一些實施例中，過敏性或異位性疾病係選自由哮喘、異位性皮炎及鼻炎組成之群。在一些實施例中，患者具有食物過敏。
在一些實施例中，該方法進一步包含在CD4 +T細胞群或醫藥組合物投與之前或之後，將細胞及器官移植於患者的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防細胞及器官移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，該方法進一步包含在CD4 +T細胞群或醫藥組合物投與之前或之後，將iPS細胞來源的細胞或組織移植於患者的步驟。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與之前或之後，將重組腺病毒、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(HSV)、逆轉錄病毒、慢病毒、α病毒、黃病毒、棒狀病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、痘病毒或小核糖核酸病毒投與患者的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物減少針對以下病毒的免疫反應：重組腺病毒、腺相關病毒(AAV)、單純疱疹病毒(HSV)、逆轉錄病毒、慢病毒、α病毒、黃病毒、棒狀病毒、麻疹病毒、新城雞瘟病毒、痘病毒或小核糖核酸病毒。
在一些實施例中，患者對病毒或細菌感染具有過度的免疫反應。在一些實施例中，個體具有冠狀病毒感染。在一些實施例中，患者具有器官及/或組織損傷。
在一些實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4 IL - 10細胞群或醫藥組合物投與之前或之後，向患者投與免疫原性治療蛋白的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞群或醫藥組合物減少針對免疫原性治療蛋白的免疫反應。在一些實施例中，免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
在一些實施例中，該方法進一步包含偵測獲自患者之生物樣品中之選擇標記物的步驟，藉此偵測多供體CD4 IL - 10T細胞的存在或不存在。在一些實施例中，生物樣品為來自患者的生檢或血液。
在一個態樣中，本發明提供一種治療患有惡性疾病之患者的方法，其包含：向患者投與同種異體HSCT及投與治療有效量之多供體CD4 IL - 10細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞投與之前，投與同種異體HSCT。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞投與之後，投與同種異體HSCT。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞中之CD4 IL - 10細胞的供體無一者為HSCT供體。
在另一態樣中，本發明提供一種治療血液學癌症的方法，其包含：向血液學癌症患者投與足以誘導抗癌作用之量的多供體CD4 IL - 10細胞，其中多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞已獲自至少兩個不同T細胞供體且接著藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾。
在一些實施例中，血液學癌症治療方法包含投與足以誘導抗癌作用之多供體CD4 +T細胞的步驟，該等T細胞已獲自個別供體且首先藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而分別經基因修飾且接著彙集。
在一些實施例中，血液學癌症治療方法包含投與足以誘導抗癌作用之多供體CD4 +T細胞的步驟，該等T細胞已獲自個別供體，首先彙集該等T細胞且接著藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而對T細胞池進行基因修飾。
在一些實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4 IL - 10細胞投與之前或之後向患者投與同種異體HSCT的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞的量進一步足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)，而不抑制同種異體HSCT的移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效。
在一些實施例中，血液學癌症為骨髓性白血病。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD13的癌細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現I類HLA的癌細胞。在一些實施例中，骨髓性白血病為急性骨髓性白血病(AML)。
在一些實施例中，同種異體HSCT獲自與接受者相關或不相關的供體。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞對於接受者而言為非自體的。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞對於接受者而言為同種異體的。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞在投與宿主之前，對宿主同種異體抗原未失能。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞為Tr1樣細胞。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞為多株的。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞為多株的且對於接受者而言為非自體的。
在一些實施例中，在對該等多供體CD4 IL - 10細胞進行基因修飾之前，自至少兩個供體分離出該等細胞。在一些實施例中，至少兩個供體中無一者為與同種異體HSCT供體相同的供體。在一些實施例中，同種異體HSCT獲自與接受者匹配或錯配的供體。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD54的細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現I類HLA及CD54的癌細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD112的癌細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD58的癌細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅宿主的癌細胞。
本發明之一個態樣提供一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症的方法，其包含： 向個體(宿主)投與同種異體HSCT； 將足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制同種異體HSCT移植物之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效之量的多供體CD4 IL - 10細胞投與宿主； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體且藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞對於該宿主而言為非自體的且對於該同種異體HSCT供體而言為非自體的； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞在投與該宿主之前，對宿主同種異體抗原未失能；及 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞為多株的及Tr1樣的。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞投與之前，投與同種異體HSCT。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞投與之後，投與同種異體HSCT。
本發明之另一態樣提供一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症的方法，其包含： 向個體(宿主)投與同種異體HSCT； 將足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效之量的多供體CD4 IL - 10細胞投與該宿主； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體且藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅該宿主的癌細胞； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞在投與該宿主之前，對宿主同種異體抗原未失能；及 其中所有多供體CD4 IL - 10細胞對於宿主而言為非自體的，且為多株的且為Tr1樣的。
本發明之另一態樣提供來自單供體或多供體的CD4 IL - 10細胞，其中IL-10為病毒IL-10。病毒IL-10具有SEQ ID NO: 6、19、20或21之序列。在一些實施例中，病毒IL-10係由具有SEQ ID NO: 7之序列的聚核苷酸編碼。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10，其中來自人類IL-10的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸經來自病毒IL-10的相應胺基酸序列置換。在一些實施例中，用組成型啟動子控制下的外源病毒IL-10轉導CD4 +T細胞。在一些實施例中，表現控制元件驅動活化的CD4 +T細胞表現病毒IL-10。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸具有SEQ ID NO: 7之序列。
本發明之另一態樣提供來自單供體或多供體的CD4 IL - 10細胞，其中IL-10為小鼠(SEQ ID NO: 10)、大鼠(SEQ ID NO: 11)、恆河獼猴(MACMU)(SEQ ID NO: 12)、大猩猩(SEQ ID NO: 13)、食蟹獼猴(CYNO)(SEQ ID NO: 14)、東非狒狒(SEQ ID NO: 15)、倭黑猩猩(SEQ ID NO: 16)、黑猩猩(SEQ ID NO: 17)或EBVB9 (SEQ ID NO: 18)的IL-10。在一些實施例中，IL-10為一種蛋白質，其與小鼠(SEQ ID NO: 10)、大鼠(SEQ ID NO: 11)、恆河獼猴(MACMU)(SEQ ID NO: 12)、大猩猩(SEQ ID NO: 13)、食蟹獼猴(CYNO)(SEQ ID NO: 14)、東非狒狒(SEQ ID NO: 15)、倭黑猩猩(SEQ ID NO: 16)、黑猩猩(SEQ ID NO: 17)或EBVB9 (SEQ ID NO: 18)之IL-10具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
本發明之另一態樣提供來自單供體或多供體的CD4 IL - 10細胞，其中IL-10為人類IL-10之變異體。人類IL-10之變異體具有SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之序列。在一些實施例中，IL-10為人類IL-10，其中人類IL-10的一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸被來自另一物種之IL-10 (例如小鼠(SEQ ID NO: 10)、大鼠(SEQ ID NO: 11)、恆河獼猴(MACMU)(SEQ ID NO: 12)、大猩猩(SEQ ID NO: 13)、食蟹獼猴(CYNO)(SEQ ID NO: 14)、東非狒狒(SEQ ID NO: 15)、倭黑猩猩(SEQ ID NO: 16)、黑猩猩(SEQ ID NO: 17)或EBVB9 (SEQ ID NO: 18)的IL-10)的相應胺基酸序列置換。在一些實施例中，用組成型啟動子控制下的外源IL-10變異體轉導CD4 +T細胞。在一些實施例中，表現控制元件驅動活化的CD4 +T細胞表現IL-10變異體。在一些實施例中，編碼IL-10變異體的外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，編碼IL-10變異體的外源聚核苷酸不整合於T細胞核基因體中。
在又另一態樣中，本發明提供一種製備病毒IL-10 CD4 IL - 10的方法，該方法包含以下步驟： (i)自T細胞單供體獲得原代CD4 +T細胞；及 (ii)藉由引入編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸來修飾該等供體CD4 +T細胞， 藉此獲得經基因修飾的CD4 +T細胞。
在一些實施例中，在步驟(i)之後或在步驟(ii)之後，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆的珠粒存在下培育原代CD4 +T細胞的步驟。
在一些實施例中，該方法包含進一步在IL-2存在下培育原代CD4 +T細胞。在一些實施例中，使用載體遞送編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸。
在一些實施例中，編碼病毒IL-10的外源聚核苷酸包含編碼選擇標記物的區段。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的EGFR多肽。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為截斷的人類EGFR多肽。
在一些實施例中，在步驟(ii)之後，該方法進一步包含分離出表現選擇標記物之經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟，藉此產生經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟。在一些實施例中，培育經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟係在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下、在IL-2存在下執行。
在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞係獲自冷凍儲備液。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞係獲自T細胞單供體的未冷凍周邊血液單核細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，周邊血液單核細胞獲自白血球層或血球分離術。
1. 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年12月30日申請之美國臨時申請案第63/295,389號的權益，該案以全文引用之方式併入本文中。 2. 序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以XML格式提交且以全文引用的方式併入本文中。該XML複本於2022年12月23日創建，命名為37104-49835Sequence-Listing.xml，且大小為30.7千位元組(KB)。 6.1. 定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有熟習本發明所屬技術者通常所瞭解的含義。如本文所用，以下術語具有下文中賦予其之含義。
「 移植物抗白血病效應」或「 GvL」係指同種異體造血幹細胞移植(HSCT)或骨髓移植(BMT)之後出現的效應。同種異體移植物中的T淋巴球排除殘餘的宿主惡性白血病細胞。
「 移植物抗腫瘤效應」或「 GvT」係指同種異體造血幹細胞移植(HSCT)或骨髓移植(BMT)之後出現的效應。同種異體移植物中的T淋巴球排除殘餘的宿主惡性癌細胞，例如骨髓瘤及淋巴及骨髓白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤及可能乳癌的細胞。術語GvT與GvL通用。
術語「 治療 ( treatment )」、「 治療 ( treating )」及類似術語在本文中以最廣泛的意義使用，如醫學技術中所瞭解。特定而言，該術語通常意謂獲得所需的藥理學及/或生理學作用。如本文所用，「治療」涵蓋對哺乳動物(尤其人類)之疾病或病狀的任何治療，且包括：(a)預防易患該疾病或病狀、但尚未確診之個體發生該疾病或病狀；(b)抑制該疾病或病狀(例如遏制其發展)；或(c)減輕該疾病或病狀(例如促使該疾病或病狀消退，從而達成一或多種症狀的改善)。任何病狀之改善可容易根據此項技術中已知的標準方法及技術評估。藉由該方法治療該疾病之個體群包括罹患非所要病狀或疾病之個體以及處於發生該病狀或疾病之風險下的個體。
如本文所用，「 HLA 匹配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在匹配的HLA對偶基因，此允許該等個體在免疫學上彼此間相容。可使用在此項技術中可利用的任一種方法測定HLA相容性，例如如Tiervy, Haematologica 2016 Volume 101(6):680-687中所述，該文獻以引用的方式併入本文中。
對於指定的基因座而言，當一位個體的兩個對偶基因中之每一者與另一位個體之兩個對偶基因匹配時，個體對存在2/2匹配。當一位個體的兩個對偶基因中僅一者與另一位個體的兩個對偶基因之一匹配時，個體對存在½匹配。當一位個體的十個對偶基因(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座中之每一者存在兩個對偶基因)全部與另一位個體的所有十個對偶基因匹配時，個體對在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有10/10匹配。
在較佳實施例中，利用對偶基因層面的分型測定HLA相容性。對偶基因層面的分型對應於HLA基因的獨特核苷酸序列，如藉由在第一、第二、第三及第四區域中使用所有數字所定義，例如A*02:01:01:01。在功能上，表徵其中差異分別為編碼序列中之靜默取代及非編碼序列中之取代之對偶基因的第三與第四區域不相關，但當取代有礙於HLA對偶基因表現時除外(例如無效對偶基因B*15:01:01:02N)。缺失無效對偶基因將引起錯配，該錯配有很大可能被同種異體反應性T細胞識別且具有有害的臨床影響。非編碼序列中的取代可影響表現量(例如A24低對偶基因A*24:02:01:02L)。此類可變性亦可影響抗HLA同種異體識別。
如本文所用，術語「 HLA 錯配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在錯配的HLA對偶基因，此使得該等個體在免疫學上彼此間不相容。
如本文所用，術語「 HLA 部分錯配」係指一對個體在I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座中存在錯配的HLA對偶基因，此使得該等個體在免疫學上彼此間存在可容許程度的不相容。一些研究已鑑別出容許錯配。一些I類HLA不相容性被認為容許程度較大。
「 HLA 單倍型」係指染色體上的一系列HLA基因座對偶基因：一個傳自母親且一個傳自父親。可利用I類HLA (HLA-A、HLA-B及HLA-C)及II類HLA (HLA-DRB1及HLA-DQB1)基因座的基因型確定HLA單倍型。
術語「 治療有效量」為有效治療疾病且從而改善疾病之症狀之量。
術語「 預防有效量」為就完全或部分地預防疾病、病狀或其症狀而言有效的量。術語「 改善」係指治療疾病狀態(例如神經退化性疾病狀態)時的任何治療有益結果，包括其預防、嚴重程度減輕或進展減緩、緩解或治癒。 6.2. 其他詮釋性慣例
本文所列舉之範圍應理解為範圍內所有值之簡寫，包括所述端點。舉例而言，範圍1至50應理解為包括選自由以下組成之群的任何數字、數字組合或子範圍：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50。 6.3. 多供體 CD4 IL - 10 細胞
在第一態樣中，提供已經基因修飾以包含編碼IL-10之外源聚核苷酸的CD4 +T細胞群(CD4 IL - 10細胞)。包含CD4 +T細胞的群體獲自至少兩個不同T細胞供體(多供體CD4 IL - 10細胞)。 6.3.1. CD4 + T 細胞 及 T 細胞供體
多供體CD4 IL - 10群體中所用的CD4 +T細胞可使用此項技術中可利用之方法自供體的周邊血液、臍帶血或其他血液樣品中分離出來。在典型實施例中，自周邊血液、較佳自人類供體的周邊血液中分離出CD4 +T細胞。在某些實施例中，藉由白血球清除術自周邊血液中分離出CD4 +T細胞。在某些實施例中，CD4 +T細胞獲自第三方-血庫。在某些實施例中，經由全血之離心、自白血球層中獲得CD4 +T細胞。
在一些實施例中，自預先冷凍的血液儲備液或預先冷凍的周邊血液單核細胞(PBMC)儲備液中分離出CD4 +T細胞。在一些實施例中，自未預先冷凍的周邊血液或PBMC中分離出CD4 +T細胞。在一些實施例中，自獲自複數個供體的血液或PBMC中分別分離出CD4 +T細胞且接著彙集。在一些實施例中，首先彙集來自複數個供體的血液或PBMC，自該血液或PBMC中分離出CD4 +T細胞。
在一些實施例中，CD4 +T細胞獲自三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。
在一些實施例中，不依據基因型來選擇至少兩個不同T細胞供體。在一些實施例中，基於基因型選擇至少兩個不同T細胞供體。
在某些實施例中，基於HLA單倍型選擇至少兩個不同T細胞供體。
在一些實施例中，至少兩個不同T細胞供體中的一些或全部存在匹配的HLA單倍型。在一些實施例中，至少兩個不同T細胞供體中的一些或全部存在錯配的HLA單倍型。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞具有A*02或A*24對偶基因。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在較佳實施例中，至少兩個不同T細胞供體中無一者為待用CD4 IL - 10細胞治療之宿主。在較佳實施例中，至少兩個不同T細胞供體中無一者為幹細胞(例如HSC)、組織或器官的供體，該幹細胞、組織或器官將聯合CD4 IL - 10細胞用於本文所述之治療方法中。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與待治療之患者(宿主)為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在較佳實施例中，CD4 +T細胞皆未永生化。 6.3.2. 編碼 IL - 10 的 外源聚核苷酸
本發明之多供體CD4 IL - 10細胞為已經基因修飾以包含編碼IL-10之外源聚核苷酸的CD4 +T細胞。外源聚核苷酸包含編碼IL-10之聚核苷酸區段，該區段可操作地連接至表現控制元件。
編碼IL-10的聚核苷酸區段可編碼人類、倭黑猩猩或恆河猴之IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼具有SEQ ID NO: 1之序列的人類IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性的人類IL-10變異體。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之核苷酸序列。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段與SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 10)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 11)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 12)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 13)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 14)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 15)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 16)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 17)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 18)之IL-10。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼蛋白質，該蛋白質與小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 10)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 11)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 12)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 13)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 14)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 15)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 16)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 17)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 18)之IL-10具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，外源聚核苷酸編碼病毒IL-10。在各種實施例中，外源多肽編碼來自HCMV、GMCMV、RhCMV、BaCMV、MOCMV、SMCMV、EBV、Bonobo-HV、BaLCV、OvHV-2、EHV-2、CyHV-3、AngHV-1、ORFV、BPSV、PCPV、LSDV、SPV、GPV或CNPV之IL-10。在一些實施例中，外源多肽編碼來自EBV或ORFV之病毒IL-10。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代。在一些實施例中，一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個胺基酸取代係在相應胺基酸位置經病毒IL-10之胺基酸取代。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸插入、缺失或修飾。在一些實施例中，人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 8或9之序列。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10 (例如SEQ ID NO: 1)，該變異體具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個胺基酸取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，該等修飾為小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 10)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 11)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 12)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 13)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 14)；阿努比斯狒狒「東非狒狒」(SEQ ID NO: 15)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 16)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 17)；及EBVB9 (SEQ ID NO: 18)之胺基酸在相應位置的取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，人類IL-10變異體具有SEQ ID NO: 19或SEQ ID NO: 20之序列。
在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段編碼人類IL-10變異體，相較於人類IL-10，該變異體的免疫刺激活性降低。在一些實施例中，人類IL-10變異體包括I105A取代。在一些實施例中，使用A Single Amino Acid Determines the Immunostimulatory Activity of Interleukin 10, J Exp Med, 191, 2, 2000, 第213-223頁中所述之方法製備人類IL-10變異體。
外源聚核苷酸進一步包含引導經編碼之IL-10在經轉導之CD4 +T細胞中表現的表現控制元件。
在一些實施例中，表現控制元件包含能夠引導IL-10在CD4 +T細胞中表現的啟動子。在一些實施例中，啟動子驅動IL-10在CD4 +T細胞中的組成性表現。在一些實施例中，啟動子驅動IL-10在活化之CD4 +T細胞中的表現。
在一些實施例中，當在治療上適當時，使用誘導型啟動子誘導IL-10表現。在一些實施例中，使用IL-10啟動子。在一些實施例中，使用組織特異性啟動子。在一些實施例中，使用譜系特異性啟動子。在一些實施例中，使用廣泛表現的啟動子。
在一些實施例中，使用原生人類啟動子。在一些實施例中，使用人類延伸因子(EF) 1α啟動子。在一些實施例中，使用人類磷酸甘油酯激酶啟動子(PGK)。在一些實施例中，使用人類泛素C啟動子(UBI-C)。
在一些實施例中，使用合成啟動子。在某些實施例中，使用最小CMV核心啟動子。在特定實施例中，使用誘導型或組成型雙向啟動子。在特定實施例中，使用Amendola等人, Nature Biotechnology, 23(1):108-116 (2005)中所揭示之合成雙向啟動子。此啟動子可介導兩個mRNA以廣泛或組織特異性方式協同轉錄。在某些實施例中，雙向啟動子誘導IL-10及選擇標記物的表現。
在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物的區段，從而允許成功轉導之CD4 +T細胞被選擇。在一些實施例中，選擇標記物為ΔNGFR。在某些實施例中，選擇標記物為具有SEQ ID NO: 3之序列的多肽。在某些實施例中，選擇標記物為與SEQ ID NO: 3具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性的多肽。在特定實施例中，編碼ΔNGFR選擇標記物的核苷酸序列具有SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，編碼ΔNGFR選擇標記物的核苷酸序列與SEQ ID NO: 4具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。
在一些實施例中，選擇標記物的表現與來自外源聚核苷酸之IL-10的表現相關。在一些實施例中，選擇標記物的表現與來自外源聚核苷酸之IL-10的表現線性相關。相應地，在一些實施例中，量測選擇標記物的表現以推測來自外源聚核苷酸之IL-10的表現。
在一些實施例中，選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。在一些實施例中，選擇標記物為人類EGFR多肽的截斷形式，視情況為以下文獻中所揭示之huEGFR：Wang等人「A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells」Blood, 第118卷，第5期(2011)，該文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼抗生素抗性基因的序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因的序列。
在典型實施例中，使用載體將外源聚核苷酸遞送至CD4 +T細胞中。在一些實施例中，載體為質體載體。在一些實施例中，載體為病毒載體。
在某些實施例中，使用慢病毒載體將外源聚核苷酸遞送至CD4 +T細胞中且外源聚核苷酸包含慢病毒載體序列。在某些實施例中，使用Mátrai等人, Molecular Therapy18(3):477-490 (2010) (「Mátrai」)中所揭示之慢病毒載體。
在一些實施例中，慢病毒載體能夠整合至T細胞核基因體中。在一些實施例中，慢病毒載體不能夠整合至T細胞核基因體中。在一些實施例中，使用整合缺乏型慢病毒載體。舉例而言，在一些實施例中，使用整合缺乏型慢病毒載體或Mátrai所揭示之其他慢病毒載體。在一些實施例中，使用整合酶缺乏型慢病毒。舉例而言，可使用如Mátrai等人, Hepatology53:1696-1707 (2011)所述的含有整合酶中之不活化突變(D64V)的整合酶缺乏型慢病毒，該文獻以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。在一些實施例中，外源聚核苷酸不整合於核基因體中。在一些實施例中，外源聚核苷酸存在於T細胞的細胞質中。
在特定實施例中，外源聚核苷酸具有SEQ ID NO: 5之序列。在一些實施例中，外源聚核苷酸與SEQ ID NO: 5具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。 6.3.3. 多供體 CD4 IL - 10 T 細胞 之基因表現
多供體CD4 IL - 10T細胞表現IL-10。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞組成性表現IL-10。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞在活化時表現IL-10。
在一些實施例中，以10 6個CD4 +T細胞/mL培養物計，多供體CD4 IL - 10T細胞組成性表現至少100 pg IL-10。在一些實施例中，以10 6個CD4 +T細胞/mL培養物計，多供體CD4 IL - 10T細胞組成性表現至少200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞在用抗CD3與抗CD28抗體之組合或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL培養物計，表現至少1 ng或2 ng IL-10。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞在用抗CD3及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒活化之後，以10 6個CD4 +T細胞/mL培養物計，表現至少5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。
在各種實施例中，在活化之後的12小時、24小時或48小時，使用蛋白質偵測及量測的各種方法測定IL-10產生量，諸如ELISA、光譜程序、比色法、胺基酸分析、放射性標記、艾德曼降解(Edman degradation)、HPLC、西方墨點法等。在較佳實施例中，在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後的48小時，藉由ELISA測定IL-10產生量。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少5倍之量表現IL-10。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40或50倍之量表現IL-10。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞進一步表現選擇標記物。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現典型地在Tr1細胞中表現的蛋白質。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現Tr1細胞特有的標記蛋白。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現CD49b。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現LAG-3。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現TGF-β。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現IFNγ。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現顆粒酶B (GzB)。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞當用骨髓抗原呈遞細胞或骨髓腫瘤細胞活化時釋放顆粒酶B (GzB)。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現穿孔素。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞當用骨髓抗原呈遞細胞或骨髓腫瘤細胞活化時釋放穿孔素。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現CD18。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現CD2。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現CD226。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現IL-22。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞表現IL-10。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞展現Tr1細胞的至少一種表型功能。在各種實施例中，該功能為分泌IL-10、分泌TGF-β，及經由釋放顆粒酶B (GzB)及穿孔素而特異性殺滅骨髓抗原呈遞細胞。 6.3.4. 處理產物
在典型實施例中，藉由用編碼IL-10的外源聚核苷酸修飾CD4 +T細胞而獲得多供體CD4 IL - 10T細胞。
在一些實施例中，藉由病毒載體或質體載體將外源聚核苷酸引入CD4 +T細胞中。在特定實施例中，用含有IL-10之編碼序列的慢病毒轉導CD4 +T細胞。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞如下產生：(i)將獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞彙集；及(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾所彙集的CD4 +T細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞如下產生：(i)自至少兩個不同T細胞供體獲得原代CD4 +T細胞；(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞，及接著(iii)彙集經基因修飾的CD4 +T細胞。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在能夠活化CD4 +T細胞的蛋白質存在下培養。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆的珠粒存在下培養。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在抗CD3抗體、抗CD28抗體及IL-2或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒及IL-2存在下培養。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在來自Miltenyi Biotec的T細胞TransAct TM存在下培養。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞已在來自STEMCELL Technologies的ImmunoCult人類T細胞Activator TM存在下培養。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞存在於冷凍儲備液中。 6.4. 醫藥組合物
在另一態樣中，提供醫藥組合物。醫藥組合物包含本文揭示之多供體CD4 IL - 10T細胞及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
醫藥組合物可調配成藉由適於人類或獸醫學的任何投藥途徑投與。在典型實施例中，組合物調配成用於靜脈內(IV)投與。在一些實施例中，組合物調配成用於靜脈內(IV)輸注。在針對靜脈內投與而調配的實施例中，醫藥組合物呈非經腸可接受的水溶液形式，其不含熱原質且具有適合的pH、等張性及穩定性。
在一些實施例中，醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑為生理鹽水、乳酸林格氏溶液(lactated Ringer's solution)或其他生理學上相容的溶液。在各種實施例中，醫藥組合物溶液包含2%至20%，較佳5%人類血清白蛋白。
在一些實施例中，提供醫藥組合物的單位劑型，其經調適以藉由全身投與(尤其靜脈內投與)來投與醫藥組合物。
在一些實施例中，單位劑型含有10 4至10 11個多供體CD4 IL - 10T細胞、10 4至10 10個多供體CD4 IL - 10T細胞、10 4至10 9個多供體CD4 IL - 10T細胞、10 5至10 10個多供體CD4 IL - 10T細胞、10 5至10 9個多供體CD4 IL - 10T細胞、10 5至10 8個多供體CD4 IL - 10T細胞，或10 5至10 7個多供體CD4 IL - 10T細胞。
在典型實施例中，醫藥組合物的單位劑型呈液體形式。 6.5. 製備多供體 CD4 IL - 10 細胞的方法
在另一態樣中，本發明提供一種製備多供體CD4 IL - 10細胞的方法。
在一些實施例中，該方法包含以下步驟：(i)將獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞彙集；及(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾所彙集的CD4 +T細胞。在其他實施例中，該方法包含以下步驟：(i)自至少兩個不同T細胞供體獲得原代CD4 +T細胞；(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞；及接著(iii)彙集經基因修飾的CD4 +T細胞，藉此獲得多供體CD4 IL - 10細胞。可利用此項技術中已知之各種方法將編碼IL-10的外源聚核苷酸引入原代CD4 +T細胞。
在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育原代CD4 +T細胞或經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體、抗CD28抗體及IL-2或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒及IL-2存在下培育原代CD4 +T細胞或經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在餵養細胞之混合物存在下培育原代CD4 +T細胞或經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含在抗CD3抗體及抗CD28抗體之奈米製劑存在下培育原代CD4 +T細胞或經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，在來自Miltenyi Biotec的T細胞TransAct TM存在下進行培育。在一些實施例中，在來自STEMCELL Technologies的ImmunoCult人類T細胞Activator TM存在下進行培育。
在一些實施例中，培育步驟係在引入編碼IL-10之外源聚核苷酸之前進行。在一些實施例中，在(i)將獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞彙集之後；但在(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾所彙集的CD4 +T細胞之前，執行培育步驟。在一些實施例中，在(i)自至少兩個不同T細胞供體獲得原代CD4 +T細胞之後，但在(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞之前，執行培育步驟。
在一些實施例中，在步驟(ii)之後執行培育步驟。換言之，在一些實施例中，在(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾所彙集的CD4 +T細胞之後，執行培育步驟。在一些實施例中，在(ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞之後，但在(iii)彙集經基因修飾的CD4 +T細胞之前，執行培育步驟，藉此獲得經基因修飾之CD4 +T細胞。在一些實施例中，在(iii)彙集經基因修飾的CD4 +T細胞之後，執行培育步驟，藉此獲得多供體CD4 IL - 10細胞。
在一些實施例中，培育步驟執行超過一次。在一些實施例中，在基因修飾CD4 +T細胞之前與之後均執行培育步驟。
在一些實施例中，使用病毒載體將外源聚核苷酸引入原代CD4 +T細胞中。在一些實施例中，病毒載體為慢病毒載體。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO: 1之序列之IL-10的區段。在一些實施例中，外源聚核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 1具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性之IL-10的區段。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。在一些實施例中，編碼IL-10的聚核苷酸區段與SEQ ID NO: 2具有至少90%、95%、98%或99%序列一致性。在一些實施例中，外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物的區段，從而允許成功轉導之CD4 +T細胞被選擇。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為ΔNGFR。在某些實施例中，所編碼的選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。在特定實施例中，外源聚核苷酸包含SEQ ID NO: 4之序列。在一些實施例中，所編碼的選擇標記物為人類EGFR多肽的截斷形式。
在一些實施例中，該方法進一步包含分離出表現選擇標記物之經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟，藉此產生經富集之經基因修飾之CD4 IL - 10細胞群。
在一些實施例中，富集群體中至少70%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現選擇標記物。在一些實施例中，富集群體中至少95%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現選擇標記物。在一些實施例中，富集群體中至少96、97、98或99%的經基因修飾之CD4 +T細胞表現選擇標記物。
在一些實施例中，該方法進一步包含培育經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟。在一些實施例中，在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及抗CD28抗體塗覆之珠粒存在下執行培育。在一些實施例中，在IL-2存在下進一步執行培育。在一些實施例中，在餵養細胞存在下執行培育。在一些實施例中，在抗CD3抗體與抗CD28抗體之奈米製劑存在下執行培育。在一些實施例中，在來自Miltenyi Biotec的T細胞TransAct TM存在下執行培育。在一些實施例中，在來自STEMCELL Technologies的ImmunoCult人類T細胞Activator TM存在下執行培育。
在一些實施例中，該方法進一步包含冷凍經基因修飾之CD4 +T細胞的步驟。
在一些實施例中，原代CD4 +T細胞來自基於HLA單倍型選擇的供體。在一些實施例中，該方法進一步包含藉由分析其遺傳資訊來選擇T細胞供體的步驟。在一些實施例中，該方法包含分析潛在T細胞供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。
在一些實施例中，原代CD4 +T細胞來自與待經原代CD4 +T細胞或其修飾治療之宿主存在至少部分HLA匹配的供體。在一些實施例中，原代CD4 +T細胞來自與幹細胞(HSC)、組織或器官供體存在至少部分HLA匹配的供體。在一些實施例中，原代CD4 +T細胞獲自在生物學上與宿主不相關的第三方供體。在一些實施例中，原代CD4 +T細胞獲自在生物學上與幹細胞、組織或器官供體不相關的第三方供體。
在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02或A*24對偶基因。
在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。在一些實施例中，至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自一或多個冷凍儲備液。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞。在一些實施例中，該方法進一步包含自周邊血液單核細胞中分離出CD4 +T細胞的步驟。在一些實施例中，在步驟(i)中，原代CD4 +T細胞獲自液體懸浮液。在一些實施例中，液體懸浮液獲自預先冷凍儲備液。
在一些實施例中，使來自供體的CD4 +T細胞與患者抗原呈遞細胞(單核球、樹突狀細胞或DC-10細胞)接觸，從而產生同種異體特異性CD4 +T細胞，接著修飾該等T細胞，以產生高含量的IL-10 (同種異體CD4 IL - 10細胞)。
在一些實施例中，該方法不包含在來自宿主的周邊血液單核細胞(PBMC)存在下使CD4 +T細胞失能的步驟。在一些實施例中，該方法不包含在重組IL-10蛋白存在下使CD4 +T細胞失能的步驟，其中CD4 +T細胞不表現重組IL-10蛋白。在一些實施例中，該方法不包含在來自宿主的DC10細胞存在下使CD4 +T細胞失能的步驟。 6.6. 使用多供體 CD4 IL - 10 細胞的方法
在又另一態樣中，本發明提供一種治療患者的方法，其包含將本文所提供之多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與需要免疫耐受之患者的步驟。
在一些實施例中，該方法進一步包含將多供體CD4 IL - 10細胞之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防患者的病原性T細胞反應或降低病原性T細胞反應的嚴重程度。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物減輕發炎。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物增強組織修復。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物增強對自身及非病原性抗原的免疫耐受性且維持免疫穩態。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物使與器官移植、GvHD及各種自體免疫及發炎疾病有關的病原性T細胞反應下調。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物治療自體免疫疾病。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物減少NLPR3發炎體的高度活化或減少與NLPR3發炎體高度活化有關的症狀。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物誘導腫瘤細胞死亡或減少腫瘤生長。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物增加無疾病存活率(例如不存在微量殘存疾病)。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物誘導傷口癒合或組織修復。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效預防患者之病原性T細胞反應或降低患者之病原性T細胞反應嚴重程度的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效減輕發炎的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增強組織修復的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增強針對自身及病原性抗原之免疫耐受性且維持免疫穩態的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效下調病原性T細胞反應的量投與，該等病原性T細胞反應與器官移植、GvHD及各種自體免疫或發炎疾病有關。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效治療自體免疫疾病的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效減少NLPR3發炎體高度活化或減輕與NLPR3發炎體高度活化有關之症狀的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效誘導腫瘤細胞死亡或減少腫瘤生長的量投與。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物係以有效增加無疾病存活率(例如不存在微量殘存疾病)的量投與。
在一些實施例中，治療方法進一步包含在投與之後監測患者中的多供體CD4 IL - 10細胞。在一些實施例中，該方法包含偵測獲自患者之生物樣品中之選擇標記物的步驟，藉此偵測多供體CD4 IL - 10T細胞的存在或不存在。在一些實施例中，在多個時間點偵測選擇標記物，以追蹤患者體內在多供體CD4 IL - 10細胞存在下發生的變化。在一些實施例中，生物樣品為來自患者的生檢或血液樣品。
以治療有效量投與多供體CD4 IL - 10T細胞。可基於體重及其他臨床因素確定該量。在一些實施例中，投與10 3至10 9個細胞/kg。在一些實施例中，投與10 3至10 8個細胞/kg。在一些實施例中，投與10 3至10 7個細胞/kg。在一些實施例中，投與10 3至10 6個細胞/kg。在一些實施例中，投與10 3至10 5個細胞/kg。在一些實施例中，投與10 3至10 4個細胞/kg。
在各種實施例中，依照治療有效時程投與多供體CD4 IL - 10T細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10T細胞投與一次。在一些實施例中，每天、每3天、每7天、每14天、每21天或每個月投與多供體CD4 IL - 10細胞。
可根據不同投與途徑，諸如全身性、皮下或腹膜內，投與多供體CD4 IL - 10T細胞。在一些實施例中，細胞在生理鹽水或可含有2%至20% (較佳5%)人類血清白蛋白之生理溶液內投與。
在一些實施例中，就完全地或部分地預防疾病、病狀或其症狀而言，投與多供體CD4 IL - 10為預防性的。 6.6.1. 減少或預防 GvHD 之方法
在一些實施例中，在造血幹細胞(HSC)移植體(HSCT)之前、與HSCT同時或在HSCT之後，使用多供體CD4 IL - 10細胞或包含多供體CD4 IL - 10細胞的醫藥組合物治療患者。
在各種實施例中，HSCT為與匹配相關的HSCT。在各種實施例中，HSCT為單倍型相合HSCT、錯配相關HSCT或錯配不相關HSCT。
在一些實施例中，患者患有需要用同種異體HSCT治療的血液學惡性疾病。在一些實施例中，血液學惡性疾病由異常骨髓細胞介導。
在一些實施例中，基於待用多供體CD4 IL - 10細胞及HSC治療之患者的遺傳資訊及/或HSC供體的遺傳資訊來選擇T細胞供體。在一些實施例中，基於待用多供體CD4 IL - 10細胞及HSC治療之患者的HLA單倍型及/或HSC供體的HLA單倍型來選擇T細胞供體。在一些實施例中，該方法進一步包含在投與CD4 IL - 10細胞之前分析T細胞供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含分析宿主之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。在一些實施例中，該方法進一步包含分析HSC供體之遺傳資訊或HLA單倍型的步驟。
在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體在生物學上不相關。在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體具有不同HLA單倍型。在一些實施例中，T細胞供體、宿主及HSC供體的HLA單倍型具有至少部分錯配。在一些實施例中，當T細胞供體具有HLA匹配超過臨限值的HLA單倍型時，選擇該等T細胞供體。
在一些實施例中，HSC供體與患者為部分的HLA錯配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，HSC供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。在一些實施例中，一或多個T細胞供體與HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物藉由移植的造血幹細胞來預防GvHD或降低GvHD嚴重程度。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物藉由移植的造血細胞來預防病理性T細胞反應或降低病理性T細胞反應的嚴重程度。在特定實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞預防或減輕GvHD。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防由病原性T細胞誘導的組織損傷或發炎或降低其嚴重程度。 6.6.2. 癌症治療方法
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞用於治療癌症。在較佳實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞直接介導抗腫瘤作用且在特定實施例中介導抗白血病作用。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞與同種異體單核細胞或PBMC組合投與用於治療癌症。在一些實施例中，在PBMC投與之前或之後，投與多供體CD4 IL - 10細胞。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞與同種異體單核細胞或PBMC同時投與。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞及同種異體單核細胞或PBMC係以1:3、1:2、1:1、2:1或3:1比率投與。
在一些實施例中，贅生性細胞表現CD13。在一些實施例中，贅生性細胞表現I類HLA。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD54。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD13、I類HLA及CD54。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD112。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD58。在一些實施例中，贅生性細胞表現CD155。在一些實施例中，腫瘤表現CD112、CD58或CD155。在各種實施例中，腫瘤為實體或血液腫瘤。
在一些實施例中，患者患有選自由以下組成之群的癌症：腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、成人之腦/CNS腫瘤、兒童之腦/CNS腫瘤、乳癌、男性乳癌、原發部位不明癌、卡斯特曼氏疾病(Castleman Disease)、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏腫瘤家族、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、妊娠期滋養層疾病、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、腎臟癌、喉及下咽癌、白血病、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML，包括骨髓肉瘤及皮膚白血病)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、兒童之慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、淋巴瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童之非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、腦垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤 - 成人軟組織癌、皮膚癌、皮膚癌 - 基底及鱗狀細胞皮膚癌、皮膚癌 - 黑色素瘤、皮膚癌 - 梅克爾細胞(Merkel Cell)、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms Tumor)。
在一些實施例中，癌症為骨髓腫瘤。在特定實施例中，癌症為AML或CML。在一些實施例中，癌症為骨髓腫瘤。
在一些實施例中，該方法用於治療影響血液、骨髓及淋巴結的血液學癌症。在各種實施例中，血液學癌症為淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤)、淋巴球性白血病、骨髓瘤。在各種實施例中，血液學癌症為急性或慢性骨髓性(骨髓)白血病(AML、CML)或骨髓發育不良症候群。
在一些實施例中，癌症對於治療性干預而言為難治性的或具有抗性。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞與治療性干預組合使用。可同時執行或在不同時間執行組合。治療性干預較佳選自由以下組成之群：化學療法、放射療法、同種異體HSCT、免疫抑制、輸血、骨髓移植體、生長因子、生物製劑。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞誘導腫瘤浸潤性及腫瘤生長促進性骨髓譜系細胞(例如單核球、巨噬細胞、嗜中性球)發生細胞死亡。 6.6.3. 治療發炎或自體免疫疾病的方法
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療發炎或自體免疫疾病。在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以治療涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。
NOD樣受體家族(NLR)蛋白質NLRP3為一種胞內信號傳導分子，其感測來自病原性、環境或內源來源的危險信號。活化之後，NLPR3與凋亡蛋白酶-1相互作用，形成稱為發炎體的複合物。由此引起凋亡蛋白酶-1活化，該凋亡蛋白酶使促炎性細胞介素IL-1β及IL-18裂解成其活性形式且介導一種類型的發炎細胞死亡，稱為細胞焦亡。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療選自以下的發炎疾病：穆-韋二氏症候群(Muckle-Wells syndrome，MWS)、家族性冷自體發炎症候群(FCAS)及新生兒發作多系統發炎疾病(NOMID)。在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療選自以下之慢性疾病：代謝症候群、2型糖尿病、動脈粥樣硬化、阿茲海默症(Alzheimer)、帕金森病(Parkinson)、ALS、非酒精性脂肪變性肝炎、骨關節炎、矽肺病、石綿沉著病、痛風及肺纖維化。在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎、多發性硬化症及全身紅斑狼瘡或發炎眼病，諸如糖尿病性視網膜病變、急性青光眼及年齡相關黃斑變性。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療與NLRP3有關的疾病。該疾病可選自由以下組成之群：CAPS、NASH、阿茲海默症、帕金森病、心血管疾病、骨關節炎、痛風、假性痛風、腎鈣沈積病、II型糖尿病、休格連症候群(Sjogren syndrome)、鐮狀細胞疾病(SCD)、AMD、感染、大腦型瘧疾、石綿沉著病、接觸型過敏、曬傷、矽肺病、囊腫性纖維化、發炎性腸病、腎鈣沈積、ALS、骨髓發育不良症候群及葡萄膜炎。
在一些實施例中，該疾病為腦病症，其選自帕金森病、阿茲海默症、年齡相關之認知障礙、額顳葉型癡呆症、創傷性腦損傷、腦內出血、敗血症相關腦病變、大腦局部缺血、蛛網膜下出血、癲癇症、丙烯醯胺中毒、類鴉片誘導的神經炎症、慢性偏頭痛、圍手術期神經認知病症、中風後認知障礙、心跳驟停後的認知障礙、社交孤立誘導的認知障礙、焦慮症及創傷後應激障礙。
在一些實施例中，該疾病為肺病，其選自哮喘、IR肺損傷、ARDS/COPD、微粒物質誘導的肺損傷、輻射肺炎、肺高血壓、類肉瘤病、囊腫性纖維化及過敏性鼻炎。
在一些實施例中，該疾病為心臟病症，其選自動脈粥樣硬化、心臟衰竭、高血壓、心肌梗塞、心房纖顫、代謝功能異常誘導的心臟損傷，及內皮功能障礙。
在一些實施例中，該疾病為胃腸疾病，諸如大腸炎。在一些實施例中，該疾病為肝病，其選自急性肝衰竭、免疫晝夜調節、NASH、糖尿病的認知功能障礙、IR肝損傷、特異藥物誘導之肝損傷及肝纖維化。在一些實施例中，該疾病為胰臟或腎臟病症，其選自糖尿病性腦病變、與糖尿病相關之動脈粥樣硬化、抗胰島素症、胰島移植排斥反應、慢性結晶腎病變、腎纖維化、I/R腎損傷、與肥胖症相關之腎病，及腎高血壓。在一些實施例中，該疾病為選自牛皮癬及視網膜新血管生成的皮膚病或眼病。在一些實施例中，該疾病為生殖病症，諸如早產。在一些實施例中，該疾病為免疫病症，其選自原發痛經、先天性免疫、先天性變成後天性免疫、全身性紅斑狼瘡-狼瘡性腎炎，及多發性硬化症。在一些實施例中，該疾病為可遺傳的病症，其選自穆-韋二氏症候群、類風濕性關節炎、鐮狀細胞疾病及VCP相關疾病。在一些實施例中，該疾病為疼痛病症，其選自多發性硬化症相關的神經病變性疼痛、慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛、癌症誘導的骨痛及痛覺過敏。在一些實施例中，該疾病為癌症，諸如人類頭頸癌鱗狀細胞癌。在一些實施例中，該疾病為感染性病症，諸如細菌、病毒或寄生蟲感染。
在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞與當前可用於NLRP3相關疾病之療法(諸如靶向IL-1的生物藥劑)組合使用。生物藥劑包括重組IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(Anakinra)、中和IL-1β抗體康納單抗(Canakinumab)及可溶性誘餌IL-1受體利納西普(Rilonacept)。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療選自以下之疾病：2型糖尿病、代謝症候群、心血管疾病、SLE、MS、CD、潰瘍性結腸炎(UC)、骨關節炎、非酒精性脂肪變性肝炎(Nash)、帕金森病、ALS、肺纖維化、矽肺病、石綿沉著病、糖尿病性視網膜病變及年齡相關黃斑變性。
在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以治療發炎。發炎可與冠狀動脈疾病(CAD)、2型糖尿病、神經退化性疾病或發炎性腸病(但不限於此)相關。
在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以治療涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的IL-1β產生。在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的IL-18產生。在一些實施例中，投與多供體CD 4IL - 10細胞以減少活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞的成熟凋亡蛋白酶1產生。 6.6.4. 治療其他病症之方法
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以治療自體免疫疾病。
在一些實施例中，自體免疫疾病係選自由以下組成之群：1型糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、自體免疫肝炎、白斑病、斑禿、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、多發性硬化症、全身狼瘡、發炎性腸病、艾迪森氏病、葛瑞夫茲氏病、休格連氏症候群、橋本氏甲狀腺炎、重症肌無力、自體免疫血管炎、惡性貧血、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病及乳糜瀉。在一些實施例中，自體免疫疾病為克羅恩氏病、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎或類風濕性關節炎。在一些實施例中，患者患有過敏性或異位性疾病。過敏性或異位性疾病可選自由哮喘、異位性皮炎及鼻炎組成之群。在一些實施例中，患者具有食物過敏。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以預防針對除HSCT之外之細胞及器官移植的病原性T細胞反應或降低該病原性T細胞反應的嚴重程度。在一些實施例中，該方法包含在多供體CD4 IL - 10T細胞或醫藥組合物投與之前或之後將器官移植於患者的步驟。在某些實施例中，該器官為腎臟、心臟或胰島細胞。在較佳實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物預防器官移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以預防或減少與基因療法(例如投與重組AAV (rAAV))有關的免疫反應。在此等實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物投與之前或之後，向患者投與重組AAV的步驟。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以預防或減少與iPS衍生之組織或細胞移植有關的免疫反應。iPS衍生的組織及細胞包括但不限於心肌細胞、肝細胞、上皮細胞、軟骨、骨骼及肌肉細胞、神經元。
在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以減少患者對病毒感染的高度活化免疫反應。在一些實施例中，病毒為SARS-coV-2。在一些實施例中，投與多供體CD4 IL - 10細胞以減少針對細菌感染的高度活化免疫反應，諸如中毒休克及細胞介素風暴。
在一些實施例中，該方法進一步包含在多供體CD4 IL - 10細胞群或醫藥組合物投與之前或之後，向患者投與免疫原性治療蛋白的步驟。在一些實施例中，多供體CD4 IL - 10細胞群或醫藥組合物減少針對免疫原性治療蛋白的免疫反應。在一些實施例中，免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。 6.7. 實例
以下實例係為了說明，而非為了限制而提供。 6.7.1. 實驗觀測之概述
本發明提供產生及使用高度純化之同種異體CD4 +T細胞的方法，該等T細胞已經含有人類IL-10基因及截斷之非信號傳導形式之人類NGFR的雙向慢病毒載體轉導。成功轉導之CD4 +T細胞係使用NGFR特異性單株抗體純化，從而得到純度＞95%、產生IL-10且表現NGFR的CD4 +T細胞(命名為CD4 IL - 10細胞)。來自同種異體HLA錯配之3個不同供體的CD4 IL - 10細胞以1:1:1比率彙集。
此等彙集的群體，在本文中亦稱為多供體CD4 IL - 10細胞，具有類似於單供體CD4 IL - 10細胞及天然來源之1型調控T (Tr1)細胞的細胞介素產生概況。其產生高含量的IL-10及IL-22、可變含量的IFN-γ及IL-5及低含量的IL-4。多供體CD4 IL - 10細胞為多株的(具有多種抗原特異性)且活體外抑制同種異體CD4 +與CD8 +T細胞增殖。另外，其活體外特異性殺滅骨髓性白血病細胞。另外，多供體CD4 IL - 10細胞抑制NLPR3發炎體活化及人類單核球活體外產生促炎性IL-1β及IL-18。
多供體CD4 IL - 10細胞授受性轉移至人源化小鼠模型中用於移植物抗宿主疾病(GvHD)表明此等細胞有效地回歸至脾臟及骨髓。多供體CD4 IL - 10細胞授受性轉移至人源化小鼠GvHD模型抑制人類CD4 +T細胞或PBMC誘導重度異種GvHD。重要的是，多供體CD4IL-10細胞即使在高濃度下，本身亦不誘導GvHD。另外，在靜脈內注射ALL-CM細胞的NSG小鼠中，多供體CD4 IL - 10細胞對癌細胞具有細胞毒性作用。ALL-CM細胞(當此等細胞的已大規模擴增正在進行時)投與之後3天注射單供體及多供體CD4 IL - 10細胞使得腫瘤生長被抑制。此等結果表明多供體CD4 IL - 10細胞在活體內具有直接的抗骨髓性白血病治療作用。當單供體及多供體CD4 IL - 10細胞聯合PBMC投與時，CD4 IL - 10細胞進一步下調同種異體PBMC誘導的異種GvHD。
此等結果證明，多供體CD4 IL - 10細胞可用於治療及/或預防GvHD；可用作用於治療白血病及其他惡性疾病之同種異體造血幹細胞移植體(HSCT)的佐劑以減輕GvHD，同時保持HSCT的GvL或GvT治療效果；及用於治療細胞及器官排斥反應及自體免疫及發炎疾病。 6.7.2. 實例 1 ： 產生多供體 CD4 IL - 10 細胞 載體產生
藉由用含有人類IL-10與截斷形式之NGFR (ΔNGFR)之編碼序列的慢病毒載體(LV-IL-10/ΔNGFR)轉導(圖1及圖2)來產生多供體CD4 IL - 10細胞，如WO2016/146542中所述，該文獻以全文引用的方式併入本文中。編碼用於製造LV-IL-10/ΔNGFR之人類IL-10及ΔNGFR (pLVIL-10)的質體序列作為SEQ ID NO: 5提供。簡而言之，藉由將來自pH15C (ATCC 68192)之549 bp片段的人類IL-10編碼序列接入質體#1074.1071.hPGK.GFP.WPRE.mhCMV.dNGFR.SV40PA來產生pLVIL-10。雙向啟動子(方向相反的人類PGK啟動子外加CMV啟動子的最小核心元件)的存在允許兩種轉殖基因共表現。質體進一步含有抗生素抗性基因(例如胺苄青黴素(ampicillin)或康黴素(kanamycin))之編碼序列。
藉由Ca 3PO 4將四個質體短暫共轉染至293T細胞中來產生慢病毒載體且藉由超速離心濃縮：將1 μM丁酸鈉添加至培養物中用於收集載體。藉由限制稀釋法估算對293T細胞的效價，且藉由HIV-1 Gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products; Waltham, MA)量測載體顆粒。載體感染力依照效價與顆粒之間的比率計算。濃縮載體的效價範圍為5x10 8至6x10 9個轉導單位/mL，且感染力範圍為5xl0 4至5x10 5個轉導單位/ng。 產生 CD4 IL - 10 細胞
圖3為CD4 IL - 10細胞的生產製程示意圖。純化來自健康供體之CD4 +T細胞。用編碼人類IL-10及截斷形式之人類NGF受體的雙向慢病毒載體(LV-IL-10/ΔNGFR)以感染倍率(MOI) 20轉導之前，用可溶性抗CD3、可溶性抗CD28 mAb及rhIL-2 (50 U/mL)活化人類CD4 +T細胞長達48小時。
9至11天之後，藉由FACS分析經轉導細胞中之ΔNGFR表現，且藉由微滴式數位PCR (ddPCR)定量載體複本數(VCN)。
來自10位不同供體之CD4 +T細胞的平均轉導效率為45±17%，VCN為2.7±0.6%。圖4A顯示經LV-IL-10/ΔNGFR (雙向慢病毒載體，其編碼人類IL-10及截斷形式的人類NGF受體)轉導之人類CD4 +T細胞中的CD4 +ΔNGFR +細胞百分比(平均值±SD，n=10，左條柱)及載體複本數(VCN，平均值±SD，n=10，右條柱)。藉由微滴式數位PCR (ddPCR)定量CD4 IL - 10細胞中的CD4 +ΔNGFR +細胞頻率及載體複本數。
使用抗CD271 mAb塗覆的微珠純化ΔNGFR +T細胞且得到純度＞95%的CD4 IL - 10細胞群。純化之後，細胞用CD4及ΔNGFR的標記物染色且藉由FACS分析。資料顯示純化步驟得到的純度逾98%。圖4B顯示所測試之10個供體中之兩個代表性供體(供體B及供體C)的FACS資料。用於此兩個供體的CD4 IL - 10細胞純度分別為98.3%及99.2%。純化的CD4 IL - 10細胞以14天間隔再刺激3次且在第二輪(TF2)及/或第三輪再刺激(TF3)發揮作用之後測試其活體外及活體內功能。
休眠的CD4 IL - 10細胞組成性產生IL-10。活化後，IL-10產生量大大增加。 CD4 IL - 10 細胞具有類似於天然來源之 Tr1 細胞的細胞介素產生概況。
第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後，分析單供體CD4 IL - 10細胞的細胞介素產生概況且結果提供於圖5中。具體而言，如先前(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790及Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)所述，再刺激CD4 IL - 10細胞(2x10 5個細胞/200 µl)。第14天，在第2輪(TF2)及第3輪(TF3)再刺激之後，CD4 IL - 10細胞不加以刺激或用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)活化48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。所有樣品三重複測試。展示所測試之n=8個供體的平均值±SD。圖5中所提供的結果顯示，經固著之抗CD3及可溶性抗CD28 mAb刺激的CD4 IL - 10細胞顯示Tr1細胞的細胞介素產生概況。
儘管觀測到不同供體之間的差異，但第二輪(TF2)(圖5左圖)或第三輪(TF3)(圖5右圖)再刺激之後的總體細胞介素產生概況類似且反映Tr1細胞的細胞介素產生概況(Roncarolo等人, Immunity, 2018)。如同Tr1細胞，CD4 IL - 10細胞產生高含量的IL-10及IL-22、可變含量的IL-5及IFN-γ，但IL-4的含量相對較低且IL-2的含量不可偵測(未圖示)。 CD4 IL - 10 細胞高量表現顆粒酶 B 且選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞
第2輪(TF2)再刺激之後，進一步分析CD4 IL - 10細胞對顆粒酶B (GzB)的表現。圖6A中的資料顯示，源於7個不同供體之所有CD4 IL - 10細胞的超過95%高量表現顆粒酶B。
進一步分析來自第2輪(TF2)再刺激之CD4 IL - 10細胞針對人類骨髓性白血病細胞株(ALL-CM)及紅血球系白血病細胞株(K562)的細胞毒性作用。將CD4 IL - 10細胞(每孔10 5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10 5個)以1:1比率共培養3天。藉由FACS對殘餘白血病細胞株(CD45 低、CD3-)中的各目標細胞進行計數。
CD4 IL - 10細胞選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞(ALL-CM)，如圖6B中所示。被殺滅的ALL-CM細胞%在62%與100%之間變化，而對紅血球系白血病細胞株K562 (對非特異性細胞毒性及自然殺手(NK)細胞活性具有高度敏感性)的殺滅在0與27%之間變化(測試4個不同供體)。總之，此等資料證實CD4 IL - 10細胞表現顆粒酶B且有效殺滅骨髓性白血病細胞。正如所預期，觀測到源於個別供體之CD4 IL - 10細胞在殺滅能力上存在一些差異。 CD4 IL - 10 細胞抑制同種異體 CD4 + T細胞 與 CD8 + T細胞 的 增殖反應
亦分析CD4 IL - 10細胞對同種異體CD4 +T細胞或CD8 +T細胞的作用。具體而言，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(mDC)(每孔5x10 3個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4 +ΔNGFR -T細胞或CD8 +ΔNGFR -T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖7A及圖7B以增殖及抑制百分比顯示來自未彙集之六個不同供體(圖7A中的供體-C、供體-E及供體-F以及圖7B中的供體-H、供體-I及供體-L)之CD4 IL - 10細胞對CD4 +T細胞的作用。圖8A及圖8B顯示來自六個不同單供體(圖8A中的供體-C、供體-E及供體-F以及圖8B中的供體-H、供體-I及供體-L)之CD4 IL - 10細胞對CD8 +T細胞增殖的影響。
結果證明，來自所測試之未彙集之6個不同單供體的CD4 IL - 10細胞分別下調同種異體CD4 +T細胞與CD8 +T細胞的增殖反應。對CD4 +T細胞的抑制作用在51%與96%之間變化，而對CD8 +T細胞的抑制作用在62%與73%之間變化。 多供體 CD4 IL - 10 細胞的產生及表徵
如上文及圖3所述，使用來自多供體的CD4 +細胞產生CD4 IL - 10細胞。藉由第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激來刺激各供體的CD4 IL - 10細胞。第三輪刺激之後，將來自三個供體的CD4 IL - 10細胞以1:1:1比率彙集且用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)刺激48小時。 多供體 CD4 IL - 10 細胞的細胞介素產生概況類似於個別供體之 CD4 Il - 10 細胞及 Tr1 細胞的細胞介素產生概況。
收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。圖9中所提供的結果顯示，自3個不同同種異體供體彙集之多供體CD4 IL - 10細胞(1:1:1彙集)的細胞介素產生(黑點)類似於源於個別供體(n=8)之CD4 IL - 10細胞中的CD4 IL - 10細胞(灰色條柱)。多供體CD4 IL - 10細胞產生高含量的IL-10及IL-22、可變含量的IL-5、IFN-γ以及低含量的IL-4及不可偵測含量的IL-2 (未圖示)。此等資料表明，彙集CD4 IL - 10細胞係可行的，且此等多供體CD4 IL - 10細胞維持單供體來源CD4 IL - 10細胞及Tr1細胞的細胞介素產生標誌。重要的是，所彙集的同種異體細胞群含有＞95%活細胞，表明其不會將彼此殺滅。 多供體 CD4 IL - 10 細胞高量表現顆粒酶 B 且選擇性地殺滅骨髓性白血病細胞。
第3輪(TF3)再刺激之後，進一步分析多供體CD4 IL - 10細胞對顆粒酶B (GzB)的表現。圖10A中的資料顯示，大部分多供體CD4 IL - 10細胞表現GzB。類似於單供體源CD4 IL - 10細胞對GzB的表現，多供體CD4 IL - 10細胞逾95%表現顆粒酶B(圖10A)。
進一步分析來自第3輪(TF3)再刺激的CD4 IL - 10細胞對骨髓性白血病細胞(ALL-CM細胞株)或K562的細胞毒性作用。將多供體CD4 IL - 10細胞(每孔10 5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10 5個)以1:1比率共培養3天。藉由FACS對殘餘白血病細胞株(CD45 低、CD3-)中的各目標細胞進行計數。圖10B中提供的結果顯示對K562細胞存在某種程度的細胞毒性，該等K562細胞對非特異性細胞毒性高度敏感。然而，多供體CD4 IL - 10細胞(黑點)對骨髓性白血病細胞(ALL-CM)達成了選擇性殺滅程度，此類似於單供體源CD4 IL - 10細胞的殺滅程度(空心條柱)。 多供體 CD4 IL - 10 細胞抑制同種異體 CD4 + T 細胞與 CD8 + T 細胞的 增殖反應。
亦分析多供體CD4 IL - 10細胞對同種異體CD4 +T細胞或CD8 +T細胞的作用。具體而言，同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在多供體CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10 3個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4 +ΔNGFR -T細胞或CD8 +ΔNGFR -T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖11A顯示來自多供體CD4 IL - 10細胞的結果，該等多供體細胞含有來自供體-C、供體-E及供體-F (C-E-F)的CD4 IL - 10細胞。圖11B顯示來自多供體CD4 IL - 10細胞的結果，該等多供體細胞含有來自供體-H、供體-I及供體-L (H-I-L)的CD4 IL - 10細胞，該等細胞已冷凍、儲存且解凍後進行測試。
圖11A顯示多供體CD4 IL - 10細胞(來自3個不同供體)將CD4 +及CD8 +T細胞反應分別抑制97%及74%。第二批不同多供體CD4 IL - 10細胞在已冷凍、儲存及測試之前的解凍之後，經測試獲得類似結果(圖11B)。對CD4 +及CD8 +T細胞增殖的抑制分別為68%及75%。此等資料表明多供體CD4 IL - 10細胞可在無功能喪失的情況下冷凍、儲存及解凍。
總體而言，用多供體CD4 IL10細胞獲得的資料表明可彙集此等細胞製劑而無任何問題。其含有＞95%活細胞且維持單供體CD4 IL - 10細胞的所有相關功能(細胞介素產生、細胞毒性能力，及同種異體T細胞反應之抑制)。使用較大的多供體CD4 IL - 10細胞池應減少源於不同個別供體之CD4 IL - 10細胞批次之間所觀測到的天然差異，且應向人類療法提供大量的現成CD4 IL - 10細胞。
多供體CD4 IL - 10細胞產物具有產物更均質的顯著優勢，從而允許確定界限分明、批次間變化小、有效力的測試完成準則。另外，其能夠開發大規模的細胞連續生產製程。 用於產生多供體 CD4 IL - 10 細胞的其他方法
慢病毒轉導之前，彙集來自最少3至5個不同供體的白血球層。使用抗CD4抗體、藉由正向選擇而自白血球層中分離出CD4 +細胞。藉由FACS檢查所彙集之CD4 +細胞的純度。或者，自最少3至5個正常健康供體獲得冷凍的人類CD4 +細胞。冷凍的人類CD4 +細胞在使用之前解凍。來自白血球層或冷凍儲備液的CD4 +細胞在IL-2存在下藉由CD3與CD28抗體的組合或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒活化24至48小時。在一些情況下，來自白血球層或冷凍儲備液的CD4 +細胞用可溶性抗CD3、可溶性抗CD28 mAb及rhIL-2 (50 U/mL)活化48小時且如上文所述用編碼人類IL-10的雙向慢病毒載體轉導以便產生CD4 IL - 10細胞。
在一些情況下，首先確定T細胞供體(或自供體分離的CD4 +細胞)的HLA單倍型且選擇性地彙集且使用具有所需HLA單倍型的CD4 +細胞。
藉由用含有上述人類IL-10及ΔNGFR編碼序列的慢病毒載體轉導上述活化CD4 +細胞來產生多供體CD4 IL - 10細胞。
第7天至第11天(轉導之後的5天至9天)，收集細胞且使用抗NGFR抗體純化成功轉導的T細胞。此過程通常產生95%純度的多供體CD4 IL - 10細胞群。
對純化的多供體CD4 IL - 10細胞進行計數且在IL-2存在下、視情況在餵養細胞存在下、用CD3抗體與CD28抗體的混合物、經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒再刺激另外8至10天。在一些情況下，在餵養細胞存在下再刺激經純化的多供體CD4 IL - 10細胞。
培養總共5週時段之後，收集CD4 IL - 10細胞，計數且測試其自發地或在CD3與CD28抗體或經CD3及CD28抗體塗覆之珠粒活化之後產生IL-10的能力。另外，量測GrzB及穿孔素含量。亦測試其抑制人類T細胞(PBMC)的能力及純化CD4 +及CD8 +T細胞的增殖。
另外，組成性地量測以及在活化200,000個CD4 IL - 10細胞/200微升體積之後量測IL-22的產生，該活化如先前所述係使用CD3與CD28抗體之組合進行以便產生其他細胞介素，諸如IFNγ、IL-10、IL-4及IL-5。利用IL-22特異性ELISA量測IL-22產生量，如WO2016/146542中關於其他細胞介素所述。所彙集的CD4 IL - 10細胞在儲存之前冷凍。 6.7.3. 實例 2 ： 使用多供體 CD4 IL - 10 細胞治療或預防 GvHD 多供體 CD4 IL - 10 細胞在活體內的作用 .
測試多供體CD4 IL - 10細胞群在人源化異種GvHD疾病模型、NSG小鼠模型中對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響，如圖12中所繪示。對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射(i)人類PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)、(ii)多供體(三個供體；BC-C/E/F) CD4 IL - 10細胞(5x10 6個細胞/小鼠)，或(iii)人類PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)與多供體CD4 IL - 10細胞(BC-C/E/F)之組合(5x10 6個細胞/小鼠)。如先前(Bondanza等人, Blood 2006)所述，基於存活率、體重損失(＞20%體重損失)、皮膚病變、皮毛狀況、活動性及背部弓起來評價異種GvHD。
圖13顯示注射後每一天之無異種GvHD的NSG小鼠%。將5x 10 6個人類PBMC投與經輻射的NSG小鼠出乎意料地引起異常爆發性異種GvHD。所有小鼠皆在第10天死亡，反映異種GvHD極具致死性。5x10 6個多供體CD4 IL - 10細胞共投與使此爆發性異種GvHD延遲，但小鼠在第14天處死，原因在於其夠到體重損失20%的預定人道處死準則(圖13)。然而，此等結果表明多供體CD4 IL - 10可延遲極其嚴重的異種GvHD。重要的是，以與PBMC (5x10 6個細胞)相同劑量單獨投與的多供體CD4 IL - 10細胞未能誘導異種GvHD的任何徵象。
亦測試注射後14天之NSG小鼠之脾臟(圖14，左圖)及骨髓(圖14，右圖)中之人類CD4 IL - 10細胞的存在，該等NSG小鼠注射有人類PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體；BC-C/E/F) CD4 IL - 10細胞(5x10 6個細胞/小鼠)，或人類PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)與多供體CD4 IL - 10細胞(三個供體；BC-C/E/F)(5x10 6個細胞/小鼠)的組合。圖14提供的結果顯示多供體CD4 IL - 10細胞遷移至脾臟及骨髓。在輸注細胞之後的14天發現此等細胞存在的百分比較低。此等結果表明，多供體CD4 IL - 10細胞延遲人類PBMC誘導的爆發性異種GvHD，且其自身不誘導任何異種GvHD。 多供體 CD4 IL - 10 細胞抑制經純化之 CD4 + 細胞所致的重度異種 GvHD .
在人源化異種GvHD模型中測試多供體CD4 IL - 10細胞，在該模型中，藉由投與2.5 x 10 6個純化人類CD4 +T細胞來誘導GvHD疾病，如圖15中所繪示。第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且第3天靜脈內注射單獨或與以下組合的人類CD4 +T細胞(2.5x10 6個細胞/小鼠)：多供體CD4 IL - 10細胞(三個不同供體；BC-H/I/L)(2.5x10 6個細胞/小鼠)，或來自細胞池之單供體(BC-H) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6個細胞/小鼠)。如先前(Bondanza等人, Blood 2006)所述，基於存活率、體重損失(＞20%體重損失)、皮膚病變、皮毛狀況、活動性及背部弓起來評價異種GvHD。
圖16顯示注射後每一天之無GvHD的NSG小鼠%。結果顯示，多供體CD4 IL - 10(BC-H/I/L)細胞可抑制人類同種異體CD4 +T細胞介導的異種GvHD。在此實驗中，由於對照組中接受CD4 +T細胞的所有小鼠在第20天死亡，因此異種GvHD極其嚴重。相比之下，2.5 x 10 6個多供體CD4 IL - 10的共投與將GvHD抑制75%。單供體CD4 IL - 10細胞亦具防護性，但作用不是太強。 其他實驗
測試多供體CD4 IL - 10細胞在四組不同小鼠中的治療效果：(i)接受與CD4 IL - 10細胞不相關之供體之人類PBMC的小鼠(異種GvHD陽性對照組)；(ii)接受多供體CD4 IL - 10細胞的小鼠(陰性對照組)；(iii)以1:1比率接受PBMC與多供體CD4 IL - 10細胞之組合的小鼠；及(iv)以2:1比率或以不同比率接受PBMC與多供體CD4 IL - 10細胞之組合的小鼠。在接受PBMC與多供體CD4 IL - 10細胞之組合的動物中，一些動物同時接受PBMC及多供體CD4 IL - 10細胞，一些動物在接受PBMC之後的若干天(例如5天)接受多供體CD4 IL - 10細胞，且一些動物在接受PBMC之前的若干天(例如5天)接受多供體CD4 IL - 10細胞。
在PBMC及/或多供體CD4 IL - 10細胞投與之後，藉由在第1、2、3、4週及必要時第5週量測體重來監測小鼠是否產生GvHD。除體重損失之外，檢查小鼠的皮膚病變、皮毛狀況及活動性。監測治療組小鼠額外的時段，以測定多供體CD4 IL - 10細胞對長期存活率的影響。
投與之後，亦監測周邊血液及組織中之多供體CD4 IL - 10細胞的量及定位。具體而言，在周邊血液中及在發炎部位：脾臟及骨髓處監測多供體CD4 IL - 10細胞的存在。監測多供體CD4 IL - 10細胞存在的其他部位包括淋巴結及腸道。監測治療組小鼠額外3週以測定長期存活率。
結果證明，多供體CD4 IL - 10細胞有效減輕及預防異種GvHD。 6.7.4. 實例 3 ： 抑制 GvHD 及治療癌症
測試多供體CD4 IL - 10細胞群在移植有人類PBMC及AML腫瘤細胞之NSG小鼠模型中對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響及抗腫瘤作用。靜脈內投與AML細胞(ALL-CM)，如WO 2016/146542中先前所述。3天後投與PBMC或多供體CD4 IL - 10細胞或其組合。
如實例1中所述獲得多供體CD4 IL - 10細胞。測試多供體CD4 IL - 10細胞在四組不同小鼠中的治療效果，該等小鼠各自已在第0天接受輻射及5x10 6個ALL-CM細胞(AML小鼠)：(i)不另經處理的AML小鼠；(ii)接受與多供體CD4 IL - 10細胞不相關之供體之5x10 6個人類PBMC (該等PBMC引起重度異種GvHD)的AML小鼠；(iii)接受2.5x10 6個多供體CD4 IL - 10細胞的AML小鼠；及(iv)以1:1或2:1比率或以不同比率接受PBMC與多供體CD4 IL - 10細胞之組合的AML小鼠。另一組小鼠不接受ALL-CML細胞，但在輻射之後的第3天接受5x10 6個人類PBMC。
基於體重損失、皮膚病變、皮毛狀況、活動性、死亡率及長期存活率，測試多供體CD4 IL - 10細胞對人類PBMC所誘導之異種GvHD的影響。基於循環中之腫瘤細胞的減少及長期無腫瘤存活率，測試多供體CD4 IL - 10細胞的抗腫瘤作用或移植物抗白血病(GvL)作用。
監測一些小鼠長達7週以便監測長期存活率及完全的腫瘤緩解。
結果證明，多供體CD4 IL - 10細胞在抑制異種GvHD與治療癌症方面均有效。 6.7.5. 實例 4 ： 使用多供體 CD4 IL - 10 細胞治療癌症
在NSG小鼠中，在使用T細胞療法的ALL-CM白血病模型中測試多供體CD4 IL - 10細胞群。
第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射骨髓性白血病細胞(ALL-CM)(2.5x10 6)。在第一組動物中，不投與額外細胞。在第二組動物中，在第3天注射PBMC (2.5x10 6)。在第三組動物中，第3天注射多供體CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)。在第四組動物中，第3天注射單供體(供體BC-I) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)。在第五組動物中，第3天注射單供體(供體BC-H) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)。基於循環白血病細胞之減少及長期無白血病存活率，測試動物的移植物抗白血病(GvL)作用。如先前所述(Locafaro G.等人, Molecular Therapy 2017)量測白血病。參見圖17A。
如圖17B及圖17C所提供，注射單獨ALL-CM骨髓性白血病細胞的所有小鼠在第17天出現大範圍的白血病惡化。投與2.5x10 6個PBMC使得白血病惡化受到強烈的抑制。有趣的是，單供體CD4 IL10(圖17B)或多供體CD4 IL10(圖17C)細胞在抑制白血病惡化方面達成類似的水平。此等資料表明單供體及多供體CD4 IL10具有很強的直接抗白血病作用。
進一步測試單供體CD4 IL10及多供體CD4 IL10與PBMC之組合在注射有ALL-CM骨髓性白血病細胞之小鼠中的移植物抗白血病(GvL)作用(圖18A)。投與2.5x10 6個PBMC使得白血病惡化受到強烈的抑制。2.5x10 6個PBMC與單供體CD4 IL10(2.5x10 6)細胞組合投與使得白血病惡化受到更強的抑制(圖18B)。2.5x10 6個PBMC與2.5x10 6個多供體CD4 IL10細胞組合投與對白血病的協同抑制作用類似於單供體CD4 IL10(2.5x10 6)細胞(圖18C)。此等資料表明，多供體CD4 IL10細胞不干擾PBMC的保護性GVL作用，而是與PBMC協同發揮作用以介導強GvL作用。 6.7.6. 實例 5 ： 使用多供體 CD4 IL - 10 細胞治療慢性發炎性及自體免疫疾病
NLPR3發炎體的活化已牽涉到多種慢性發炎性及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由「危險信號」活化，引起凋亡蛋白酶1介導單核球/巨噬細胞產生促炎性細胞介素IL-1β及IL-18。執行一系列活體外實驗以研究多供體CD4 IL - 10細胞對NLPR3發炎體及人類單核球產生IL-1β/IL-18的影響。
首先，在Ficoll/Paque (Sigma-Aldrich)上藉由標準密度離心自周邊血液中分離出人類PBMC。使用單核球分離套組II (Miltenyi)，根據製造商說明書，藉由負向選擇自人類PBMC中分離出單核球。由於正向選擇或黏附可引起細胞發生非所需的活化，因此負向選擇較佳。將分離的單核球在含有3%無毒素人類AB血清的培養基中、在2x10 5或1x10 5個多供體CD4 IL - 10細胞/200 µl/孔存在下、以5x10 4個細胞/200 µl接種於96孔微量滴定盤中。
表1概述應用於9組單核球的處理條件，各組包括6個孔的細胞。
表 1
組 # 單核球 CD4 細胞 / 上清液 抑制劑 * LPS** 其他 ***
培養基對照培育時間：1小時；隨後藉由LPS +/- 尼日利亞菌素活化 如圖19A-G中所指示
1 單核球 否 否 無LPS   
2 單核球 否 否 LPS   
3 單核球 否 Z-YVADfmk LPS   
4 單核球 否 MCC950 LPS   
在 獲自單供體或多供體 CD4 IL - 10 細胞或獲自 CD4 GFP 細胞培養物之 上清液 **** 存在下培養單核球
5 單核球 CD4 IL - 10細胞的50%上清液 否 LPS   
6 單核球 CD4 IL - 10細胞的25%上清液 否 LPS   
7 單核球 CD4 IL - 10細胞的12.5%上清液 否 LPS   
8 單核球 CD4 IL - 10細胞的50%上清液 否 LPS 抗IL-10受體抗體
9 單核球 CD4 GFP細胞的50%上清液 No LPS   
*  Z-YVADfmk為對凋亡蛋白酶1具有特異性的抑制劑。溶解於DMSO中的20 μM Z-YVADfmk (Biovision、Enzo Life Sciences或Axxora Life Sciences)按照指示使用。MCC950為NLRP3抑制劑。10 μM MCC950 (Invivogen)按照指示使用。 ** 在LPS培育的最後30分鐘期間，按照指示添加100 ng/mL LPS (Sigma-Aldrich) + 10 uM尼日利亞菌素(Nig，Invivogen)。 *** 30 μg/mL抗IL-10R抗體(Biolegend)。 **** 藉由將1X10 6/mL的CD4 IL - 10或CD4 GFP細胞培育3天且收集上清液來獲得CD4 IL - 10及CD4 GFP培養物的上清液。藉由IL-10特異性ELISA量測IL-10產生量。
如表1概述處理之後，收集各組6個孔的上清液且藉由特異性針對成熟IL-1β或IL-18的ELISA (Biolegend)量測IL-1β/IL-18產生。藉由西方墨點法分析自所選群組之6個孔收集的細胞，以測定活化凋亡蛋白酶1含量。
實驗資料顯示，多供體CD4 IL - 10細胞下調活化單核球的IL-1β及IL-18產生。其進一步顯示，多供體CD4 IL - 10細胞下調活化單核球的成熟凋亡蛋白酶-1產生。另外，多供體CD4 IL - 10所產生的多供體CD4 IL - 10及IL-10下調發炎體。
使用人類巨噬細胞或樹突狀細胞而非單核球執行類似實驗。實驗結果證明，多供體CD4 IL - 10細胞進一步下調活化巨噬細胞及樹突狀細胞的IL-1β、IL-18及成熟凋亡蛋白酶-1產生。
此等資料表明，多供體CD4 IL - 10細胞可用於治療涉及NLPR3發炎體過度活化的疾病或病症。特定言之，多供體CD4 IL - 10細胞可用於治療慢性發炎及自體免疫疾病。NLPR3發炎體可藉由外源或內源「危險信號」活化，諸如病原體相關分子模式(PAMP)、二氧化矽、石棉、危險相關分子模式(DAMP)，如來自受損粒線體、壞死及應激細胞的產物及尿酸晶體。 6.7.7. 實例 6 ： 多供體 CD4 IL - 10 細胞上清液抑制 NLPR3 發炎體活化以及人類單核球產生 IL - 1β 及 IL - 18
使用泛單核球分離套組(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)自PBMC中分離出CD14 +單核球且以每孔2x10 5/200 µL接種於96孔平坦微量滴定盤中且在LPS存在下培養。進一步在Z-YVADfmk (20 μMol)、MMC950 (10 μMol)、IL-10 (10 ng/mL)或如表1中概述之各種濃度之單供體或彙集供體CD4 IL - 10細胞上清液存在下培養細胞。
上清液係獲自單供體或彙集供體CD4 IL - 10細胞，該等細胞如先前所述經CD3與CD28抗體之組合活化72小時。(Andolfi等人, 2012, Mol. Therapy 第20卷, 1778-1790, Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)。在一些情況下(圖19C及圖19D)，將單核球與LPS與NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(「NIG」)的組合一起培育，該組合係在LPS活化的最後30分鐘期間添加。
NLPR3發炎體藉由LPS活化，從而產生成熟凋亡蛋白酶1及具有生物活性形式的IL-1β及IL-18。在培育期期間，在LPS活化不存在下接種的單核球不產生可偵測含量的IL-10 (未圖示)。
以50%、25%及12.5%的濃度分別添加單供體源CD4 IL - 10細胞上清液(含有1769 pg IL-10/mL)以劑量依賴性方式抑制來自供體#1及#2之LPS活化單核球產生IL-1β (圖19A及圖19B)。經GFP轉導之CD4 +細胞上清液用作對照。在50%及25%的濃度下觀測到IL-1β產生被完全抑制，而經GFP轉導之對照CD4 +細胞上清液在50%濃度下無效。
針對經LPS及尼日利亞菌素(「NIG」)活化之單核球進一步測試各種濃度之CD4 IL - 10T細胞上清液(50%、25%或12.5%)、Z-YVADfmk或MCC950。單供體(BC-E)或彙集供體CD4 IL - 10細胞上清液分別含有5295或3532 pg IL-10/mL。單供體CD4 IL - 10細胞上清液亦極其有效地抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素增強的IL-1β產生(圖19C及圖19D)。
資料證明濃度為50%的CD4 IL - 10細胞上清液與不可逆凋亡蛋白酶1抑制劑Z-YVADfmk (Guo等人, 2015, Nature Med 21, 677)、選擇性NLPR3發炎體抑制劑MCC950 (Coll等人, 2019, Nature Chem. Biol 15, 556)及重組IL-10同樣有效，表明含IL-10上清液抑制NLPR3發炎體活化及成熟凋亡蛋白酶1產生，從而很強地抑制促炎性細胞介素IL-1β產生(圖19A至圖19D)。
在第二系列實驗中，使用單供體(BC-E)及自2個不同供體(BC-C/E)彙集之CD4 IL - 10細胞的上清液獲得類似結果。藉由CD3與CD28抗體之組合活化CD4 IL - 10細胞，如(Andolfi等人, 2012)所述。3天之後，收集CD4 IL - 10細胞上清液。此等上清液分別含有5295及3532 pg IL-10/mL，且以劑量依賴性方式抑制LPS誘導供體#3之單核球產生IL-1β(圖19E)。濃度為50%的上清液與Z-YVADfmk及MCC950同樣有效。抗IL-10受體抗體完全中和所彙集之CD4 IL - 10細胞之上清液的抑制效應。類似地，自3個不同供體彙集之含有2589 pg IL-10/mL的上清液以劑量依賴性方式抑制供體#4之單核球產生IL-1β (圖19F)。IL-10受體抗體完全地中和上清液的抑制效應，證明NLPR3活化係由IL-10介導。結果表明，多供體CD4 IL - 10T細胞所產生的IL-10強烈抑制促炎性細胞介素IL-1β的產生。正如所料，抗IL-10受體抗體不具有抑制Z-VADfmk及MCC950介導IL-1β產生的作用(圖19E)。
針對LPS及尼日利亞菌素活化之來自供體#4之單核球進一步測試CD4 IL - 10T細胞。使用分別含有2583或2589 pg IL-10/mL的各種濃度之單供體(BC-V)或多供體(三個供體；BC-T/U/V) CD4 IL - 10細胞上清液測試ZYVADfmk或MCC950。圖19G提供的資料顯示，3個不同供體(BC T-U-V)彙集的上清液下調LPS與尼日利亞菌素組合所誘導的IL-18產生。
總體而言，此等資料表明，單供體及多供體CD4 IL - 10細胞產生的IL-10很強地下調NLPR3發炎體，從而很強地抑制促炎性細胞介素IL-1β及IL-18。 6.7.8. 實例 7 ： 單供體及多供體 CD4 IL - 10 細胞在活體內抑制異種 GvHD 及骨髓腫瘤生長
如Andolfi等人, Mol Ther 2012, 20, 177及Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254中所述，測試單供體(BC-T、BC-V及BC-E)或多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞的功能特性及品質。單供體與多供體CD4 IL - 10細胞均產生高含量的IL-10、可變含量的IFN-γ、極低含量的IL-4及不可偵測的IL-2 (後者未顯示)，反映Tr1細胞的特徵性細胞介素產生概況(圖21)。
另外，活體外針對同種異體PBMC量測單供體(BC-T、BC-V及BC-E)或多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞對CD4 +及CD8 +T細胞增殖的抑制能力。PBMC用eFLuor670 (Invitrogen)標記。經標記的PBMC (1x10 5)用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28抗體(1 μg/mL)活化。在圓底96孔盤中，以0.2 mL的最終體積、以1:1比率添加單供體及多供體CD4 IL - 10細胞。共培養4天之後，如(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述，藉由eFluor670稀釋、使用流式細胞術測定其對經eFluor670標記之有反應細胞之增殖的抑制作用。圖22提供流式細胞術的結果。單供體及多供體CD4 IL - 10細胞很強地將同種異體CD4 +與CD8 +T細胞的活體外增殖均抑制超過80% (圖22)。
進一步分析CD4 IL - 10細胞針對骨髓性白血病細胞(ALL-CM)及紅血球系白血病細胞株(K562)的細胞毒性作用。單供體(BC-E及BC-V)或多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞與ALL-CM或K562細胞以1:1比率共培養。3天之後，收集細胞且對存活的CD45 低CD3 -目標細胞進行計數且藉由FACS、如(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述加以分析。單供體及多供體CD4 IL - 10細胞亦介導直接針對ALL-CM骨髓腫瘤細胞的強細胞毒性作用，而其未能殺滅敏感性K562細胞，K562細胞缺乏其細胞毒性活性所必需的I類MHC表現(圖23)。單供體(BC-E及BC-V)或多供體(BC-V/T/E) CD4 IL 10細胞針對此兩種目標細胞株(ALL-CM及K562)的細胞毒性活性類似。
亦使用人源化異種GvHD疾病模型 - 靜脈內注射有ALL-CM細胞(2.5x10 6)的NSG小鼠，在活體內測試單供體(BC-E)及多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞的細胞毒性作用。如圖20中所繪示，測試其對來自同種異體供體之人類PBMC所誘導之GvHD的影響以及其在治療背景下對細胞株ALL CM之急性骨髓性白血病生長的影響。
自Charles-River Italia (Calco, Italy)獲得八至十週齡雌性NOD scid γ (NSG)小鼠。實驗方案經Ospedale San Raffaele動物研究內部委員會(實驗動物照護及使用委員會(IACUC))批准。第0天，小鼠接受來自線性加速器的全身輻射。第0天注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)。第0天，不同組的小鼠注射：空白、同種異體PBMC (2.5x10 6)、單供體(BC-E，2.5x10 6)或以1:1:1比率自3個不同供體(BC-V/T/E，2.5 x10 6)彙集之多供體CD4 IL - 10細胞與同種異體PBMC (2.5x10 6)的組合，或第3天注射多供體CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)。所有細胞於250 μl體積的經伊氏修改之杜氏培養基(Iscove's modified Dulbecco's medium)中靜脈內投與。小鼠每週監測3至4次。
將NSG小鼠分成五組各5隻小鼠且各組在第0天用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4 IL - 10細胞(BC-E)；或(v)第3天投與多供體CD4 IL - 10(BC-V/T/E)細胞。如先前(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述量測骨髓性白血病惡化。
ALL-CM細胞投與NSG小鼠引起此等細胞快速擴增且所有小鼠在第20天死亡或必須處死。正如所料，注射PBMC防止白血病惡化。單供體及多供體CD4 IL10細胞與同種異體PBMC組合給與不干擾PBMC的抗骨髓性白血病效應。
ALL-CM細胞(當此等細胞的已大規模擴增正在進行時)投與之後3天注射多供體CD4 IL - 10(BC-V/T/E)細胞使得腫瘤生長被抑制。此等結果表明多供體CD4 IL - 10細胞在活體內具有直接的抗骨髓性白血病治療作用(圖24)。
然而，PBMC儘管具有有益的抗骨髓性白血病效應，但誘導極其嚴重的異種GvHD形式且截至第24天，所有小鼠死亡(圖25)。在研究中，測試單供體(BC-E)及多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞在投與NSG小鼠後抑制PBMC所誘導之異種GvHD的能力。第0天向NSG小鼠注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)。將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4 IL - 10細胞(BC-E)或第3天注射多供體(BC-V/T/E) CD4 IL - 10細胞。根據存活率及體重損失來量測動物的異種GvHD。另外，如(Bondanza等人, Blood, 2006, 107, 1828)所述監測背部弓起、皮毛狀況及皮膚完整性。若體重損失達到超過20%，則出於倫理原因而處死小鼠。 圖 25顯示第1天注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)後每一天的無GvHD之NSG小鼠%及隨後用PBMC聯合或不聯合單供體或多供體CD4 IL - 10細胞處理後之每一天的無GvHD之NSG小鼠%。
結果顯示，多供體CD4 IL - 10細胞不誘導異種GvHD且下調同種異體PBMC所誘導的異種GvHD。總體而言，此等結果表明，多供體CD4 IL - 10細胞下調重度異種GvHD，在治療背景下具有直接的抗骨髓性白血病作用且不干擾PBMC的保護性抗骨髓性白血病作用。 6.7.9. 實例 8 ： 源於四個不同供體之多供體 CD4IL - 10 細胞的授受性轉移
測試源於四個不同供體之多供體CD4 IL - 10細胞的授受性轉移抑制PBMC所誘導之異種GvHD的轉移能力。
在此等實驗中，在同種異體PBMC所誘導之GvHD的人源化小鼠模型中測試單供體CD4 IL - 10細胞(供體C；批號C)及源於4個不同供體的多供體CD4 IL - 10細胞(供體C、E、F及H；批號CEFH)。在此模型中，第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且第3天注射(靜脈內緩慢推注) (i) 2.5E+06個同種異體PBMC；(ii) 2.5E+06個同種異體PBMC與2.5E+06個單供體CD 4IL - 10細胞(批號C)的組合；(iii) 2.5E+06個同種異體PBMC與2.5E+06個細胞多供體CD4 IL - 10細胞(批號CEFH)的組合；或(iv) 2.5E+06個單獨細胞多供體CD4 IL - 10細胞(批號CEFH)。利用體重損失、毛皮外觀、皮膚外觀、背部弓起及活動性之綜合評分(參見Bondanza A等人, Blood2006;107:1828-36)確定異種GvHD。如圖26中所示，僅投與多供體CD4 IL - 10細胞的小鼠在研究結束時100%無異種GvHD。
總之，此資料證明，源於四個不同供體之多供體CD4 IL - 10細胞的授受性轉移抑制PBMC所誘導的異種GvHD而不誘導異種GvHD。 6.7.10. 實例 9 ： 產生 IL - 10 變異體
考慮其他物種的IL-10序列，藉由引入胺基酸修飾(例如取代、插入、缺失)來產生人類IL-10變異體。藉由如圖27A所提供之序列比對來確定修飾位點。利用比對鑑別出各物種中具有不同胺基酸的胺基酸位置且藉由引入胺基酸之取代、插入或缺失加以修飾。
人類IL-10變異體之兩個實例提供於圖27B中。藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之三個不同胺基酸(E、A及D)取代人類IL-10之三個胺基酸(D、I及A)來產生可能的huIL-10雜合體#1 (SEQ ID NO: 19)。藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之另一胺基酸(A105)取代人類IL-10之一個胺基酸(I105)來產生可能的huIL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 20)。圖 27C顯示人類IL-10 (SEQ ID NO: 1)與IL10 EBVB9 (SEQ ID NO: 18)的比對，其中「*」指示IL-10雜合體#1中發生取代的一或多個胺基酸位置且「#」指示IL-10雜合體#2的較佳I105→A105胺基酸取代。
如上文章節中所述將人類IL-10變異體選殖入表現載體中且測試變異體蛋白質的表現及功能。使用所選的人類IL-10變異體產生CD4 IL - 10細胞。如本文所提供，測試CD4 IL - 10細胞的效率。 6.7.11. 實驗方法及材料
細胞製備及細胞株. 藉由Ficoll-Hypaque梯度離心製備周邊血液單核細胞(PBMC)。使用CD4 T細胞分離套組(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)純化CD4 +T細胞，所得純度＞95%。由周邊血液CD14 +單核球產生成熟樹突狀細胞(DC)，使用CD14 +微珠(Miltenyi Biotech, Germany)、根據製造商說明書正向選擇且在37℃下、在補充有10%胎牛血清(FBS；Lonza, Italy)、100 U/mL青黴素/鏈黴素(Lonza, Italy)、2 mM L-麩醯胺酸(Lonza, Italy)的RPMI 1640 (Lonza, Italy)中、在10 ng/mL重組人類(rh) IL-4 (R&D Systems, Minneapolis MN, USA)及100 ng/mL rhGM-CSF (Genzyme, Seattle, WA, USA)存在下培養5天且用1 mg/mL脂多醣(LPS, Sigma, CA, USA)成熟額外兩天。
質體構築 .自pH15C (ATCC n° 68192)切得人類IL-10編碼序列，且將549 bp片段選殖入pBluKSM (Invitrogen)的多選殖位點中以獲得pBluKSM-hIL-10。如下獲得555 bp片段：自pBluKSM-hIL-10切得hIL-10且連接至1074.1071.hPGK.GFP.WPRE.mhCMV.dNGFR.SV40PA (在此稱為LV-ΔNGFR)，以獲得pLVIL-10。雙向啟動子(方向相反的人類PGK啟動子外加CMV啟動子的最小核心元件)的存在允許兩種轉殖基因共表現。
(Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)。藉由焦磷酸定序(Primm)驗證pLVIL-10序列。
LV-IL-10/ΔNGFR 載體產生及滴定. 藉由Ca 3PO 4將四個質體短暫共轉染至293T細胞中來產生VSV-G假型化第三代雙向慢病毒載體且藉由超速離心濃縮，如(Locafaro等人, Mol Ther. 2017;25(10):2254-2269)所述。藉由限制稀釋法估算效價，藉由HIV-1 Gag p24抗原免疫捕捉(NEN Life Science Products; Waltham, MA)量測載體顆粒，且載體感染力依照效價與顆粒之間的比率計算。效價範圍為5x10 8至6x10 9個轉導單位/mL，且感染力範圍為5x10 4至10 5個轉導單位/ng p24。
CD4 IL - 10 細胞株的產生 .如先前所述獲得經CD4轉導的多株細胞(Andolfi等人, Mol Ther. 2012;20(9):1778-1790；Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)。簡言之，純化的CD4 T細胞用可溶性抗CD3單株抗體(mAb, 30 ng/mL, OKT3, Janssen-Cilag, Raritan, NJ, USA)、抗CD28 mAb (1 μg/mL, BD)及rhIL-2 (50 U/mL, PROLEUKIN, Novartis, Italy)活化48小時。以20的感染倍率(MOI)用LV-IL-10/ΔNGFR (CD4 IL - 10)轉導T細胞。第11天，使用CD271 +微珠(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)對CD4 +ΔNGFR +細胞進行珠粒分選且在含有5%人類血清(BioWhittaker-Lonza, Washington)、100 U/mL青黴素-鏈黴素(BioWhittaker)及50 U/mL rhIL-2 (PROLEUKIN, Novartis, Italy)的X-VIVO15培養基中擴增。第7天及第10天，培養基用補充有50 U/mL rhIL-2的新鮮培養基置換。第14天，收集細胞，洗滌，且如先前(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述用同種異體餵養細胞混合物再刺激。14天後，收集細胞且冷凍。將解凍的CD4 IL - 10細胞再刺激且在第2輪及第3輪再刺激及擴增之後，進行活體外功能表徵且用於活體內實驗。
載體複本數分析 .轉導之後培養細胞11天，以便除去未整合的載體形式。使用QIAamp DNA血液小型套組(QIAGEN, 51106)，根據製造商說明書分離出基因體DNA。使用QX200液滴式數位PCR系統(Bio-Rad)，根據製造商說明書定量載體整合。
細胞介素測定 .為了量測細胞介素產生，在第2輪及第3輪再刺激之後，單供體及多供體CD4 IL - 10細胞不加以刺激或在最終體積為200 μl的培養基(圓底96孔盤，2x10 5每孔)中用固著的抗CD3 (10 µg/mL)及可溶性抗CD28 (1 µg/mL) mAb加以刺激。培養48小時之後收集上清液且藉由ELISA、根據製造商說明書(BD Biosciences)測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。
流式細胞術分析 .對於顆粒酶B (殖株MHGB04, Invitrogen, USA)的表現而言，CD4 IL - 10細胞在用CD4進行表面染色之後加以固定，滲透且使用BD Cytofix/Cytoperm™套組、根據製造商說明書(目錄號554714, Biolegend, USA)染色。染色的細胞用補充有1% FBS的PBS洗滌兩次且使用BD LSRFortessa分析(使用FlowJo 10軟體分析)。
殺滅分析 .第2輪及第3輪再刺激之後，在共培養實驗(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)中分析單供體及多供體CD4 IL - 10細胞的細胞毒性。簡言之，分別使用非骨髓性白血病細胞株K562及骨髓性白血病細胞株ALL-CM作為目標細胞且與CD4 IL - 10細胞一起以1:1比率(10 5個目標細胞及10 5個CD4 IL - 10細胞)接種3天。共培養結束時，收集細胞且基於CD45+、CD3-表現來分析K562及ALL-CM細胞且藉由FACS計數。
抑制分析 .為了量測單供體及多供體CD4 IL - 10細胞的抑制能力，使用細胞增殖染料eFluor® 670 (Invitrogen, CA, USA)，根據製造商說明書標記同種異體PBMC。經標記的細胞在GM-CSF及IL-4存在下、在抗CD3 mAb (50 ng/mL)存在下用來自CD14 +細胞的同種異體成熟樹突狀細胞(DC)活化。使用CD14微珠(Miltenyi Biotec)，根據製造商說明書正向選擇周邊血液CD14單核球。細胞在37℃下、在補充有10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL青黴素/鏈黴素(Lonza)、2 mM L-麩醯胺酸(Lonza)的RPMI 1640 (Lonza)中、在10 ng/mL重組人類(rh)IL-4 (R&D Systems)及100 ng/mL重組人類顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(rhGM-CSF)(Genzyme)存在下培養5天。為了產生成熟樹突狀細胞(mDC)，第5天用1 mg/mL脂多醣(LPS; Sigma)刺激細胞額外2天。第7天收集DC，進行表型分析且用於刺激T細胞。藉由流式細胞術檢查DC的純度及成熟狀態，以測定CD1a、CD14、CD86、CD83及HLA-DR的表現。
如下將經標記的細胞以200 μl的最終體積接種於96孔圓形孔盤中且培育3天：(i)每孔5x10 4個經標記的單獨PBMC細胞；(ii)每孔5x10 4個經標記的PBMC細胞 + 每孔5x10 3個成熟DC細胞 + 抗CD3 mAb (50 ng/mL)；(iii)每孔5x10 4個經標記的PBMC細胞 + 每孔5x10 4個單供體或多供體CD4IL-10細胞 + 每孔5x10 3個成熟DC細胞 + 抗CD3 mAb (50 ng/mL)。
培養3天之後，收集細胞且轉移至V形底96孔盤中進行免疫螢光染色。藉由對活 CD4 +eFluor670 +及CD8 +eFluor670 +細胞設門的FACS來分析細胞。如先前(Locafaro等人, Mol Ther 2017, 25, 2254)所述，藉由量測eFluor670標記的稀釋度來抑制百分比。
移植物抗宿主疾病模型 ：在所有實驗中使用6/8週齡雌性NSG小鼠。第0天，根據小鼠體重，使小鼠接受來自線性加速器之全身輻射，單次劑量為175至200 cGy。在一些實驗中，小鼠接受350 cGy的單次劑量輻射。小鼠靜脈內注射PBMC細胞(5x10 6或2.5x10 6)或CD4 IL - 10細胞(單供體或多供體-三個供體之細胞池-5x10 6或2.5x10 6)，或注射PBMC (5x10 6或2.5x10 6)與CD4 IL - 10細胞(5x10 6或2.5x10 6)的組合。如先前(Bondanza等人, Blood. 2006;107(5):1828-1836)所述，每週監測存活率、體重損失、活動性、毛皮、皮膚及背部弓起至少3次。當小鼠體重損失為20%時，出於倫理原因將小鼠安樂死。
或者，在第0天，小鼠如上所述接受全身輻射。第3天，向小鼠注射CD4 +T細胞(2.5x10 6)、單供體及多供體(三個供體之細胞池) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)，或CD4 +T細胞(2.5x10 6)與單供體及多供體(三個供體之細胞池) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)的組合。如上文所指示監測GvHD誘導情況。 7. 以引用之方式併入
本申請案中所引用之所有出版物、專利、專利申請案及其他文獻皆以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的，其引用的程度就如同各個別出版物、專利、專利申請案及其他文獻經個別地指示以引用之方式併入以用於所有目的一樣。 8. 等效物
雖然已說明且描述各種特定實施例，但以上說明不具限制性。應瞭解，可進行各種變化而不背離本發明之精神及範疇。熟習此項技術者在審閱本說明書後將顯而易知諸多變型。 9. 序列SEQ ID NO: 1 (人類IL-10胺基酸序列--蛋白質序列：Ref P22301) SEQ ID NO: 2 (人類IL-10例示性nt序列) SEQ ID NO: 3 (ΔNGFR胺基酸序列) SEQ ID NO: 4 (ΔNGFR例示性nt序列) SEQ ID NO: 5 (pLVIL-10核苷酸序列) SEQ ID NO: 6 (病毒介白素-10同源物，亦稱為介白素-10 BCRF1，亦稱為IL10H_EBVB9)蛋白質序列：Ref：P03180 SEQ ID NO: 7 (病毒介白素-10同源物cDNA序列) 核苷酸序列(cDNA)：Ref：NC_007605.1 SEQ ID NO: 8 (例示性人類IL-10變異體，其中胺基酸取代基於病毒IL-10) SEQ ID NO: 9 (例示性人類IL-10變異體，其中胺基酸取代基於病毒IL-10) SEQ ID NO: 10 (小家鼠；「小鼠」) SEQ ID NO: 11 (褐家鼠；「大鼠」) SEQ ID NO: 12 (恆河獼猴；「MACMU」) SEQ ID NO: 13 (金剛猩猩；「大猩猩」) SEQ ID NO: 14 (食蟹獼猴；「CYNO」) SEQ ID NO: 15 (阿努比斯狒狒；「東非狒狒」) SEQ ID NO: 16 (倭黑猩猩；「BONOBO」) SEQ ID NO: 17 (黑猩猩；「CHIMP」) SEQ ID NO: 18 (EBVB9) SEQ ID NO: 19 huIL-10雜合體#1 SEQ ID NO: 20 huIL-10雜合體#2
圖 1非限制性繪示一種雙向慢病毒載體的結構，該載體用於將人類IL-10及ΔNGFR編碼序列遞送至來自多供體的CD4 +T細胞中以產生多供體CD4 IL - 10細胞。
圖 2繪示雙向慢病毒載體的完整及環狀結構，其用於產生慢病毒載體以將人類IL-10及ΔNGFR編碼序列遞送至來自多供體的CD4 +T細胞中，從而產生多供體CD4 IL - 10細胞。
圖 3繪示用於產生CD4 IL - 10細胞的例示性方案。
圖 4A顯示經LV-IL-10/ΔNGFR (雙向慢病毒載體，其編碼人類IL-10及截斷形式的人類NGF受體)轉導之人類CD4 +T細胞中的CD4 +ΔNGFR +細胞百分比(平均值±SD，n=10，左灰色條柱)及載體複本數(VCN，平均值±SD，n=10，右灰色條柱)。 圖 4B顯示來自兩個代表性供體(供體B及供體C)之人類CD4 +T細胞中之CD4及ΔNGFR表現的FACS分析，該等T細胞經LV-IL-10/ΔNGFR轉導且使用抗CD271微珠純化。
圖 5顯示單供體CD4 IL - 10細胞在第二輪(TF2)及第三輪(TF3)再刺激之後的細胞介素產生概況。TF2 (左圖)及TF3 (右圖) CD4 IL - 10細胞不加以刺激(如箭頭所示)或經固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。所有樣品三重複測試。展示所測試之n=8個供體的平均值±SD。
圖 6A顯示表現顆粒酶B (GzB)之CD4 IL - 10細胞在第2輪刺激(TF2)之後的百分比，如藉由FACS所分析。展示n=7個不同單供體的盒鬚圖。 圖 6B顯示CD4 IL -10細胞(每孔10 5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10 5個)以1:1比率共培養3天時的死細胞%。盒鬚圖代表n=4個供體的資料且圓點代表單供體的資料。
圖 7A 及圖 7B顯示單供體CD4 IL - 10細胞可抑制同種異體CD4 +T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10 3個細胞)與可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4 +ΔNGFR -T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖7A顯示來自供體-C、供體-E及供體-F的結果且圖7B顯示來自供體-H、供體-I及供體-L的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4 IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4 IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 8A 及圖 8B顯示單供體CD4 IL - 10細胞可抑制同種異體CD8 +T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔5x10 3個細胞)與可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD8 +ΔNGFR -T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖8A顯示來自供體-C、供體-E及供體-F的結果且圖8B顯示來自供體-H、供體-I及供體-L的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4 IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4 IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 9顯示多供體CD4 IL - 10細胞在第三輪(TF3)再刺激之後的細胞介素產生概況相較於8位個別供體之CD4 IL - 10細胞所產生的平均值水平(+/-SD)。將來自三個供體的TF3 CD4 IL - 10細胞以1:1:1比率彙集且用固著的CD3 (10 μg/mL)及可溶性CD28 mAb (1 μg/mL)刺激48小時。收集培養上清液且藉由ELISA測定IL-10、IL-4、IL-5、IFN-γ及IL-22含量。圓點為多供體CD4 IL - 10細胞的結果；灰色條柱代表n=8個單供體的平均值±SD。
圖 10A顯示表現顆粒酶B (GzB)之多供體CD4 IL - 10細胞的百分比相較於為了產生細胞池而使用之n=3個單供體之CD4 IL - 10細胞之顆粒酶B平均表現量% (+/-SD)。第3輪刺激(TF3)之後，藉由FACS分析細胞。 圖 10B顯示多供體CD4 IL - 10細胞(每孔10 5個)與K562及ALL-CM細胞(每孔10 5個)以1:1比率共培養3天時的死細胞%。藉由FACS對殘餘白血病細胞(CD45+、CD3-)中的各目標細胞進行計數。圓點為多供體CD4 IL - 10的結果且灰色條柱代表為了產生細胞池而使用之n=3個單供體的平均值±SD。
圖 11A 及圖 11B顯示多供體CD4 IL - 10細胞可抑制同種異體CD4 +T細胞及CD8 +T細胞增殖。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在多供體CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔1x10 4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4 +ΔNGFR -T細胞及CD8 +ΔNGFR -T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖11A顯示自供體-C、供體-E及供體-F彙集之含有CD4 +細胞之多供體CD4 IL - 10細胞的結果。圖11B顯示自供體-H、供體-I及供體-L彙集之含有CD4 +細胞之多供體CD4 IL - 10細胞的結果。如下計算由CD4 IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4 IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 12繪示用於測試利用人類PBMC及/或多供體CD4 IL - 10(BC-C/E/F)細胞誘導GvHD的方案，該等細胞在輻射後第0天注射。
圖 13顯示PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體；BC-C/E/F) CD4 IL - 10細胞(5x10 6個細胞/小鼠)或PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)與多供體CD4 IL - 10細胞(三個供體；BC-C/E/F)(5x10 6個細胞/小鼠)組合注射後每一天之無GvHD之NSG小鼠%。
圖 14顯示在PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)、多供體(三個供體；(BC-C/E/F)) CD4 IL - 10細胞(5x10 6個細胞/小鼠)或PBMC (5x10 6個細胞/小鼠)與多供體CD4 IL - 10細胞(三個供體；(BC-C/E/F))(5x10 6個細胞/小鼠)組合注射之NSG小鼠中，CD4 IL -10細胞向脾臟(左圖)及骨髓(右圖)遷移。展示所測試之n=8個動物的盒鬚圖。
圖 15繪示用於測試利用CD4 +T細胞及多供體(BC-H/I/L)或單供體(BC-H) CD4 IL - 10細胞誘導GvHD的方案，該等細胞在輻射後第3天注射。
圖 16顯示注射後每一天之無GvHD的NSG小鼠%。
圖 17A 至 圖 17C顯示基於循環白血病細胞之減少及長期無白血病存活率所測試的移植物抗白血病(GvL)效果。如先前所述(Locafaro G.等人, Molecular Therapy 2017)量測白血病。第0天對NSG小鼠進行亞致死量的輻射且靜脈內注射骨髓性白血病細胞(ALL-CM)(2.5x10 6)。 圖 17A為實驗之圖解說明。 圖 17B顯示第3天注射PBMC (2.5x10 6)或單供體(供體BC-I及供體BC-H) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)之動物的無白血病存活率。 圖 17C顯示第3天注射PBMC (2.5x10 6)或多供體CD4 IL - 10細胞(來自供體BC-I及供體BC-H)(2.5x10 6)之動物的無白血病存活率。
圖 18A 至 圖 18C顯示第0天經亞致死量之輻射且靜脈內注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)之NSG小鼠的長期無白血病存活率量測值。 圖 18A為實驗之圖解說明。 圖 18B顯示第3天注射單獨的單核細胞(PBMC)(2.5x10 6)或單核細胞(PBMC)(2.5x10 6) + 單供體(供體BC-H及供體BC-I) CD4 IL - 10細胞(2.5x10 6)之動物的資料。 圖 18C顯示第3天注射單獨的單核細胞(PBMC)(2.5x10 6)或單核細胞(PBMC)(2.5x10 6) + 多供體CD4 IL - 10細胞(BC-I/H)(2.5x10 6)之動物的資料。
圖 19A 至 圖 19G顯示CD4 IL - 10細胞對NLPR3發炎體活化的抑制作用。 圖 19A顯示單供體(#1)之CD4 IL - 10細胞上清液對LPS活化之單核球產生IL-1β的影響。 圖 19B顯示來自另一單供體(#2)之CD4 IL - 10細胞上清液對LPS活化之單核球產生IL-1β的影響。 圖 19C顯示單供體(#1)之CD4 IL - 10細胞上清液抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(nigericine)(NIG)增強之IL-1β產生的作用。 圖 19D顯示單供體(#2)之CD4 IL - 10細胞上清液抑制經LPS誘導、經NLPR3發炎體活化劑尼日利亞菌素(NIG)增強之IL-1β產生的作用。 圖 19E為條形圖，其顯示單供體(BC-E)之CD4 IL - 10細胞上清液及自2個不同供體(BC-C/E)彙集之細胞在抗IL-10受體(抗IL-10R) mAb存在或不存在下對LPS誘導單核球產生IL-1β的影響。 圖 19F顯示多供體CD4 IL - 10細胞(BC-T/U/V)上清液在抗IL-10R mAb存在或不存在下對單核球產生IL-1β的影響。 圖 19G顯示多供體CD4 IL - 10細胞(BC-T/U/V)上清液在抗IL-10R mAb存在或不存在下對LPS與尼日利亞菌素組合誘導IL-18產生的影響。
圖 20繪示用於測試移植物抗骨髓白血病及異種GvHD影響的實驗方案。第0天向NSG小鼠靜脈內注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)。第3天，將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E，1:1:1彙集)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4 IL - 10細胞(BC-E)；或(v)多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E)，濃度如圖20所指示。
圖 21為條形圖，其描繪單供體(BC-V、BC-T、BC-V及BC-E)及多供體CD4 IL - 10細胞(細胞池：1:1:1彙集的BC-E、BC-V及BC-T)的細胞介素分泌概況。
圖 22顯示單供體(BC-V及BC-E)及多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E之細胞池)對同種異體CD4 +及CD8 +T細胞之活體外增殖的抑制作用。同種異體PBMC細胞用eFluor® 670 (每孔5x10 4個細胞)標記且在CD4 IL - 10細胞(每孔5x10 4個細胞)不存在或存在下用同種異體成熟樹突狀細胞(DC)(每孔1x10 4個細胞)及可溶性抗CD3 mAb刺激，有反應細胞:受抑制細胞的比率為1:1。培養3天之後，在對CD4 +ΔNGFR -(上)或CD8 +ΔNGFR -(下) T細胞設門之後，藉由eFluor® 670稀釋、使用流式細胞術測定有反應之增殖細胞的百分比。圖22顯示來自單供體BC-V及BC-E及自供體BC-V/T/E彙集之細胞的結果。指示增殖及抑制之百分比。如下計算由CD4 IL - 10細胞介導的抑制作用：100-([有反應細胞在CD4 IL - 10細胞存在下的增殖/單獨的有反應細胞之增殖]×100)。
圖 23顯示單供體(BC-E及BC-V)或多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E)與ALL-CM骨髓腫瘤細胞或K562細胞共培養中之活細胞%。結果顯示單供體及多供體CD4 IL - 10細胞對ALL-CM骨髓腫瘤細胞具有選擇性細胞毒性效應，但對缺乏I類MHC表現的K562細胞則不然。
圖 24顯示第0天靜脈內注射ALL-CM細胞(2.5x10 6)之NSG小鼠的無白血病存活率量測值。第3天，將小鼠分成五組且各組用以下處理：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/ET)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4 IL - 10細胞(BC-E)或(v)多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E)。圖形顯示各組動物的無白血病存活率。
圖 25顯示ALL-CM細胞(2.5x10 6)注射後每一天的無GvHD之NSG小鼠%及隨後投與以下各者後每一天的無GvHD之NSG小鼠%：(i)空白對照；(ii)同種異體單核細胞(PBMC)；(iii)同種異體PBMC及多供體CD4 IL - 10細胞(BC-V/T/E)；(iv)同種異體PBMC及單供體CD4 IL - 10細胞(BC-E)或(v)第3天投與多供體CD4 IL - 10細胞。
圖 26顯示給與2.5E+06個PBMC(對於供體C、E、F及H為同種異體的)的NSG小鼠在第22天皆死於急性及致死性異種GvHD。單供體CD4 IL - 10細胞(批號C)或多供體CD4 IL - 10細胞(批號CEFH)與PBMC組合投與分別防止75%小鼠(3/4小鼠)及80%小鼠(4/5小鼠)出現致死性異種GvHD。相比之下，2.5E+06個多供體CD4 IL - 10細胞的轉移不誘導GvHD的任何徵象。總之，此等結果表明，來自4個不同供體的多供體CD4 IL - 10細胞抑制病原性人類T細胞反應，其抑制效力如同或稍微大於單供體CD4 IL - 10細胞。PBMC：周邊單核細胞；GvHD：移植物抗宿主疾病。
圖 27A顯示不同物種之IL-10蛋白序列的比對，包括人類(SEQ ID NO: 1)、小家鼠「小鼠」(SEQ ID NO: 10)；褐家鼠「大鼠」(SEQ ID NO: 11)；恆河獼猴「MACMU」(SEQ ID NO: 12)；金剛猩猩「大猩猩」(SEQ ID NO: 13)；食蟹獼猴「CYNO」(SEQ ID NO: 14)；阿努比斯狒狒( Papio Anubis)「東非狒狒」(SEQ ID NO: 15)；倭黑猩猩「BONOBO」(SEQ ID NO: 16)；黑猩猩「CHIMP」(SEQ ID NO: 17)；或EBVB9 (SEQ ID NO: 18)。
圖 27B提供藉由在相應位置用病毒IL-10 (EBVB9)之胺基酸取代人類IL-10之一或多個胺基酸而產生之IL-10變異體的序列。亦提供例示性變異體之序列，其可為huIL-10雜合體#1 (SEQ ID NO: 19)且可為huIL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 20)。「*」表示一或多個發生取代的胺基酸位置。「#」表示IL-10雜合體#2 (SEQ ID NO: 20)的較佳I105→A105胺基酸取代。
圖 27C顯示人類IL-10 (SEQ ID NO: 1)與IL10 EBVB9 (SEQ ID NO: 18)的比對。「*」表示IL-10雜合體#1中發生取代的一或多個胺基酸位置。「#」表示IL-10雜合體#2的較佳I105→A105胺基酸取代。
該等圖僅出於圖解說明的目的而描繪本發明之各種實施例。熟習此項技術者自以下論述將容易認識到可以使用本文所繪示之結構及方法的替代實施例而此等替代實施例不悖離本文所述之本發明原理。
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Claims (188)

  1. 一種CD4 +T細胞(多供體CD4 IL - 10細胞)群，其已經基因修飾以包含編碼IL-10的外源聚核苷酸，其中該等CD4 +T細胞係獲自至少兩個不同T細胞供體。
  2. 如請求項1之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞係獲自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。
  3. 如請求項1或2之CD4 +T細胞群，其中該群體中的該等CD4 +T細胞總共具有六種、七種、八種、九種、十種、十一種、十二種或更多種不同HLA單倍型。
  4. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
  5. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  6. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
  7. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
  8. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
  9. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
  10. 如請求項1至3中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
  11. 如請求項10之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  12. 如請求項10至11中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
  13. 如請求項10至12中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
  14. 如請求項10至13中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有CD4 +T細胞在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
  15. 如請求項10至14中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
  16. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體中的所有該等CD4 +T細胞具有A*02或A*24對偶基因。
  17. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞中無一者永生化。
  18. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸包含可操作地連接至表現控制元件的編碼IL-10之聚核苷酸區段。
  19. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該IL-10為人類IL-10。
  20. 如請求項1至19中任一項之CD4 +T細胞群，其中該IL-10為病毒IL-10。
  21. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該編碼IL-10之聚核苷酸區段編碼具有SEQ ID NO: 1之序列的蛋白質。
  22. 如請求項21之CD4 +T細胞群，其中該編碼IL-10之聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2之序列。
  23. 如請求項20之CD4 +T細胞群，其中該編碼IL-10之聚核苷酸區段編碼具有SEQ ID NO: 6之序列的蛋白質。
  24. 如請求項23之CD4 +T細胞群，其中該編碼IL-10之聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 7之序列。
  25. 如請求項18至24中任一項之CD4 +T細胞群，其中該表現控制元件驅動該經編碼之IL-10的組成性表現。
  26. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物的聚核苷酸區段。
  27. 如請求項26之CD4 +T細胞群，其中該選擇標記物為ΔNGFR。
  28. 如請求項27之CD4 +T細胞群，其中該ΔNGFR具有SEQ ID NO: 3之序列。
  29. 如請求項27之CD4 +T細胞群，其中該聚核苷酸區段包含SEQ ID NO: 4之序列。
  30. 如請求項26之CD4 +T細胞群，其中該選擇標記物為EGFR多肽的截斷形式。
  31. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸具有SEQ ID NO: 5之序列。
  32. 如請求項1至31中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸整合於T細胞核基因體中。
  33. 如請求項1至31中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸未整合於該T細胞核基因體中。
  34. 如請求項32或33之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸進一步包含慢病毒載體序列。
  35. 如請求項1至34中任一項之CD4 +T細胞群，其中該外源聚核苷酸不整合於該T細胞核基因體中。
  36. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少70%的該等CD4 +T細胞表現IL-10。
  37. 如請求項36之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少90%的該等CD4 +T細胞表現IL-10。
  38. 如請求項37之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少95%或98%的該等CD4 +T細胞表現IL-10。
  39. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中以10 6個該等CD4 +T細胞/mL培養基計，該等經基因修飾的CD4 +T細胞組成性表現至少100 pg IL-10。
  40. 如請求項39之CD4 +T細胞群，其中以10 6個該等CD4 +T細胞/mL計，該等經基因修飾的CD4 +T細胞組成性表現至少100 pg、200 pg、500 pg、1 ng、5 ng、10 ng或50 ng IL-10。
  41. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個該等CD4 +T細胞/mL計，該等經基因修飾的CD4 +T細胞表現至少1 ng IL-10。
  42. 如請求項41之CD4 +T細胞群，其中在用抗CD3及抗CD28抗體活化之後，以10 6個該等CD4 +T細胞/mL計，該等經基因修飾的CD4 +T細胞表現至少2 ng、5 ng、10 ng、100 ng、200 ng或500 ng IL-10。
  43. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少5倍之量表現IL-10。
  44. 如請求項43之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞以比未修飾的CD4 +T細胞高至少10倍之量表現IL-10。
  45. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少70%的該等CD4 +T細胞表現來自該外源聚核苷酸的該選擇標記物。
  46. 如請求項45之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少90%的該等CD4 +T細胞表現來自該外源聚核苷酸的該選擇標記物。
  47. 如請求項46之CD4 +T細胞群，其中該群體內至少95%或98%的該等CD4 +T細胞表現來自該外源聚核苷酸的該選擇標記物。
  48. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現CD49b。
  49. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現LAG-3。
  50. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現TGF-β。
  51. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IFN-γ。
  52. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現GzB。
  53. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現穿孔素。
  54. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現CD18。
  55. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現CD2。
  56. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現CD226。
  57. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-22。
  58. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞在來自宿主的周邊血液單核細胞(PBMC)存在下尚未失能。
  59. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞在重組IL-10蛋白存在下尚未失能，其中該等CD4 +T細胞不表現該重組IL-10蛋白。
  60. 如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞在來自宿主的DC10細胞存在下尚未失能。
  61. 如請求項1至60中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞存在於冷凍懸浮液中。
  62. 如請求項1至60中任一項之CD4 +T細胞群，其中該等CD4 +T細胞存在於液體懸浮液中。
  63. 如請求項62之CD4 +T細胞群，其中該液體懸浮液先前已冷凍。
  64. 一種醫藥組合物，其包含： (i)如前述請求項中任一項之CD4 +T細胞群；其懸浮於 (ii)醫藥學上可接受之載劑。
  65. 一種製備多供體CD4 IL - 10細胞的方法，其包含以下步驟： (i)將獲自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞彙集；及 (ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來修飾該等經彙集的CD4 +T細胞， 藉此獲得該等多供體CD4 IL - 10細胞。
  66. 一種製備多供體CD4 IL - 10細胞的方法，其包含以下步驟： (i)獲得來自至少兩個不同T細胞供體的原代CD4 +T細胞；及 (ii)藉由引入編碼IL-10的外源聚核苷酸來分別修飾各供體的CD4 +T細胞，且接著 (iii)彙集該等經基因修飾的CD4 +T細胞， 藉此獲得該等多供體CD4 IL - 10細胞。
  67. 如請求項65或請求項66之方法，在步驟(i)之後且在步驟(ii)之前，在步驟(ii)之後，在步驟(ii)之後且在步驟(iii)之前，或在步驟(iii)之後，該方法進一步包含： 在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經抗CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下培育該等原代CD4 +T細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中在IL-2存在下進一步培育該等原代CD4 +T細胞。
  69. 如請求項65至68中任一項之方法，其中使用病毒載體將該外源聚核苷酸引入該等原代CD4 +T細胞中。
  70. 如請求項69之方法，其中該病毒載體為慢病毒載體。
  71. 如請求項65至70中任一項之方法，其中該外源聚核苷酸包含編碼具有SEQ ID NO: 1之序列之IL-10的區段。
  72. 如請求項53至58中任一項之方法，其中該編碼IL-10之聚核苷酸區段具有SEQ ID NO: 2或7之序列。
  73. 如請求項65至72中任一項之方法，其中該外源聚核苷酸進一步包含編碼選擇標記物之區段。
  74. 如請求項73之方法，其中該經編碼之選擇標記物為ΔNGFR。
  75. 如請求項74之方法，其中該經編碼之選擇標記物具有SEQ ID NO: 3之序列。
  76. 如請求項73至75中任一項之方法，在步驟(ii)之後，該方法進一步包含以下步驟： 分離出表現該選擇標記物之該等經基因修飾的CD4 +T細胞，藉此產生經富集的經基因修飾之CD4 +T細胞群。
  77. 如請求項76之方法，其中該富集群體中至少70%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10。
  78. 如請求項77之方法，其中該富集群體中至少90%、95%或98%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現IL-10。
  79. 如請求項76至78中任一項之方法，其中該富集群體中至少70%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現該選擇標記物。
  80. 如請求項70之方法，其中該富集群體中至少90%、95%或98%的該等經基因修飾之CD4 +T細胞表現該選擇標記物。
  81. 如請求項76至80中任一項之方法，其進一步包含培育該經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的步驟。
  82. 如請求項81之方法，其中培育該經富集之經基因修飾之CD4 +T細胞群的該步驟係在IL-2存在下、在抗CD3抗體及抗CD28抗體或經CD3抗體及CD28抗體塗覆之珠粒存在下執行。
  83. 如請求項65至82中任一項之方法，其進一步包含冷凍該等經基因修飾之CD4 +T細胞的後續步驟。
  84. 如請求項65至83中任一項之方法，其中在步驟(i)中，該等原代CD4 +T細胞獲自兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個不同T細胞供體。
  85. 如請求項84之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
  86. 如請求項65至85中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有至少4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  87. 如請求項65至86中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有2/2匹配。
  88. 如請求項65至87中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有2/2匹配。
  89. 如請求項65至88中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有2/2匹配。
  90. 如請求項65至89中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有至少3/4或4/4匹配。
  91. 如請求項84中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於5/10、6/10、7/10、8/10或9/10匹配。
  92. 如請求項84或91之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座彼此具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  93. 如請求項84及91至92中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-A基因座彼此具有小於2/2匹配。
  94. 如請求項84及91至93中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-B基因座彼此具有小於2/2匹配。
  95. 如請求項84及91至94中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-C基因座彼此具有小於2/2匹配。
  96. 如請求項84及91至95中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座彼此具有小於3/4或4/4匹配。
  97. 如請求項65至96中任一項之方法，其中該等至少兩個T細胞供體中之每一者具有A*02或A*24對偶基因。
  98. 如請求項65至97中任一項之方法，其中在步驟(i)中，自一或多個冷凍儲備液獲得該等原代CD4 +T細胞。
  99. 如請求項65至97中任一項之方法，其中在步驟(i)中，自該等至少兩個不同T細胞供體的未冷凍周邊血液單核細胞中獲得該等原代CD4 +T細胞。
  100. 如請求項99之方法，其進一步包含自該等周邊血液單核細胞中分離出CD4 +T細胞的步驟。
  101. 一種治療患者的方法，其包含： 向需要免疫耐受之患者投與如請求項1至63中任一項之多供體CD4 IL - 10細胞或如請求項64之醫藥組合物。
  102. 如請求項101之方法，其進一步包含將多供體CD4 IL - 10細胞之冷凍懸浮液解凍的先行步驟。
  103. 如請求項101或102之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物預防該患者之病原性T細胞反應或降低該病原性T細胞反應的嚴重程度。
  104. 如請求項101或102之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物減少發炎或增強免疫耐受性。
  105. 如請求項101或102之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物增強組織修復。
  106. 如請求項101至105中任一項之方法，其進一步包含向該患者投與單核細胞之步驟。
  107. 如請求項106之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物與該等單核細胞同時投與。
  108. 如請求項106之方法，其中在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物之前或之後，投與該等單核細胞。
  109. 如請求項101至108中任一項之方法，其進一步包含以下步驟： 在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞或醫藥組合物之前或之後，將造血幹細胞(HSC)供體之HSC投與該患者。
  110. 如請求項109之方法，其中該HSC供體與該患者為部分的HLA錯配。
  111. 如請求項110之方法，其中該HSC供體與該患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。
  112. 如請求項110之方法，其中該HSC供體與該患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  113. 如請求項110之方法，其中該HSC供體與該患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。
  114. 如請求項110之方法，其中該HSC供體與該患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
  115. 如請求項101至114中任一項之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該患者為HLA錯配或部分的HLA錯配。
  116. 如請求項115之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。
  117. 如請求項115之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該患者在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  118. 如請求項115之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該患者在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。
  119. 如請求項115之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該患者在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於2/4、3/4或4/4匹配。
  120. 如請求項101至119中任一項之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該HSC供體為HLA錯配或部分的HLA錯配。
  121. 如請求項120之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於5/10、6/10、7/10、8/10、9/10或10/10匹配。
  122. 如請求項120之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該HSC供體在HLA-A、HLA-B、HLA-C及HLA-DRB1基因座具有小於4/8、5/8、6/8、7/8或8/8匹配。
  123. 如請求項120之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該HSC供體在HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座具有小於2/2匹配。
  124. 如請求項120之方法，其中該等T細胞供體中的一或多者與該HSC供體在HLA-DRB1及HLA-DQB1基因座具有小於3/4或4/4匹配。
  125. 如請求項101至124中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物預防該等所移植之造血幹細胞所致的GvHD或減輕該GvHD的嚴重程度。
  126. 如請求項109至125中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物預防來自該等所移植之造血細胞之淋巴細胞的病原反應或降低該病原反應的嚴重程度。
  127. 如請求項101至126中任一項之方法，其中該患者具有贅生性細胞。
  128. 如請求項127之方法，其中該等贅生性細胞表現CD13、I類HLA及CD54。
  129. 如請求項127至128中任一項之方法，其中該等贅生性細胞表現CD112、CD58或CD155。
  130. 如請求項127至129中任一項之方法，其中該患者患有癌症，視情況其中該癌症為實體或血液學贅瘤。
  131. 如請求項101至130中任一項之方法，其中該患者患有選自由以下組成之群的癌症：腎上腺癌、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、成人之腦/CNS腫瘤、兒童之腦/CNS腫瘤、乳癌、男性乳癌、原發部位不明癌、卡斯特曼氏疾病(Castleman Disease)、子宮頸癌、大腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文氏腫瘤家族(Ewing Family Of Tumors)、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、妊娠期滋養層疾病、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、腎臟癌、喉及下咽癌、白血病、急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML，包括骨髓肉瘤及皮膚白血病)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性骨髓白血病(CML)、兒童之慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、淋巴瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及副鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、兒童之非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、腦垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤 - 成人軟組織癌、皮膚癌、皮膚癌 - 基底及鱗狀細胞、皮膚癌 - 黑色素瘤、皮膚癌 - 梅克爾細胞(Merkel Cell)、小腸癌、胃癌、睪丸癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、外陰癌、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)及威爾姆斯腫瘤(Wilms Tumor)。
  132. 如請求項131之方法，其中該患者患有骨髓癌。
  133. 如請求項131之方法，其中該患者患有AML或CML。
  134. 如請求項101之方法，其中該患者患有發炎或自體免疫疾病。
  135. 如請求項134之方法，其中該發炎或自體免疫疾病係選自由以下組成之群：1型糖尿病、自體免疫葡萄膜炎、自體免疫肝炎、白斑病、斑禿、類風濕性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、多發性硬化症、全身狼瘡、發炎性腸病、艾迪森氏病(Addison's disease)、葛瑞夫茲氏病(Graves' disease)、休格連氏症候群(Sjögren's syndrome)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、重症肌無力、自體免疫血管炎、惡性貧血、潰瘍性大腸炎、大皰性疾病、硬皮病及乳糜瀉。
  136. 如請求項135之方法，其中該發炎或自體免疫疾病為克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性大腸炎、乳糜瀉、1型糖尿病、狼瘡、牛皮癬、牛皮癬性關節炎或類風濕性關節炎。
  137. 如請求項101至129或134至136中任一項之方法，其中該患者患有涉及NLPR3發炎體高度活化的疾病或病症。
  138. 如請求項101至129或134至137中任一項之方法，其中該患者患有2型糖尿病、神經退化性疾病、心血管疾病或發炎性腸病。
  139. 如請求項101至129或134至137中任一項之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-1β產生增加的疾病或病症。
  140. 如請求項101至129或134至137中任一項之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之IL-18產生增加的疾病或病症。
  141. 如請求項101至129或134至137中任一項之方法，其中該患者患有涉及活化單核球、巨噬細胞或樹突狀細胞之成熟凋亡蛋白酶1產生增加的疾病或病症。
  142. 如請求項101至129中任一項之方法，其中該患者患有過敏性或異位性疾病。
  143. 如請求項142之方法，其中該過敏性或異位性疾病係選自由以下組成之群：哮喘、異位性皮炎及鼻炎。
  144. 如請求項101至129中任一項之方法，其中該患者具有食物過敏。
  145. 如請求項101至129中任一項之方法，其進一步包含在投與該CD4 +T細胞群或該醫藥組合物之前或之後，將器官移植至該患者的步驟。
  146. 如請求項145之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物預防該器官移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
  147. 如請求項101至129中任一項之方法，其進一步包含在投與該CD4 +T細胞群或該醫藥組合物之前或之後，將iPS細胞來源的細胞或組織移植至該患者的步驟。
  148. 如請求項147之方法，其中多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物預防該細胞移植的宿主排斥反應或降低該宿主排斥反應的嚴重程度。
  149. 如請求項101至129中任一項之方法，其進一步包含在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物之前或之後向該患者投與重組AAV之步驟。
  150. 如請求項149之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞或該醫藥組合物減少針對該重組AAV的免疫反應。
  151. 如請求項150之方法，其進一步包含在投與該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物之前或之後，向該患者投與免疫原性治療蛋白。
  152. 如請求項151之方法，其中該等CD4 IL - 10 / CAR細胞、該CD4 IL - 10 / CAR細胞群或該醫藥組合物減少針對該免疫原性治療蛋白的免疫反應。
  153. 如請求項151或152之方法，其中該免疫原性治療蛋白係選自治療抗體、因子VIII替代品、細胞介素及細胞介素突變蛋白。
  154. 如請求項101至129中任一項之方法，其中該患者對病毒或細菌感染具有過度的免疫反應。
  155. 如請求項154之方法，其中該患者具有冠狀病毒感染。
  156. 如請求項149或155之方法，其中該患者具有器官及/或組織損傷。
  157. 如請求項101至156中任一項之方法，其進一步包含偵測獲自該患者之生物樣品中之該選擇標記物的步驟， 藉此偵測多供體CD4 IL - 10T細胞的存在或不存在。
  158. 如請求項157之方法，其中該生物樣品為來自該患者之生檢或血液。
  159. 一種治療患有惡性疾病之患者的方法，其包含： 向該患者投與同種異體HSCT，及 投與治療有效量之多供體CD4 IL - 10細胞。
  160. 如請求項159之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞中之該等CD4 IL - 10細胞的供體無一者為HSCT供體。
  161. 一種治療血液學癌症之方法，其包含： 將足以誘導抗癌作用之量的多供體CD4 IL - 10細胞投與血液學癌症患者， 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體且藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾。
  162. 如請求項161之方法，其進一步包含在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞之前或之後向患者投與同種異體HSCT的步驟。
  163. 如請求項162之方法，其中多供體CD4 IL - 10細胞的量進一步足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)，而不抑制該同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效。
  164. 如請求項161至163中任一項之方法，其中該血液學癌症為骨髓性白血病。
  165. 如請求項161至162中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD13之癌細胞。
  166. 如請求項161至165中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現I類HLA的癌細胞。
  167. 如請求項161至166中任一項之方法，其中該骨髓性白血病為急性骨髓性白血病(AML)。
  168. 如請求項161至167中任一項之方法，其中該同種異體HSCT獲自與接受者相關或不相關的供體。
  169. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞對於該接受者而言為非自體的。
  170. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞對於該接受者而言為同種異體的。
  171. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞在投與該宿主之前，對宿主同種異體抗原未失能。
  172. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞為Tr1樣細胞。
  173. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞為多株的。
  174. 如請求項161至168中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞為多株的且對於該接受者而言為非自體的。
  175. 如請求項161至168中任一項之方法，其中在對該等多供體CD4 IL - 10細胞進行基因修飾之前，自至少兩個供體分離出該等細胞。
  176. 如請求項170之方法，其中該等至少兩個供體中無一者為與該同種異體HSCT供體相同的供體。
  177. 如請求項161至176中任一項之方法，其中該同種異體HSCT獲自與該接受者匹配或錯配的供體。
  178. 如請求項161至177中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD54的細胞。
  179. 如請求項161至178中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現I類HLA及CD54的癌細胞。
  180. 如請求項161至179中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD112的癌細胞。
  181. 如請求項161至180中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅表現CD58的癌細胞。
  182. 如請求項161至181中任一項之方法，其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅該宿主的癌細胞。
  183. 一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症之方法，其包含： 向個體投與同種異體HSCT； 將足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效之量的多供體CD4 IL - 10細胞投與該個體； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體且藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞對於該個體而言為非自體的且對於該同種異體HSCT供體而言為非自體的； 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞在投與該個體之前，對個體之同種異體抗原未失能；及 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞為多株的及Tr1樣的。
  184. 如請求項183之方法，其中在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞之後，投與該同種異體HSCT。
  185. 如請求項183之方法，其中在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞之前，投與該同種異體HSCT。
  186. 一種藉由同種異體造血幹細胞移植體(同種異體HSCT)治療血液學癌症之方法，其包含： 向個體投與同種異體HSCT； 將足以抑制或預防移植物抗宿主疾病(GvHD)而不抑制該同種異體HSCT之移植物抗白血病(GvL)或移植物抗腫瘤(GvT)功效之量的多供體CD4 IL - 10細胞投與該個體， 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞包含CD4 +T細胞，該等T細胞獲自至少兩個不同T細胞供體且藉由載體介導處於組成型啟動子控制下之人類IL-10編碼序列之基因轉移而經基因修飾， 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞靶向且殺滅該個體的癌細胞， 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞在投與該個體之前，對個體之同種異體抗原未失能；及 其中該等多供體CD4 IL - 10細胞對於該個體而言為非自體的，且為多株的且為Tr1樣的。
  187. 如請求項186之方法，其中在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞之後，投與該同種異體HSCT。
  188. 如請求項186之方法，其中在投與該等多供體CD4 IL - 10細胞之前，投與該同種異體HSCT。
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