JP2018526028A - 抗シアリルｔｎキメラ抗原受容体 - Google Patents

抗シアリルｔｎキメラ抗原受容体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＴＡＧ−７２の糖エピトープＳＴｎを発現するがんのための養子細胞療法用の改善された組成物を提供する。細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインが、ａ）糖タンパク質で発現するＳＴｎ抗原の１つ以上のエピトープに結合する、抗シアリルＴｎ（ＳＴｎ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１〜３、９〜１１、または１７〜１９に記載のＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖配列と、配列番号４〜６、１２〜１４、または２０〜２２に記載のＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖配列と、を含む、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片と、ｂ）膜貫通ドメインと、ｃ）１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ｄ）一次シグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体。
【選択図】図４Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年４月４日出願の米国仮出願第６２／３１７，９５０号の利益を主張し、米国特許法第１１９条（ａ）〜（ｄ）の下で、２０１５年８月３１日出願の韓国特許出願第１０−２０１５−０１２２７２７号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、ここに参照することによって本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称はＢＬＢＤ＿０６６＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは３８ＫＢであり、２０１６年８月３０日に作成され、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
背景
技術分野
本発明は、がんを治療するための改善された組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片を含む改善されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、これらのＣＡＲを発現するように遺伝子改変された免疫エフェクター細胞、及びＳＴｎを発現するがんを効果的に治療するためのこれらの組成物の使用に関する。
関連技術の説明
シアリル−Ｔｎ抗原（ＳＴｎ）は、ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒにα２，６結合したシアル酸残基を含む短いＯ−グリカンである。ＳＴｎの生合成は、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉと呼ばれる特異的なシアリルトランスフェラーゼによって媒介され、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ Ｉは、Ｏ−グリカンを伸長するグリコシルトランスフェラーゼと競合し、がん細胞がより長いＯ−グリカンを示すことを防止する。ＳＴｎ抗原の様々なエピトープは、ムチン及びムチン様タンパク質、例えばムチン１（ＭＵＣ１）、ムチン１６（ＭＵＣ１６）、及び腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）を含む糖タンパク質で発現する。
ＳＴｎは、胎生組織及び正常な成体組織で弱く発現するが、ヒト癌腫の８０％超でも発現する。ＳＴｎの検出は一般に、有害事象及びがん患者の全体的な生存率の減少に関連する。有害事象に関連するその汎癌腫（ｐａｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ）発現のため、Ｔｈｅｒａｔｏｐｅと名付けられた抗がんワクチンが、ＳＴｎ抗原に対して設計された。この免疫療法には多大な熱意が寄せられたものの、Ｔｈｅｒａｔｏｐｅは第ＩＩＩ相臨床治験に失敗した。
ＳＴｎを発現するがんの治療に関する臨床治験の別の失敗例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作されたＴ細胞を使用したものであった。Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓの科学者は、転移性結腸がん患者の糖タンパク質ＴＡＧ−７２で発現したＳＴｎ抗原に結合する抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞を使用した。患者は、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内または肝内注入を与えられた。抗ＳＴｎ ＣＡＲは、抗腫瘍活性を全く誘導しなかった。
したがって、ＳＴｎを標的とする効率的な免疫療法の方略の潜在性は未だ実現されていない。
本発明は概して、Ｔ細胞療法をもたらすための改善されたベクター及びその使用方法を提供する。より具体的には、本発明は、抗シアリルＴｎ抗原（ｓＴｎ）ＣＡＲ分子、及びｓＴｎ発現糖タンパク質を発現するがんの治療、防止、または寛解におけるそれらの使用に関する。
様々な実施形態において、細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、該細胞外ドメインが、ａ）ＳＴｎ抗原の１つ以上のエピトープまたは糖タンパク質で発現するＳＴｎ抗原に結合する、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１〜３、９〜１１、または１７〜１９に記載のＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖配列と、配列番号４〜６、１２〜１４、または２０〜２２に記載のＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖配列と、を含む、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片と；ｂ）膜貫通ドメインと；ｃ）１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと；ｄ）一次シグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体が提供される。
様々な実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチンまたはムチン様糖タンパク質からなる群から選択される糖タンパク質で発現する。
特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチン１及びムチン１６からなる群から選択されるムチンで発現する。
ある特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチン様タンパク質で発現する。
様々な実施形態において、ムチン様タンパク質は、ＴＡＧ−７２である。
特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原に結合する抗ＳＴｎ抗体または抗原結合断片は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原に結合する抗ＳＴｎ抗体または抗原結合断片は、ｓｃＦｖである。
特定の実施形態において、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号４〜６のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号９〜１１のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号１２〜１４のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
付加的な実施形態では、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１７〜１９のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号２０〜２２のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
いくつかの実施形態では、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、１５、もしくは２３のいずれか１つに記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号８、１６、もしくは２４のいずれか１つに記載の可変重鎖配列を含む。
ある特定の実施形態において、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号８に記載の可変重鎖配列を含む。
さらなる実施形態では、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１５に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号１６に記載の可変重鎖配列を含む。
特定の実施形態において、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、配列番号２３に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号２４に記載の可変重鎖配列を含む。
さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する。
付加的な実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、及びＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドに由来する。
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。
さらなる実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤ１に由来する。
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ１５２に由来する。
さらなる実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する。
ある特定の実施形態において、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子に由来する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３４に由来する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ１３７に由来する。
特定の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される。
特定の実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから単離される。
付加的な実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む。
ある特定の実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む。
さらなる実施形態では、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＰＤ１のヒンジ領域を含む。
特定の実施形態において、ヒンジ領域ポリペプチドは、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む。
付加的な実施形態では、ＣＡＲは、スペーサー領域をさらに含む。
さらなる実施形態では、スペーサー領域ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。
さらなる実施形態では、ＣＡＲは、シグナルペプチドをさらに含む。
特定の実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２５〜２７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲのアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが提供される。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
ある特定の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターである。
さらなる実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
さらなる実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクターである。
特定の実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
さらなる実施形態では、レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される。
特定の実施形態において、ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス排出エレメント、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む。
さらなる実施形態では、ベクターは、異種ポリアデニル化配列をさらに含む。
特定の実施形態において、ベクターは、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。
付加的な実施形態では、５’ＬＴＲのプロモーターは、異種プロモーターに置き換えられている。
さらなる実施形態では、異種プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである。
いくつかの実施形態では、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲは、レンチウイルスＬＴＲである。
ある特定の実施形態において、３’ＬＴＲは、１つ以上の改変を含む。
ある特定の実施形態において、３’ＬＴＲは、１つ以上の欠失を含む。
特定の実施形態において、３’ＬＴＲは、自己不活性化型（ＳＩＮ）ＬＴＲである。
特定の実施形態において、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である。
付加的な実施形態では、ポリヌクレオチドは、最適化されたコザック配列を含む。
付加的な実施形態では、ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするベクターを含む免疫エフェクター細胞が提供される。
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、本明細書において想定されるベクターを形質導入され、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、それにより、形質導入免疫エフェクター細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して維持される。
特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のマーカーの全ての発現が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する。
特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のマーカーの全ての発現が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する。
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
様々な実施形態において、本明細書において想定される免疫エフェクター細胞と、生理学的に許容される賦形剤と、を含む組成物が提供される。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲをコードするベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含む、本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法が提供される。
特定の実施形態において、本方法は、免疫エフェクター細胞を刺激し、ＣＤ３に結合する抗体及びＣＤ２８に結合する抗体に該細胞を接触させることによって該細胞の増殖を誘導し、それによって免疫エフェクター細胞の集団を生成することをさらに含む。
ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘導される。
付加的な実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。
いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞を含む。
特定の実施形態において、該細胞は、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、それにより、形質導入免疫エフェクター細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激される免疫エフェクター細胞の増殖と比較して維持される。
いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のマーカーの全ての発現が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する。
特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞では、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のマーカーの全ての発現が、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する。
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
様々な実施形態において、対象において糖タンパク質でＳＴｎを発現するがん細胞における細胞傷害性を増加させるための方法であって、ＳＴｎを発現するがん細胞における細胞傷害性を、ＳＴｎを発現するがん細胞における投与前の細胞傷害性と比較して増加させるのに十分な量で、本明細書において想定される組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
様々な実施形態において、対象において糖タンパク質でＳＴｎを発現するがん細胞の数を減少させるための方法であって、ＳＴｎを発現するがん細胞の数を、ＳＴｎを発現するがん細胞の投与前の数と比較して減少させるのに十分な量で、本明細書において想定される組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
様々な実施形態において、本明細書において想定される組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、がんの治療を必要とする対象にそれを行う方法が提供される。
特定の実施形態において、がんは、固形がんである。
さらなる実施形態では、がんは、食道がん、膀胱がん、腎がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、結腸がん、または乳がんである。
一実施形態において、がんは、食道がんである。
一実施形態において、がんは、膀胱がんである。
一実施形態において、がんは、腎がんである。
一実施形態において、がんは、肺がんである。
一実施形態において、がんは、卵巣がんである。
一実施形態において、がんは、子宮頸がんである。
一実施形態において、がんは、膵がんである。
一実施形態において、がんは、胆管癌である。
一実施形態において、がんは、胃がんである。
一実施形態において、がんは、結腸がんである。
一実施形態において、がんは、乳がんである。
特定の実施形態において、がんは、液性がんである。
一実施形態において、液性がんは、血液学的悪性腫瘍である。
一実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。
一実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、ＣＬＬである。
様々な実施形態において、対象において糖タンパク質でＳＴｎを発現するがんに関連する少なくとも１つ以上の症状を寛解させるための方法であって、ＳＴｎを発現するがん細胞に関連する少なくとも１つの症状を寛解させるのに十分な量で、本明細書において想定される組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
特定の実施形態において、寛解される１つ以上の症状は、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性及び易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される。
先行する実施形態のいずれかにおいて、ＳＴｎ抗原は、糖タンパク質のＴＡＧ−７２で発現する。
抗ＳＴｎ ＣＡＲ構築物の模式図を示す。 様々なＥ：Ｔ比での共培養において、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｅ）はＳＴｎ発現ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ｔ）を殺滅するが、非形質導入対照Ｔ細胞はＳＴｎ発現ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ｔ）を殺滅しないことを示す。 抗ＳＴｎ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入したＴ細胞におけるベクターコピー数（ＶＣＮ）を示す。 抗ＳＴｎ ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを形質導入したＴ細胞における抗ＳＴｎ ＣＡＲの細胞表面発現を示す。 図４は、例示的な抗ＳＴｎ ＣＡＲの抗がん活性を示す。図４Ａ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２でＳＴｎを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株及びＬＳ１７４Ｔ細胞株と共培養するとＩＦＮγを分泌する。図４Ｂ：共培養において、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅するが、非形質導入Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅しない。図４Ｃ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｅ）は、ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ｔ）と様々なＥ：Ｔ比で共培養すると用量依存性細胞傷害性を示す。 図４は、例示的な抗ＳＴｎ ＣＡＲの抗がん活性を示す。図４Ａ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２でＳＴｎを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株及びＬＳ１７４Ｔ細胞株と共培養するとＩＦＮγを分泌する。図４Ｂ：共培養において、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅するが、非形質導入Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅しない。図４Ｃ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｅ）は、ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ｔ）と様々なＥ：Ｔ比で共培養すると用量依存性細胞傷害性を示す。 図４は、例示的な抗ＳＴｎ ＣＡＲの抗がん活性を示す。図４Ａ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＴＡＧ７２でＳＴｎを発現するＪｕｒｋａｔ細胞株及びＬＳ１７４Ｔ細胞株と共培養するとＩＦＮγを分泌する。図４Ｂ：共培養において、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅するが、非形質導入Ｔ細胞はＬＳ１７４Ｔ細胞株を殺滅しない。図４Ｃ：抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｅ）は、ＬＳ１７４Ｔ細胞（Ｔ）と様々なＥ：Ｔ比で共培養すると用量依存性細胞傷害性を示す。 抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与が、皮下結腸腺癌細胞（ＬＳ１７４Ｔ）を受けたＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにおいて腫瘍の増殖を遅延させることを示す。
配列識別子の簡単な説明
配列番号１〜２４は、本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲの、例示的な軽鎖ＣＤＲ配列、重鎖ＣＤＲ配列、可変ドメイン軽鎖、及び可変ドメイン重鎖のアミノ酸配列を記載する。
配列番号２５〜２７は、例示的な抗ＳＴｎ ＣＡＲのアミノ酸配列を記載する。
配列番号２８〜３８は、様々なリンカーのアミノ酸配列を記載する。
配列番号３９〜５１は、プロテアーゼ切断部位及び自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５２は、ヒト腫瘍関連糖タンパク質（ＴＡＧ−７２）のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５３は、ＣＤＲ−Ｌ３を決定するための例示的な規則のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５４は、ＣＤＲ−Ｈ１を決定するための例示的な規則のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５５は、ＣＤＲ−Ｈ２を決定するための例示的な規則のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５６は、ＣＤＲ−Ｈ３を決定するための例示的な規則のアミノ酸配列を記載する。
配列番号５７は、コンセンサスコザック配列のヌクレオチド配列を記載する。
詳細な説明
Ａ． 概要
本発明は概して、糖タンパク質でＳＴｎ抗原を発現するがんの防止もしくは治療、またはＳＴｎを発現するがんに関連する少なくとも１つの症状の防止、治療、もしくは寛解を行うための、改善された組成物及び方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を使用した、糖タンパク質でＳＴｎ抗原を発現するがんの改善された養子細胞療法に関する。遺伝子的手法は、免疫認識及びがん細胞の排除を増強するための手段の可能性を提示する。有望な方略の１つは、細胞傷害性をがん細胞に再指向させるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように免疫エフェクター細胞を遺伝子操作することである。
本明細書において想定される養子細胞療法の改善された組成物及び方法は、容易に増幅し、インビボで長期持続性を示し、かつ糖タンパク質でシアリルＴｎ抗原（ＳＴｎ）を発現する細胞に対して抗原依存性細胞傷害性を示すことのできる、遺伝子改変免疫エフェクター細胞を提供する。
ＳＴｎ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、ＣＤ１７５ｓとしても知られ、最も単純なシアリル化ムチン型Ｏ−グリカンである。ＳＴｎは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の１つの残基がセリンまたはスレオニン残基にアルファ−Ｏ結合し、炭素６においてシアル酸（ヒトにおけるＮｅｕ５Ａｃ）で置換されたものから形成された二糖である。このシアリル化は、さもなければムチン型Ｏ−グリカンに見出される様々なコア構造の形成を妨げる。
ＳＴｎは、両方の性別の胎児の食道、胃、膵臓、結腸（杯細胞）、肺、乳腺、及び性腺組織といった胎生組織において発現する。しかしながら、胚発生中のＳＴｎの生物学的役割についてはあまり知られていない。
正常組織におけるＳＴｎ発現は稀であり、かつ／またはがん組織と比較して低いことを報告する、様々な研究が行われてきた。免疫組織化学的検査は、対応する健常な細胞と比較したがん細胞におけるＳＴｎの過剰発現を示した。したがって、ＳＴｎは癌胎児性抗原と説明された。ＳＴｎの新発現（ｎｅｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または過剰発現は多くの上皮がんで報告され、膵臓がん、膀胱がん、肺がん、結腸直腸がん、及び卵巣がんにおいて最も頻度が高かった。発癌の早期では、ＳＴｎは、がんの潜在的な前駆体とみなされるいくつかの上皮性良性病変、例えば食道扁平上皮の異形成、胃腸形成異常、結腸の中等度異形成、肺異型腺腫様過形成（ｌｕｎｇ ａｔｙｐｉｃａｌ ａｄｅｍａｔｏｕｓ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）、乳管過形成、及びアポクリン化生において過剰発現すると報告された。ＳＴｎの発現は、健常な状態ではＳＴｎの発現がない２つの組織である膵臓及び卵巣における良性病変内でも報告された。
ＳＴｎの発現を胃の炎症性疾患（胃炎）または結腸の炎症性疾患（潰瘍性大腸炎及び結腸クローン病）と関連付ける報告も存在する。胃炎では、症例の５０〜１００％でＳＴｎが検出された。潰瘍性大腸炎では、脱Ｏ−アセチル化ＳＴｎは、異形成癌腫配列の独立したマーカーであることが示された。脱Ｏ−アセチル化ＳＴｎは、結腸がんリスクに関連する別の炎症性疾患である結腸クローン病の症例の４４％でも検出された。
様々な実施形態において、抗ＳＴｎ抗体配列を含むＣＡＲは、高度に有効であり、インビボで堅実に増幅し、糖タンパク質でＳＴｎを発現するがん細胞を認識し、ＳＴｎを発現するがん細胞に対して細胞傷害活性を示す。ＳＴｎ抗原は、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、結腸がん、及び乳がんを含むがそれらに限定されない多様な固形腫瘍で高度に発現する。
一実施形態において、抗ＳＴｎ抗体または抗原結合断片、膜貫通ドメイン、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲが提供される。
一実施形態において、免疫エフェクター細胞が、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される。ＣＡＲを発現するＴ細胞は、本明細書において、ＣＡＲ Ｔ細胞またはＣＡＲ改変Ｔ細胞と称される。
様々な実施形態において、遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、固形腫瘍及び血液学的悪性腫瘍を含むがそれらに限定されない、糖タンパク質でＳＴｎを発現するがん細胞を有する患者に投与される。
別段の指示が具体的にない限り、特定の実施形態の実践には、当該技術分野の技能の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来法が用いられ、これらの多くは、例証の目的で以下に記載される。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００８年７月更新）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。
Ｂ． 定義
別様に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実践及び試験には、本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料が使用され得るが、好ましい実施形態の組成物、方法、及び材料を本明細書に記載する。本開示において、以下の用語は、以下の定義の通りである。
「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という冠詞は、本明細書において、その冠詞の文法上の目的語の１つ、または１つより多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように使用される。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（ある要素）」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
代替物（例えば、「ｏｒ（または）」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するよう理解されるものとする。
「及び／または」という用語は、代替物のうちの１つまたは両方のいずれかを意味するよう理解されるものとする。
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％ほど異なる分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の範囲の分量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という言葉は、記載されるステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の包含を暗示するが、いかなる他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の一群の除外を暗示するものではないと理解される。「からなる」とは、「からなる」という表現に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という表現は、列記される要素が必要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的になる」とは、この表現の後に列記されるあらゆる要素を含み、列記される要素の開示内容において指定される活性または作用に干渉も寄与もしない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「から本質的になる」という表現は、列記される要素が必要または必須であるが、列記される要素の活性または作用に物質的に影響する他の要素が存在しないことを示す。
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「付加的な実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した様々な箇所に前述の表現が存在しても、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているとは限らない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な様式で組み合わされてもよい。また、一実施形態においてある特徴が明白に記述されていることが、特定の実施形態においてその特徴を除外する根拠となることが理解される。
ＳＴｎ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、ＣＤ１７５ｓとしても知られ、最も単純なシアリル化ムチン型Ｏ−グリカンである。ＳＴｎは、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の１つの残基がセリンまたはスレオニン残基にアルファ−Ｏ結合し、炭素６においてシアル酸（ヒトにおけるＮｅｕ５Ａｃ）で置換されたものから形成された二糖である。このシアリル化は、さもなければムチン型Ｏ−グリカンに見出される様々なコア構造の形成を妨げる。
様々な実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチンまたはムチン様糖タンパク質からなる群から選択される糖タンパク質で発現する。
特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチン１及びムチン１６からなる群から選択されるムチンで発現する。
ある特定の実施形態において、ＳＴｎ抗原は、ムチン様タンパク質で発現する。
様々な実施形態において、ムチン様タンパク質は、ＴＡＧ−７２である。
Ｃ． キメラ抗原受容体
様々な実施形態において、がん細胞ＳＴｎ抗原に免疫エフェクター細胞の細胞傷害性を再指向させる遺伝子操作された受容体が提供される。これらの遺伝子操作された受容体は、本明細書において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と称される。ＣＡＲは、特異的な抗ＳＴｎの細胞免疫活性を示すキメラタンパク質を生成するために、所望の抗原（例えば、糖タンパク質で発現するＳＴｎ）に対する抗体ベースの特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせる分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」という用語は、異なる起源の異なるタンパク質またはＤＮＡの部分から構成されていることを説明するものである。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＳＴｎに結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの抗ＳＴｎ抗原結合ドメインと、標的細胞の表面上のＳＴｎ結合糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２との会合は、ＣＡＲのクラスター化をもたらし、ＣＡＲ含有細胞に活性化刺激を送達する。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞の特異性を再指向させ、それにより、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能力を利用して、主要組織適合性（ＭＨＣ）依存様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介することのできる分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を誘発するそれらの能力である。
様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＳＴｎ特異的結合ドメインを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片を含む細胞外結合ドメイン、１つ以上のヒンジドメインまたはスペーサードメイン、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインを含む膜貫通ドメイン、及び一次シグナル伝達ドメインを含む。
１． 結合ドメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的細胞、例えばがん細胞で発現するヒトＳＴｎ結合糖タンパク質に特異的に結合する、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片を含む、細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、及び「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、互換的に使用され、目的の標的抗原、例えばＳＴｎに特異的に結合する能力を有するＣＡＲを提示する。結合ドメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。
本明細書で使用される「特異的結合親和性」、または「特異的に結合する」、または「特異的に結合している」、または「特異的結合」、または「特異的に標的化する」という用語は、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片（またはそれらを含むＣＡＲ）が、バックグラウンド結合よりも高い結合親和性でＳＴｎに結合することを説明するものである。結合ドメイン（または結合ドメインを含むＣＡＲもしくは結合ドメインを含む融合タンパク質）は、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）でＳＴｎと結合もしくは会合する場合に、ＳＴｎ結合糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的に結合する。「高親和性」結合ドメイン（またはその一本鎖融合タンパク質）とは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
あるいは、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）の平衡解離定数（Ｋｄ）と定義される場合がある。本開示による結合ドメインポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の親和性は、従来の技術を使用して、例えば、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって、または結合会合（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、もしくは標識リガンドを使用した置換アッセイ（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｓｓａｙ）によって、あるいは、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能であるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００などの表面プラズモン共鳴デバイス、またはそれぞれＣｏｒｎｉｎｇ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能なＥＰＩＣシステムもしくはＥｎＳｐｉｒｅなどの光学バイオセンサ技術を使用して、容易に定量することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、及び米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、またはその均等物も参照されたい）。
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合より約２倍高いか、バックグラウンド結合より約５倍高いか、バックグラウンド結合より約１０倍高いか、バックグラウンド結合より約２０倍高いか、バックグラウンド結合より約５０倍高いか、バックグラウンド結合より約１００倍高いか、またはバックグラウンド結合より約１０００倍以上高い。
特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。「抗体」とは、免疫細胞により認識されるものなどの抗原決定基を含む脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸といった抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。
「抗原（Ａｇ）」とは、動物において抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することのできる化合物、組成物、または物質を指し、動物に注射または吸収される組成物（例えば、がん特異的タンパク質を含むものなど）を含む。例示的な抗原としては、脂質、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ペプチド、または核酸が挙げられるが、それらに限定されない。抗原は、開示される抗原などの異種抗原により誘導されるものを含む特定の体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。特定の実施形態において、標的抗原は、ＳＴｎ抗原である。
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
抗体には、その抗原結合断片、例えばラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ならびに抗原結合に関与する全長抗体の一部分などが含まれる。この用語には、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ接合抗体（例えば二重特異性抗体など）、及びそれらの抗原結合断片といった、遺伝子操作された形態も含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
当業者には理解されるように、また本明細書の他の箇所に記載されるように、完全抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む。各重鎖は、１つの可変領域と、第１、第２、及び第３の定常領域とからなり、一方で各軽鎖は、１つの可変領域と１つの定常領域とからなる。哺乳動物の重鎖は、α、δ、ε、γ、及びμに分類される。哺乳動物の軽鎖は、λまたはκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμの重鎖を含む免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は「Ｙ」形状を形成する。Ｙのステムは、一緒に結合した２本の重鎖の第２及び第３の定常領域（そしてＩｇＥ及びＩｇＭに関しては第４の定常領域）からなり、ジスルフィド結合（鎖間）がヒンジに形成される。重鎖γ、α、及びδは、３つのタンデム（一列）のＩｇドメインと柔軟性を高めるためのヒンジ領域とから構成された定常領域を有し、重鎖μ及びεは、４つの免疫グロブリンドメインから構成された定常領域を有する。第２及び第３の定常領域は、それぞれ「ＣＨ２ドメイン」及び「ＣＨ３ドメイン」と称される。Ｙの各アームは、単一の軽鎖の可変領域及び定常領域に結合した単一の重鎖の可変領域及び第１の定常領域を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、抗原結合に関与する。
軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断されている「フレームワーク」を含む。ＣＤＲは、従来の方法によって、例えばＫａｂａｔらによる配列（Ｗｕ，ＴＴ ａｎｄ Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）、Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）（参照により本明細書に組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１を参照されたい）、またはＣｈｏｔｈｉａらによる構造（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））などによって、定義または特定することができる。
軽鎖ＣＤＲを予測するための規則の例証となる例としては、次のものが挙げられる：ＣＤＲ−Ｌ１は、約残基２４で開始し、Ｃｙｓが先行し、約１０〜１７残基であり、Ｔｒｐが続く（通常はＴｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎだが、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ、Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕも続く）；ＣＤＲ−Ｌ２は、ＣＤＲ−Ｌ１の端部の後の約１６残基で開始し、概してＩｌｅ−Ｔｙｒが先行するが、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ、Ｉｌｅ−Ｐｈｅも先行し、７残基である；そしてＣＤＲ−Ｌ３は、ＣＤＲ−Ｌ２の端部の後の約３３残基で開始し、Ｃｙｓが先行し、７〜１１残基であり、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙが続く（ＸＸＸは任意のアミノ酸である、配列番号５３）。
重鎖ＣＤＲを予測するための規則の例証となる例としては、次のものが挙げられる：ＣＤＲ−Ｈ１は、約残基２６で開始し、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（配列番号５４）が先行し、１０〜１２残基であり、Ｔｒｐが続く（通常はＴｒｐ−Ｖａｌだが、Ｔｒｐ−Ｉｌｅ、Ｔｒｐ−Ａｌａも続く）；ＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１の端部の後の約１５残基で開始し、概してＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ（配列番号５５）またはいくつかの変形形態が先行し、１６〜１９残基であり、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｐｈｅ／Ｔｈｒ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ｉｌｅ／Ａｌａが続く；そしてＣＤＲ−Ｈ３は、ＣＤＲ−Ｈ２の端部の後の約３３残基で開始し、Ｃｙｓ−ＸＸＸ−ＸＸＸ（通常はＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ）が先行し、３〜２５残基であり、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ（配列番号５６）が続く。
一実施形態において、軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法に従って決定される。
一実施形態において、軽鎖ＣＤＲならびに重鎖ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ法に従って決定され、重鎖ＣＤＲ１は、ＡｂＭ法に従って決定され、これは、Ｋａｂａｔ法とＣｌｏｔｈｉａ法との間の含むである。例えば、Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ Ｎ ＆ Ｒｅｅｓ ＡＲ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２０００ Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９−２４及びＭｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４；２４８：５１−９１を参照されたい。例えばＡｂＹｓｉｓ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ／）などの、ＣＤＲを予測するためのプログラムが公的に利用可能である。
異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内で比較的保存されている。構成物である軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間におけるＣＤＲの位置決定及びアライメントに役立つ。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは通常、Ｎ末端から開始して順次付番されてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称され、また通常は、特定のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。したがって、抗体の重鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３と称され、一方で、抗体の軽鎖の可変ドメインに位置するＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３と称される。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体間で異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置しか、抗原結合に直接関与しない。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な軽鎖ＣＤＲの例証となる例としては、配列番号１〜３、９〜１１、及び１７〜１９に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な重鎖ＣＤＲの例証となる例としては、配列番号４〜６、１２〜１４、及び２０〜２２に記載のＣＤＲ配列が挙げられるが、それらに限定されない。
「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な軽鎖可変領域の例証となる例としては、配列番号７、１５、及び２３に記載の軽鎖可変領域配列が挙げられるが、それらに限定されない。
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な重鎖可変領域の例証となる例としては、配列番号８、１６、及び２４に記載の重鎖可変領域配列が挙げられるが、それらに限定されない。
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、または単一抗体の軽鎖及び重鎖の遺伝子が形質導入されている細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られる方法によって、例えば骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞との融合からハイブリッド抗体を形成する細胞を作製することによって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基、及びマウスなどの別の種に由来するＣＤＲ（これが一般的に抗原結合をもたらす）を有する。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、キメラ抗体またはその抗原結合断片である抗原特異的結合ドメインを含む。
好ましい実施形態では、抗体は、ヒトＳＴｎ発現糖タンパク質に特異的に結合するヒト抗体（例えばヒトモノクローナル抗体など）またはその断片である。ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を、上述のような既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製されてもよい。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞株が、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）によって説明されている。加えて、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照されたい。ヒト抗体が、起点となる非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する場合、遺伝子シャフリングを使用して、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得ることもできる。（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ ＷＯ ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲまたはＣＤＲ残基を有しない完全ヒト抗体をもたらす。
一実施形態において、ＣＡＲは、「ヒト化」抗体を含む。ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えばマウス、ラット、または合成）の免疫グロブリンに由来する１つ以上のＣＤＲとを含む、免疫グロブリンである。ＣＤＲをもたらす非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークをもたらすヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。一実施形態において、全てのＣＤＲが、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域が存在する必要はないが、存在する場合、それらは、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％以上同一でなければならない。したがって、場合によりＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体または他のモノクローナル抗体は、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない、付加的な保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化抗体は、遺伝子操作の手段によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
特定の実施形態において、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片は、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体（ＶＨＨ））、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）を含むが、それらに限定されない。
本明細書で使用される「ラクダＩｇ」または「ラクダ科ＶＨＨ」は、重鎖抗体の最小の既知の抗原結合単位を指す（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ，ｅｔ ａｌ，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，２１：３４９０−３４９８（２００７））。「重鎖抗体」または「ラクダ科抗体」は、２つのＶＨドメインを含み、軽鎖を含まない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｌ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：２５−３８（１９９９）、ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９４／２５５９１、米国特許第６，００５，０７９号）。
「免疫グロブリン新抗原受容体」の「ＩｇＮＡＲ」は、１つの可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）ドメインと、５つの定常新抗原受容体（ＣＮＡＲ）ドメインとのホモ二量体からなる、サメ免疫レパートリー由来の抗体のクラスを指す。ＩｇＮＡＲは、最も小さい既知の免疫グロブリンベースのタンパク質の足場の一部であり、高度に安定であり、効率的な結合特性を有する。この本質的な安定性は、（ｉ）マウス抗体に見られる従来の抗体のＶＨ及びＶＬドメインと比較して相当数の荷電した親水性の表面露出残基を提示する、基礎となるＩｇ足場と、（ｉｉ）ループ間ジスルフィド架橋、及びループ内水素結合のパターンを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）ループ内の安定化構造特徴との両方に起因し得る。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が単一の抗原結合部位を有する２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映した名称である残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有しながらも抗原に架橋結合することのできるＦ（ａｂ’）２断片をもたらす。
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、密接な非共有性会合状態にある、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で会合することができるように、可動性ペプチドリンカーによって共有結合していてもよい。各可変ドメインの３つの超可変領域（ＨＶＲ）がＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するように相互作用するのは、この構成においてである。集合的に、６つのＨＶＲは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性であるにせよ、抗原を認識しそれに結合する能力を有する。
Ｆａｂ断片は、重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端におけるいくつかの残基の付加により、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に対する、本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、ヒンジシステインを間に有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
「ダイアボディ」という用語は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖内で重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続したもの（ＶＨ−ＶＬ）を含む。同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合させられ、２つの抗原結合部位を作り出す。ダイアボディは、二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７、ＷＯ １９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）に、より詳細に記載されている。トリアボディ及びテトラボディもまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）に記載されている。
「単一ドメイン抗体」すなわち「ｓｄＡｂ」または「ナノボディ」は、抗体重鎖の可変領域（ＶＨドメイン）または抗体軽鎖の可変領域（ＶＬドメイン）からなる抗体断片を指す（Ｈｏｌｔ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１（１１）：４８４−４９０）。
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に、いずれかの配向（例えば、ＶＬ−ＶＨまたはＶＨ−ＶＬ）で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４），ｐｐ．２６９−３１５を参照されたい。
好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖであり、かつマウス、ヒト、またはヒト化型のｓｃＦｖであってもよい、抗原特異的結合ドメインを含む。一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングされ得る。このようなハイブリドーマの産生は日常的となっている。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）のクローニングに使用することのできる技術は、例えば、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
特定の実施形態において、ＳＴｎを発現するヒト糖タンパク質に結合するｓｃＦｖである抗原特異的結合ドメイン。
本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な可変軽鎖の例証となる例としては、配列番号７、１５、及び２３に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な可変重鎖の例証となる例としては、配列番号８、１６、及び２４に記載のアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない。
例示的なＳＴｎ特異的結合ドメインは、少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む、ＳＴｎに特異的な免疫グロブリン可変領域である。「ヒトフレームワーク領域」は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型（すなわち、天然起源）のフレームワーク領域、その領域内のアミノ酸の約５０％未満（例えば、好ましくは約４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、もしくは１％未満）が欠失しているか、もしくは（例えば、対応する位置における非ヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つ以上のアミノ酸残基で）置換されている、ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域、または、一実施形態では、免疫原性が低減するように、その領域内のアミノ酸の約５０％未満（例えば、４５％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、もしくは５％未満）が欠失しているか、もしくは（例えば、露出残基の位置で、かつ／もしくは対応する位置におけるヒト免疫グロブリンフレームワーク領域の１つ以上のアミノ酸で）置換されている、非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域を指す。
ある特定の実施形態において、ヒトフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン可変領域の野生型フレームワーク領域である。ある他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の位置にアミノ酸欠失または置換を有する、ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。他の実施形態では、ヒトフレームワーク領域は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の位置にアミノ酸欠失または置換を有する、非ヒト免疫グロブリン可変領域の変更されたフレームワーク領域である。
特定の実施形態において、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、ヒト重鎖ＦＲ３、ヒト軽鎖ＦＲ４、及びヒト重鎖ＦＲ４から選択される、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
ＳＴｎ特異的結合ドメイン内に存在し得るヒトＦＲとしては、例示的なＦＲの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のアミノ酸が置換されているかもしくは欠失している、本明細書に提供される例示的なＦＲのバリアントも挙げられる。
ある特定の実施形態において、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、（ａ）ヒト軽鎖ＦＲ１、ヒト軽鎖ＦＲ２、ヒト軽鎖ＦＲ３、及びヒト軽鎖ＦＲ４を含むヒト化軽鎖可変領域、ならびに（ｂ）ヒト重鎖ＦＲ１、ヒト重鎖ＦＲ２、ヒト重鎖ＦＲ３、及びヒト重鎖ＦＲ４を含むヒト化重鎖可変領域を含む。
本明細書に提供されるＳＴｎ特異的結合ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲも含む。そのようなＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３、ならびに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３から選択される、非ヒトＣＤＲまたは変更された非ヒトＣＤＲであり得る。ある特定の実施形態において、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、（ａ）軽鎖ＣＤＲＬ１、軽鎖ＣＤＲＬ２、及び軽鎖ＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｂ）重鎖ＣＤＲＨ１、重鎖ＣＤＲＨ２、及び重鎖ＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、配列番号１〜３、９〜１１、または１７〜１９に記載の軽鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、配列番号１〜３、９〜１１、または１７〜１９に記載の軽鎖ＣＤＲ配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
一実施形態において、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、配列番号４〜６、１２〜１４、または２０〜２２に記載の重鎖ＣＤＲ配列を含む。特定の実施形態では、ＳＴｎ特異的結合ドメインは、配列番号４〜６、１２〜１４、または２０〜２２に記載の重鎖ＣＤＲ配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有する重鎖ＣＤＲ配列を含む。
「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な軽鎖可変領域の例証となる例としては、配列番号７、１５、または２３に記載の軽鎖可変領域配列が挙げられるが、それらに限定されない。
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、または本明細書に開示される他の抗体断片のものを含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを構築するのに好適な重鎖可変領域の例証となる例としては、配列番号８、１６、または２４に記載の重鎖可変領域配列が挙げられるが、それらに限定されない。
２． リンカー
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間に、例えば、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、分子の適切な空間配置及び立体構造のために付加されたリンカー残基を含む。特定の実施形態において、リンカーは、可変領域連結配列である。「可変領域連結配列」とは、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖及び重鎖の可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、ＶＨドメインとＶＬドメインとを接続し、２つのサブ結合ドメインの相互作用と適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、リンカーは、１つ以上の重鎖もしくは軽鎖の可変ドメイン、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び／または一次シグナル伝達ドメインを分離する。ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、もしくは約１０〜約２０アミノ酸、またはその間の任意のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸長である。
リンカーの例証となる例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で知られる他の可動性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは比較的構造不定であり、したがって、本明細書に記載のＣＡＲなどの融合タンパク質のドメイン間の中性のテザーとして機能することができる場合がある。グリシンは、アラニンよりも有意にファイ−プサイ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりも大幅に制限が少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照されたい）。特定の実施形態におけるＣＡＲの設計が全体的または部分的に可動性であるリンカーを含み得、その結果リンカーが、所望のＣＡＲ構造をもたらすように可動性リンカーならびに可動性の低い構造を付与する１つ以上の部分を含み得ることは、当業者であれば認識するであろう。
他の例示的なリンカーとしては、次のアミノ酸配列が挙げられるが、それらに限定されない：ＧＧＧ；ＤＧＧＧＳ（配列番号２８）；ＴＧＥＫＰ（配列番号２９）（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号３０）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ｅｔ ａｌ．１９９５、上記）；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、１、２、３、４、または５である）（配列番号３１）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号３２）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号３３）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号３４）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号３５）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号３６）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号３７）。あるいは、可動性リンカーは、ＤＮＡ結合部位とペプチド自体との両方をモデリングすることのできるコンピュータプログラムを使用して（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ＆ Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）、またはファージディスプレイ法により、合理的に設計することができる。一実施形態において、リンカーは、次のアミノ酸配列：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３８）を含む（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０１（４）：１６３７−１６４４（２００３））。
３． スペーサードメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインには１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化が可能となるように抗原結合ドメインをエフェクター細胞の表面から離して移動させる領域を指す（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２及びＣＨ３を含むがそれらに限定されない、免疫グロブリンの一部分である。スペーサードメインは、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。
４． ヒンジドメイン
ＣＡＲの結合ドメインには、概して、１つ以上の「ヒンジドメイン」が続き、これは、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化が可能となるように、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して位置付ける機能を果たす。ＣＡＲは概して、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ヒンジドメインは、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域または変更された免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
「変更されたヒンジ領域」とは、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換もしくは欠失）を有する天然起源のヒンジ領域、（ｂ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換もしくは欠失）を有する、少なくとも１０アミノ酸長（例えば、少なくとも１２、１３、１４、または１５アミノ酸長）の天然起源のヒンジ領域の一部分、または（ｃ）（４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５、または少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５アミノ酸長であり得る）コアヒンジ領域を含む天然起源のヒンジ領域の一部分を指す。ある特定の実施形態において、天然起源の免疫グロブリンヒンジ領域内の１つ以上のシステイン残基は、１つ以上の他のアミノ酸残基（例えば、１つ以上のセリン残基）で置換されていてもよい。変更された免疫グロブリンヒンジ領域では、代替的または付加的に、野生型免疫グロブリンヒンジ領域のプロリン残基が別のアミノ酸残基（例えば、セリン残基）で置換されていてもよい。
本明細書に記載のＣＡＲで使用するのに好適な例証となるヒンジドメインとしては、ＣＤ８α及びＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域が挙げられ、これは、これらの分子の野生型ヒンジ領域であってもよいし、変更されていてもよい。別の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
５． 膜貫通（ＴＭ）ドメイン
「膜貫通ドメイン」とは、細胞外結合部分と細胞内シグナル伝達ドメインとを融合させ、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固着させる、ＣＡＲの一部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換えの起源のいずれに由来してもよい。ＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１に由来し得る（すなわち、少なくともこれらの膜貫通領域（複数可）を含み得る）。特定の実施形態において、ＴＭドメインは合成的であり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、またはＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態では、ＣＡＲは、ＰＤ１、ＣＤ１５２、もしくはＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、ＣＡＲのＴＭドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを連結させる、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の間のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンベースのリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
６． 細胞内シグナル伝達ドメイン
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、ヒトＴＡＧ−７２ポリペプチドに対する抗ＳＴｎ ＣＡＲの効果的な結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及びＣＡＲ結合標的細胞に対する細胞傷害因子の放出を含む細胞傷害活性、または細胞外ＣＡＲドメインに対する抗原結合により誘発される他の細胞応答を誘発することに関与する、ＣＡＲの部分を指す。
「エフェクター機能」という用語は、免疫エフェクター細胞の特殊機能を指す。例えばＴ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、またはサイトカインの分泌を含む補助もしくは活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊機能を行わせる、タンパク質の一部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体を用いてもよいが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮化部分が使用される範囲内では、そのような短縮化部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる短縮化部分をも含むよう意図される。
ＴＣＲによって生成されたシグナル単独ではＴ細胞の完全な活性化に不十分であり、二次的すなわち共刺激性のシグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの明確に異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、すなわち、ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメインと、抗原依存様式で作用して二次的すなわち共刺激性のシグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインとによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」及び「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
一次シグナル伝達ドメインは、刺激方法または阻害方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。刺激様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフすなわちＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
特定の実施形態で使用するのに好適なＩＴＡＭを含む一次シグナル伝達ドメインの例証となる例としては、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。特定の好ましい実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。細胞内一次シグナル伝達ドメイン及び共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端に、任意の順序でタンデムに連結していてよい。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性及び増幅を増強するために、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。共刺激分子は、抗原に結合するとＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要とされる第２のシグナルを提供する、抗原受容体またはＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。そのような共刺激分子の例証となる例としては、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、及びＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
なおも別の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７及びＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３７共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ１３４共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態において、ＣＡＲは、がん細胞でＳＴｎを発現する糖タンパク質に特異的に結合する抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片を含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ならびにＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインを含む。
一実施形態において、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＩｇＧ４ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３、ＰＤ１ヒンジ、ＣＤ１５２ヒンジ、及びＣＤ８αヒンジからなる群から選択されるヒンジドメイン；Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン；ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の間のアミノ酸長の短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー；ならびにＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子に由来する１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびにＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来する一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＩｇＧ１ヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ポリペプチド及びＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＣＤ８αポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＣＤ８α膜貫通ドメイン；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＰＤ１ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＰＤ１ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＰＤ１ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＣＤ１５２ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ１３７細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＣＤ１５２ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ１３４細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ；ＣＤ１５２ヒンジポリペプチドを含むヒンジドメイン；約３〜約１０アミノ酸のポリペプチドリンカーを含むＰＤ１またはＣＤ１５２膜貫通ドメイン；ＣＤ２８細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；及びＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含む。
さらに、本明細書において想定されるＣＡＲの設計は、未改変のＴ細胞または他のＣＡＲを発現するように改変されたＴ細胞と比較して、本ＣＡＲを発現するＴ細胞の増幅、長期持続性、及び細胞傷害特性の改善を可能にする。
Ｄ． ポリペプチド
ＣＡＲポリペプチド及びその断片、それらを含む細胞及び組成物、ならびにポリペプチドを発現するベクターを含むがそれらに限定されない、様々なポリペプチドが本明細書において想定される。好ましい実施形態では、１つ以上のＣＡＲを含むポリペプチドが提供される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、配列番号２５〜２７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む抗ＳＴｎ ＣＡＲである。
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として互換的に使用される。ポリペプチドは、合成されても組換え産生されてもよい。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、それらは、全長タンパク質配列または全長タンパク質の断片を含み得、かつ、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該技術分野で知られる天然起源と非天然起源との両方の他の修飾を含み得る。様々な実施形態において、ＣＡＲポリペプチドは、タンパク質の移動を同時翻訳によってか翻訳後かに指向するシグナル（またはリーダー）配列を、タンパク質のＮ末端に含む。本明細書において想定されるＣＡＲにおいて有用な好適なシグナル配列の例証となる例としては、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドが挙げられるが、それらに限定されない。ポリペプチドは、種々の周知の組換え技術及び／または合成技術のうちのいずれを使用して調製されてもよい。本明細書において想定されるポリペプチドは、本開示のＣＡＲ、または本明細書において想定されるＣＡＲの１つ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を有する配列を明確に包含する。
本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、また細胞の他の成分との会合から、ペプチドもしくはポリペプチド分子をインビトロで単離及び／または精製することを指す（すなわち、それは、インビボの物質と著しく会合していない）。同様に、「単離された細胞」とは、インビボ組織または器官から得られ、細胞外基質を実質的に含まない細胞を指す。
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入において天然起源のポリペプチドと異なり得る。そのようなバリアントは、天然起源であっても、または、例えば、上記のポリペプチド配列のうちの１つ以上を改変することによって合成的に生成されてもよい。例えば、特定の実施形態において、１つ以上の置換、欠失、付加、及び／または挿入を、ＣＡＲポリペプチドの結合ドメイン、ヒンジ、ＴＭドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインに導入することによって、ＣＡＲの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善させることが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、典型的にはバリアントが参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する場合、本明細書において想定される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む。
ポリペプチドは、「ポリペプチド断片」を含む。ポリペプチド断片は、天然起源または組換え産生のポリペプチドのアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／または内部欠失もしくは置換を有する、単量体であっても多量体であってもよいポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約５００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長であることは理解されよう。特に有用なポリペプチド断片は、抗体の抗原結合ドメインまたは断片を含む機能性ドメインを含む。抗ＳＴｎ抗体の場合、有用な断片としては、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖のＣＤＲ３領域、重鎖または軽鎖の可変領域、２つのＣＤＲを含む抗体鎖または可変領域の一部分などが挙げられるが、それらに限定されない。
ポリペプチドは、ポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製、もしくは特定を容易にするため、または固体担体へのポリペプチドの結合を増強するために、インフレームで融合されるか、またはリンカーもしくは他の配列に接合されてもよい。
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、短縮化、及び挿入を含む様々な方法で変更され得る。そのような操作の方法は、当該技術分野で一般的に知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製され得る。変異誘発及びヌクレオチド配列変更のための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、及びこれらの文献中に引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する指針は、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
ある特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」とは、ポリペプチドの二次構造及び疎水性／親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）が実質的に変化しないことをペプチド化学分野における当業者が予想するような、アミノ酸が同様の特性を有する別のアミノ酸に置換されるものである。特定の実施形態で想定されるポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に改変を行いながらも、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体のポリペプチドをコードする機能分子を得ることができる。同等の、またはさらには改善されたバリアントポリペプチドを作り出すために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが所望される場合、当業者は、例として、例えば表１によるコードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させることができる。
Figure 2018526028
生物活性を消失することなく置換、挿入、または欠失させることのできるアミノ酸残基がどれかを決定する指針は、当該技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアなどを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖が関連しているアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。天然起源のアミノ酸は一般に、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性アミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、及び非荷電極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは、一緒に芳香族アミノ酸として分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は当業者に知られており、一般に、得られる分子の生物活性を変更することなく作製することができる。概して、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物活性を実質的に変更しないことを、当業者は認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
そのような変更を行う際、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮される場合がある。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与するアミノ酸の疎水性親水性指標の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている（参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている（Ｋｙｔｅ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。それらの値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。
ある特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置き換え、依然として同様の生物活性を有するタンパク質をもたらすこと、すなわち、依然として生物学機能的に同等のタンパク質を得ることができることは、当該技術分野で知られている。そのような変更を行う際、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。親水性に基づいて同様のアミノ酸の置換が効果的に行われ得ることも、当該技術分野では理解されている。
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されているように、次の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を有する別のものに置換し、依然として生物学的に同等な、特に免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが理解されている。そのような変化において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内であるものがさらにより特に好ましい。
上記に概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズに基づいてもよい。
ポリペプチドバリアントは、グリコシル化形態、他の分子との凝集接合体、及び無関係の化学部分との共有結合接合体（例えば、ＰＥＧ化分子）をさらに含む。共有結合バリアントは、当該技術分野で知られているように、アミノ酸鎖内またはＮ末端もしくはＣ末端の残基に見出される基に官能基を連結することによって調製することができる。バリアントには、対立遺伝子バリアント、種バリアント、及びムテインも含まれる。タンパク質の機能活性に影響しない領域の短縮化または欠失もまたバリアントである。
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で詳解されるように、ＩＲＥＳ配列によって分離され得る。別の実施形態では、２つ以上のポリペプチドが、１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現し得る。
特定の実施形態で想定されるポリペプチドは、融合ポリペプチドを含む。好ましい実施形態では、融合ポリペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲが提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質とは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。融合ポリペプチドは通常Ｃ末端とＮ末端で連結しているが、それらは、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、またはＮ末端とＣ末端で連結していてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であっても指定の順序であってもよい。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質は、融合ポリペプチドの所望の転写活性が保存される限り、保存的に改変されたバリアント、多形性バリアント、対立遺伝子、変異体、サブ配列、及び種間相同体も含み得る。融合ポリペプチドは、化学合成法もしくは２つの部分間の化学結合によって産生されてもよいし、概して他の標準的技術を使用して調製されてもよい。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で詳解される好適な転写または翻訳の制御エレメントに作動可能に連結される。
一実施形態において、融合パートナーは、未変性組換えタンパク質よりも高い収率でのタンパク質の発現を補助する配列（発現エンハンサー）を含む。他の融合パートナーが、タンパク質の溶解度を増加させるように、タンパク質を所望の細胞内区画に標的化することを可能にするように、または細胞膜を通した融合タンパク質の輸送を促進するように選択されてもよい。
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間にポリペプチド切断シグナルをさらに含んでもよい。加えて、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。例示的なポリペプチド切断シグナルとしては、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、稀な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、及び自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が挙げられる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
好適なプロテアーゼ切断部位及び自己切断型ペプチドは当業者に知られている（例えば、Ｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位としては、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ、（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、及びエンテロキナーゼの切断部位が挙げられるが、それらに限定されない。その高い切断厳密性により、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号３９）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号４０）及びＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号４１）（ここで、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断はＱとＧとの間またはＱとＳとの間で生じる）が一実施形態において好ましい。
特定の実施形態において、自己切断型ペプチドは、ポティウイルス及びカルジオウイルス２Ａペプチド、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ウマ鼻炎Ａウイルス、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス、ならびにブタテッショウウイルスから得られるポリペプチド配列を含む。
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａもしくは２Ａ様の部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。例示的な２Ａ部位を表２に示す。
Figure 2018526028
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドを含む。
Ｅ． ポリヌクレオチド
好ましい実施形態では、１つ以上のＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または組換えＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において想定される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはバリアントを含む。様々な例証となる実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクター、ウイルスベクター、及び移入プラスミド、ならびにそれらを含む組成物及び細胞を含む。様々な例証となる実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１〜５１に記載のポリペプチド配列を含むがそれらに限定されない本明細書において想定されるポリペプチドをコードする。
特定の実施形態において、ポリペプチドの少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、５００個、１０００個、１２５０個、１５００個、１７５０個、もしくは２０００個、またはそれ以上、ならびに全ての中間の長さの隣接アミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドが提供される。この文脈における「中間の長さ」が、引用された値の間の任意の長さ、例えば６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３などを意味することは、容易に理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」及び「バリアント」などの用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または下文に定義されるストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語には、参照ポリヌクレオチドと比較して、１つ以上のヌクレオチドが付加されているか、もしくは欠失しているか、または異なるヌクレオチドに置き換えられているポリヌクレオチドが含まれる。この点において、変更されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持するような、変異、付加、欠失、及び置換を含むある特定の変更を参照ポリヌクレオチドに行うことができることは、当該技術分野で十分に理解されている。
本明細書で使用される「配列同一性」または例えば「に対して５０％同一の配列」を含む記述は、配列が比較枠にわたってヌクレオチド単位基準またはアミノ酸単位基準で同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の割合」は、比較枠にわたって２つの最適にアライメントされた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置数を決定して対応位置数を得、対応位置数を比較枠内の位置の総数（すなわち、枠のサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性の割合を得ることによって計算され得る。典型的にはポリペプチドバリアントが参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を維持する場合、本明細書に記載される参照配列のいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、８６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド及びポリペプチドが含まれる。
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語は、「参照配列」、「比較枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的な同一性」を含む。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２だがしばしば１５〜１８であり、多くの場合少なくとも２５の単量体単位である。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は通常、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較枠」にわたって比較して、配列類似性のある局所的な領域を特定し比較することによって行われる。「比較枠」は、２つの配列が最適にアライメントされた後に、ある配列が、同数の隣接位置をもつ参照配列と比較される、少なくとも６個、一般的には約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の隣接位置の概念的なセグメントを指す。比較枠は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較した場合に約２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。比較枠をアライメントするための配列の最適なアライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズムの実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって、または検査及び選択された様々な方法のいずれかにより生成された最良のアライメント（すなわち、比較枠にわたって最高率の相同性をもたらすもの）によって実施され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムも参照することができる。配列分析の詳細な説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のユニット１９．３に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」」は、天然起源の状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、断片に通常隣接する配列から取り除かれたＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」は、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または自然界に存在せず、人の手によって作製された他のポリヌクレオチドも指す。
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語は、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）及び３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）を含む。ポリヌクレオチド配列は、５’から３’への配向または３’から５’への配向と注記され得る。ＤＮＡ及びｍＲＮＡについては、５’から３’の鎖は、その配列がプレメッセンジャー（ｐｒｅｍＲＮＡ）の配列と同一であるため［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりにＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除く］、「センス」鎖、「プラス」鎖、または「コード」鎖と呼称される。ＤＮＡ及びｍＲＮＡでは、ＲＮＡポリメラーゼにより転写される鎖である相補的な３’から５’の鎖は、「鋳型」鎖、「アンチセンス」鎖、「マイナス」鎖、または「非コード」鎖と呼称される。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、５’から３’の配列が３’から５’の配向で書かれたもの、または３’から５’の配列が５’から３’の配向で書かれたものを指す。
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合規則によって関係が表されるポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は、左側に５’末端、そして右側に３’末端の逆相補体、すなわち５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’として書かれることが多い。その逆相補体と等しい配列は、パリンドローム配列と言われる。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合規則に従って一致する「部分的」なものであり得る。または、核酸間で「完全」相補性もしくは「全」相補性が存在し得る。
さらに、本明細書に記載されるように、遺伝コードの縮重の結果として、ポリペプチドまたはそのバリアントの断片をコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いずれの未変性遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。とはいえ、コドン利用の差により異なるポリヌクレオチド、例えばヒト及び／または霊長類のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態において特に想定される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現及び／または安定性のためにコドン最適化されている。さらに、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子も使用され得る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、及び／または置換などの１つ以上の変異の結果として変更されている内在性遺伝子である。
本明細書で使用される「核酸カセット」という用語は、ＲＮＡ、そして後にタンパク質を発現することのできるベクター内の遺伝子配列を指す。核酸カセットは、目的の遺伝子、例えばＣＡＲを含む。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要に応じてタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換細胞における活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物活性のために適切な区画に転位置され得るように、ベクター内に位置的かつ順次的に配向される。好ましくは、カセットは、その３’末端及び５’末端が、ベクターに容易に挿入できるように適合されており、例えば、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態では、核酸カセットは、ＳＴｎ結合糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２を発現するがん細胞の細胞傷害性を増加させるために使用されるキメラ抗原受容体の配列を含む。カセットは、除去され、単一単位としてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入され得る。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的のポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「目的のポリヌクレオチド」という用語は、発現が所望される発現ベクターに挿入された、ポリペプチド（すなわち、目的のポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の目的のポリヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、疾患もしくは障害の治療または防止において治療効果をもたらすポリペプチドをコードする。目的のポリヌクレオチド及びそれからコードされるポリペプチドは、野生型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにその機能的バリアント及び断片の両方を含む。特定の実施形態において、機能的バリアントは、対応する野生型参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。ある特定の実施形態において、機能的バリアントまたは断片は、対応する野生型ポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％の生物活性を有する。
一実施形態において、目的のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、リボザイム、または他の阻害性ＲＮＡを転写するための鋳型である。様々な他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＣＡＲをコードする目的のポリヌクレオチド、ならびに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びリボザイムを含むがそれらに限定されない阻害性核酸配列を含むがそれに限定されない、１つ以上の付加的な目的のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」または「低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」という用語は、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、転写阻害、またはエピジェネティックＲＮＡｉのプロセスを媒介する短いポリヌクレオチド配列を指す（Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９、Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ．，１３，１３９−１４１、及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。ある特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、同じ数のヌクレオシドを有する第１の鎖及び第２の鎖を含むが、第１及び第２の鎖は、第１及び第２の鎖上の２つの末端ヌクレオシドが相補鎖上の残基と対合しないようにオフセットである。ある特定の事例において、対合しない２つのヌクレオシドは、チミジン残基である。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡまたはその断片が標的遺伝子の下方制御を媒介し得るように、標的遺伝子に対して十分な相同性のある領域を含み、かつヌクレオチド単位で十分な長さであるべきである。したがって、ｓｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である領域を含む。ｓｉＲＮＡと標的との間に完全な相補性が存在する必要はないが、その対応関係は、ｓｉＲＮＡまたはその切断産物が標的ＲＮＡのＲＮＡｉ切断などにより配列特異的サイレンシングを指向できるように、十分である必要がある。標的鎖との相補性すなわち相同性の程度は、アンチセンス鎖で最も重要である。完全な相補性は特にアンチセンス鎖において所望されるが、いくつかの実施形態は、標的ＲＮＡに対して、１個以上だが好ましくは１０個、８個、６個、５個、４個、３個、２個、またはそれ以下のミスマッチを含む。ミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合、例えば５’末端及び／もしくは３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内の末端領域（複数可）にあることが好ましい。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖の特徴を維持するのに十分にアンチセンス鎖と相補的であれば十分である。
加えて、ｓｉＲＮＡは、改変されても、またはヌクレオシド類似体を含んでもよい。ｓｉＲＮＡの一本鎖領域は、改変されても、またはヌクレオシド類似体を含んでもよく、例えば、ヘアピン構造の不対領域（複数可）、例えば、２つの相補領域を連結する領域は、改変またはヌクレオシド類似体を有し得る。ｓｉＲＮＡの１つ以上の３’末端もしくは５’末端を、例えばエキソヌクレアーゼに対して安定化させるため、またはＲＩＳＣに侵入するようにアンチセンスｓｉＲＮＡ剤を優先するための改変も有用である。改変は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、または、ホスホラミダイトをもたらし、かつ別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成中に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含み得る。ｓｉＲＮＡの各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であり得る。この鎖は、好ましくは少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各鎖は、２１〜２５ヌクレオチド長であり得る。好ましいｓｉＲＮＡは、１７個、１８個、１９個、２９個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のヌクレオチド対の二本鎖領域、及び２〜３ヌクレオチドの１つ以上のオーバーハング、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’オーバーハングを有する。
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」という用語は、通常はｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとして知られる約７０ヌクレオチドのフォールドバック（ｆｏｌｄｂａｃｋ）ＲＮＡ前駆体構造から切除された、２０〜２２ヌクレオチドの小さな非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡと標的との間の相補性の程度に応じて、２つの方法のうちの１つでそれらの標的を負に調節する。第１に、タンパク質コードｍＲＮＡ配列に完全またはほぼ完全な相補性で結合するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ媒介干渉（ＲＮＡｉ）経路を誘導する。ｍＲＮＡ標的の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）内の不完全相補部位に結合することによって調節作用を及ぼすｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路に使用されるものと同様または場合により同一であるＲＩＳＣ複合体を通して、転写後に、見かけ上は翻訳のレベルで、標的遺伝子発現を抑制する。翻訳制御と一致して、この機序を使用するｍｉＲＮＡは、それらの標的遺伝子のタンパク質レベルを低下させるが、これらの遺伝子のｍＲＮＡレベルは、最小限の影響しか受けない。ｍｉＲＮＡは、天然起源のｍｉＲＮＡ、ならびに任意のｍＲＮＡ配列を特異的に標的化し得る人工的に設計されたｍｉＲＮＡの両方を包含する。例えば、一実施形態において、当業者は、ヒトｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−２１）一次転写物として発現する短いヘアピンＲＮＡ構築物を設計することができる。この設計は、ヘアピン構築物にドローシャプロセシング部位を付加するものであり、ノックダウン効率を大幅に増加させることが示されている（Ｐｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００４）。このヘアピンのステムは、２２−ｎｔのｄｓＲＮＡ（例えば、アンチセンスは所望の標的に対して完全な相補性を有する）及びヒトｍｉＲ由来の１５−１９−ｎｔのループからなる。ヘアピンの片側または両側にｍｉＲループ及びｍｉＲ３０フランキング配列を付加すると、発現したヘアピンのドローシャ及びダイサープロセシングにおいて、マイクロＲＮＡを含まない従来のｓｈＲＮＡ設計と比較したときに１０倍超の増加がもたらされる。ドローシャ及びダイサープロセシングの増加は、ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ産生の増加、及び発現したヘアピンの効力の増加につながる。
本明細書で使用される場合、「ｓｈＲＮＡ」または「短いヘアピンＲＮＡ」という用語は、単一の自己相補的ＲＮＡ鎖によって形成される二本鎖構造を指す。標的遺伝子のコード配列または非コード配列のいずれかの一部分と同一のヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ構築物は、阻害のために好ましい。標的配列に対して挿入、欠失、及び一点変異を有するＲＮＡ配列も、阻害に有効であることが見出されている。阻害性ＲＮＡと標的遺伝子の一部分との間で９０％超の配列同一性、またはさらには１００％の配列同一性が好ましい。ある特定の好ましい実施形態では、ｓｈＲＮＡの二本鎖形成部分の長さは、例えば、ダイサー依存切断により産生されたＲＮＡ産物と相当するサイズの、少なくとも２０、２１、または２２ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００または４００塩基長である。ある特定の実施形態において、ｓｈＲＮＡ構築物は、４００〜８００塩基長である。ｓｈＲＮＡ構築物は、ループ配列及びループサイズの変化に対する耐性が高い。
本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、標的ｍＲＮＡの部位特異的切断が可能な触媒的に活性なＲＮＡ分子を指す。例えば、ハンマーヘッド型及びヘアピン型のリボザイムといった、いくつかのサブタイプが説明されている。リボザイムの触媒活性及び安定性は、非触媒性塩基でデオキシリボヌクレオチドをリボヌクレオチドに置換することによって改善させることができる。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して特定のｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッド型リボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成するフランキング領域によって決められた位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、２つの塩基の配列：５’−ＵＧ−３’を標的ｍＲＮＡが有することである。ハンマーヘッド型リボザイムの構築及び産生は、当該技術分野で周知である。
ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはリボザイムを含む目的のポリヌクレオチドの好ましい送達方法は、例えば、本明細書の他の箇所に記載される、強力な構成的ｐｏｌ ＩＩＩ、例えば、ヒトＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、マウスＵ６ ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒト及びマウスＨ１ ＲＮＡプロモーター、ならびにヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構成的ｐｏｌ ＩＩプロモーターといった、１つ以上の調節配列を含む。
本明細書において想定されるポリヌクレオチドは、コード配列自体の長さにかかわらず、本明細書の他の箇所に開示されるか当該技術分野で知られている、プロモーター及び／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、付加的な制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、及びＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、及び自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされてもよく、その結果、それらの全体的な長さが大幅に変動してもよい。したがって、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片が用いられ得ることが想定され、その全長は、好ましくは、意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける調製及び使用の容易さにより限定される。
ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られており利用可能である十分に確立された種々の技術のいずれを使用して、調製、操作、かつ／または発現してもよい。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適切なベクターに挿入してもよい。
ベクターの例は、プラスミド、自己複製配列、及び転位因子である。付加的な例示的なベクターとしては、限定されないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、トランスポゾン、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、限定されないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介性遺伝子移入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、及びｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。特定の実施形態において、本明細書に開示されるキメラタンパク質のコード配列が、哺乳動物細胞におけるキメラタンパク質の発現のために、このような発現ベクターに連結され得る。
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外で維持されるベクターを含むがそれらに限定されない非組み込みベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに組み込まれることなく、かつ分裂する宿主細胞から徐々に失われることなく複製することのできるベクターを指し、また、該ベクターが染色体外またはエピソームで複製することも意味する。ベクターは、リンパ増殖性ヘルペスウイルスもしくはガンマヘルペスウイルス、アデノウイルス、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、または酵母由来のＤＮＡ複製起源、特にＥＢＶのｏｒｉＰに対応するリンパ増殖性ヘルペスウイルスまたはガンマヘルペスウイルスの複製起源をコードする配列すなわち「ｏｒｉ」を保有するように操作される。特定の実施形態では、リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）であり得る。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）及びカポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）は、ガンマヘルペスウイルスの例でもある。通常、宿主細胞は、複製を活性化するウイルス複製トランス活性化因子タンパク質を含む。
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、トランスポゾンベクター系を使用して標的または宿主細胞に導入される。ある特定の実施形態において、トランスポゾンベクター系は、本明細書において想定される転位因子及びポリヌクレオチドを含むベクター、ならびにトランスポサーゼを含む。一実施形態において、トランスポゾンベクター系は、単一トランスポサーゼベクター系である。例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／１８９２２号を参照されたい。例示的なトランスポサーゼとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｍｏｓ１、Ｔｃ１／マリナー、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２、Ｔｃ３、ＭｕＡ、Ｈｉｍａｒ Ｉ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、及びそれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン及びトランスポサーゼは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，９６２，８１０号に記載されている。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン及びトランスポサーゼは、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＩｚｓｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：９３−１０２（２０００）に記載されている。メダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）から最初に単離され、トランスポゾンのｈＡＴファミリーに属するＴｏｌ２トランスポゾンは、Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記載されている。Ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ２は、Ｔｏｌ２のバリアントであり、Ｂａｌｃｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）に記載されている。Ｔｏｌ２及びＭｉｎｉ−Ｔｏｌ２トランスポゾンは、Ｔｏｌ２トランスポサーゼと同時作用（ｃｏ−ａｃｔ）するとき、生物のゲノムへの導入遺伝子の組み込みを促進する。Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン及びトランスポサーゼは、例えば、Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：６８７３−６８８１（２００３）に記載されている。
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写及び翻訳を行う、ベクター複製起源の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、ポリアデニル化配列、５’及び３’非翻訳領域である。そのようなエレメントは、それらの強度及び特異性が異なり得る。用いられるベクター系及び宿主に応じて、遍在性プロモーター及び誘導性プロモーターを含めた任意の数の好適な転写エレメント及び翻訳エレメントを使用することができる。
特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターを含むがそれに限定されず、ウイルスベクターは、プロモーター及び／またはエンハンサーなどの外因性、内因性、もしくは異種の制御配列を含む。「内因性」制御配列は、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に連結しているものである。「外因性」制御配列は、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技術）によってある遺伝子と並立に配置され、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるようなものである。「異種」制御配列は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域、及び／または、転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）を含む。
「エンハンサー」という用語は、転写を増強することができ、いくつかの事例では別の制御配列に対するそれらの配向に関係なく機能することができる配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーター及び／または他のエンハンサーエレメントと協働的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能とエンハンサー機能との両方を提供することのできる配列を含むＤＮＡのセグメントを指す。
「作動可能に連結される」という用語は、説明されている成分がそれらの意図される様式で機能することを可能にする関係にある並立を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（例えばプロモーター及び／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば目的のポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここでこの発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結された配列の転写を構成的もしくは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、それぞれ、多様な細胞型及び組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサー、または、制限された種類の細胞型及び組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」なプロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであり得る。
特定の実施形態で使用するのに好適な例証となる遍在性発現制御配列としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、及びＰ１１プロモーター、伸長因子１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核細胞翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータメンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が挙げられるが、それらに限定されない。
一実施形態において、ベクターは、ＭＮＤプロモーターを含む。
一実施形態において、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを含むＥＦ１ａプロモーターを含む。
一実施形態において、ベクターは、ヒトＥＦ１ａ遺伝子の第１イントロンを欠いているＥＦ１ａプロモーターを含む。
特定の実施形態において、Ｔ細胞特異的プロモーターからＣＡＲを含むポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。
本明細書で使用される場合、「条件付き発現」は、誘導性発現、抑制性発現、特定の生理学的状態、生物学的状態、または疾患状態を有する細胞または組織における発現などを含むがそれらに限定されない、あらゆる種類の条件付き発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的な発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、目的のポリヌクレオチドの条件付き発現をもたらす。例えば、ポリヌクレオチドを発現させる処理または条件、あるいは目的のポリヌクレオチドによりコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる処理または条件に、細胞、組織、生物などを供することによって、発現が制御される。
誘導性プロモーター／系の例証となる例としては、グルココルチコイドもしくはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理によって誘導可能）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン調節可能な系（Ｓｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、２００３、Ｇｅｎｅ、３２３：６７）、クミン酸誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが挙げられるが、それらに限定されない。
条件付き発現は、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによって達成することもできる。ある特定の実施形態によると、ベクターは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る１つ以上の組換え部位（例えば、２、３、４、５、７、１０、１２、１５、２０、３０、５０など）を伴う組換え反応に関与する、切除性（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）もしくは組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）のタンパク質、酵素、補助因子、または関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含む融合タンパク質）、断片、及びバリアントを含む。特定の実施形態で使用するのに好適なリコンビナーゼの例証となる例としては、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、及びＰａｒＡが挙げられるが、それらに限定されない。
ベクターは、多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかに対して１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えばレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に加えてのものであることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し結合する特定の核酸配列を指す。
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの組換え部位の１つはｌｏｘＰであり、これは、８塩基対コア配列に隣接する２つの１３塩基対逆方向反復（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位としては、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ ａｎｄ Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、及びｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９５）が挙げられるが、それらに限定されない。
ＦＬＰリコンビナーゼの好適な認識部位としては、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９８８）が挙げられるが、それらに限定されない。
認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えばｐｈｉ−ｃ３１により認識される、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、及びａｔｔＲ配列である。φＣ３１ ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間の組換えのみを媒介する（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。それぞれファージインテグラーゼの細菌ゲノム及びファージゲノム上の結合部位にちなんで名付けられたａｔｔＢ及びａｔｔＰは、両方とも、φＣ３１ホモ二量体によって結合されている可能性が高い不完全な逆方向反復を含む（Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。産物部位であるａｔｔＬ及びａｔｔＲは、φＣ３１媒介性組換えを進めるために効率的に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）、反応を不可逆にする。挿入の触媒では、ａｔｔＢを保有するＤＮＡが、ａｔｔＰ部位をゲノムａｔｔＢ部位に挿入するよりも容易にゲノムａｔｔＰ部位に挿入されることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な方略では、ａｔｔＰを保有する「ドッキン部位」を相同組換えによって定義された遺伝子座に位置付け、これを次に、挿入のためにａｔｔＢ保有入来配列（ｉｎｃｏｍｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と組み合わせる。
本明細書で使用される場合、「内部リボソーム侵入部位」すなわち「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）のＡＴＧなどの開始コドンへの直接的な内部リボソーム侵入を促進し、それによって遺伝子のキャップ非依存性翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １５（１２）：４７７−８３）及びＪａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ １（１０）：９８５−１０００を参照されたい。特定の実施形態において、ベクターは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的のポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、１つ以上のＩＲＥＳ配列または自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって、ポリヌクレオチド配列を分離することができる。
本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号５７）であり、ここでＲは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、及びＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。特定の実施形態において、ベクターは、コンセンサスコザック配列を有し、かつ所望のポリペプチド、例えばＣＡＲをコードする、ポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを保有する細胞は、直接的な毒性及び／または未制御の増殖のリスクを低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を用いる。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドを保有する宿主または細胞に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ９もしくはカスパーゼ８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ９は、特定の化学的二量体化誘導物質（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｃｅｒ ｏｆ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ、ＣＩＤ）を使用して活性化することができる。
ある特定の実施形態において、ベクターは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞に、インビボで負の選択を受けやすくさせる遺伝子セグメントを含む。「負の選択」とは、注入された細胞が、個々のインビボ条件の変化の結果として排除され得ることを意味する。負の選択可能な表現型は、投与される薬剤、例えば化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。負の選択可能な遺伝子は当該技術分野で知られており、とりわけ、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ）遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３，１９７７）、細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、及び細菌性シトシンデアミナーゼを含む（Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３（１９９２））。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、負の選択可能な表現型の細胞のインビトロでの選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択マーカーは、宿主細胞に導入されると、その遺伝子を有する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は当該技術分野で知られており、とりわけ、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子を含む。
正の選択マーカー及び負の選択可能エレメントは、負の選択可能エレメントの損失が正の選択マーカーの損失も必然的に伴うように連結されていることが好ましい。正の選択マーカー及び負の選択マーカーは、一方の損失が他方の損失に義務的につながるように融合していることが、さらにより好ましい。上述される所望の正負両方の選択の特徴を付与するポリペプチドを発現産物としてもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロの正の選択ではハイグロマイシンＢ耐性を、そしてインビボの負の選択ではガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドをもたらす。Ｌｕｐｔｏｎ Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：３３７４−３３７８，１９９１を参照されたい。加えて、好ましい実施形態では、キメラ受容体をコードするポリヌクレオチドは、融合遺伝子、特に、インビトロの正の選択ではハイグロマイシンＢ耐性を、そしてインビボの負の選択ではガンシクロビル感受性を付与するものを含むレトロウイルスベクター、例えばＬｕｐｔｏｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）（上記）に記載されるＨｙＴＫレトロウイルスベクターに存在する。ドミナントポジティブな選択マーカーを負の選択マーカーと融合することから得られる二機能性選択可能融合遺伝子の使用を記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の公開文献も参照されたい。
好ましい正の選択マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、及びｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、正の選択マーカーがｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択マーカーがシトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子もしくは選択マーカーに由来する、二機能性選択可能融合遺伝子である。
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドを一過性に発現するために細胞に導入されるｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「一過性」とは、時間単位、日単位、または週単位の期間にわたる非組み込み導入遺伝子の発現を指し、この発現の期間は、ゲノムに組み込まれた場合または細胞内の安定なベクターまたはプラスミド内に含められた場合のポリヌクレオチドの発現の期間未満である。
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、インビトロ転写ｍＲＮＡである。本明細書で使用される場合、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロで合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡを生成するために使用される鋳型を含む。
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、５’キャップもしくは改変された５’キャップ、及び／またはポリ（Ａ）配列をさらに含む。本明細書で使用される場合、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ ７−メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ７Ｇキャップとも称される）とは、転写の開始の直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「前面」すなわち５’末端に付加される改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、第１の転写されたヌクレオチドに連結され、リボソームによって認識され、ＲＮアーゼから保護される末端基を含む。キャッピング部分を改変すると、ｍＲＮＡの機能性、例えばその安定性または翻訳効率などを調節することができる。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、約５０〜約５０００アデニンのポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約１００〜約１０００塩基、約２００〜約５００塩基、または約３００〜約４００塩基のポリ（Ａ）配列を含む。一実施形態において、ｍＲＮＡは、約６５塩基、約１００塩基、約２００塩基、約３００塩基、約４００塩基、約５００塩基、約６００塩基、約７００塩基、約８００塩基、約９００塩基、または約１０００塩基以上のポリ（Ａ）配列を含む。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または翻訳効率などのｍＲＮＡ機能性を調節するように、化学的または酵素的に改変されてもよい。
Ｆ． ウイルスベクター
特定の実施形態において、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）は、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを形質導入される。例えば、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、またはそれらの任意の組み合わせの細胞内シグナル伝達ドメインを有する、ＳＴｎ発現糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２に結合する抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片を含むＣＡＲをコードするベクターを形質導入される。したがって、これらの形質導入細胞は、ＣＡＲ媒介性細胞傷害応答を誘発することができる。
レトロウイルスは、遺伝子送達の標準的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。特定の実施形態では、レトロウイルスが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖状二本鎖ＤＮＡのコピーに逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。ウイルスが宿主ゲノムに組み込まれたら、それは「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、新しいウイルス粒子を産生するために必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指向する。
特定の実施形態で使用するのに好適な例証となるレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例証となるレンチウイルスとしては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶベースのベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用性配列エレメント）が好ましい。特定の実施形態では、レンチウイルスが、ＣＡＲを含むポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用される。
レトロウイルスベクター、より具体的にはレンチウイルスベクターを、特定の実施形態の実施において使用してもよい。したがって、本明細書で使用される「レトロウイルス」または「レトロウイルスベクター」という用語は、それぞれ「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」を含むよう意図される。
「ベクター」という用語は、本明細書において、別の核酸分子を移入または輸送することのできる核酸分子を指すように使用される。移入された核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入される。ベクターは、細胞における自律複製を指向する配列を含んでもよいし、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、例えば、複製欠損レトロウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。
当業者には明らかであるように、「ウイルスベクター」という用語は、典型的には核酸分子の移入もしくは細胞のゲノムへの組み込みを促進するウイルス由来の核酸エレメントを含む核酸分子（例えば、移入プラスミド）、または核酸移入を媒介するウイルス粒子のいずれかを指すように広く使用されている。ウイルス粒子は、通常、様々なウイルス成分、そして場合により核酸（複数可）に加えて宿主細胞の成分も含む。
ウイルスベクターという用語は、核酸を細胞に移入することのできるウイルスもしくはウイルス粒子、または移入される核酸自体のいずれかを指す場合がある。ウイルスベクター及び移入プラスミドは、主にウイルスに由来する構造的及び／または機能的な遺伝子エレメントを含む。「レトロウイルスベクター」という用語は、主にレトロウイルスに由来する構造的及び機能的な遺伝子エレメントもしくはそれらの一部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「レンチウイルスベクター」という用語は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含めた構造的及び機能的な遺伝子エレメントもしくはそれらの一部分を含むウイルスベクターまたはプラスミドを指す。「ハイブリッドベクター」という用語は、レトロウイルス配列、例えばレンチウイルス配列と、非レンチウイルスのウイルス配列との両方を含む、ベクター、ＬＴＲ、または他の核酸を指す。一実施形態において、ハイブリッドベクターは、逆転写、複製、組み込み、及び／もしくはパッケージングのためのレトロウイルス配列、例えばレンチウイルス配列を含む、ベクターまたは移入プラスミドを指す。
特定の実施形態において、「レンチウイルスベクター」、「レンチウイルス発現ベクター」という用語は、レンチウイルス移入プラスミド及び／または感染性レンチウイルス粒子を指すように使用される場合がある。本明細書において、クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントが参照される場合、これらのエレメントの配列がＲＮＡ形態でレンチウイルス粒子内に存在し、ＤＮＡ形態でＤＮＡプラスミド内に存在することを理解されたい。
プロウイルスの各末端には、「末端反復配列（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）」すなわち「ＬＴＲ」と呼ばれる構造が存在する。「末端反復配列（ＬＴＲ）」という用語は、天然の配列構成において直列反復配列であり、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域を含む、レトロウイルスＤＮＡの両端に位置する塩基対のドメインを指す。ＬＴＲは概して、レトロウイルス遺伝子の発現（例えば、遺伝子転写の促進、開始、及びポリアデニル化）及びウイルス複製に必須である機能を提供する。ＬＴＲは、転写制御エレメント、ポリアデニル化シグナル、ならびにウイルスゲノムの複製及び組み込みに必要な配列を含めた、多数の調節シグナルが含む。ウイルスＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分割される。Ｕ３領域は、エンハンサー及びプロモーターエレメントを含む。Ｕ５領域は、プライマー結合部位とＲ領域との間の配列であり、ポリアデニル化配列を含む。Ｒ（反復）領域には、Ｕ３及びＵ５領域が隣接している。ＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ、及びＵ５領域で構成され、ウイルスゲノムの５’及び３’の両端に存在する。５’ＬＴＲには、ゲノムの逆転写に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）、及びウイルスＲＮＡを粒子に効率的にパッケージングするために必要な配列（プサイ部位）が隣接している。
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスＲＮＡをウイルスカプシドまたは粒子に挿入するのに必要とされる、レトロウイルスゲノム内に位置する配列を指す。例えば、Ｃｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。いくつかのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのカプシド形成に必要とされる最小限のパッケージングシグナル（プサイ［Ψ］配列とも称される）を使用する。したがって、本明細書で使用される場合、「パッケージング配列」、「パッケージングシグナル」、「プサイ」という用語、及び「Ψ」の記号は、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に必要とされる非コード配列に関して使用される。
様々な実施形態において、ベクターは、改変された５’ＬＴＲ及び／または３’ＬＴＲを含む。ＬＴＲの一方または両方が、１つ以上の欠失、挿入、または置換を含むがそれらに限定されない、１つ以上の改変を含んでもよい。３’ＬＴＲの改変は、多くの場合、ウイルスを複製欠損にすることによって、レンチウイルス系またはレトロウイルス系の安全性を改善するために行われる。本明細書で使用される場合、「複製欠損」という用語は、感染性ビリオンが産生されないように完全で有効な複製ができないウイルス（例えば、複製欠損レンチウイルス子孫）を指す。「複製可能」という用語は、ウイルスのウイルス複製が感染性ビリオンを産生することができるように、複製が可能な野生型ウイルスまたは変異ウイルス（例えば、複製可能レンチウイルス子孫）を指す。
「自己不活性化型」（ＳＩＮ）ベクターとは、Ｕ３領域として知られる右（３’）ＬＴＲエンハンサー・プロモーター領域が１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を防止するように（例えば欠失または置換によって）改変されている、複製欠損ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを指す。これは、右（３’）ＬＴＲのＵ３領域がウイルス複製中に左（５’）ＬＴＲのＵ３領域のための鋳型として使用され、したがってウイルス転写物がＵ３エンハンサー・プロモーターなしに作製され得ないためである。さらなる実施形態において、３’ＬＴＲは、Ｕ５領域が例えば理想的なポリ（Ａ）配列に置き換えられるように改変される。ＬＴＲへの改変、例えば３’ＬＴＲ、５’ＬＴＲ、または３’及び５’両方のＬＴＲへの改変なども含まれることに留意されたい。
５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターに置き換えてウイルス粒子の産生中のウイルスゲノムの転写を推進することによって、さらなる安全性の増強がもたらされる。使用することのできる異種プロモーターの例としては、例えば、ウイルス性サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが挙げられる。典型的なプロモーターは、Ｔａｔ依存様式で高レベルの転写を推進することができる。ウイルス産生系に完全なＵ３配列が存在しないため、この置き換えは、組換えにより複製可能ウイルスが生成される可能性を低減させる。ある特定の実施形態において、異種プロモーターは、ウイルスゲノムが転写される様式の制御において付加的な利点を有する。例えば、異種プロモーターは、誘発因子が存在するときにのみウイルスゲノムの全てまたは一部の転写が起こるように誘導性であり得る。誘発因子としては、１つ以上の化学化合物、または宿主細胞が培養される温度もしくはｐＨなどの生理的条件が挙げられるが、それらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＴＡＲエレメントを含む。「ＴＡＲ」という用語は、レンチウイルス（例えばＨＩＶ）ＬＴＲのＲ領域に位置する「トランス活性化応答」遺伝子エレメントを指す。このエレメントは、レンチウイルストランス活性化因子（ｔａｔ）遺伝子エレメントと相互作用してウイルス複製を増強する。しかしながら、このエレメントは、５’ＬＴＲのＵ３領域が異種プロモーターに置き換えられる実施形態では必要とされない。
「Ｒ領域」は、キャッピング基の始点（すなわち、転写の始点）で始まり、ポリ（Ａ）トラクトの始点直前で終わる、レトロウイルスＬＴＲ内の領域を指す。Ｒ領域は、Ｕ３領域及びＵ５領域が隣接しているものとも定義される。Ｒ領域は、逆転写中に、新生ＤＮＡをゲノムの一端からもう一端に移動させる役割を果たす。
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」という用語は、レトロウイルス、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のセントラルポリプリントラクト及び中央終止配列（ｃＰＰＴ及びＣＴＳ）が配列に含まれる核酸を指す。いくつかの実施形態では、「ＦＬＡＰエレメント」及び「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、前述のＦＬＡＰエレメントを指すように互換的に使用される。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号及びＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。ＨＩＶ−１逆転写中、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）でのプラス鎖ＤＮＡの中央開始、及び中央終止配列（ＣＴＳ）での中央終止は、三本鎖ＤＮＡ構造：ＨＩＶ−１中央ＤＮＡ ＦＬＡＰの形成をもたらす。いずれかの理論に束縛されることを望むものではないが、ＤＮＡ ＦＬＡＰは、レンチウイルスゲノム核内移行のシス活性決定基として機能し得、かつ／またはウイルスの力価を増加させ得る。特定の実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターの骨格は、ベクター内の目的の異種遺伝子の上流または下流に、１つ以上のＦＬＡＰエレメントを含む。例えば、特定の実施形態において、移入プラスミドはＦＬＡＰエレメントを含む。一実施形態において、ベクターは、ＨＩＶ−１から単離されたＦＬＡＰエレメントを含む。
一実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスの移入ベクターは、１つ以上の排出エレメントを含む。「排出エレメント」という用語は、細胞の核から細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節エレメントを指す。ＲＮＡ排出エレメントの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、及びＣｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ ５８：４２３を参照されたい）、及びＢ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）が挙げられるが、それらに限定されない。概して、ＲＮＡ排出エレメントは、遺伝子の３’ＵＴＲ内に配置され、１つまたは複数のコピーとして挿入され得る。
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節エレメント、効率的なポリアデニル化部位、そして任意選択により転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増加する。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、及び同類のもの（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１７６６）など、種々の転写後調節エレメントが、タンパク質における異種核酸の発現を増加させることができる。特定の実施形態において、ベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを含む。
特定の実施形態において、ベクターはＷＰＲＥまたはＨＰＲＥなどの転写後調節エレメントを欠いている、すなわちそれらを含まないが、これは、いくつかの事例において、これらのエレメントが細胞形質転換のリスクを増加させ、かつ／あるいはｍＲＮＡ転写物の量を実質的もしくは有意に増加させない、またはｍＲＮＡ安定性を増加させないためである。しかしながら、いくつかの実施形態では、所与のベクターにＷＰＲＥを含めることの効果が予測不可能である場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、ベクターは、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを欠いている、すなわちそれらを含まない。
効率的な終止及び異種核酸転写物のポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。
特定の実施形態において、ベクターは、発現すべきポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」という用語は、終止とＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物のポリアデニル化との両方を指向するＤＮＡ配列を意味する。ポリアデニル化配列は、コード配列の３’末端へのポリ（Ａ）テイルの付加によってｍＲＮＡ安定性を促進し、ひいては翻訳効率の増加に寄与し得る。切断及びポリアデニル化は、ＲＮＡ内のポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳動物のプレｍＲＮＡのコアなポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識エレメントを有する。典型的には、ほぼ不変のＡＡＵＡＡＡ六量体が、Ｕ残基またはＧＵ残基に富んだより可変のエレメントの２０〜５０ヌクレオチド上流に位置する。新生転写物の切断がこれら２つのエレメント間で起こり、５’切断産物への最大２５０個のアデノシンの付加に連関する。特定の実施形態において、コアなポリ（Ａ）配列は、理想的なポリ（Ａ）配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施例において、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリ（Ａ）配列、ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリ（Ａ）配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野で知られる別の好適な異種もしくは内因性ポリ（Ａ）配列である。
ある特定の実施形態において、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、１つ以上のインスレーターエレメントをさらに含む。インスレーターエレメントは、ゲノムＤＮＡ内に存在するシス作用性エレメントによって媒介され、移入された配列の発現の調節解除を引き起こし得る組み込み部位作用（すなわち、位置作用；例えば、Ｂｕｒｇｅｓｓ−Ｂｅｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９９：１６４３３、及びＺｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１０９：４７１を参照されたい）から、レンチウイルス発現配列、例えば治療用ポリペプチドを保護するのに寄与し得る。いくつかの実施形態では、移入ベクターは、１つ以上のインスレーターエレメントを３’ＬＴＲに含み、プロウイルスが宿主ゲノムに組み込まれると、プロウイルスは、３’ＬＴＲを複製することによって、５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲの両方に１つ以上のインスレーターを含む。特定の実施形態で使用するのに好適なインスレーターとしては、ニワトリβ−グロビンインスレーター（参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｃｅｌｌ ７４：５０５，Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７．ＰＮＡＳ ９４：５７５、及びＢｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｃｅｌｌ ９８：３８７を参照されたい）が挙げられるが、それに限定されない。インスレーターエレメントの例としては、ニワトリＨＳ４などのβ−グロビン遺伝子座由来のインスレーターが挙げられるが、それに限定されない。
ある特定の具体的な実施形態によると、ウイルスベクター骨格配列の大部分または全てが、レンチウイルス、例えばＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルス及び／またはレンチウイルスの多くの異なる配列源を使用することまたは組み合わせることができ、レンチウイルス配列のうちある特定のものにおいて、本明細書に記載の機能を行う移入ベクターの能力を損なうことなく多数の置換及び変更が適応され得ることを理解されたい。さらに、種々のレンチウイルスベクターが当該技術分野で知られており（Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい）、それらの多くが、ウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するように適合され得る。
様々な実施形態において、ベクターは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。ベクターは、いずれかのＬＴＲが１つ以上の改変、例えば１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠失を含む、１つ以上のＬＴＲを有し得る。ベクターは、形質導入効率を増加させるためのさらなるアクセサリーエレメント（例えば、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、ウイルスパッケージング（例えば、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、ＲＲＥ）、及び／または治療用遺伝子発現を増加させる他のエレメント（例えば、ポリ（Ａ）配列）のうちの１つをさらに含んでもよく、任意選択により、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含んでもよい。
特定の実施形態において、移入ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ；セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス排出エレメント；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲ；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
特定の実施形態において、移入ベクターは、左（５’）レトロウイルスＬＴＲ；レトロウイルス排出エレメント；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）レトロウイルスＬＴＲ；及びポリ（Ａ）配列；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。別の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、左（５’）ＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）ＬＴＲ；及びポリアデニル化配列；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、左（５’）ＨＩＶ−１ ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；右（３’）自己不活性化型（ＳＩＮ）ＨＩＶ−１ ＬＴＲ；及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
別の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つのＬＴＲ；セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）；レトロウイルス排出エレメント；及び本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
特定の実施形態において、ベクターは、少なくとも１つのＬＴＲ；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；及びポリアデニル化配列；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つのＳＩＮ ＨＩＶ−１ ＬＴＲ；プサイ（Ψ）パッケージングシグナル；ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ；ＲＲＥ；本明細書において想定されるＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された、Ｔ細胞において活性なプロモーター；及びウサギβ−グロビンポリアデニル化配列；そして任意選択によりＷＰＲＥまたはＨＰＲＥを含む。
「宿主細胞」は、インビボ、エクスビボ、もしくはインビトロで、組換えベクターまたはポリヌクレオチドを電気穿孔、トランスフェクト、感染、もしくは形質導入された細胞を含む。宿主細胞は、パッケージング細胞、プロデューサー細胞、及びウイルスベクターに感染した細胞を含み得る。特定の実施形態において、ウイルスベクターに感染した宿主細胞は、治療法を必要とする対象に投与される。ある特定の実施形態において、「標的細胞」という用語は、宿主細胞と互換的に使用され、所望の細胞型のトランスフェクト細胞、感染細胞、または形質導入細胞を指す。好ましい実施形態では、標的細胞はＴ細胞である。
妥当なウイルス力価を達成するためには、大規模なウイルス粒子産生が必要であることが多い。ウイルス粒子は、ウイルス構造遺伝子及び／またはアクセサリー遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、もしくはｎｅｆ遺伝子、または他のレトロウイルス遺伝子を含むパッケージング細胞株に移入ベクターをトランスフェクトすることによって産生される。
本明細書で使用される場合、「パッケージングベクター」という用語は、パッケージングシグナルを欠いており、１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれ以上のウイルス構造遺伝子及び／またはアクセサリー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターまたはウイルスベクターを指す。通常、パッケージングベクターは、パッケージング細胞に含まれ、トランスフェクション、形質導入、または感染によって細胞に導入される。トランスフェクション、形質導入、または感染の方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において、レトロウイルス／レンチウイルス移入ベクターは、プロデューサー細胞または細胞株を生成するために、トランスフェクション、形質導入、または感染によってパッケージング細胞株に導入される。特定の実施形態において、パッケージングベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む標準的方法によって、ヒト細胞または細胞株に導入される。いくつかの実施形態では、パッケージングベクターは、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジン、ゼオシン、チミジンキナーゼ、ＤＨＦＲ、Ｇｌｎシンセターゼ、またはＡＤＡなどの優性選択マーカーと一緒に細胞に導入され、続いて、適切な薬物の存在下での選択、及びクローンの単離が行われる。選択マーカー遺伝子は、パッケージングベクター、例えば、ＩＲＥＳまたは自己切断型ウイルスペプチドによってコードされる遺伝子に物理的に連結され得る。
ウイルスエンベロープタンパク質（ｅｎｖ）は、細胞株から生成された組換えレトロウイルスに最終的に感染し形質転換し得る宿主細胞の範囲を決定する。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、及びＥＩＶなどのレンチウイルスの場合、ｅｎｖタンパク質は、ｇｐ４１及びｇｐ１２０を含む。好ましくは、パッケージング細胞により発現するウイルスｅｎｖタンパク質は、これまでに説明されているように、ウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子からの別々のベクターでコードされる。
特定の実施形態で用いることのできるレトロウイルス由来ｅｎｖ遺伝子の例証となる例としては、ＭＬＶエンベロープ、１０Ａ１エンベロープ、ＢＡＥＶ、ＦｅＬＶ−Ｂ、ＲＤ１１４、ＳＳＡＶ、エボラ、センダイ、ＦＰＶ（家禽ペストウイルス）、及びインフルエンザウイルスエンベロープが挙げられるが、それらに限定されない。同様に、ＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス科、カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、レオウイルス科、ビルナウイルス科、レトロウイルス科のＲＮＡウイルスファミリー）、ならびにＤＮＡウイルス（ヘパドナウイルス科、サーコウイルス科、パルボウイルス科、パボバウイルス科、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、及びイリドウイルス科のファミリー）由来のエンベロープをコードする遺伝子を用いてもよい。これらのウイルスの代表例としては、ＦｅＬＶ、ＶＥＥ、ＨＦＶＷ、ＷＤＳＶ、ＳＦＶ、狂犬病、ＡＬＶ、ＢＩＶ、ＢＬＶ、ＥＢＶ、ＣＡＥＶ、ＳＮＶ、ＣｈＴＬＶ、ＳＴＬＶ、ＭＰＭＶ、ＳＭＲＶ、ＲＡＶ、ＦｕＳＶ、ＭＨ２、ＡＥＶ、ＡＭＶ、ＣＴ１０、及びＥＩＡＶが挙げられるが、それらに限定されない。
他の実施形態では、ウイルスをシュードタイプ化するためのエンベロープタンパク質は、限定されないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、及びＨ５Ｎ１（トリインフルエンザ）などのインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、インフルエンザＣウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス群のいずれかのウイルス、腸内アデノウイルス、パルボウイルス、デング熱ウイルス、サル痘、モノネガウイルス目のリッサウイルス（狂犬病ウイルス、ラゴスコウモリウイルス、モコラウイルス、ドゥベンヘイジウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス１＆２、及びオーストラリアコウモリウイルスなど）、エフェメロウイルス、ベジクロウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型及び２型、水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ）、ヒトヘルペス６型及び８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、パピローマウイルス、マウスガンマヘルペスウイルスなど）、アレナウイルス（アルゼンチン出血熱ウイルス、ボリビア出血熱ウイルス、サビア関連出血熱ウイルス、ベネズエラ出血熱ウイルス、ラッサ熱ウイルス、マチュポウイルスなど）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ブニヤウイルス科（クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、ハンタウイルス、腎症候群原因ウイルスを伴う出血熱、リフトバレー熱ウイルスなど）、フィロウイルス科（フィロウイルス）（エボラ出血熱及びマールブルグ出血熱を含む）、フラビウイルス科（キャサヌール森林病ウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎原因ウイルスなど）、及びパラミクソウイルス科（ヘンドラウイルス及びニパウイルスなど）、大痘瘡及び小痘瘡（天然痘）、アルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＳＡＲＳ関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ウエストナイルウイルス、任意の脳炎原因ウイルスなど）のウイルスのいずれかを含む。
一実施形態において、パッケージング細胞は、ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質でシュードタイプ化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生する。
本明細書で使用される「シュードタイプ」または「シュードタイプ化」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を有する別のウイルスのもので置換されているウイルスを指す。例えば、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によりコードされるもの）は通常ウイルスの標的をＣＤ４＋提示細胞に定めるため、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質でシュードタイプ化することができ、これにより、ＨＩＶがより広範囲の細胞に感染することが可能になる。好ましい実施形態では、レンチウイルスエンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化される。一実施形態において、パッケージング細胞は、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化された組換えレトロウイルス、例えばレンチウイルスを産生する。
本明細書で使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、パッケージングシグナルを含まないが、ウイルス粒子の正しいパッケージングに必要なウイルス構造タンパク質及び複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ）を安定的または一過的に発現する細胞株に関して使用される。任意の好適な細胞株を用いてパッケージング細胞を調製することができる。概して、この細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、パッケージング細胞株を産生するために使用される細胞は、ヒト細胞である。使用され得る好適な細胞株としては、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、ＦＬＹ細胞、Ｐｓｉ−２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞，Ｂ−５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、及び２１１Ａ細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、パッケージング細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、またはＡ５４９細胞である。別の好ましい実施形態では、この細胞はＡ５４９細胞である。
本明細書で使用される場合、「プロデューサー細胞株」という用語は、パッケージング細胞株とパッケージングシグナルを含む移入ベクター構築物とを含む、組換えレトロウイルス粒子を産生することのできる細胞株を指す。感染性ウイルス粒子及びウイルス原液の生成は、従来の技術を使用して行うことができる。ウイルス原液の調製方法は当該技術分野で知られており、例えば、Ｙ．Ｓｏｎｅｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６２８−６３３、及びＮ．Ｒ．Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：５１１０−５１１３によって例証されている。感染性ウイルス粒子は、従来の技術を使用してパッケージング細胞から収集することができる。例えば、感染性粒子は、当該技術分野で知られているように、細胞溶解、または細胞培養物の上清の収集によって収集することができる。所望される場合、任意選択により、収集されたウイルス粒子を精製してもよい。好適な精製技術は当業者に周知である。
トランスフェクションではなくウイルス感染の手段によるレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用した遺伝子（複数可）または他のポリヌクレオチド配列の送達は、「形質導入」と称される。一実施形態において、レトロウイルスベクターは、感染及びプロウイルスの組み込みによって細胞に形質導入される。ある特定の実施形態において、標的細胞、例えばＴ細胞は、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを使用した感染によって細胞に送達された遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む場合、「形質導入される」。特定の実施形態において、形質導入細胞は、その細胞ゲノム内にレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターによって送達された１つ以上の遺伝子または他のポリヌクレオチド配列を含む。
特定の実施形態において、１つ以上のポリペプチドを発現するウイルスベクターを形質導入した宿主細胞が、Ｂ細胞悪性腫瘍を治療及び／または防止するために対象に投与される。ある特定の実施形態に従って用いられ得る、遺伝子療法におけるウイルスベクターの使用に関する他の方法は、例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．（１９９７）Ｃｈｅｓｔ １１１（６ Ｓｕｐｐ．）：１３８Ｓ−１４２Ｓ、Ｆｅｒｒｙ，Ｎ．ａｎｄ Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９７５−８１、Ｓｈｉｒａｔｏｒｙ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｌｉｖｅｒ １９：２６５−７４、Ｏｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１１：１７９−８６、Ｔｈｕｌｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１７４４−５２、Ｙａｎｇ，Ｎ．Ｓ．（１９９２）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：３３５−５６、Ａｌｔ，Ｍ．（１９９５）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２３：７４６−５８、Ｂｒｏｄｙ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：９０−１０１、Ｓｔｒａｙｅｒ，Ｄ．Ｓ．（１９９９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ８：２１５９−２１７２、Ｓｍｉｔｈ−Ａｒｉｃａ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｐ．３：４３−４９、及びＬｅｅ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０８：４８３−８に見出すことができる。
Ｇ． 遺伝子改変細胞
様々な実施形態において、がんの治療において使用するための、本明細書において想定されるＣＡＲを発現するように遺伝子改変された細胞が提供される。本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子改変された」という用語は、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態における追加の遺伝子材料を付加することを指す。「遺伝子改変細胞」、「改変細胞」、及び「再指向された細胞」という用語は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子の発現を回復、修正、もしくは改変する、または治療用ポリペプチド、例えばＣＡＲを発現する目的で、細胞内の全遺伝子材料にＤＮＡまたはＲＮＡの形態における追加の遺伝子材料を導入することを指す。
特定の実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲは、目的の標的抗原、例えばＳＴｎ発現糖タンパク質にそれらの特異性を再指向させるために、免疫エフェクター細胞に導入され、発現する。「免疫エフェクター細胞」とは、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。本明細書において想定される例証となる免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、及びヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
免疫エフェクター細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であってもよい。
本明細書で使用される「自家性」とは、同じ対象に由来する細胞を指す。
本明細書で使用される「同種」とは、比較される細胞と遺伝的に異なる同じ種の細胞を指す。
本明細書で使用される「同系」とは、比較される細胞と遺伝的に同一である異なる対象の細胞を指す。
本明細書で使用される「異種」とは、比較される細胞と異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態では、細胞は同種である。
本明細書において想定されるＣＡＲと共に使用される例証となる免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含む。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むよう意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞とすることができる。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであってもよい。特定の実施形態で使用するのに好適な他の例証となるＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞を含む。
当業者には理解されるように、他の細胞を免疫エフェクター細胞として本明細書に記載のＣＡＲと共に使用してもよい。特に、免疫エフェクター細胞は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及びマクロファージも含む。免疫エフェクター細胞にはエフェクター細胞の前駆細胞も含まれ、そのような前駆細胞は、インビボまたはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するよう誘導され得る。したがって、特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、臍帯血、骨髄、または動員末梢血に由来する細胞のＣＤ３４＋集団に含まれる造血幹細胞（ＨＳＣ）などの免疫エフェクター細胞の前駆細胞を含み、これは、対象に投与されると成熟免疫エフェクター細胞に分化するか、または成熟免疫エフェクター細胞に分化するようにインビトロで誘導され得る。
本明細書で使用される場合、ＳＴｎ特異的ＣＡＲを含むように遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、「ＳＴｎ特異的な再指向された免疫エフェクター細胞」と称され得る。
本明細書で使用される「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上でＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される「ＣＤ３４」は、多くの場合、細胞−細胞接着因子として作用し、かつリンパ節へのＴ細胞進入に関与する、細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。ＣＤ３４＋細胞集団には、患者に投与されると分化し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、及び単球／マクロファージ系列の細胞を含む全ての造血系に寄与する、造血幹細胞（ＨＳＣ）が含まれる。
本明細書において想定されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞を作製するための方法が、特定の実施形態に提供される。一実施形態において、本方法は、免疫エフェクター細胞が本明細書に記載される１つ以上のＣＡＲを発現するように、個体から単離された免疫エフェクター細胞にトランスフェクションまたは形質導入を行うことを含む。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、インビトロで個体から単離され、さらなる操作を行うことなく遺伝子改変される。このような細胞は次に、個体に直接再投与され得る。さらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、まずインビトロで増殖するよう活性化され刺激される。この点において、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書において想定されるＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前及び／または後に培養されてもよい。
特定の実施形態において、本明細書に記載される免疫エフェクター細胞のインビトロでの操作または遺伝子改変の前に、細胞源が対象から得られる。特定の実施形態において、ＣＡＲ改変免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣは、本明細書において想定される方法を使用して、ＣＡＲを発現するように直接遺伝子改変され得る。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球がさらに単離され、ある特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、遺伝子改変及び／もしくは増幅の前あるいは後に、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、公知の方法を使用して単離した後に遺伝子改変されてもよいし、免疫エフェクター細胞は、遺伝子改変される前にインビトロで活性化及び増幅（または前駆細胞の場合は分化）されてもよい。特定の実施形態において、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞は、本明細書において想定されるキメラ抗原受容体で遺伝子改変され（例えば、ＣＡＲをコードする核酸を含むウイルスベクターを形質導入され）、次にインビトロで活性化及び増幅される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現するための遺伝子改変の前または後に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載の方法を使用して活性化及び増幅され得る。
一実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書において想定される核酸構築物を形質導入される。ある特定の実施形態において、形質導入されたＣＤ３４＋細胞は、対象、概して細胞が最初に単離された対象への投与後に、インビボで成熟免疫エフェクター細胞に分化する。別の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、本明細書に記載のＣＡＲへの曝露前、またはそれで遺伝子改変された後に、次のサイトカイン：Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬＴ３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球増殖分化因子（ＴＰＯ）、ＩＬ−３、及びＩＬ−６のうちの１つ以上により、これまでに説明されている方法に従ってインビトロで刺激され得る（Ａｓｈｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｉｍｒｅｎ，ｅｔ ａｌ．，２００４）。
特定の実施形態において、がんの治療のために改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に開示されるＣＡＲを含む。例えば、改変された免疫エフェクター細胞の集団は、本明細書に記載のＢ細胞悪性腫瘍と診断された患者（自家性ドナー）から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から調製される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋、及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一集団を形成する。
ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞といった他の細胞傷害性リンパ球も含み得る。本明細書において想定されるＣＡＲのコード配列を有する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。特定の実施形態では、フローサイトメトリを使用し、正常に形質導入された発現ベクターを有するＴ細胞を分別して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次に、抗ＣＤ３抗体及びもしくは抗ＣＤ２８抗体ならびにＩＬ−２、または本明細書の他の箇所に記載される当該技術分野で知られる任意の他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのＣＡＲタンパク質発現Ｔ細胞の数を増加させるためにさらに繁殖させることができる。貯蔵及び／またはヒト対象に使用するための調製のために、ＣＡＲタンパク質Ｔ細胞を発現するＴ細胞の凍結保存の標準的な手順が使用される。一実施形態において、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、及び／または増幅は、ウシ胎児血清及びウシ胎仔血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で行われる。ＰＢＭＣの不均一集団が遺伝子改変されるため、得られる形質導入細胞は、本明細書において想定されるＳＴｎ発現糖タンパク質を標的とするＣＡＲを含む改変細胞の不均一集団である。
さらなる実施形態では、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の異なる発現ベクターの混合物を、免疫エフェクター細胞のドナー集団の遺伝子改変に使用することができ、ここで各ベクターは、本明細書において想定される異なるキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。得られる改変された免疫エフェクター細胞は、ある割合の改変細胞が２つ以上の異なるＣＡＲタンパク質を発現する、改変細胞の混合集団を形成する。
Ｈ． Ｔ細胞の製造方法
様々な実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、ＣＤ３ ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触により増幅される。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、刺激剤及び共刺激剤、例えば可溶性の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体と接触させられる。
特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、刺激剤及び共刺激剤、例えば可溶性の抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体、またはビーズもしくは他の表面に結合した抗体、ならびに／またはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させられる。
好ましい実施形態では、本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞は、改善された養子免疫療法組成物を提供する。いずれかの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書において想定される特定の実施形態の方法によって製造されたＴ細胞組成物は、生存率の増加、分化が比較的少ない増幅、及びインビボでの持続性を含む、優れた特性を有していると考えられる。一実施形態において、Ｔ細胞を製造する方法は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と細胞を接触させることを含む。一実施形態において、Ｔ細胞を製造する方法は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と細胞を接触させることを含む。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、任意の供給源から得られ、製造プロセスの活性化及び／または増幅段階中に薬剤と接触させられてよい。得られるＴ細胞組成物は、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びＣＤ８のうちの１つ以上を増殖及び発現する能力を有する発達的に強力なＴ細胞が濃縮されている。一実施形態において、１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されているＴ細胞を含む細胞集団は、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が濃縮されている。
一実施形態において、１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理されているＴ細胞を含む細胞集団は、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つ以上または全てを共発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の集団が濃縮されている。
一実施形態では、維持されたレベルの増殖及び低減された分化を含む、改変されたＴ細胞が製造される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上の刺激シグナル及びＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤である薬剤の存在下で、活性化し増殖するようにＴ細胞を刺激することによって製造される。
Ｔ細胞は次に、抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように改変され得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを含むウイルスベクターをＴ細胞に形質導入することによって改変される。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の前に改変される。別の実施形態では、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の後に改変される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路の阻害剤の存在下での刺激及び活性化の１２時間、２４時間、３６時間、または４８時間以内に改変される。
Ｔ細胞が活性化された後、細胞は増殖のために培養される。Ｔ細胞は、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回以上増幅しながら、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日、少なくとも２週間、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月以上にわたって培養され得る。
様々な実施形態において、Ｔ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路の１つ以上の阻害剤の存在下で製造される。阻害剤は、この経路における１つ以上の活性または単一の活性を標的化し得る。いずれかの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、製造プロセスの刺激、活性化、及び／または増幅段階中の処理、またはＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤とＴ細胞の接触が、若いＴ細胞を優先的に増加させ、それによって優れた治療用Ｔ細胞組成物が生成されることが想定される。
特定の実施形態において、操作されたＴ細胞受容体を発現するＴ細胞の増殖を増加させるための方法が提供される。かかる方法は、例えば、対象からＴ細胞源を採取すること、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤の存在下でＴ細胞を刺激及び活性化すること、抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するようにＴ細胞を改変すること、及び培養物中でＴ細胞を増幅させることを含み得る。
ある特定の実施形態では、次のバイオマーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、及びＣＤ８のうちの１つ以上の発現のために濃縮されたＴ細胞の集団を産生するための方法が想定される。一実施形態において、若いＴ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。
一実施形態において、若いＴ細胞は、次の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つ以上または全てを含む。
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３の発現を欠いている若いＴ細胞が提供される。本明細書の他の箇所で詳解されるように、発現レベル若いＴ細胞バイオマーカーは、より分化したＴ細胞または免疫エフェクター細胞集団におけるかかるマーカーの発現レベルと相対的なものである。
一実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、本明細書において想定されるＴ細胞の製造方法におけるＴ細胞源として使用される。ＰＢＭＣは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはＣＤ４＋、及びＣＤ８＋であり得るＴリンパ球の不均一集団を形成し、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫＴ細胞といった他の単核細胞を含み得る。本明細書において想定される操作されたＴＣＲまたはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。特定の実施形態では、フローサイトメトリを使用し、正常に形質導入された発現ベクターを有するＴ細胞を分別して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次に、抗ＣＤ３抗体及びもしくは抗ＣＤ２８抗体、ならびにＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５を使用した細胞活性化に加えて、改変されたＴ細胞の数を増加させるためにさらに繁殖させることができる。
本明細書において想定される製造方法は、貯蔵及び／またはヒト対象に使用するための調製のための、改変されたＴ細胞の凍結保存をさらに含み得る。一実施形態では、解凍に際し細胞が生存可能なままであるように免疫エフェクター細胞を凍結保存することを含む、ＳＴｎ発現糖タンパク質を標的化する、遺伝子改変されたマウス、ヒト、またはヒト化ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞を貯蔵するための方法が提供される。ＣＡＲタンパク質を発現する免疫エフェクター細胞の画分を、当該技術分野で知られる方法によって凍結保存すると、がん細胞で発現するＳＴｎ発現糖タンパク質に苦しむ患者の将来の治療のための、かかる細胞の永続的な供給源を提供することができる。Ｔ細胞は、解凍に際し細胞が生存可能なままであるように凍結保存される。必要に応じて、凍結保存された形質転換免疫エフェクター細胞は、かかる細胞をさらに得るために、解凍、増殖、及び増幅され得る。本明細書で使用される場合、「凍結保存」とは、（典型的には）７７Ｋまたは−１９６℃（液体窒素の沸点）などの氷点下温度に冷却することによる細胞の保存を指す。凍結保護剤は、多くの場合、保存される細胞が低温での凍結または室温への加温により損傷するのを防ぐために、氷点下温度で使用される。凍結保存剤及び最適な冷却速度は、細胞の損傷を防ぐことができる。使用され得る凍結保護剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｌｏｖｅｌｏｃｋ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，Ｎａｔｕｒｅ，１９５９；１８３：１３９４−１３９５、Ａｓｈｗｏｏｄ−Ｓｍｉｔｈ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６１；１９０：１２０４−１２０５）、グリセロール、ポリビニルピロリドン（Ｒｉｎｆｒｅｔ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９６０；８５：５７６）、及びポリエチレングリコール（Ｓｌｏｖｉｔｅｒ ａｎｄ Ｒａｖｄｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９６２；１９６：４８）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい冷却速度は、１℃〜３℃／分である。少なくとも２時間後、Ｔ細胞は−８０℃の温度に達し、長期低温貯蔵槽などにおける永続的な貯蔵のために液体窒素（−１９６℃）に直接入れることができる。
１． Ｔ細胞
改善されたＣＡＲ Ｔ細胞組成物の製造が、特定の実施形態で提供される。ＣＡＲ Ｔ細胞産生に使用されるＴ細胞は、自家性／自律性（「自己」）であっても、非自家性（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であってもよい。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、霊長類対象から得られる。最も好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト対象から得られる。
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含むがそれらに限定されない、いくつかの供給源から得ることができる。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当業者に知られる任意の数の技術、例えば遠心沈降、例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などを使用して、対象から収集された血液単位から得ることができる。一実施形態において、個体の循環血液からの細胞が、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、通常、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含めたリンパ球を含む。一実施形態では、アフェレーシスにより収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、細胞を後続処理のために適切な緩衝液または培地に入れてもよい。これらの細胞は、ＰＢＳ、またはカルシウム、マグネシウム、そして全てではないがほとんどの他の二価カチオンを含まない別の好適な溶液で洗浄することができる。当業者には理解されるように、洗浄ステップは、当業者に知られる方法、例えば半自動フロースルー遠心分離機の使用などによって達成され得る。例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅなどである。洗浄後、これらの細胞は、種々の生体適合性緩衝液、または緩衝液ありもしくはなしの他の食塩水溶液に再懸濁させてもよい。ある特定の実施形態において、アフェレーシス試料の望まれない成分は、この細胞を直接再懸濁させた培養培地中で除去することができる。
特定の実施形態において、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞集団が、本明細書において想定される製造方法で使用される。他の実施形態では、単離または精製されたＴ細胞集団が、本明細書において想定される製造方法で使用される。細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントによる遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、活性化、増幅、及び／もしくは遺伝子改変の前あるいは後に、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
特定の実施形態において、Ｔ細胞、例えば、ＰＢＭＣを含む細胞集団が、本明細書において想定される製造方法で使用される。他の実施形態では、単離または精製されたＴ細胞集団が、本明細書において想定される製造方法で使用される。細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）グラジエントによる遠心分離によって単球を枯渇させることによって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、活性化、増幅、及び／もしくは遺伝子改変の前あるいは後に、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
特定の実施形態において、本明細書において想定される方法を使用してＣＡＲを発現するように遺伝子改変されているが正または負の選択を受けていないＰＢＭＣから、免疫エフェクター細胞の集団が製造される。ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣの単離後、Ｔリンパ球がさらに単離され、ある特定の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球との両方が、遺伝子改変及び／もしくは増幅の前あるいは後に、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及びエフェクターＴ細胞の亜集団に分別され得る。
ある特定の実施形態において、次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団が、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。一実施形態において、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団が、正または負の選択技術によってさらに単離される。様々な実施形態において、製造されたＴ細胞組成物は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
一実施形態において、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅させたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ありで活性化及び増幅させたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
一実施形態において、本明細書において想定される製造方法は、ナイーブＴ細胞または発達的に強力なＴ細胞の１つ以上のマーカーを含むＣＡＲ Ｔ細胞の数を増加させる。いずれかの特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、Ｔ細胞を含む細胞集団を１つ以上のＰＩ３Ｋ阻害剤で処理すると、発達的に強力なＴ細胞の増幅が増加し、既存のＣＡＲ Ｔ細胞両方と比較してより堅実かつ有効な養子性ＣＡＲ Ｔ細胞免疫療法がもたらされると考える。
本明細書において想定される方法を使用して製造されたＴ細胞で増加する、ナイーブＴ細胞または発達的に強力なＴ細胞のマーカーの例証となる例としては、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８が挙げられるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、ナイーブＴ細胞は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
Ｔ細胞に関して、本明細書において想定される様々な増幅方法から生じるＴ細胞集団は、用いられる条件に応じて種々の特定の表現型特性を有し得る。様々な実施形態において、増幅されたＴ細胞集団は、次の表現型マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ＣＤ８、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を含む。
一実施形態において、そのような表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８のうちの１つ以上または全ての発現の増強を含む。特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とするＣＤ８＋Ｔリンパ球が増幅する。
一実施形態において、そのような表現型マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８のうちの１つ以上または全ての発現の増強を含む。特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８を含むナイーブＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とするＣＤ８＋Ｔリンパ球が増幅する。
特定の実施形態において、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８を含む中枢メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現を特徴とし、かつグランザイムＢに陰性のＴ細胞が増幅する。いくつかの実施形態では、中枢メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態において、ＣＤ６２Ｌを含むナイーブＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現を特徴とし、かつＣＤ４５ＲＡ及び／またはＣＤ４５ＲＯの発現が陰性のＣＤ４＋Ｔリンパ球が増幅する。いくつかの実施形態では、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯ陽性を含む中枢メモリーＣＤ４＋細胞の表現型マーカーの発現を特徴とするＣＤ４＋細胞。いくつかの実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性及びＣＤ４５ＲＯ陰性である。
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように遺伝子改変される前に、個体から単離され、インビトロで増殖するよう活性化され刺激される。この点において、Ｔ細胞は、遺伝子改変される（すなわち、本明細書において想定される抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように形質導入またはトランスフェクトされる）前及び／または後に培養されてもよい。
２． 活性化及び増幅
Ｔ細胞組成物の十分な治療用量を達成するために、Ｔ細胞は多くの場合、１回以上の刺激、活性化、及び／または増幅を受ける。Ｔ細胞は概して、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、及び同第６，８６７，０４１号（これらの各々は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して活性化及び増幅され得る。抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように改変されるＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または後に活性化及び増幅され得る。加えて、Ｔ細胞は、活性化及び／もしくは増幅の前、その間、ならびに／またはその後に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤と接触させられてもよい。一実施形態において、本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞は、１回、２回、３回、４回、または５回以上の活性化及び増幅を受け、これらの各々は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ細胞シグナル伝達経路を調節する１つ以上の薬剤を含み得る。
人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、天然のＡＰＣの使用とは対照的に、外因性サイトカインの付加を必要とすることなく、機能性ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のエクスビボ増殖及び長期増幅を支持する。特定の実施形態において、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−７、及び／またはＩＬ−１５などの適切なサイトカインを含む培養培地において、概してビーズまたは他の表面に結合した抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体などの刺激剤及び共刺激剤と接触させられる。
他の実施形態では、種々の共刺激分子及びサイトカインの安定した発現ならびに分泌を指向するようにＫ５６２、Ｕ９３７、７２１．２２１、Ｔ２、及びＣ１Ｒ細胞を操作することにより作製された人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）。特定の実施形態において、ＡＡＰＣ細胞表面上での１つ以上の抗体ベースの刺激分子の提示を指向するために、Ｋ３２またはＵ３２ ａＡＰＣが使用される。Ｔ細胞集団は、ＣＤ１３７Ｌ（４−１ＢＢＬ）、ＣＤ１３４Ｌ（ＯＸ４０Ｌ）、及び／またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６を含むがそれらに限定されない、種々の共刺激分子を発現するａＡＰＣによって増幅させることができる。ａＡＰＣは、遺伝子改変Ｔ細胞を増幅させ、ＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ２８発現を維持するのに効率的なプラットホームを提供する。ＷＯ ０３／０５７１７１及びＵＳ２００３／０１４７８６９に提供されるａＡＰＣは、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態において、共刺激リガンドが、Ｔ細胞上の同族の共刺激分子に特異的に結合する抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）で提示され、それにより、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によりもたらされる一次シグナルに加えて、所望のＴ細胞応答を媒介するシグナルが提供される。好適な共刺激リガンドとしては、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンフォトキシンベータ受容体、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合する作動薬または抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドを含むがそれらに限定されない、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
好適な共刺激リガンドは、標的抗原をさらに含み、これは、可溶形態で提供されても、または改変Ｔ細胞で発現する操作されたＴＣＲもしくはＣＡＲに結合するＡＰＣもしくはａＡＰＣで発現してもよい。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＴ細胞を製造するための方法は、Ｔ細胞を含む細胞集団を活性化させること、及びＴ細胞集団を増幅させることを含む。Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって、またはＣＤ２表面タンパク質の刺激を介して一次的な刺激シグナルを提供すること、及びアクセサリー分子、例えばＣＤ２８によって二次的な共刺激シグナルを提供することによって達成され得る。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、好適なＣＤ３結合剤、例えばＣＤ３リガンドまたは抗ＣＤ３モノクローナル抗体とＴ細胞を接触させることによって刺激され得る。ＣＤ３抗体の例証となる例としては、ＯＫＴ３、Ｇ１９−４、ＢＣ３、及び６４．１が挙げられるが、それらに限定されない。
別の実施形態では、ＣＤ２結合剤が、一次刺激シグナルをＴ細胞に提供するために使用され得る。ＣＤ２結合剤の例証となる例としては、ＣＤ２リガンド及び抗ＣＤ２抗体、例えば、Ｔ１１．１またはＴ１１．２抗体と組み合わせたＴ１１．３抗体（Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｃｅｌｌ ３６：８９７−９０６）、及び９−１抗体と組み合わせた９．６抗体（これはＴＩ １．１と同じエピトープを認識する）（Ｙａｎｇ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０９７−１１００）が挙げられるが、それらに限定されない。上述の抗体のいずれかと同じエピトープに結合する他の抗体も使用することができる。本明細書の他の箇所に開示される標準的技術によって、付加的な抗体、または抗体の組み合わせを調製及び特定することができる。
ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によって、またはＣＤ２を介して提供される一次刺激シグナルに加えて、Ｔ細胞応答の誘導は、第２の共刺激シグナルを必要とする。特定の実施形態において、ＣＤ２８結合剤が、共刺激シグナルを提供するために使用され得る。ＣＤ２８結合剤の例証となる例としては、天然のＣＤ２８リガンド、例えば、ＣＤ２８の天然リガンド（例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）及びＢ７−２（ＣＤ８６などのタンパク質のＢ７ファミリーのメンバー）、ならびにＣＤ２８分子に架橋結合することのできる抗ＣＤ２８モノクローナル抗体またはその断片、例えば、モノクローナル抗体９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８、ＫＯＬＴ−２、１５Ｅ８、２４８．２３．２、及びＥＸ５．３Ｄ１０が挙げられるが、それらに限定されない。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２によって刺激を提供する分子、及び共刺激分子は、同じ表面に結合する。
ある特定の実施形態において、刺激シグナル及び共刺激シグナルを提供する結合剤は、細胞の表面上に局在化される。これは、細胞表面でのその発現に好適な形態における結合剤をコードする核酸を細胞にトランスフェクトもしくは形質導入することによって、あるいは結合剤を細胞表面に結合させることによって達成することができる。
別の実施形態では、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２によって刺激を提供する分子、及び共刺激分子は、抗原提示細胞で提示される。
一実施形態において、一次刺激シグナルを提供する分子、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＤ２によって刺激を提供する分子、及び共刺激分子は、別々の表面上に提供される。
ある特定の実施形態では、刺激シグナル及び共刺激シグナルを提供する結合剤のうちの１つは、可溶性であり（溶液で提供され）、他の薬剤（複数可）は、１つ以上の表面上に提供される。
特定の実施形態において、刺激シグナル及び共刺激シグナルを提供する結合剤は、両方とも可溶形態で提供される（溶液で提供される）。
様々な実施形態において、本明細書において想定されるＴ細胞を製造するための方法は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体でＴ細胞を活性化させることを含む。
本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞組成物は、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び／または増幅されたＴ細胞を含む。抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように改変されるＴ細胞は、Ｔ細胞が改変される前及び／または後に活性化及び増幅され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞集団は、活性化され、抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現するように改変され、次に増幅のために培養される。
一実施形態において、本明細書において想定される方法によって製造されたＴ細胞は、高い増殖の可能性及び自己再生能力を示すマーカーを発現するが、Ｔ細胞分化のマーカーを発現しないか、またはその発現が実質的に検出不可能である、増加した数のＴ細胞を含む。これらのＴ細胞は、堅実な様式で繰り返し活性化及び増幅され、それにより改善された治療用Ｔ細胞組成物が提供され得る。
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び増幅されたＴ細胞集団は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増幅される。
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ細胞シグナル伝達経路を阻害する１つ以上の薬剤の存在下で活性化及び増幅された若いＴ細胞であるマーカーの発現を特徴とするＴ細胞集団は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅されたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増幅される。
一実施形態において、本明細書において想定される方法によって活性化されたＴ細胞の増幅は、Ｔ細胞を含む細胞集団を、数時間（約３時間）から約７日間〜約２８日間、またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養することをさらに含む。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、１４日間培養され得る。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、約２１日間培養される。別の実施形態では、Ｔ細胞組成物は、約２〜３日間培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上になり得るように、数サイクルの刺激／活性化／増幅が所望される場合もある。
特定の実施形態において、Ｔ細胞培養に適切な条件としては、適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０もしくはＸ−ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））、ならびに、血清（例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ−α、または当業者に知られる細胞の増殖に好適な任意の他の添加剤を含むがそれらに限定されない、増殖及び生存能に必要な１つ以上の要素が挙げられる。
細胞培養培地のさらなる例証となる例としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、血清不含であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）または定義されたホルモン一式、ならびに／またはＴ細胞の増殖及び増幅に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充された、ＲＰＭＩ １６４０、Ｃｌｉｃｋｓ、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ １５、及びＸ−Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられるが、それらに限定されない。
Ｔ細胞増幅のための他の添加剤の例証となる例としては、界面活性剤、ピアスマネート（ｐｉａｓｍａｎａｔｅ）、ＨＥＰＥＳなどのｐＨ緩衝剤、ならびにＮ−アセチル−システイン及び２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、それらに限定されない。
抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験用培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、増殖の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び雰囲気（例えば、空気＋５％ ＣＯ２）に維持される。
３． 薬剤
様々な実施形態において、細胞のＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を増幅させる、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。様々な実施形態において、細胞のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を調節する薬剤とＴ細胞を接触させることを含む、未分化または発達的に強力なＴ細胞を増幅させる、Ｔ細胞を製造するための方法が提供される。細胞は、活性化ならびに増幅の前、その間、及び／またはその後に接触させられ得る。Ｔ細胞組成物は、それらが分化の実質的増加を伴わずに複数回の増幅を受けることができるように、十分なＴ細胞の効力を保持する。
本明細書で使用される場合、「調節する」、「調節因子」、もしくは「調節剤」という用語、または比較可能な用語は、細胞シグナル伝達経路の変化を誘発する薬剤の能力を指す。調節因子は、経路成分の量、活性を増加または減少させるか、あるいは細胞シグナル伝達経路の所望の効果もしくは出力を増加または減少させることができる。一実施形態において、調節因子は阻害剤である。別の実施形態では、調節因子は活性化因子である。
「薬剤」は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の調節に使用される化合物、小分子、例えば、有機小分子、核酸、ポリペプチド、またはそれらの断片、アイソフォーム、バリアント、類似体、もしくは誘導体を指す。
「小分子」は、約５ｋＤ未満、約４ｋＤ未満、約３ｋＤ未満、約２ｋＤ未満、約１ｋＤ未満、または約０．５ｋＤ未満の分子量を有する組成物を指す。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、炭水化物、脂質、それらの成分、または他の有機分子もしくは無機分子を含み得る。真菌、細菌、または藻類の抽出物などの化学的及び／または生物学的混合物のライブラリは、当該技術分野で知られており、アッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。分子ライブラリの合成方法の例は、（Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ａ、Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４ｂ、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３、ＤｅＷｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｇａｌｌｏｐ ｅｔ ａｌ．，１９９４、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４）に見出すことができる。
「類似体」は、ある化合物、ヌクレオチド、タンパク質、もしくはポリペプチド、または所望の活性を有する化合物と同様もしくは同一の活性または機能（複数可）を有するが、必ずしも好ましい実施形態の配列または構造と同様もしくは同一の配列または構造を含む必要はない、小有機化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドを指す。
「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加の導入によって変更されている親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含む化合物、タンパク質、またはポリペプチドか、あるいは、ヌクレオチドの置換もしくは欠失、付加または変異の導入のいずれかによって改変されている核酸またはヌクレオチドのいずれかを指す。誘導体である核酸、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドは、親ポリペプチドと同様または同一の機能を有する。
様々な実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、経路の成分を活性化させる。「活性化因子」または「作動薬」は、ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を活性化させる分子を含むがそれに限定されない、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における分子の１つ以上の活性を促進、増加、または誘導する薬剤を指す。
様々な実施形態において、ＰＩ３Ｋ経路を調節する薬剤は、経路の成分を阻害する。「阻害剤」または「拮抗薬」は、ＰＩ３Ｋの１つ以上の活性を阻害する分子を含むがそれに限定されない、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路における分子の１つ以上の活性を阻害、減少、または低減する薬剤を指す。一実施形態において、阻害剤は、二重分子阻害剤である。特定の実施形態では、阻害剤は、同じまたは実質的に同様の活性を有するクラスの分子を阻害し得る（汎阻害剤）か、または分子の活性を特異的に阻害し得る（選択的または特異的阻害剤）。阻害は、不可逆的であっても可逆的であってもよい。
一実施形態において、阻害剤は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、または少なくとも１００μＭのＩＣ５０を有する。ＩＣ５０の決定は、当該技術分野で知られる任意の従来技術を使用して達成することができる。例えば、ＩＣ５０は、ある範囲の濃度の研究中の阻害剤の存在下で所与の酵素の活性を測定することによって決定することができる。次に、実験で得られた酵素活性値を、使用した阻害剤濃度に対してプロットする。５０％の酵素活性（あらゆる阻害剤の非存在下での活性と比較して）を示す阻害剤の濃度を「ＩＣ５０」値とする。類似的に、活性の適切な定量によって他の阻害性濃度を定義することができる。
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、少なくとも１ｎＭ、少なくとも２ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも２００ｎＭ、少なくとも５００ｎＭ、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも５０μＭ、少なくとも１００μＭ、または少なくとも１Ｍの濃度で、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１つ以上の調節因子と接触させられるか、またはそれで処理されるか、またはそれと共に培養される。
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上増幅しながら、少なくとも１２時間、１８時間、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日、少なくとも２週間、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、または６か月以上にわたって、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の１つ以上の調節因子と接触させられるか、またはそれで処理されるか、またはそれと共に培養されてもよい。
ホスファチジル−イノシトール−３キナーゼ／Ａｋｔ／哺乳類ラパマイシン標的（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）経路は、成長因子シグナル伝達を細胞の増殖、分化、代謝、及び生存と統合する導管として機能する。ＰＩ３Ｋは、高度に保存された細胞内脂質キナーゼのファミリーである。クラスＩＡのＰＩ３Ｋは、直接的に、あるいはアダプター分子のインスリン受容体基質ファミリーとの相互作用を介して、成長因子受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化される。この活性は、セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔの制御因子であるホスファチジル−イノシトール−３，４，５−トリスホスペート（ｔｒｉｓｐｈｏｓｐａｔｅ）（ＰＩＰ３）の産生をもたらす。ｍＴＯＲは、明確に異なる活性を付与する異なる結合パートナーを各々が特徴とする２つの明確に異なる複合体を介して、正準な（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）ＰＩ３Ｋ経路を通じて作用する。ｍＴＯＲＣ１（ＰＲＡＳ４０、ｒａｐｔｏｒ、及びｍＬＳＴ８／ＧｂＬと複合したｍＴＯＲ）は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル伝達の下流エフェクターとして作用し、成長因子シグナルをタンパク質翻訳、細胞成長、増殖、及び生存と関連付ける。ｍＴＯＲＣ２（ｒｉｃｔｏｒ、ｍＳＩＮ１、ｐｒｏｔｏｒ、及びｍＬＳＴ８と複合したｍＴＯＲ）は、Ａｋｔの上流活性化因子として作用する。
ＰＩ３Ｋが成長因子受容体を媒介して活性化されると、Ａｋｔがそのプレクストリン相同ドメインのＰＩＰ３との相互作用によって膜に動員され、したがってその活性化ループが露出し、構成的活性型のホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ１（ＰＤＫ１）によるスレオニン３０８（Ｔｈｒ３０８）におけるリン酸化が可能になる。最大の活性化のために、Ａｋｔは、そのＣ末端側の疎水性モチーフのセリン４７３（Ｓｅｒ４７３）において、ｍＴＯＲＣ２によってもリン酸化される。ＤＮＡ−ＰＫ及びＨＳＰもまた、Ａｋｔ活性の調節において重要であることが示されている。Ａｋｔは、ＴＳＣ１と共に、ｍＴＯＲＣ１の正の制御因子であるＲｈｅｂ ＧＴＰアーゼを阻害することによってｍＴＯＲＣ１を負に調節する、ＴＳＣ２の阻害性リン酸化によってｍＴＯＲＣ１を活性化する。ｍＴＯＲＣ１は、２つの明確に定義された基質、ｐ７０Ｓ６Ｋ（以後Ｓ６Ｋ１と称す）及び４Ｅ−ＢＰ１を有し、これらは両方ともタンパク質合成を決定的に調節する。したがって、ｍＴＯＲＣ１は、成長因子シグナル伝達をタンパク質翻訳及び細胞増殖と関連付けるＰＩ３Ｋの重要な下流エフェクターである。
ａ． ＰＩ３Ｋ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＰＩ３Ｋ阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋに結合し、その少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ＰＩ３Ｋタンパク質は、クラス１のＰＩ３Ｋ、クラス２のＰＩ３Ｋ、及びクラス３のＰＩ３Ｋという３つのクラスに分類することができる。クラス１のＰＩ３Ｋは、４つのｐ１１０触媒サブユニット（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ）のうちの１つ、及び制御サブユニットの２つのファミリーのうちの１つからなるヘテロ二量体として存在する。特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤を標的化するのが好ましい。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤の１つ以上のアイソフォームに対する選択性（すなわち、ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γ、またはｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、及びｐ１１０γのうちの１つ以上に対する選択性）を提示する。別の実施形態では、ＰＩ３Ｋ阻害剤はアイソフォーム選択性を提示せず、「汎ＰＩ３Ｋ阻害剤」とみなされる。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ触媒ドメインとの結合に関してＡＴＰと競合する。
ある特定の実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、例えば、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路においてＰＩ３Ｋならびに付加的なタンパク質を標的化し得る。特定の実施形態において、ｍＴＯＲとＰＩ３Ｋとの両方を標的化するＰＩ３Ｋ阻害剤は、ｍＴＯＲ阻害剤あるいはＰＩ３Ｋ阻害剤と称される場合がある。ＰＩ３Ｋのみを標的とするＰＩ３Ｋ阻害剤は、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤と称され得る。一実施形態において、選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤は、経路におけるｍＴＯＲ及び／または他のタンパク質に対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＰＩ３Ｋに対する５０％阻害濃度を示す薬剤を指すものと理解することができる。
特定の実施形態において、例示的なＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＰＩ３Ｋを阻害する。
本明細書において想定されるＴ細胞製造方法で使用するのに好適なＰＩ３Ｋ阻害剤の例証となる例としては、ＢＫＭ１２０（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ１４７（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、（汎ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、及びＰＸ−８６６（クラス１のＰＩ３Ｋ阻害剤；ｐ１１０α、ｐ１１０β、及びｐ１１０γアイソフォーム、Ｏｎｃｏｔｈｙｒｅｏｎ）が挙げられるが、それに限定されない。
選択的ＰＩ３Ｋ阻害剤の他の例証となる例としては、ＢＹＬ７１９、ＧＳＫ２６３６７７１、ＴＧＸ−２２１、ＡＳ２５２４２、ＣＡＬ−１０１、ＺＳＴＫ４７４、及びＩＰＩ−１４５が挙げられるが、それらに限定されない。
汎ＰＩ３Ｋ阻害剤のさらなる例証となる例としては、ＢＥＺ２３５、ＬＹ２９４００２、ＧＳＫ１０５９６１５、ＴＧ１００７１３、及びＧＤＣ−０９４１が挙げられるが、それらに限定されない。
好ましい実施形態において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＺＳＴＫ４７４である。
ｂ． ＡＫＴ阻害剤
本明細書で使用される場合、「ＡＫＴ阻害剤」という用語は、ＡＫＴの少なくとも１つの活性を阻害する核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ＡＫＴ阻害剤は、脂質系阻害剤（例えば、ＡＫＴが形質膜に局在化することを防ぐＡＫＴのプレクストリン相同ドメインを標的とする阻害剤）、ＡＴＰ競合阻害剤、及びアロステリック阻害剤を含むいくつかのクラスにグループ分けすることができる。一実施形態において、ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ触媒部位に結合することによって作用する。特定の実施形態において、Ａｋｔ阻害剤は、ｍＴＯＲなどの下流ＡＫＴ標的のリン酸化を阻害することによって作用する。別の実施形態では、ＡＫＴ活性は、例えば、ＡＫＴのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡＫＴのＰＤＫ−１活性化、及び／またはＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化を阻害することにより、Ａｋｔを活性化させる入力シグナルを阻害することによって阻害される。
ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３の３つ全てのＡＫＴアイソフォームを標的としてもよく、またはアイソフォーム選択性でありＡＫＴアイソフォームのうちの１つまたは２つのみを標的としてもよい。一実施形態において、ＡＫＴ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路においてＡＫＴならびに付加的なタンパク質を標的化し得る。ＡＫＴのみを標的とするＡＫＴ阻害剤は、選択的ＡＫＴ阻害剤と称され得る。一実施形態において、選択的ＡＫＴ阻害剤は、経路における他のタンパク質に対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低いＡＫＴに対する５０％阻害濃度を示す薬剤を指すものと理解することができる。
特定の実施形態では、例示的なＡＫＴ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）でＡＫＴを阻害する。一実施形態において、ＡＫＴは、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０でＡＫＴを阻害する。
オーリスタチン系抗体−薬物接合体と組み合わせて使用するためのＡＫＴ阻害剤の例証となる例としては、例えば、ペリフォシン（Ｋｅｒｙｘ）、ＭＫ２２０６（Ｍｅｒｃｋ）、ＶＱＤ−００２（ＶｉｏＱｕｅｓｔ）、ＸＬ４１８（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、及びＰＸ３１６（ＰＲＯＬＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。
選択的Ａｋｔ１阻害剤の例証となる非限定的な例はＡ−６７４５６３である。
選択的Ａｋｔ２阻害剤の例証となる非限定的な例はＣＣＴ１２８９３０である。
特定の実施形態において、Ａｋｔ阻害剤ＡｋｔのＤＮＡ−ＰＫ活性化、ＡｋｔのＰＤＫ−１活性化、ＡｋｔのｍＴＯＲＣ２活性化、またはＡｋｔのＨＳＰ活性化。
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の例証となる例としては、ＮＵ７４４１、ＰＩ−１０３、ＮＵ７０２６、ＰＩＫ−７５、及びＰＰ−１２１が挙げられるが、それらに限定されない。
ｃ． ｍＴＯＲ阻害剤
「ｍＴＯＲ阻害剤」または「ｍＴＯＲを阻害する抗原」という用語は、ｍＴＯＲタンパク質の少なくとも１つの活性、例えば、その基質（例えば、ｐ７０Ｓ６キナーゼ１、４Ｅ−ＢＰ１、ＡＫＴ／ＰＫＢ、及びｅＥＦ２）のうちの少なくとも１つに対するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性などを阻害する、核酸、ペプチド、化合物、または有機小分子を指す。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、またはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方に直接結合し、それらを阻害することができる。
ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２活性の阻害は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路のシグナル伝達の低減によって定量することができる。多様な読み出し情報を用いて、そのようなシグナル伝達経路の出力の低減を立証することができる。いくつかの非限定的な例示的読み出し情報としては、（１）５４７３及びＴ３０８を含むがそれらに限定されない残基におけるＡｋｔのリン酸化の減少；（２）例えば、Ｆｏｘ０１／Ｏ３ａ Ｔ２４／３２、ＧＳＫ３ａ／β、Ｓ２１／９、及びＴＳＣ２ Ｔ１４６２を含むがそれらに限定されないＡｋｔ基質のリン酸化の低減によって証明されるＡｋｔの活性化の減少；（３）リボソームＳ６ Ｓ２４０／２４４、７０Ｓ６Ｋ Ｔ３８９、及び４ＥＢＰ１ Ｔ３７／４６を含むがそれらに限定されないｍＴＯＲの下流のシグナル伝達分子のリン酸化の減少；ならびに（４）がん性細胞の増殖の阻害が挙げられる。
一実施形態において、ｍＴＯＲ阻害剤は、活性部位阻害剤である。これらは、ｍＴＯＲのＡＴＰ結合部位（ＡＴＰ結合ポケットとも称される）に結合し、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方の触媒活性を阻害するｍＴＯＲ阻害剤である。本明細書において想定されるＴ細胞製造方法で使用するのに好適な１つのクラスの活性部位阻害剤は、ＰＩ３ＫとｍＴＯＲとの両方を標的とし直接阻害する二重特異性阻害剤である。二重特異性阻害剤は、ｍＴＯＲ及びＰＩ３ＫのＡＴＰ結合部位の両方に結合する。そのような阻害剤の例証となる例としては、イミダゾキナゾリン、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ＳＦ１１２６（Ｓｅｍａｆｏｒｅ）、ＢＧＴ２２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ７６５（Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、及びＮＶＰ−ＢＥＺ２３５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）が挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書において想定される方法で使用するのに好適な別のクラスのｍＴＯＲ活性部位阻害剤は、１つ以上のＩ型ホファチジルイノシトール（ｐｈｏｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）３−キナーゼ、例えば、ＰＩ３キナーゼα、β、γ、またはδに対して、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２活性を選択的に阻害する。これらの活性部位阻害剤は、ｍＴＯＲの活性部位には結合するが、ＰＩ３Ｋの活性部位には結合しない。そのような阻害剤の例証となる例としては、ピラゾロピリミジン、Ｔｏｒｉｎ１（Ｇｕｅｒｔｉｎ ａｎｄ Ｓａｂａｔｉｎｉ）、ＰＰ２４２（２−（４−アミノ−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−オール）、ＰＰ３０、Ｋｕ−００６３７９４、ＷＡＹ−６００（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−６８７（Ｗｙｅｔｈ）、ＷＡＹ−３５４（Ｗｙｅｔｈ）、及びＡＺＤ８０５５（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ，８，６２７−６４４，２００９）が挙げられるが、それらに限定されない。Ｉ
一実施形態において、選択的ｍＴＯＲ阻害剤とは、１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上のＩ型ＰＩ３キナーゼ、またはＩ型ＰＩ３キナーゼの全てに対する阻害剤のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上低い、ｍＴＯＲＣ１及び／またはｍＴＯＲＣ２に対する５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を示す薬剤を指す。
特定の実施形態で使用するための別のクラスのｍＴＯＲ阻害剤は、本明細書において「ラパログ」と称される。本明細書で使用される「ラパログ」という用語は、ｍＴＯＲ ＦＲＢドメイン（ＦＫＢＰラパマイシン結合ドメイン）に選択的に結合し、ラパマイシンと構造的に関連しており、ｍＴＯＲ阻害特性を保持する化合物を指す。ラパログという用語は、ラパマイシンを除外する。ラパログには、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、及びヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシンのコア構造上の官能基が例えば還元または酸化により修飾されている化合物が含まれる。そのような化合物の薬学的に許容される塩もラパマイシン誘導体とみなされる。本明細書において想定される方法で使用するのに好適なラパログの例証となる例としては、限定されないが、テムシロリムス（ＣＣ１７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、及びＯＳＩ−０２７（ＯＳＩ）が挙げられる。
一実施形態において、薬剤は、ｍＴＯＲ阻害剤ラパマイシン（シロリムス）である。
特定の実施形態において、例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、あるいはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方を阻害する。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ｍＴＯＲＣ１、ｍＴＯＲＣ２、あるいはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方を阻害する。
一実施形態において、例示的なｍＴＯＲ阻害剤は、約２００ｎＭ以下、好ましくは約１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは約６０ｎＭ以下、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１０μＭ、１μＭ以下のＩＣ５０（活性の５０％を阻害する濃度）で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１またはｍＴＯＲＣ２、あるいはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方及びＰＩ３Ｋを阻害する。一実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤は、約２ｎＭ〜約１００ｎｍ、より好ましくは約２ｎＭ〜約５０ｎＭ、さらにより好ましくは約２ｎＭ〜約１５ｎＭのＩＣ５０で、ＰＩ３Ｋ及びｍＴＯＲＣ１またはｍＴＯＲＣ２、あるいはｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２との両方及びＰＩ３Ｋを阻害する。
特定の実施形態で使用するのに好適なｍＴＯＲ阻害剤のさらなる例証となる例としては、ＡＺＤ８０５５、ＩＮＫ１２８、ラパマイシン、ＰＦ−０４６９１５０２、及びエベロリムスが挙げられるが、それらに限定されない。
ｍＴＯＲは、ウェスタンブロッティングにおいてリン光体特異的抗体により測定された場合に、生理学的基質タンパク質ｐ７０ Ｓ６リボソームタンパク質キナーゼＩ（ｐ７０Ｓ６Ｋ１）及びｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）に対して堅実かつ特異的な触媒活性を示すことが示されている。
一実施形態において、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の阻害剤は、ＢＩ−Ｄ１８７０、Ｈ８９、ＰＦ−４７０８６７１、ＦＭＫ、及びＡＴ７８６７からなる群から選択されるｓ６キナーゼ阻害剤である。
Ｉ． 組成物及び製剤
本明細書において想定される組成物は、本明細書において想定される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、遺伝子改変免疫エフェクター細胞などを含み得る。組成物は、薬学的組成物を含むが、これに限定されない。「薬学的組成物」は、単独で、あるいは１つ以上の他の治療様式と組み合わせて細胞もしくは動物に投与するための、薬学的に許容される溶液または生理学的に許容される溶液において製剤化される組成物を指す。また、所望される場合、組成物が、例えばサイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的活性剤といった他の薬剤と組み合わせて投与されてもよいことは理解されよう。付加的な薬剤が意図される療法を提供する組成物の能力に有害に作用しない限り、組成物中に含まれてもよい他の成分に実質的な制限はない。
「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに好適な、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために用いられる。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、限定されないが、ヒトまたは飼育動物に使用するのに許容可能なものとして米国食品医薬品局によって承認されている任意のアジュバント、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、風味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含む。例示的な薬学的に許容される担体としては、ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖類；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体；トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；カカオバター、ワックス、動物脂及び植物脂、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛；落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコールなどのポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液、ならびに薬学的製剤において用いられる任意の他の適合性物質が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書において想定される、ある量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む。本明細書で使用される場合、「量」という用語は、遺伝子改変された治療用細胞、例えばＴ細胞が、有益なもしくは所望される臨床結果を含めた予防的結果または治療的結果を達成するのに「有効な量」または「有効量」を指す。
「予防有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに有効な遺伝子改変された治療用細胞の量を指す。必ずしもそうではないが典型的には、予防的用量は疾患の発生前または初期段階で対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量未満である。
遺伝子改変された治療用細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する幹細胞及び前駆細胞の能力などの要因によって異なり得る。治療有効量はまた、ウイルスまたは形質導入された治療用細胞のいかなる毒性もしくは有害な作用をも治療上有益な効果が上回るものである。「治療有効量」という用語は、対象（例えば患者）を「治療」するのに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与されるべき組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染もしくは転移の範囲、及び状態の個々の差を考慮して医師により決定され得る。本明細書に記載のＴ細胞を含む薬学的組成物は、体重１ｋｇ当たり１０２〜１０１０個の細胞、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０５〜１０６個の細胞の投薬量（これらの範囲内の全ての整数値を含む）で投与され得ると概説することができる。細胞数は、組成物中に含まれる細胞型と同様に、組成物の意図される最終的な用途に依存する。本明細書に提供される用途において、細胞は、概して１リットル以下の容量であり、５００ｍＬ以下、さらには２５０ｍＬまたは１００ｍＬ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１０６細胞／ｍｌ超であり、概して１０７細胞／ｍｌ超、概して１０８細胞／ｍｌ以上である。臨床的に関連する免疫細胞数は、累積的に１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２細胞と等しいかまたはそれを超える複数回の注入に分配され得る。いくつかの実施形態では、特に、注入された細胞の全てが特定の標的抗原に再指向されるため、１０６／キログラム（患者当たり１０６〜１０１１）の範囲内の低い細胞数が投与され得る。ＣＡＲ発現細胞組成物は、これらの範囲内の投薬量で複数回投与され得る。細胞は、療法を受ける患者に対して同種、同系、異種、または自家性であってもよい。所望される場合、治療は、免疫応答の誘導を増強するために、本明細書に記載されるマイトジェン（例えばＰＨＡ）またはリンホカイン、サイトカイン、及び／もしくはケモカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１８、及びＴＮＦ−ベータ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、Ｆｌｔ３−Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１αなど）の投与を含んでもよい。
概して、本明細書に記載されるように活性化及び増幅された細胞を含む組成物は、免疫不全の個体において生じる疾患の治療及び防止に用いられ得る。特に、本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、がんの治療に使用される。特定の実施形態において、ＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独投与されてもよく、あるいは担体、希釈剤、賦形剤、及び／またはＩＬ−２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の成分と組み合わせた薬学的組成物として投与されてもよい。特定の実施形態において、薬学的組成物は、１つ以上の薬学的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、ある量の遺伝子改変Ｔ細胞を含む。
Ｔ細胞などのＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞集団を含む薬学的組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。特定の実施形態において、組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内または筋肉内投与のために製剤化される。
液体薬学的組成物は、それらが溶液であるか、懸濁液であるか、または他の同様の形態であるかにかかわらず、注射用水、食塩水溶液、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水などの無菌希釈剤、溶媒もしくは懸濁媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリドなどの固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；アセテート、シトレート、またはホスフェートなどの緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性を調整するための薬剤のうちの１つ以上を含み得る。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入され得る。注射用の薬学的組成物は、無菌であることが好ましい。
一実施形態において、本明細書において想定されるＴ細胞組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地において製剤化される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、血清不含培地である。
血清不含培地は、簡素かつより明確に定義された組成、低い程度の混入物、感染因子源の可能性の排除、及びコストの低下を含め、血清含有培地に比べていくつかの利点を有する。様々な実施形態において、血清不含培地は動物質不含であり、任意選択によりタンパク質不含であってもよい。任意選択により、培地は生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含んでもよい。「動物質不含」培地とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。動物質不含培地では、組換えタンパク質が天然の動物タンパク質に取って代わり、栄養素は合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質不含」培地は、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
特定の組成物に使用される血清不含培地の例証となる例としては、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＸ−ＶＩＶＯ １０が挙げられるが、それらに限定されない。
好ましい一実施形態では、本明細書において想定されるＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む溶液において製剤化される。
別の好ましい実施形態では、本明細書において想定されるＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地を含む溶液において製剤化される。例えば、凍結保存剤を含む凍結保存培地を使用して、解凍後の高い細胞生存成績を維持することができる。特定の組成物に使用される凍結保存培地の例証となる例としては、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５、及びＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ２が挙げられるが、それらに限定されない。
より好ましい実施形態では、本明細書において想定されるＴ細胞を含む組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ ＡとＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０を含む溶液において製剤化される。
特定の実施形態において、組成物は、有効量のＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を、単独で、または１つ以上の治療剤との組み合わせで含む。したがって、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞組成物は、単独で投与されても、または他の公知のがん治療、例えば放射線療法、化学療法、移植、免疫療法、ホルモン療法、光線力学的療法などと組み合わせて投与されてもよい。組成物はまた、抗生物質と組み合わせて投与されてもよい。そのような治療剤は、本明細書に記載される特定の疾患状態、例えば特定のがんなどの標準的治療として、当該技術分野で認められている場合がある。想定される例示的な治療剤としては、サイトカイン、成長因子、ステロイド、ＮＳＡＩＤ、ＤＭＡＲＤ、抗炎症薬、化学療法薬、放射線療法薬、治療用抗体、または他の活性剤及び補助剤が挙げられる。
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与されてもよい。化学療法剤の例証となる例としては、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチローロメラミンレジューム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンならびにメチルアメラミン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；アクラシロマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなどの抗生物質；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デホファミン；デメコルシン；ジアジコン；エフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）及びドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトクス）；エスペラミシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。この定義には、がんに対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン薬など；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン薬；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
種々の他の治療剤が、本明細書に記載の組成物と併せて使用され得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、抗炎症剤と共に投与される。抗炎症剤または抗炎症薬としては、ステロイド及びグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロンを含む）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬物、シクロホスファミド、及びミコフェノレートを含む非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が挙げられるが、それらに限定されない。
他の例示的なＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ＶＩＯＸＸ（登録商標）（ロフェコキシブ）及びＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）などのＣｏｘ−２阻害剤、ならびにシアリレート（ｓｉａｌｙｌａｔｅ）からなる群から選ばれる。例示的な鎮痛薬は、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン（ｐｒｏｐｏｒｘｙｐｈｅｎｅ）塩酸塩のトラマドールからなる群から選ばれる。例示的なグルココルチコイドは、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンからなる群から選ばれる。例示的な生体応答修飾物質としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ５など）に対して指向される分子、ＴＮＦ拮抗薬（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、及びインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））などのサイトカイン阻害剤、ケモカイン阻害剤、ならびに接着分子阻害剤が挙げられる。生体応答修飾物質は、モノクローナル抗体ならびに組換え形態の分子を含む。例示的なＤＭＡＲＤとしては、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシリラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）及び筋肉内）、及びミノサイクリンが挙げられる。
本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞との組み合わせに好適な治療用抗体の例証となる例としては、バビツキシマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、コナツムマブ、ダラツムマブ、ドゥリゴツマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エロツズマブ（ＨｕＬｕｃ６３）、ゲムツズマブ、イブリツモマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、ミラツズマブ、モキセツモマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、リツキシマブ、シルツキシマブ、テプロツムマブ、及びウブリツキシマブが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、サイトカインと併せて投与される。本明細書で使用される「サイトカイン」とは、１つの細胞集団によって放出され、細胞間の介在物質として別の細胞に作用するタンパク質の総称を意味する。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインの中には、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及び黄体ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝臓成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファ及びＴＧＦ−ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−アルファ、ベータ、及び−ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；ならびに顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）、ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦ及びキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源由来または組換え細胞培養物由来のタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な同等物を含む。
特定の実施形態において、組成物は、本明細書に開示されるＰＩ３Ｋ阻害剤の存在下で培養され、かつ次のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、及びＨＬＡ−ＤＲのうちの１つ以上を発現し、正または負の選択技術によってさらに単離され得る、本明細書において想定されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む。一実施形態において、組成物は、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、ＣＤ３８、ならびにｉｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上を発現するＴ細胞の特定の亜集団を含み、正または負の選択技術によってさらに単離される。様々な実施形態において、組成物は、次のマーカー：ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３のうちの１つ以上を発現しないか、または実質的に発現しない。
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅させたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
一実施形態において、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤なしで活性化及び増幅させたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上増加する。
一実施形態において、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、及びＬＡＧ３からなる群から選択されるマーカーのうちの１つ以上の発現は、ＰＩ３Ｋ阻害剤ありで活性化及び増幅させたＴ細胞集団と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、またはそれ以上減少する。
Ｊ． 標的細胞及び抗原
標的細胞、例えばがん細胞に再指向され、標的細胞のＳＴｎ発現糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２に結合する結合ドメインを有するＣＡＲを含む、遺伝子改変免疫エフェクター細胞。
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、概して、異常細胞が制御されずに分裂し、近くの組織に浸潤し得る疾患または状態のクラスに関する。
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の一群が未制御の増殖（すなわち、正常の限界を超えた分裂）、浸潤（すなわち、周囲組織への侵入及びその破壊）、及び転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の位置への拡散）のうちの１つ以上を提示するがんを指す。本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分へとがんが拡散することを指す。拡散した細胞により形成された腫瘍は「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元々（原発）の腫瘍の細胞と同様の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、大きく成長し得るが身体の他の部分に拡散しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、通常は浸潤または転移しない。
「がん細胞」は、がん性腫瘍または組織の個々の細胞を指す。がん細胞は、固形がんと液性がんとの両方を含む。「腫瘍」または「腫瘍細胞」とは、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常増殖により形成された腫脹または病変を指す。ほとんどのがんは腫瘍を形成するが、液性がん、例えば白血病は、必ずしも腫瘍を形成するわけではない。腫瘍を形成するがんに関しては、がん（細胞）及び腫瘍（細胞）という用語は互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
一実施形態において、標的細胞は、他の正常な（所望の）細胞の表面上には実質的に見出されない抗原、例えば標的抗原を発現する。
一実施形態において、標的細胞は、骨の細胞（ｂｏｎｅ ｃｅｌｌ）、骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｙｔｅ）、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、筋肉細胞、骨格筋細胞、筋芽細胞、筋細胞、平滑筋細胞、膀胱細胞、骨髄細胞、中枢神経系（ＣＮＳ）細胞、末梢神経系（ＰＮＳ）細胞、グリア細胞、アストロサイト細胞、ニューロン、色素細胞、上皮細胞、皮膚細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、乳房細胞、結腸細胞、食道細胞、胃腸管細胞、胃細胞、結腸細胞、頭部細胞、頸部細胞、歯肉細胞、舌細胞、腎細胞、肝細胞、肺細胞、上咽頭細胞、卵巣細胞、濾胞細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、子宮細胞、膵細胞、膵実質細胞、膵管細胞、膵島細胞、前立腺細胞、陰茎細胞、生殖腺細胞、睾丸細胞、造血細胞、リンパ球系細胞、または骨髄系細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現する。一実施形態において、標的細胞は、造血細胞、食道細胞、肺細胞、卵巣細胞、子宮頸部細胞、膵臓細胞、胆嚢もしくは胆管の細胞、胃細胞、結腸細胞、乳房細胞、杯細胞、腸細胞、幹細胞、内皮細胞、上皮細胞、または、糖エピトープ、例えばＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１を発現する任意の細胞である。
ある特定の実施形態において、標的細胞は、腸（例えば、食道、胃、結腸）の内膜、乳房組織、肺組織、結腸組織、膵臓組織、胆嚢もしくは胆管組織、卵巣組織、子宮頸部組織、膀胱組織、腎臓組織、または上皮組織の一部である。
特定の実施形態では、標的細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現するがん細胞またはがん幹細胞である。
一実施形態において、標的細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現する固形がん細胞である。
特定の実施形態で想定される組成物及び方法によって標的化することのできる細胞の例証となる例としては、次の固形がん：副腎がん、副腎皮質癌、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳがん、乳がん、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、線維組織腫（ｆｉｂｒｏｕｓ ｈｉｓｔｉｏｓａｒｃｏｍａ）、線維肉腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頸部がん、血管芽腫、肝細胞がん、下咽頭がん、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎がん、喉頭がん、平滑筋肉腫、口唇がん、脂肪肉腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌、正中管癌（ｍｉｄｌｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口がん、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口頭がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、膵島細胞腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、前立腺がん、直腸がん、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎及び尿管がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮脂腺癌、皮膚がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺がん、小腸がん、胃のがん、汗腺癌、滑膜腫、精巣がん、咽喉がん、胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、血管がん、外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍のものが挙げられるが、それらに限定されない。
別の実施形態において、細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現する固形がん細胞である。本組成物を用いて防止、治療、もしくは寛解され得る例示的なＳＴｎ発現固形がん細胞としては、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、結腸がん、膀胱がん、腎がん、及び乳がんが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態では、標的細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現する液性がんまたは血液がん細胞である。
特定の実施形態で想定される組成物を用いて防止、治療、もしくは寛解され得る液性がんまたは血液がんの例証となる例としては、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態で想定される抗ＳＴＮ ＣＡＲによって標的化され得る細胞の例証となる例としては、次の白血病：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、ならびに真性多血症のものが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態で想定される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例証となる例としては、次のリンパ腫：ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、ならびに、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫：バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、及びマントル細胞リンパ腫；及びＴ細胞非ホジキンリンパ腫：菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、及び前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫を含むがそれに限定されない非ホジキンリンパ腫のものが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態で想定される組成物及び方法によって標的化され得る細胞の例証となる例としては、次の多発性骨髄腫：顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫のものが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態では、標的細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現するがん細胞またはがん幹細胞である。
別の特定の実施形態では、標的細胞は、がん患者の細胞などのがん細胞である。
Ｋ． 治療方法
本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質、例えばＴＡＧ−７２を発現するがんの防止、治療、及び寛解に使用するための、またはＳＴｎ発現がんに関連する少なくとも１つの症状を防止、治療、もしくは寛解するための、改善された養子免疫療法の方法を提供する。
様々な実施形態において、本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞は、対象においてＳＴｎ発現糖タンパク質を発現するがん細胞における細胞傷害性を増加させるのに使用するための、または対象においてＳＴｎを発現するがん細胞の数を減少させるのに使用するための、改善された養子免疫療法の方法を提供する。
特定の実施形態において、一次免疫エフェクター細胞の特異性は、本明細書において想定されるＣＡＲで一次免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することにより、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現する細胞、例えばがん細胞に再指向される。様々な実施形態では、糖タンパク質で発現するＳＴｎに結合する抗ＳＴｎ抗原結合ドメイン；ヒンジドメイン；膜貫通（ＴＭ）ドメイン、ＴＭドメインをＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結させる短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー；及び１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン；ならびに一次シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする特定のポリヌクレオチドで免疫エフェクター細胞を遺伝子改変するために、ウイルスベクターが使用される。
一実施形態において、がん細胞で発現するＳＴｎ発現糖タンパク質を標的とするＣＡＲを発現するようにＴ細胞が遺伝子改変され、ＣＡＲ Ｔ細胞がそれを必要とする受容者に注入される、ある種の細胞療法が提供される。注入された細胞は、受容者の病原細胞を殺滅することができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、がん療法の持続につながり得る長期持続性をもたらす。
一実施形態において、ＣＡＲ Ｔ細胞は、堅実なインビボＴ細胞増幅を受けることができ、長時間にわたって持続することができる。別の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞は、さらなる腫瘍形成または成長を阻害するように再活性化させることのできる特異的メモリーＴ細胞に進化する。
特定の実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を含む組成物が、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現するがん細胞またはがん幹細胞に関連する状態の治療に使用される。
本明細書において想定されるＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を使用して治療、防止、または寛解することのできる状態の例証となる例としては、血液がん、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、結腸がん、膀胱がん、腎がん、及び乳がんが挙げられるが、それらに限定されない。
特定の実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、固形がんの治療に使用される。ある特定の実施形態において、固形がんは、食道がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、膀胱がん、結腸がん、腎がん、及び乳がんからなる群から選択される。
特定の実施形態において、本明細書において想定されるＣＡＲ改変Ｔ細胞を含む組成物は、液性がんまたは血液がんの治療に使用される。
ある特定の実施形態において、液性がんまたは血液がんは、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、液性がんまたは血液がんは、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）及び真性多血症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、周辺帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、孤立性骨形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、液性がんまたは血液がんは、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される。
ある特定の実施形態において、液性がんまたは血液がんは、ＣＬＬである。
特定の実施形態において、治療有効量の本明細書において想定されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞またはそれを含む組成物を、それを必要とする患者に、単独で、または１つ以上の治療剤と組み合わせて投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態において、この細胞は、ＳＴｎ発現糖タンパク質を発現するがん細胞に関連する状態を発症するリスクのある患者の治療に使用される。したがって、特定の実施形態において、治療有効量の本明細書において想定されるＣＡＲ改変細胞をそれを必要とする患者に投与することを含む、がんの少なくとも１つの症状の治療または防止または寛解のための方法。
本明細書で使用される場合、「個体」及び「対象」という用語は、多くの場合互換的に使用され、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他の箇所で想定される方法を用いて治療され得る疾患、障害、または状態の症状を示す任意の動物を指す。好ましい実施形態では、対象は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他の箇所で想定される方法を用いて治療され得るがんに関連する疾患、障害、または状態の症状を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば患者）は、実験動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、及び飼育動物またはペット（例えばネコまたはイヌなど）を含む。非ヒト霊長類、及び好ましくはヒト患者が含まれる。典型的な対照には、糖タンパク質でＳＴｎを発現するがんを有するか、その診断経験があるか、またはそのリスクがあるか、もしくはそれを有するリスクのあるヒト患者が含まれる。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、遺伝子療法ベクター、細胞ベースの治療薬、及び本明細書の他の箇所で開示される方法を用いて治療され得る特定の疾患、障害、または状態と診断されたことのある対象を指す。
本明細書で使用される「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、疾患または病態の症状もしくは病理に対する、あらゆる有益な作用または望ましい作用を含み、治療される疾患または状態の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療は、任意選択により、低減疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の進行の遅延、例えば腫瘍増殖の遅延のいずれかを伴ってもよい。「治療」は、疾患もしくは状態、またはその関連症状の完全な根絶あるいは治癒を必ずしも意味しない。
本明細書で使用される場合、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」及び「防止される（ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ）」、「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」などの同様の用語は、疾患もしくは状態の発生または再発の可能性を防止、阻害、または低減するための手法を示す。これは、疾患もしくは状態の発症または再発を遅延させること、あるいは疾患もしくは状態の症状の発生または再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」及び同様の用語には、疾患もしくは状態の強度、作用、症状、及び／または負荷を、疾患もしくは状態の発症または再発前に低減させることも含まれる。
本明細書で使用される場合、「の少なくとも１つの症状を寛解させる」という表現は、対象が治療を受けている疾患または状態の１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療される疾患または状態はがんであり、寛解される１つ以上の症状としては、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性及び易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または（腹部器官の肥大による）痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、及び（腎機能不全による）排尿減少が挙げられるが、それらに限定されない。
「増強する」もしくは「促進する」、または「増加する」もしくは「増幅する」とは、概して、本明細書において想定される組成物、例えば、遺伝子改変Ｔ細胞またはＣＡＲをコードするベクターが、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより大きな生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な生理学的応答は、当該技術分野における理解及び本明細書の説明から明らかであるものの中でもとりわけ、Ｔ細胞の増幅、活性化、持続性の増加、及び／またはがん細胞殺滅能力の増加を含み得る。「増加した」または「増強された」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照組成物によりもたらされる応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加を含み得る。
「減少する」、または「低下する」、または「減らす」、または「低減する」、または「軽減する」とは、概して、本明細書において想定される組成物が、ビヒクルもしくは対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答と比較してより小さな生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。「減少」または「低減した」量は、典型的には「統計的に有意な」量であり、ビヒクル、対照組成物によりもたらされる応答（参照応答）または特定の細胞系列における応答の１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（その間及び１を超える全ての整数ならびに小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含み得る。
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化しない」、または「実質的に変化しない」、または「実質的に減少しない」とは、概して、本明細書において想定される組成物が、細胞において、ビヒクル、対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる応答、または特定の細胞系列における応答と比較した場合に実質的に同様もしくは比較可能な生理学的応答（すなわち、下流作用）をもたらすか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。比較可能な応答とは、参照応答と有意な差がないもの、または測定可能な差がないものである。
一実施形態において、がんの治療を必要とする対象にそれを行う方法は、本明細書において想定される遺伝子改変免疫エフェクター細胞を含む組成物を、有効量、例えば治療有効量で投与することを含む。適切な投薬量は臨床治験によって決定され得るが、投与の分量及び頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類及び重症度などの要因によって決定される。
一実施形態において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０５個の細胞、少なくとも０．５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも５×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも０．５×１０７個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも０．５×１０８個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも０．５×１０９個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞である。特定の実施形態において、約１×１０７個のＴ細胞〜約１×１０９個のＴ細胞、約２×１０７個のＴ細胞〜約０．９×１０９個のＴ細胞、約３×１０７個のＴ細胞〜約０．８×１０９個のＴ細胞、約４×１０７個のＴ細胞〜約０．７×１０９個のＴ細胞、約５×１０７個のＴ細胞〜約０．６×１０９個のＴ細胞、または約５×１０７個のＴ細胞〜約０．５×１０９個のＴ細胞が対象に投与される。
一実施形態において、対象に投与される組成物中の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の量は、少なくとも０．１×１０４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも０．５×１０４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０４個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０５個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも０．５×１０６個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０６個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも０．５×１０７個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０７個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも０．５×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも１×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも２×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも３×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも４×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、少なくとも５×１０８個の細胞／体重１ｋｇ、または少なくとも１×１０９個の細胞／体重１ｋｇである。特定の実施形態において、約１×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約１×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇ、約２×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約０．９×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇ、約３×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約０．８×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇ、約４×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約０．７×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇ、約５×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約０．６×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇ、または約５×１０６個のＴ細胞／体重１ｋｇ〜約０．５×１０８個のＴ細胞／体重１ｋｇが対象に投与される。
所望の療法をもたらすために、本明細書において想定される組成物の複数回投与が必要とされる場合があることは、当業者であれば認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、１年、２年、５、年、１０年、またはそれ以上のスパンにわたって、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回以上投与されてもよい。
ある特定の実施形態において、活性化された免疫エフェクター細胞を対象に投与し、次に再採血し（またはアフェレーシスを行い）、そこから免疫エフェクター細胞を活性化させ、これらの活性化及び増幅した免疫エフェクター細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間毎に複数回行われてもよい。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数回採血／複数回再注入プロトコルの使用は、ある特定の免疫エフェクター細胞集団を選出することに役立ち得る。
本明細書において想定される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、留置、または移植を含む、任意の簡便な様式で行うことができる。好ましい実施形態において、組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口投与される」という表現は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与形態を指し、限定されないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射、ならびに注入を含む。一実施形態において、本明細書において想定される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注射によって対象に投与される。
一実施形態において、それを必要とする対象は、対象のがんに対する細胞免疫応答を増加させるために有効量の組成物を投与される。免疫応答は、感染細胞、調節性Ｔ細胞、及びヘルパーＴ細胞応答を殺滅することのできる細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される細胞免疫応答を含み得る。Ｂ細胞を活性化させ、ひいては抗体産生をもたらすことのできるヘルパーＴ細胞により媒介される体液性免疫応答も誘導され得る。組成物により誘導される免疫応答の種類を分析するには種々の技術を使用することができ、これらは、当該技術分野において、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ：Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅｒ（２００１）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．に詳しく記載されている。
Ｔ細胞媒介性殺滅の場合、ＣＡＲ−リガンド結合がＴ細胞へのＣＡＲシグナル伝達を開始し、様々な機序によって標的細胞アポトーシスを誘導することのできるタンパク質を産生または放出するようにＴ細胞を誘導する、種々のＴ細胞シグナル伝達経路の活性化がもたらされる。これらのＴ細胞媒介機序としては、Ｔ細胞から標的細胞への細胞内細胞傷害性微小体の移入、標的細胞殺滅を直接（または他のキラーエフェクター細胞の動員によって間接的に）誘導することのできる炎症促進性サイトカインのＴ細胞分泌、及び標的細胞上の同族の細胞死受容体（例えばＦａｓ）に結合した後に標的細胞アポトーシスを誘導するＴ細胞表面上の細胞死受容体リガンド（例えばＦａｓＬ）の上方制御が挙げられる（しかしそれらに限定されない）。
一実施形態において、ＳＴｎ発現がんと診断された対象から免疫エフェクター細胞を取り出し、本明細書において想定されるＣＡＲをコードする核酸を含むベクターで該免疫エフェクター細胞を遺伝子改変し、それによって改変された免疫エフェクター細胞の集団を生成し、改変された免疫エフェクター細胞の集団を同じ対象に投与することを含む、糖タンパク質でＳＴｎを発現するがんと診断された対象を治療する方法が提供される。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＡＲ分子をコードする核酸構築物を発現する免疫エフェクター細胞集団を対象に投与するステップを含む、対象において標的細胞集団に対する免疫エフェクター細胞媒介性免疫調節因子応答を刺激するための方法が提供される。
特定の実施形態で想定される細胞組成物を投与するための方法は、対象においてＣＡＲを直接発現するか、または対象に導入されるとＣＡＲを発現する成熟免疫エフェクター細胞に分化する免疫エフェクター細胞の遺伝子改変前駆細胞の再導入時のいずれかであるエクスビボの遺伝子改変免疫エフェクター細胞の再導入をもたらすのに有効な任意の方法を含む。１つの方法は、本明細書において想定されるものに従う核酸構築物をエクスビボで末梢血Ｔ細胞に形質導入し、形質導入細胞を対象に戻すことを含む。
本明細書に引用される公開文献、特許出願、及び交付済み特許は全て、個々の公開文献、特許出願、または交付済み特許それぞれが参照により組み込まれるよう明確かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の実施形態は、理解を明確にするために例証及び例によりいくらか詳細に記載されているが、本明細書において想定される教示に照らして、添付の請求項の趣旨及び範囲を逸脱することなくある特定の変更及び改変がそれに対して行われ得ることは、当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、限定ではなく、単なる例示として提供されるものである。当業者であれば、変更または改変しても本質的に同様の結果を得ることができる必須ではない種々のパラメータを容易に認識するであろう。
実施例１
抗ＳＴＮ ＣＡＲの構築
ヒト化抗ＳＴｎ ｓｃＦｖ抗体を含むＣＡＲを、抗ＳＴｎ ｓｃＦｖに作動可能に連結されたＭＮＤプロモーター、ＣＤ８α由来のヒンジ及び膜貫通ドメイン、及びＣＤ１３７共刺激ドメイン、続いてＣＤ３ζ鎖の細胞内シグナル伝達ドメインを含むように設計した。図１。これらの抗ＳＴｎ ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞での表面発現のためのＣＤ８αシグナルペプチド（ＳＰ）配列を含む。表３は、例示的な抗ＳＴｎ ＣＡＲレンチウイルスベクターの様々なヌクレオチドセグメントの識別情報、Ｇｅｎｂａｎｋ照会番号、供給源名、及び引用文献を示す。
Figure 2018526028
Figure 2018526028
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実施例２
ヒト結腸直腸がんのインビトロモデルにおける抗ＳＴＮ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性
配列番号１５による軽鎖可変領域及び配列番号１６による重鎖可変領域を有する抗ＳＴｎ ＣＡＲを含むＣＡＲ Ｔ細胞は、結腸直腸癌のインビトロモデルにおいてＬＳ１７４Ｔ細胞の選択的殺滅を示した。ＬＳ１７４Ｔ細胞は、高レベルのＳＴｎ発現ＴＡＧ−７２糖タンパク質を発現するヒト結腸直腸がん細胞株である。
ＬＳ１７４Ｔ細胞でのＳＴｎ発現ＴＡＧ−７２糖タンパク質の発現を免疫組織化学的検査によって確認した。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び５μｇのＳＴｎ特異的抗体（３Ｅ８）を含むＰＢＳ １００μＬ中に、５×１０５個のＬＳ１７４Ｔ細胞を懸濁させた。この反応物を３０分間４℃でインキュベートし、次に、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄した。次に、１μＬのマウス抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を添加し、この混合物を３０分間４℃でインキュベートした。次に、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を２回洗浄した。ＳＴｎ発現ＴＡＧ−７２糖タンパク質の発現をフローサイトメトリで確認した。ＬＳ１７４Ｔ細胞の９８％がＳＴｎ発現ＴＡＧ−７２糖タンパク質を発現した。ヒト胃がん細胞株の細胞の９５％も、ＳＴｎ発現を示した。対照的に、ＴＡＧ−７２陰性ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）細胞の約２％しかＳＴｎを発現しなかった。
ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）Ｇｒｅｅｎを使用し、ＬＳ１７４Ｔ細胞に対する抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害活性をアッセイした。１×１０４個のＬＳ１７４Ｔ細胞を５０μＬの培養培地中に懸濁させ、２．０μＬのＣｅｌｌＴｏｘ（商標）Ｇｒｅｅｎと合わせたを添加した。この混合物のアリコートを黒色の９６ウェルプレートにとり、ヒト血清及びＩＬ−２（Ｅ：Ｔ比＝５、１０、２０、３０）を含む５０μｌの培養培地において、５×１０４個、１×１０５個、２×１０５個、または３×１０５個のいずれかの抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞とアリコートを合わせた。３７℃で２４時間の培養後、細胞傷害性を次のように計算した。
ＣｅｌｌＴｏｘ（商標）Ｇｒｅｅｎの蛍光（ＲＦＵ）＝｛Ｔ細胞及びＥ細胞の反応｝−（Ｅ細胞の反応）｝−（Ｔ細胞の反応、バックグラウンド）
その結果は、抗ＳＴｎ−ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＳＴｎが不在のＨＵＶＥＣと比較して、すなわち抗ＳＴｎ ＣＡＲを発現しない対照Ｔ細胞と比較して、ＳＴｎ−ＴＡＧ−７２発現ＬＳ１７４Ｔがん細胞を効果的に殺滅することを示した。
実施例３
形質導入Ｔ細胞における抗ＳＴＮ ＣＡＲの発現及びベクターコピー数
大規模な臨床製造プロセスに直接拡張可能なシステムを使用し、ＣＡＲ Ｔ細胞培養物を確立した。簡潔に述べると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、静置フラスコにおいて、ＩＬ−２（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｉｘ）、ＣＤ３及びＣＤ２８に特異的な抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、ならびにＺＳＴＫ４７４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）を含んだ培地で培養した。配列番号１５による軽鎖可変領域及び配列番号１６による重鎖可変領域を有する抗ＳＴｎ ＣＡＲをコードするレンチウイルス２×１０８形質導入単位を、培養開始の１日後に添加した。合計１０日の培養日数の間、ＩＬ−２及びＺＳＴＫ４７４を含む新鮮な培地を追加することにより、抗ＳＴＮ ＣＡＲ Ｔ細胞を対数期に維持した。培養の最後に、３体のドナーから得た形質導入Ｔ細胞において抗ＳＴＮ ＣＡＲの細胞表面発現及びベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定した。
培養の最後に、ベクターまたはゲノム対照ＲＮＡｓｅＰを検出するプライマーを使用し、定量的ＰＣＲによってＶＣＮを評価した。非形質導入Ｔ細胞と比較した３体のドナーの形質導入Ｔ細胞における抗ＳＴｎ ＣＡＲのＶＣＮデータを図３Ａに示す。非形質導入対照細胞における検出不可能なＶＣＮと比較して、形質導入Ｔ細胞は約４．５のＶＣＮを有した。
培養の最後に、Ｔ細胞表面での抗ＳＴｎ ＣＡＲの発現をフローサイトメトリによって評価した。ビオチン化タンパク質Ｌに続いてストレプトアビジン−ＰＥを用いる２ステップ検出方法を使用し、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞を特異的に特定した。３体の正常なドナーのＴ細胞は、抗ＳＴｎ ＣＡＲの高度な発現を示した。この実験の結果を図３Ｂに示す。
実施例４
抗ＳＴＮ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原特異的細胞傷害性
実施例３に記載のように抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞を産生した。培養の最後に、２つの独立したアッセイにおいて、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗原特異的応答をアッセイした。
ビーズベースのサイトカインアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用し、ＴＡＧ７２でＳＴｎを発現する細胞株に応答しＩＦＮγを産生する抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞の能力を検査した。等数の腫瘍細胞及び抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（各５×１０４個）を２４時間にわたり共培養した。上清を収集し、産生されたＩＦＮγの量をＬｕｍｉｎｅｘによって数量化した。抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍細胞なしで培養したとき、ＩＦＮγをほとんどまたは全く産生しなかった。二次元培地において細胞表面でＳＴｎを発現しない腫瘍細胞（Ａ５４９及びＨＤＬＭ−２）と共培養した抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞からＩＦＮγは産生されなかった。ＴＡＧ７２でＳＴｎを発現する腫瘍細胞（Ｊｕｒｋａｔ及びＬＳ１７４Ｔ）と抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞を共培養したとき、産生されたＩＦＮγの量は著しく増加した。図４Ａ。
抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞と共培養したＬＳ１７４Ｔ細胞の細胞溶解を分析した。生細胞の電気インピーダンスの監視が可能なｉＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ機器を用い、細胞溶解を実時間で監視した。共培養したＬＳ１７４Ｔ細胞において、抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は細胞溶解を誘導したが、非形質導入対照Ｔ細胞は細胞溶解を誘導しなかった。図４Ｂ。
抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞（エフェクター細胞）をＬＳ１７４Ｔ細胞（標的細胞）と様々なエフェクター：標的細胞比で共培養した。抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞は、共培養したＬＳ１７４Ｔ細胞において細胞傷害性を用量依存的様式で増加させる。図４Ｃ。
実施例５
抗ＳＴＮ ＣＡＲ Ｔ細胞は侵襲性インビボ腫瘍モデルにおいて腫瘍の増殖を遅延させる
実施例３に記載のように抗ＳＴｎ ＣＡＲ Ｔ細胞を産生した。侵襲性インビボ腫瘍モデルにおいてＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を検査した。動物に結腸腺癌細胞（ＬＳ１７４Ｔ）を皮下投与し、翌日に等用量のＣＡＲ Ｔ細胞（２×１０７個のＴ細胞）を注入した。シグナルを伝達する能力を欠く短縮化ＣＡＲを含む対照ＣＡＲ Ｔ細胞は、ビヒクルで処置した動物と比較して腫瘍の増殖に影響を及ぼさなかった。この侵襲性結腸がんモデルにおいて、抗ＳＴＮ ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍の増殖を遅延させた。図５。
概して、続く特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、可能性のある全ての実施形態を、かかる特許請求の範囲が権利を有する同等物の全範囲と共に含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は開示内容により限定されない。

Claims (96)

  1. 細胞外ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、前記細胞外ドメインが、
    ａ）糖タンパク質で発現するＳＴｎ抗原の１つ以上のエピトープに結合する、抗シアリルＴｎ（ＳＴｎ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号１〜３、９〜１１、または１７〜１９に記載のＣＤＲＬ１−ＣＤＲＬ３配列を含む可変軽鎖配列と、配列番号４〜６、１２〜１４、または２０〜２２に記載のＣＤＲＨ１−ＣＤＲＨ３配列を含む可変重鎖配列と、を含む、抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片と、
    ｂ）膜貫通ドメインと、
    ｃ）１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、
    ｄ）一次シグナル伝達ドメインと、を含む、キメラ抗原受容体。
  2. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチンまたはムチン様糖タンパク質からなる群から選択される糖タンパク質で発現する、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチン１及びムチン１６からなる群から選択されるムチンで発現する、請求項１または請求項２に記載のＣＡＲ。
  4. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチン様タンパク質で発現する、請求項１に記載のＣＡＲ。
  5. 前記ＳＴｎ抗原が、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）で発現する、請求項１に記載のＣＡＲ。
  6. 前記抗ＳＴｎ抗体または抗原結合断片が、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  7. 前記抗ＳＴｎ抗体または抗原結合断片が、ｓｃＦｖである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  8. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１〜３のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号４〜６のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  9. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号９〜１１のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号１２〜１４のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  10. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１７〜１９のいずれか１つに記載の１つ以上の軽鎖ＣＤＲ、及び／または配列番号２０〜２２のいずれか１つに記載の１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  11. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号７に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号８に記載の可変重鎖配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  12. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１５に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号１６に記載の可変重鎖配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  13. 前記抗ＳＴｎ抗体またはその抗原結合断片が、配列番号２３に記載の可変軽鎖配列、及び／または配列番号２４に記載の可変重鎖配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  14. 前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  15. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＰＤ１、及びＣＤ１５２からなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  16. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８αから単離される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  17. 前記膜貫通ドメインが、ＰＤ１から単離される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  18. 前記膜貫通ドメインが、ＣＤ１５２から単離される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  19. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  20. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、及びＣＤ１３７からなる群から選択される共刺激分子から単離される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  21. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ２８から単離される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  22. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３４から単離される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  23. 前記１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインが、ＣＤ１３７から単離される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  24. 前記一次シグナル伝達ドメインが、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  25. 前記一次シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζから単離される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  26. ヒンジ領域ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  27. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ８αのヒンジ領域を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
  28. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＰＤ１のヒンジ領域を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
  29. 前記ヒンジ領域ポリペプチドが、ＣＤ１５２のヒンジ領域を含む、請求項２６に記載のＣＡＲ。
  30. スペーサー領域をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  31. 前記スペーサー領域ポリペプチドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２及びＣＨ３領域を含む、請求項３０に記載のＣＡＲ。
  32. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  33. 前記シグナルペプチドが、ＩｇＧ１重鎖シグナルポリペプチド、ＣＤ８αシグナルポリペプチド、またはヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体アルファシグナルポリペプチドを含む、請求項３２に記載のＣＡＲ。
  34. 前記ＣＡＲが、配列番号２５〜２７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
  35. 請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＣＡＲのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
  36. 請求項１〜３５のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードするポリヌクレオチド。
  37. 請求項３６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  38. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項３７に記載のベクター。
  39. 前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項３７または請求項３８に記載のベクター。
  40. 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載のベクター。
  41. 前記ベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載のベクター。
  42. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載のベクター。
  43. 前記レンチウイルスベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）から本質的になる群から選択される、請求項４２に記載のベクター。
  44. 左（５’）レトロウイルスＬＴＲ、プサイ（Ψ）パッケージングシグナル、セントラルポリプリントラクト／ＤＮＡフラップ（ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ）、レトロウイルス排出エレメント、請求項６４に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター、及び右（３’）レトロウイルスＬＴＲを含む、請求項４０〜４３のいずれか１項に記載のベクター。
  45. 異種ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載のベクター。
  46. 前記異種ポリアデニル化配列が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化またはシグナルウサギβ−グロビンポリアデニル化配列である、請求項４５に記載のベクター。
  47. Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＨＰＲＥ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載のベクター。
  48. 前記５’ＬＴＲのプロモーターが、異種プロモーターに置き換えられている、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載のベクター。
  49. 前記異種プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、またはサルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーターである、請求項４８に記載のベクター。
  50. 前記５’ＬＴＲまたは３’ＬＴＲが、レンチウイルスＬＴＲである、請求項４０〜４９のいずれか１項に記載のベクター。
  51. 前記３’ＬＴＲが、１つ以上の改変を含む、請求項４０〜５０のいずれか１項に記載のベクター。
  52. 前記３’ＬＴＲが、１つ以上の欠失を含む、請求項４０〜５１のいずれか１項に記載のベクター。
  53. 前記３’ＬＴＲが、自己不活性化型（ＳＩＮ）ＬＴＲである、請求項４０〜５２のいずれか１項に記載のベクター。
  54. 請求項６４に記載のポリヌクレオチドが、最適化されたコザック配列を含む、請求項４０〜５３のいずれか１項に記載のベクター。
  55. 請求項３６に記載のポリヌクレオチドに作動可能に連結された前記プロモーターが、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ１−α）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＱ−Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、ベータアクチンプロモーター（β−ＡＣＴ）、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項４０〜５４のいずれか１項に記載のベクター。
  56. 請求項４０〜５５のいずれか１項に記載のベクターを含む免疫エフェクター細胞。
  57. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球、ナチュラルキラーＴリンパ球（ＮＫＴ）細胞、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群から選択される、請求項５６に記載の免疫エフェクター細胞。
  58. 前記免疫エフェクター細胞が、請求項３７〜５５のいずれか１項に記載のベクターを形質導入され、ＰＩ３Ｋ経路の阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、それにより、前記形質導入免疫エフェクター細胞の増殖が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された形質導入免疫エフェクター細胞の増殖と比較して維持される、請求項５６または５７に記載の免疫エフェクター細胞。
  59. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で活性化及び刺激された前記免疫エフェクター細胞が、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全てのマーカーの発現が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する、請求項５８に記載の免疫エフェクター細胞。
  60. ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で活性化及び刺激された前記免疫エフェクター細胞が、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全てのマーカーの発現が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する、請求項５８に記載の免疫エフェクター細胞。
  61. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＺＳＴＫ４７４である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞。
  62. 請求項５６〜６１のいずれか１項に記載の免疫エフェクター細胞と、生理学的に許容される賦形剤と、を含む組成物。
  63. 請求項４０〜５５のいずれか１項に記載のベクターを免疫エフェクター細胞に導入することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞を生成する方法。
  64. 前記免疫エフェクター細胞を刺激し、ＣＤ３に結合する抗体及びＣＤ２８に結合する抗体に前記細胞を接触させることによって前記細胞の増殖を誘導し、それによって免疫エフェクター細胞の集団を生成することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記免疫エフェクター細胞が、前記ベクターを導入する前に刺激され、増殖を誘導される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記免疫エフェクター細胞が、Ｔリンパ球を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記免疫エフェクター細胞が、ＮＫ細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 前記免疫エフェクター細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、及びＣＤ３８の全てのマーカーの発現が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記免疫エフェクター細胞が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の存在下で活性化及び刺激され、ｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８からなる群から選択される１つ以上のマーカー、またはｉｉ）ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２７、及びＣＤ８の全てのマーカーの発現が、ＰＩ３Ｋ経路の前記阻害剤の非存在下で活性化及び刺激された免疫エフェクター細胞と比較して増加する、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記ＰＩ３Ｋ阻害剤が、ＺＳＴＫ４７４である、請求項６３〜６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 対象において糖タンパク質で発現するＳＴｎ抗原を発現するがん細胞における細胞傷害性を増加させるための方法であって、ＳＴｎを発現するがん細胞における細胞傷害性を、ＳＴｎを発現する前記がん細胞における投与前の細胞傷害性と比較して増加させるのに十分な量で、請求項６２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  72. 対象において糖タンパク質で発現するＳＴｎ抗原を発現するがん細胞の数を減少させるための方法であって、ＳＴｎを発現するがん細胞の数を、ＳＴｎを発現する前記がん細胞の投与前の数と比較して減少させるのに十分な量で、請求項６２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  73. 請求項６２に記載の組成物を治療有効量で対象に投与することを含む、がんの治療を必要とする対象にそれを行う方法。
  74. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチンまたはムチン様糖タンパク質からなる群から選択される糖タンパク質上で発現する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチン１及びムチン１６からなる群から選択されるムチン上で発現する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  76. 前記ＳＴｎ抗原が、ムチン様タンパク質上で発現する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  77. 前記ＳＴｎ抗原が、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）上で発現する、請求項７１〜７３のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記がんが、固形がんである、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  79. 前記がんが、食道がん、膀胱がん、腎がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膵がん、胆管癌、胃がん、結腸がん、または乳がんである、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記がんが、食道がんである、請求項７８に記載の方法。
  81. 前記がんが、膀胱がんである、請求項７８に記載の方法。
  82. 前記がんが、腎がんである、請求項７８に記載の方法。
  83. 前記がんが、肺がんである、請求項７８に記載の方法。
  84. 前記がんが、卵巣がんである、請求項７８に記載の方法。
  85. 前記がんが、子宮頸がんである、請求項７８に記載の方法。
  86. 前記がんが、膵がんである、請求項７８に記載の方法。
  87. 前記がんが、胆管癌である、請求項７８に記載の方法。
  88. 前記がんが、胃がんである、請求項７８に記載の方法。
  89. 前記がんが、結腸がんである、請求項７８に記載の方法。
  90. 前記がんが、乳がんである、請求項７８に記載の方法。
  91. 前記がんが、液性がんである、請求項７１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
  92. 前記液性がんが、血液学的悪性腫瘍である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記血液学的悪性腫瘍が、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、または慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）からなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記血液学的悪性腫瘍が、ＣＬＬである、請求項９３に記載の方法。
  95. 対象において糖タンパク質でＳＴｎを発現するがんに関連する１つ以上の症状を寛解させるための方法であって、がん細胞に関連する少なくとも１つの症状を寛解させるのに十分な量で、請求項６２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  96. 寛解される前記１つ以上の症状が、脱力感、疲労、息切れ、易挫傷性及び易出血性、頻繁な感染症、リンパ節腫大、腹部の膨張または痛み、骨痛または関節痛、骨折、計画外の体重減少、食欲不振、寝汗、持続的微熱、ならびに排尿減少からなる群から選択される、請求項９５に記載の方法。
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