EA029492B1 - Вакцина на основе микобактериальных антигенов - Google Patents

Abstract

Изобретение, в общем, относится к иммуногенным комбинациям, содержащим по меньшей мере пять антигенов из видов рода микобактерий, а также к их гибридам и молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим такие объединенные антигены и гибриды. Настоящее изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, векторам, клеткам-хозяевам и композициям, содержащим или кодирующим указанные комбинации микобактериальных антигенов и слитые полипептиды, а также к способам их рекомбинантной продукции. Настоящее изобретение также относится к способам применения указанных комбинаций микобактериальных антигенов, слитых полипептидов, векторов, клеток-хозяев, композиций, в частности для индуцирования или стимулирования иммунного ответа против инфекции микобактерией или любого заболевания, вызванного или ассоциированного с инфекцией микобактерией. Настоящее изобретение также касается антител, направленных на такие микобактериальные антигены и слитые полипептиды, которые можно использовать в диагностике инфекции микобактерией, и способа детекции, а также наборов реактивов, содержащих указанные комбинации микобактериальных антигенов, слитые полипептиды, векторы, клетки-хозяева, композиции или антитела.

Description

изобретение относится к антителу, которое селективно связывается с по меньшей мере одним микобактериальным антигеном, содержащимся в или кодируемым иммуногенной комбинацией, или со слитым полипептидом по настоящему изобретению.

Термин "антитело" в том виде, как он здесь используется, охватывает любой полипептид, который содержит антигенсвязывающий фрагмент или антигенсвязывающий домен и селективно связывается с белком-мишенью, причем при связывании с белком-мишенью он значимо не связывается с неродственным белком. В определенных случаях следовало бы понимать, что связывание антитела с белкоммишенью все еще является селективным, несмотря на некоторую степень перекрестной реактивности. Типично связывание между антителом и антигеном считается специфичным, когда константа ассоциации К_А больше чем 10^-6 М. Подходящие условия для связывания, такие как концентрация антитела, ионная сила раствора, температура, время, требующееся для связывания, концентрация блокирующей агента (например, сывороточный альбумин, казеин молока) и т.д. могут быть оптимизированы специалистом с использованием традиционных методик.

Антитело по настоящему изобретению может быть поликлональным, моноклональным, моноспецифичным, полиспецифичным, человеческим, гуманизированным, одноцепочечным, химерным, синтетическим, рекомбинантным, а также любым фрагментом таких антител, которые сохраняют связывание антигена, включая фрагменты РаЬ, Р(аЬ')₂, Ρν и 5сΡν, но не ограничиваясь ими.

Антитела по настоящему изобретению можно получать с использованием традиционных в данной области методик, например, после введения животному (например, кролику, лошади и т.д.) эффективного количества любого описанного здесь микобактериального антигена, слитого белка и/или его пептидного фрагмента, или посредством дисплея (например, фагового, дрожжевого или рибосомного дисплея), или гибридомных методик. Общая методология получения моноклональных антител хорошо известна в данной области.

Антитело по настоящему изобретению может быть предоставлено в выделенной форме, в растворе (например, животная антисыворотка) или в клетках-хозяевах (например, гибридомы). Кроме того, его

- 25 029492

можно конъюгировать с подходящими метками (детектируемыми или функциональными метками), включая радиоактивные (¹³¹1 или ⁹⁹Тс и т.д.), ферментативные (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и т.д.) и химические (например, биотин и т.д.) метки.

Антитела по настоящему изобретению имеют множество потенциальных применений, которые находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, такие антитела можно использовать (а) в качестве реактивов в анализах для детекции микобактериального антигена, используемого в настоящем изобретении, (б) в качестве реактивов в анализах для детекции присутствия микобактерии в биологическом образце и/или (в) в качестве инструментов для детекции и/или выделения рекомбинантно продуцированных микобактериальных антигенов и слитого полипептида согласно способу по изобретению из смеси белков и других примесей (например, обеспечивая очистку аффинной хроматографией или иммуноосаждением из культивируемых клеток-хозяев). Их также можно использовать для терапевтических целей, например, для лечения субъекта после воздействия микобактерии (например, пассивная иммунотерапия).

В одном воплощении настоящее изобретение относится к способу детекции и/или количественного измерения микобактериального антигена в биологическом образце (например, плазме, сыворотке, мокроте и т.д.), взятом у субъекта, инфицированного или чувствительного к инфекции микобактерией, с использованием антитела по изобретению, который включает этапы приведения указанного биологического образца в контакт с антителом по изобретению в качестве реактива при условиях, обеспечивающих образование комплекса между микобактериальным антигеном и реактивом в виде антитела, и детектирование и/или количественное измерение образования указанного комплекса любым подходящим способом. Детектирование присутствия микобактериального антигена-мишени указывает на инфекцию микобактерией (например, М1Ь).

В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу детекции и/или количественного измерения антител, направленных на микобактерию, в биологическом образце (например, плазма, сыворотка и т.д., взятом у субъекта, инфицированного или чувствительного к инфекции микобактерией), который включает этапы приведения указанного биологического образца в контакт с реактивом, содержащим любую иммуногенную комбинацию, слитый полипептид, молекулы нуклеиновой кислоты, векторы, инфекционные вирусные частицы, клетки-хозяева по изобретению, при условиях, обеспечивающих образование комплекса между антителом и микобактериальным антигеном/эпитопом, содержащимся или кодируемым любым из вышеупомянутых реактивов, и детектирование и/или количественное измерение образования указанного комплекса любым подходящим способом. Детектирование присутствия специфичного антитела указывает на инфекцию микобактерией (например, М1Ь).

Специалист в данной области легко определит количество реактива, подлежащее применению в способах по изобретению. Способы детекции и/или количественного измерения комплекса антиген/антитело являются традиционными и хорошо известными специалисту в данной области. В качестве иллюстрации, можно упомянуть блоттинги, ЕЫЗЛ, так называемые методики сэндвича, конкурентные методики и методики ПЦР, в частности так называемые методики "в реальном времени". Применение вышеупомянутого реактива может облегчаться связыванием (например, физическим связыванием) с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают разные ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу), простетические группы (например, стрептавидин/биотин или авидин/биотин), флуоресцентные вещества (например, умбеллиферон, флуоресцеин или производные флуоресцеина), люминисцентные вещества, биолюминисцентные вещества (например, люцифераза, люциферин или экворин) и радиоактивные вещества (например, ¹²⁵1, ¹³¹1,³⁵З или ³Н).

Настоящее изобретение также касается набора реактивов для диагностики инфекции микобактерией (например, МёЬ) для анализа антигена, включающего антитело по изобретению, и для анализа антитела, включающего иммуногенную комбинацию, слитый полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина, композицию по изобретению.

Все вышеупомянутые раскрытия патентов, публикации и записи в базах данных конкретно включены сюда посредством ссылки во всей их полноте в той же самой степени, как если бы каждый такой индивидуальный патент, публикация или запись были конкретно и индивидуально указанными как включенные посредством ссылки.

Описание графических материалов

Фиг. 1 демонстрирует схематическое представление разных слитых полипептидов антигенов М(Ь, которые были получены и использовались, как описано в приложенном разделе Примеров. "ЗЗ" означает сигнальный пептид, "ТМ" - трансмембранный домен, "Р" - метка Р1ад, "М" - метка Мус, и "Н" - Ηίδ метка. * указывает модификацию антигена М(Ь по отношению к нативному аналогу. На данной фигуре также упомянуты № слитого полипептида и ссылка на экспрессирующий плазмидный вектор (рТОХХХХХ) в том виде, в котором они используются ниже.

Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию индивидуальных генов М(Ь определенную вестерн-блоттингом с последующей иммунодетекцией специфичными антителами. 2х10⁶ клеток НЕК293 трансфицировали 5 мкг ДНК с использованием липофектамина 2000. Протеасомный ингибитор МО132 добавляли в культу- 26 029492

ральную среду через 18 ч после трансфекции. Лизаты клеток, отобранные после 48 ч культуры, анализировали электрофорезом на 10%-ном геле Сгкепои, и иммунодетекцию проводили с использованием кроличьей антисыворотки, разведенной 1/1000, распознающей Κν2029* (фиг. 2А), КРРВ-ЭНуЬ (фиг. 2В), и имеющихся в продаже антител, распознающих ЕδΑТ-6 (фиг. 2С) и Κν2626 (фиг. 2Ό).

Фиг. 3 иллюстрирует анализ посредством вестерн-блоттинга гибридов М!Ь, охватывающих антигены латентной фазы (рТО18295, кодирующая гибрид № 9), антигены активной фазы (рТО18296, кодирующая гибрид № 10), антигены фазы оживления (рТО18307, кодирующая гибрид № 12) и антигены и фазы оживления, и активной фазы (рТО18297, кодирующая гибрид № 11), с последующей иммунодетекцией Р1ад. +/- показывает с или без МО132.

Фиг. 4 иллюстрирует анализ посредством вестерн-блоттинга гибридов М!Ь, включающих ТВ10.4 (фиг. 4А), Κν0569 (фиг. 4В) и Κν2626 (фиг. 4С) соответственно, с последующей иммунодетекцией с использованием имеющегося в продаже антитела против ТВ10.4 (ΑβΙΝ361292), кроличьей антисыворотки против Κν0569 и мышиного моноклинального антитела 26А11 против Κν2626.

Фиг. 5 иллюстрирует клетки, продуцирующие ΙΡΝ§, индуцированные после иммунизации животных плазмидами, кодирующими гибрид, рТС18266 (δδ-Α§85В-ТВ10.4-ЕδΑТ6-ТМ; фиг. 5а), рТО18296 (цитоплазматический Α§85В-ТВ10.4-ЕδΑТ6; фиг. 5Ь), смесью плазмид рТО18310, рТО18315 и рТО18308, кодирующих индивидуальные антигены А§85В, ТВ10.4 и ЕδΑТ6 (фиг. 5с) и рО\У1/ (фиг. 5ά). Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами.

Фиг. 6 иллюстрирует клетки, продуцирующие ΙΡΝ§, индуцированные после иммунизации животных плазмидами, кодирующими гибрид, рТО18268 ^-КРРВ-ЭЬуЬ-А§85В-ТВ10.4-ЕЯАТ6-ТМ; фиг. 6а), рТО18297 (цитоплазматический КΡРВ-^ЬуЬ-Α§85В-ТВ10.4-ЕδΑТ6; фиг. 6Ь), смесью плазмид рТО18307, рТО18310, рТО18315 и рТО18308, кодирующих индивидуальные антигены КРРВ-ЭЬуЬ, А§85В, ТВ10.4 и ЕδΑТ6 (фиг. 6с) и рО\У1/ (фиг. 6ά). Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами.

Фиг. 7 иллюстрирует клетки, продуцирующие ΙΡΝ§, индуцированные после иммунизации животных плазмидами, кодирующими гибрид, рТО18267 (δδ-КРРВ-ТМ; фиг. 7А), рТО18307 (цитоплазматический КРРВ-ЭЬуЬ; фиг. 7В) и рО\У1/ (фиг. 7С). Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами, охватывающими антигены КрГВ и КрГО.

Фиг. 8 иллюстрирует клетки, продуцирующие ΙΡΝ§, индуцированные после иммунизации животных плазмидами, кодирующими гибрид, рТО18269 (δδ-Кν0569-Кν1813-Кν3407-Кν3478-Кν1807-ТМ; фиг. 8а), рТО18295 (цитоплазматический Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478-Κν1807; фиг. 8Ь), смесью плазмид рТО18301, рТО18303, рТО18300, рТО18304 и рТО18302, кодирующих индивидуальные антигены Κν0569, Κν1813, Κν3407, Κν3478 и Κν1807 (фиг. 8с) и рО\У1/ (фиг. 8ά). Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами.

Фиг. 9 иллюстрирует анализ δΌδ-РАОЕ очищенного Κν2626 (фиг. 9А), слияния КРРВ-ЭНуЬ (фиг. 9В) и ТВ10.4 (фиг. 9С).

Фиг. 10 иллюстрирует клеточный иммунный ответ, продуцируемый после иммунизации животных плазмидой, кодирующей гибрид, рТО18323 (Κν2029 -Κν2626 - Κν1733 - Κν0111; фиг. 10а) или рО\У1/ (фиг. 10Ь). Клетки, продуцирующие ΙΡΝγ, оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами. Каждый столбик представляет собой ответ одной мыши (7 мышей/группу).

Фиг. 11 иллюстрирует клеточный иммунный ответ, индуцированный после иммунизации мышей (а) МУАТО18365 (Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111 + КрГВГОЬуЬ-А§85В-ТВ10.4^АТ6 без δδ/ТМ) или (Ь) МУАТО18364 (Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111 + КрГВГОЬуЬ-А§85В-ТВ10.4^АТ6). Клетки, продуцирующие ΙΡΝγ, оценивали через одну неделю после инъекции МУА посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами. Каждый столбик представляет собой ответ индивидуальной мыши (5 мышей/группу).

Фиг. 12 обобщает уровни ответа ΙΡΝγ у мышей ВАЬВ/с, вакцинированных всеми кандидатами на основе МУА, полученными согласно фазе заболевания ТВ или биохимической мотивировке. Клетки, продуцирующие ΙΡΝγ, оценивали через одну неделю после инъекции МУА посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό специфическими пептидными пулами 14 антигенов М!Ь. Интенсивность детектированных ответов ранжируется согласно кратности увеличения значения медианы (пятен/10⁶ спленоцитов) для каждой повторной стимуляции по отношению к значению отсечения с использованием кодирования цветом (см. легенду с варьированием -, +, ++,

- 27 029492

+++). Квадратики со штриховкой означают то, что антиген отсутствует в данной вакцине на основе МУА.

Фиг. 13 иллюстрирует клеточный иммунный ответ, индуцированный после иммунизации трансгенных мышей НБА-А2 (а) МУАТС18376 (Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111 + Кр£В-ПйуЪ-А§85В-ТВ10.4Е8АТ6 + Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478-Κν1807) или (Ъ) пустым МУАТСШ3.1. Клетки, продуцирующие ГРИу, оценивали через одну неделю после инъекции МУА посредством анализов ГРЫу методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νίνο специфическими пептидными пулами. Каждый столбик представляет собой ответ индивидуальной мыши (6 мышей/группу).

Фиг. 14 иллюстрирует клеточный иммунный ответ, индуцированный после иммунизации мышей С3Н/НеN (а) МУАТС 18377 (Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111 + Крт-ПйуЪ-А§85В-ТВ10.4-Е8АТ6 без 88/ТМ + Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478-Κν1807) или (Ъ) пустым МУАТСШ3.1. Клетки, продуцирующие ШЫу, оценивали через одну неделю после инъекции МУА посредством анализов ГРЫу методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νίνο специфическими пептидными пулами. Каждый столбик представляет собой ответ индивидуальной мыши (6 мышей/группу).

Фиг. 15 обобщает уровни ответа ШЫу у трансгенных мышей НБА-А2, С57ВБ/6 и С3Н/НеN, вакцинированных указанными кандидатами на основе МУА. Клетки, продуцирующие ШЫу, оценивали через одну неделю после инъекции МУА посредством анализов ГРЫу методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νίνο специфическими пептидными пулами 14 антигенов М!Ъ. Интенсивность детектированных ответов ранжировали согласно кратности увеличения значения медианы (пятен/10⁶ спленоцитов) для каждой повторной стимуляции по отношению к значению отсечения с использованием кодирования цветом (см. легенду с варьированием -, +, ++, +++). Квадратики со штриховкой означают то, что антиген отсутствует в данной вакцине на основе МУА.

Материалы и методы Аналитические методы

Существующие данные по антигенам М!Ъ исследовали из доступной литературы и баз данных с целью идентификации первого набора генов/антигенов М!Ъ, которые могут быть полезными в иммунотерапевтической вакцине, способной вызывать иммунитет против ТВ на протяжении всех фаз природного хода инфекции.

Выбранные антигены затем вносили в систему бальной оценки анализа данных, которая была разработана для расшифровки и сравнения данных из разных источников. Генерировали общий конечный "балл", отражающий значение для каждого антигена. Данный балл принимает во внимание иммуногенный потенциал антигена, а также его способность защищать против инфекционного заражения в животных моделях и у людей (например, данные по защите у людей будут давать больший балл, чем индуцирование иммуногенности в животных моделях). Как только собраны все данные для конкретного антигена, каждой категории присваивается оценка от 0 до 5, причем 0 является наихудшей возможной оценкой, тогда как 5 является наилучшей. Выбор оценки также был основан на качестве данных (например, на правильных контролях, использованных в экспериментах, строгой интерпретации), но также и на надежности данных (например, на числе повторов экспериментов, числе публикаций, подтверждающих/поддерживающих открытия).

Биохимические анализы антигенов ΐη $Шсо

Биохимические и биологические данные также представляют собой ключевые данные для оптимизации экспрессии и конструкции слияния, позволяя предвосхищать потенциальные проблемы с экспрессией. Например, биологические функции белка могут приводить к потенциальной токсичности, приводящей к генетической нестабильности и/или отрицательному профилю безопасности при опосредованной вектором экспрессии. Кроме того, разворачивание белка может влиять на стабильность и уровни экспрессии из-за более высокой скорости деградации в клетке.

Для всех антигенов М!Ъ проводили обширный библиографический поиск для того, чтобы лучше понять и охарактеризовать структуру и функции данных белков.

Кроме того, для характеризации антигенов М!Ъ также осуществляли биохимическое и биоинформационное прогнозирование. Для того чтобы посмотреть на предсказанные эпитопы молекул НЬА класса I и II использовали биоинформационные инструменты прогнозирования (№екеп е! а1., 2007 РЬо8 0пе 2: е796; №екеп е! а1., 2008, РЬо8 Сотри! Вю1 4: е1000107). Идентификация данных эпитопных областей может быть полезной для оптимизации выбранных антигенов М!Ъ или для облегчения разработки иммунных анализов.

Кроме того, обширные анализы прогнозирования структуры ίη δίΐίοο проводили для того, чтобы прогнозировать биохимические свойства и/или биологические свойства и, таким образом, обеспечивать отбор и конструирование антигенов М!Ъ (например, выяснение того, экспрессируется ли полноразмерная нативная форма, или требуются ли модификации).

Более конкретно:

поиск структурных гомологов в банке данных белков (РОВ). Используемой программой была ВБА8ТР с параметрами по умолчанию, и выбранной базой данных была №8@ 3Ό 8ЕриЕНСЕ8 (от

- 28 029492

РОВ). Этот поиск обеспечивает нахождение спектров ЯМР (ядерный магнитный резонанс) или кристаллических структур антигена или белков с гомологиями последовательности больше чем 25%. 3Ό (3мерные) структуры визуализировали с использованием системы просмотра 0Ν3Ό 4.1 или РОВ;

поиск в базах данных υNIРΚОТ-δ^IδδРΚОТ или ТВ. Белки-гомологи интересующих антигенов МкЬ искали в базе данных υNIРΚОТ-δ^IδδРΚОТ с использованием первичных структур в качестве поискового запроса и поиска ВБА8Т в ΝΡδ@. Используемой программой была ВБА8ТР с параметрами по умолчанию, и выбранной базой данных была υNIРΚОТ-δ^IδδРΚОТ; записи υNIРΚОТ-δ^IδδРΚОТ дают доступ к общей информации по функции белка, доменам, потенциальным сигнальным пептидам, пострансляционным модификациям, а также библиографические ссылки. Общую информацию (например, функции генов, генетическая связь между генами, фенотипы и мутации, ассоциированные с генами, иммуногенность, а также библиографические ссылки) о выбранных антигенах МкЬ извлекали с использованием названия белка Κν в качестве поискового запроса в базе данных ТВ;

прогнозирование сигнальных пептидов: эти короткие последовательности на Ν-конце часто прогнозируются в виде трансмембранных доменов, но они отсутствуют в нативных и зрелых белках. О присутствии сигнального пептида для определенных антигенов уведомляла база данных υNIРΚ0Т5>\У188РР0Т или использование скрытой модели Маркова сигнального алгоритма ν3.0;

в отсутствие совпадений при поиске гомологов предпринимали дополнительные поиски: прогнозирование потенциальных трансмембранных доменов (ТМ) с использованием трех разных

программ (например, способа плотного выравнивания на поверхности (ИА8), алгоритма ТМНММ и ТорРгеб0.01). Наблюдением авторов изобретения является именно то, что присутствие таких гидрофобных ТМ доменов может ухудшать генетическую стабильность соответствующего антигена при экспрессии в вирусных векторах, таких как МУА;

поиск на известный мотив белка, ассоциированный с белковыми доменами, семействами и функциональными сайтами с использованием РΚОδIТЕ δί',ΆΝ;

прогнозирование вторичных структур с использованием нескольких способов прогнозирования (а именно: 80РМ, МБРС, ΗΝΝ, И8С, ΡΗΌ, РРЕ0АТ0Р). Вторичную структуру считали высоковероятной, если 6 данных способов прогнозировали ее. Вторичную структуру считали возможной, если 3 из 6 способов прогнозировали ее;

анализ гидрофобных кластеров (НСА). Способ НСА основан на существенных характеристиках сворачивания белка: гидрофильной/гидрофобной дихотомии и гидрофобной компактности глобулярных доменов белка. Графики НСА использовали для идентификации гидрофобных кластеров вдоль последовательности белка. Данные кластеры характерны для свернутых белков со скрытым гидрофобным ядром. Считали, что антиген вероятно имеет свернутое состояние, если гидрофобные кластеры присутствовали, по меньшей мере, в некоторой части белка;

прогнозирование неупорядоченных областей в нативном состоянии, которое обеспечивает идентификацию развернутых областей (прогнозирования Ме1аРгЭ08). Данный анализ дополняет график НСА путем прогнозирования областей белка, которые не свернуты. Все области, превышающие порог 0,5 (тенденция к неупорядоченности), считались развернутыми частями белка. Следует отметить, что большую часть времени Ν- и С-концевые части белков являются несвернутыми в их нативном состоянии. При присутствии таких отрезков на концах с длиной меньше чем 10 остатков их принимали в качестве потенциальных линкеров для слияния;

прогнозирование суперспирали (с использованием программы С01Б8). Состояние олигомеризации антигена могло бы оказывать влияние на конструкцию слияния антигена. Домен в виде суперспирали прогнозировали, если вероятность на выходе демонстрировала значение 1 для части белка по меньшей мере с 14 остатками в окне для анализа.

Кроме того, проводили выравнивания последовательностей для того, чтобы подтвердить то, что выбранные антигены МкЬ являются консервативными среди разных штаммов и изолятов МкЬ. Более конкретно множественные выравнивания последовательностей между аминокислотной последовательностью каждого выбранного антигена (приведенные в качестве примера антигены МкЬ происходят из штамма Η37Κν) и его эквивалента из 11 других штаммов МкЬ (клинические изоляты) и М. Ьоу15, которые были идентифицированы в базах данных белков (поиск ВЬАЗТР) проводили с использованием С1и8ка1 \У2 (@.еЫ.ас.ик/Тоок/т8а/с1и81аШ2/). В результате, антигены ТВ демонстрировали высокую консервативность среди 12 проанализированных штаммов микобактерий с процентной долей идентичности, варьирующей от 100% до 96%, в зависимости от антигена и штамма микобактерий. Главное исключение наблюдали с Κν3478, для которого обнаружили только 88%-ную идентичность между последовательностями Η37Κν и СИС1551.

Наконец, другим ключевым критерием для достижения конечного выбора антигена ТВ было обеспечение сбалансированной представленности антигенов из разных фаз инфекции. Например, выбирали некоторые антигены латентной фазы, несмотря на меньший конечный балл анализа данных, чем у большинства антигенов активной фазы.

- 29 029492

Конструирование слияния антигенов МИ)

Конструировали 12 гибридов антигенов Мй, как проиллюстрировано на фиг. 1. Пять гибридов разрабатывали на основе биохимических соображений (слияния 3, 5, 6, 8 и 14), тогда как слияния 2, 4 и 13 разрабатывали в отношении фазы заболевания ТВ, причем гибрид 2 содержал антигены активной фазы, гибрид 4 -антигены активной фазы и фазы оживления, и гибрид 13 был составлен из антигенов латентной фазы. Для того чтобы облегчать детекцию разных гибридов генов и избегать необходимости использования специфичных антител в отношении каждого антигена Мй, в каждый гибрид добавляли последовательности меток, соответственно, метки Р1ад (ΌΥΚΌΌΌΌΚ; 8Еф ГО N0: 25) на Ν-конце и меток с-тус (ΕΡΚΕΙ8ΕΕΌΕ; 8ЕЦ ГО Ν0: 26) и Ηΐ8 (НННННН; 8ЕЦ ГО Ν0: 27) на С-конце.

С другой стороны, сигнальные пептиды (также именуемые сигнальная последовательность или 88) и заякоривающие в мембране пептиды (также именуемые трансмембранный или ТМ пептид/домен) добавляли, соответственно, на Ν-конце и С-конце слитых белков Мй для обеспечения заякоривания на поверхности клетки, которое, как предполагается, в определенных случаях оптимизирует иммуногенную активность. Однако добавление ТМ домена не было необходимым для гибридов, заканчивающихся Κν0111 или Κν1733, поскольку данные белки уже содержат заякоривающие в мембране пептиды. Для целей сравнения также конструировали четыре слияния без какой-либо сигнальной последовательности (88) и ТМ домена так, чтобы исследовать влияние локализации в клетке (презентации на мембране в присутствии пептидов 88 и ТМ относительно цитоплазматической локализации в отсутствие таких пептидов) на уровень экспрессии и иммуногенную активность. Например, рТС18269 кодирует те же самые антигены Мй (Κν0569 - Κν1813* - Κν3407 - Κν3478 - Κν1807), что и рТС18295, за исключением того, что гибрид, кодируемый рТС18269, оснащен 88 на его Ν-конце и ТМ на его С-конце между метками Мус и Н18, тогда как гибрид, кодируемый рТС18295, лишен таких пептидов 88 и ТМ.

Синтетические гены, кодирующие разные антигены Мй и гибриды, были синтезированы СепеаП (Регенсбург, Германия). Последовательности были оптимизированы для использования кодонов у человека, и перед инициирующим кодоном АТС была добавлена последовательность Козака (АСС). Кроме того, были исключены некоторые мотивы: ТТТТТКТ, ССССС, ССССС, которые являются вредными для экспрессии в векторе на основе вируса оспы, и АААССС, ААААСС, СССААА, ССССАА (и комплементарные последовательности ТТСССС, ТТТССС, ССТТТТ, ССССТТ), которые могут быть вредными для экспрессии в некоторых других векторах.

Данные слияния клонировали в плазмиду рС\У1/ (Се1апЙ8), расщепленную №П и ВатН1. Данная плазмида содержит модифицированный промотор СМУ (вирус мозаики цветной капусты), с последующим интроном А из немедленного раннего гена СМУ и высокоэффективным искусственным терминатором транскрипции.

Конструкция рТС18266 (гибрид № 2).

Аминокислотная последовательность слияния № 2 показана в 8Еф ГО Ν0: 28. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства (описан в СепЪапк № М38452), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-317 соответствуют Ад85В*, аминокислоты 318-412 соответствуют ТВ10.4, аминокислоты 413-506 соответствуют Е8АТ6, аминокислоты 507-516 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, аминокислоты 518-583 соответствуют заякоривающему в мембране пептиду, происходящему из гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства, и аминокислоты 584-589 соответствуют Н18 метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 2, показанную в 8Еф ГО Ν0: 40, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рС\У1/, расщепленную №П и ВатН1, с получением рТС18266.

Конструкция рТС18267 (гибрид № 3).

Аминокислотная последовательность слияния № 3 показана в 8Еф ГО Ν0: 30. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма РС вируса бешенства (описан в СепЪапк № ау009097 и 8Еф ГО Ν0: 2 в \У0 2008/138649), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-380 соответствуют КРРВГОпуЪ*, аминокислоты 381-390 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, аминокислоты 392-457 соответствуют заякоривающему в мембране пептиду, происходящему из гликопротеина штамма РС вируса бешенства (8Еф ГО Ν0: 3 в \У0 2008/138649), и аминокислоты 458-463 соответствуют Н18 метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 3, показанную в 8Еф ГО Ν0: 42, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рС\У1/, расщепленную №П и ВатН1 с получением рТС18267.

Конструкция рТС18268 (гибрид № 4).

Аминокислотная последовательность слияния № 4 показана в 8Еф ГО Ν0: 32. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма РС вируса бешенства (описан в СепЪапк № ау009097), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-380 соответствуют КРРВГОпуЪ*, аминокислоты 381-666 соответствуют Ад85В*, аминокислоты 667-761 соответствуют ТВ10.4, аминокислоты 762-855 соответствуют Е8АТ6, аминокислоты 856-865 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, аминокислоты 867-932 соответствуют заякоривающему в мембране пептиду, происходящему из гликопротеина штамма РС вируса бешенства, и аминокислоты 933-938 соответствуют Н18 метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид

- 30 029492

кислоты 933-938 соответствуют Ηίδ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 4, показанную в 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 44, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рС\У1/, расщепленную №ΐΙ и ВатН1, с получением рТС18268.

Конструкция рТС18269 (гибрид № 5).

Аминокислотная последовательность слияния № 5 показана в 8Е0 ГО ΝΟ: 34. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства (описан в СепЪапк № М38452), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-118 соответствуют Κν0569, аминокислоты 119-227 соответствуют К'1813*, аминокислоты 228-325 соответствуют Κν3407, аминокислоты 326-717 соответствуют Κν3478, аминокислоты 718-1115 соответствуют Κν1807, аминокислоты 1116-1125 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, аминокислоты 1127-1192 соответствуют заякоривающему в мембране пептиду, происходящему из гликопротеина штамма РС вируса бешенства (8ЕО ГО ΝΟ: 3 в ΥΟ 2008/138649) и аминокислоты 843-848 соответствуют Ηίδ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 5, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ: 46, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в ρθ\νίζ, расщепленную №!Ι и ВатН1 с получением рТС18269.

Конструкция рТС18270 (гибрид № 6).

Аминокислотная последовательность слияния № 6 показана в 8ЕО ГО ΝΟ: 36. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства (описан в СепЪапк № М38452), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-317 соответствуют Ад85В*, аминокислоты 318-459 соответствуют Κν2626, аминокислоты 460-880 соответствуют КРРВГОНуЪ*, аминокислоты 809-956 соответствуют К'1733*, аминокислоты 957-966 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, аминокислоты 968-973 соответствуют Ηίδ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 6, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ: 48, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рСV^ζ, расщепленную №!Ι и ВатН1 с получением рТС18270.

Конструкция рТС18272 (гибрид № 8).

Аминокислотная последовательность слияния № 8 показана в 8ЕО ГО ΝΟ: 37. Аминокислоты 1-23 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства (описан в СепЪапк № М38452), аминокислоты 24-31 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 32-317 соответствуют Ад85В*, аминокислоты 318-459 соответствуют К'2626, аминокислоты 460-607 соответствуют Ку1733*, аминокислоты 608-617 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, и аминокислоты 619-624 соответствуют №δ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 8, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ: 49, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рСV^ζ, расщепленную №ίΙ и ВатН1, с получением рТС18272.

Конструкция рТС18323 (гибрид № 13).

Аминокислотная последовательность слияния № 13 показана в 8ЕО ГО ΝΟ: 38. Аминокислоты 1-28 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце белка Р вируса кори (штамм На11е, описан в СепЪапк № Х05597-1), аминокислоты 29-36 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 37-349 соответствуют К'2029*, аминокислоты 350-491 соответствуют К'2626, аминокислоты 492-639 соответствуют Ку1733*, аминокислоты 640-932 соответствуют К'0111*, аминокислоты 933-942 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, и аминокислоты 944-949 соответствуют Είδ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 13, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ: 50, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рСV^ζ, расщепленную №ίΙ и ВатН1 с получением рТС18323.

Конструкция рТС18324 (гибрид № 14).

Аминокислотная последовательность слияния № 14 показана в 8ЕО ГО ΝΟ: 39. Аминокислоты 1-28 соответствуют сигнальному пептиду, присутствующему на Ν-конце белка Р вируса кори (штамм На11е, описан в СепЪапк № Х05597-1), аминокислоты 29-36 соответствуют метке Р1ад, аминокислоты 37-349 соответствуют К'2029*, аминокислоты 350-444 соответствуют ТВ10.4, аминокислоты 445-538 соответствуют Е8АТ6, аминокислоты 539-831 соответствуют К'0111*, аминокислоты 832-841 соответствуют метке с-тус, 8ег линкеру, и аминокислоты 843-848 соответствуют Είδ метке. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 14, показанную в 8ЕО ГО ΝΟ: 51, получали синтетическим способом, и синтетический ген клонировали в рСV^ζ, расщепленную №ίΙ и ВатН1 с получением рТС18324.

Конструкция гибридов 9-12.

Адресующие последовательности удаляли из плазмид рТС18267, рТС18269, рТС18266 и рТС18268 посредством прямого мутагенеза (набор для сайт-направленного мутагенеза Ошск СНапде, 8!га!адепе) с использованием подходящих пар праймеров ΟТС20188 (СССССССССАССАТССАТТАСААССАТСАССАСС; 8ЕО ГО ΝΟ: 52) и ΟТС20189 (ССТССТСАТССТТСТААТССАТССТССССССССС; 8ЕО ГО ΝΟ: 53) для удаления последовательности сигнального пептида, и ΟТС20190 (САТСТСАСААСАССАТСТС-САТСАТСАТСАТСАТСАТТС; 8ЕО ГО ΝΟ: 54) и ΟТС20191 (СААТСАТСАТСАТСАТСАТССАСАТССТСТТСТСАСАТС; 8ЕО ГО ΝΟ: 55) для удаления ТМ последовательности. Образующиеся плазмиды представляли собой, соответственно, рТС18307 (гибрид № 12 соответствует цитоплазматическому гибриду № 3), рТС18295 (гибрид № 9 соответствует цитоплазматическому гибриду №

- 31 029492

5), рТО18296 (гибрид № 10 соответствует цитоплазматическому гибриду № 2) и рТО18297 (гибрид № 11 соответствует цитоплазматическому гибриду № 4), соответствующие аминокислотным последовательностям δЕ^ ГО N0: 31, 35, 29 и 33, кодируемым нуклеотидными последовательностями δЕ^ ГО N0: 43, 47, 41 и 45.

Конструирование индивидуальных плазмид, экспрессирующих ген .СНЬ

В плазмиду ρΟ^ΐζ ниже промотора СМУ вводили последовательность Б1ад и последовательности е-шуе-Ηΐδ, разделенные рестрикционным сайтом №е1. Синтетический фрагмент ДНК, содержащий конец промотора СМУ, последовательности Б1ад и е-шуе-Ηΐδ, был синтезирован Оепеаг! и вставлен в плазмиду БЬАО_ТАО_1. Данную плазмиду расщепляли РуиП и Вд111, и образующийся фрагмент вставляли в ρΟ^ΐζ, расщепленную тем же самым ферментом, с образованием рТО18282. Индивидуальные гены Κν3407, Κν0569, Κν1807, Κν1813*, Κν3478 и Κν2626 затем амплифицировали ПЦР от рТО18269, за исключением Κν2626, для которого в качестве матрицы использовали рТО18323.

Пары амплифицирующих праймеров, использованных для выделения каждого гена ТВ, проиллюстрированы в табл. 1.

Таблица 1

Ген ТВ	Название праймера	Последовательность праймера
Εν3407	ОТС20232 5Ε<3 Ю ΝΟ: 56	САТСАССАССАТААСССТАССАСАСССАСССТСССАС ТСС
ОТС20233 5Ε<3 Ю N0 57	САТСАСТТТТТСТТСССТАСССТСТТСАТСССССАТСТС СТ
Εν0569	ОТС20234 5Ε<3 Ю ΝΟ: 58	САТСАССАССАТААСССТАССААССССАААСТССССС
ОТС20235 5Ε<3 Ю ΝΟ: 59	САТСАСТТТТТСТТСССТАССТСТТССТСТССССТСС
Εν1807	ОТС20236 5Ε<3 Ю ΝΟ: 60	САТСАССАССАТААСССТАСССАТТТТСССАСССТССС АСС
ОТС20237 5Ε<3 Ю ΝΟ: 61	САСАТСАСТТТТТСТТСССТАСССССАССТССАССАСС ТСТСС
Εν1813*	ОТС20238 5Ε<3 Ю ΝΟ: 62	САТСАССАССАТААСССТАСССССААССССАССАТСА ССС
ОТС20239 5Ε<3 Ю ΝΟ: 63	САСАТСАСТТТТТСТТСССТАСССТТССАСССССАСТТ САССА
Εν3478	ОТС20240 5Ε<3 Ю ΝΟ: 64	САТСАССАССАТААСССТАСССТССАСТТСССССССС ТСС
ОТС20241 5Ε<3 Ю ΝΟ: 65	САСАТСАСТТТТТСТТСССТАСССССАСССССТССАСТ ТСТСС
Εν2626	ОТС20242 5ΕΟ Ю ΝΟ: 66	САТСАССАССАТААСССТАССАСААСССССАСАСАСАТ САТС
ОТС20243 5ΕΟ Ю ΝΟ: 67	САТСАСТТТТТСТТСССТАССАСАССССАСССССАТСС СС

Образующиеся ампликоны клонировали посредством способа ПЦР-клонирования "1п Ыоп АТуап1а§е" (С1оп!еей) в рТО18282, линеаризованную №е1. Это обеспечивает слияние последовательностей меток с генами М!Ъ. Полученные плазмиды называли рТО18300 (Κν3407), рТО18301 (Κν0569), рТО18302 (Κν1807), рТО18303 (Κν1813*), рТО18304 (Κν3478) и рТО18305 (Κν2626) соответственно.

Шесть плазмид, содержащих экспрессионные кассеты для Е8АТ6, Κν1733*, Ад85В*, ТВ10-4, Κν0111* и Κν2029*, слитые с Б1ад в 5' и последовательностями с-шуе-Ηΐδ в 3', были синтезированы Оепеаг! и вставлены в ρΟ^^ζ. Они были названы рТО18308 (Е8АТ6), рТО18309 (Κν1733*), рТО18310 (Ад85В*), рТО18315 (ТВ10.4), рТО18329 (Κν0111*), рТО18317 (Κν2029*) соответственно. Поскольку белки Κν1733* и Κν0111* содержат ТМ домен, сигнальный пептид, представленный на Оконце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства, сливали выше от последовательности Б1ад для того, чтобы избежать проблем с экспрессией.

Плазмиды, используемые для иммунизации, независимо от того кодируют ли они индивидуальные или слитые гены М!Ъ, получали в условиях, обеспечивающих отсутствие эндотоксинов.

Конструирование рекомбинантного МУА

Удаление последовательностей меток.

Последовательности меток удаляли из гибридов антигенов М!Ъ для того, чтобы избежать их присутствия в векторах на основе МУА. Последовательности меток, расположенные внутри кассет слияния М!Ъ (например, Б1ад, присутствующую между сигнальным пептидом и первой аминокислотой слияния М!Ъ, и метку с-тус, присутствующую между последней аминокислотой слияния М!Ъ и пептидом, заякоривающим в мембране), удаляли путем прямого мутагенеза с использованием набора для сайтнаправленного мутагенеза ^и^кСйаηде (8!га!адепе) и подходящих пар праймеров, как проиллюстрирова- 32 029492

но в следующей табл. 2. Последовательности меток, расположенные снаружи от кассет слияния М!Ь (для цитоплазматического слияния и Ηΐδ метки), удаляли посредством ПЦР с использованием праймеров, обеспечивающих добавление инициирующего Ме! и терминирующего кодона на обоих концах гибридов.

Таблица 2

Гибрид	Пары праймеров для делеции Над	Пары праймеров для делеции с-тус	Образующаяся плазмида
4	ОТС20313 (5Е<3 Ю N0:68) ОТС20314 (5Е<3 Ю N0: 69)	ОТС20315 (5Е<3 Ю N0: 70) ОТС20316 (5Е<3 Ю N0: 71)	рТС 18339
5	ОТС20317 (5Е<3 Ю N0: 72) ОТС20318(5Е<3 Ю N0: 73)	ОТС20319 (5Е<3 Ю N0: 74) ОТС20320 (5Е<3 Ю N0: 75)	рТС 18340
6	ОТО20321 (5Е0 Ю N0: ОТС20322 (5Е<3 Ю N0	76) 77)	ΝΑ	рТС 18341
13	ОТС20333 (5Е<3 Ю N0 ОТС20334 (5Е<3 Ю N0	78) 79)	ΝΑ	рТС 18342
14	ОТС20333 (5Е<3 Ю N0 ОТС20334 (5Е<3 Ю N0	78) 79)	ΝΑ	рТС 18343

Конструкция МУАТС18355 (гибрид № 13).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 13 (8Ρ-Κν2029*-Κν2626-Κν1733*Κν0111*, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО N0: 38 от 1 до 28 и от 37 до 932), помещали под контроль промотора р7.5К (8ЕЦ ГО N0: 80; ССАСССАСТТТТТАТАСТААСТТТТТСАСССАТАААТААТАААТАСААТААТТААТТТС ТССТААААСТАСААААТАТАТТСТААТТТАТТССАСССТААССААСТАСААТСАТААА СААСАСТ). Этот последний амплифицировали посредством ПЦР из ДНК штамма СорепЬадеп УУ (вирус осповакцины) с использованием пары подходящих праймеров 0ТС20405 (8ЕЦ ГО N0: 81) и 0ТС20406 (8ЕЦ ГО N0: 82), тогда как последовательность слияния № 13 амплифицировали из плазмиды рТС18342 посредством ПЦР с 0ТС20407 (8ЕЦ ГО N0: 83) и 0ТС20408 (8ЕЦ ГО N0: 84). Затем р7.5К и последовательность, кодирующую гибрид № 13, повторно собирали посредством двойной ПЦР с использованием праймеров 0ТС20405 (8ЕЦ ГО N0: 81) и 0ТС20408 (8ЕЦ ГО N0: 84). Образующийся фрагмент вставляли в сайты рестрикции ВдШ и ^!1 плазмиды переноса на основе вируса осповакцины -рТС17960, что приводило к образованию рТС18355.

Плазмиду переноса на основе МУА, рТС17960, конструировали так, чтобы обеспечивать вставку нуклеотидной последовательности, подлежащей трансфекции, посредством гомологичной рекомбинации в делецию III генома МУА. Она происходит из плазмиды рТС1Е (описана в Вгаип е! а1., 2000, Сепе ТЬег. 7:1447), в которую были клонированы фланкирующие последовательности (ВКС3 и ВК03), окружающие делецию III МУА (8и!!ег апб М, 1992, Ргос. N6. Асаб. 8ск И8А 89:10847). Данная плазмида переноса также содержит слияние между усиленным зеленым флуоресцентным белком Аециогеа ν^с!о^^а (ген еСРР, выделенный из рЕСР-С1, С1оп!есЬ) и геном ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы Е§сйепсЫа сой (ген др!) под контролем раннего позднего синтетического промотора р11К7.5 вируса осповакцины (любезно предоставлен К. ШЛек Университет Лозанны). Синтез ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы обеспечивает рост рекомбинантного СРТ+ МУА в селективной среде, содержащей микофеноловую кислоту, ксантин и гипоксантин (Ра1кпег е! а1., 1988, I. У1го1. 62, 1849-54), и еСРР обеспечивает визуализацию бляшек рекомбинантного МУА. Селективный маркер еСРР-СРТ помещен между двумя гомологичными последовательностями в той же самой ориентации. После клональной селекции селективный маркер можно легко устранять посредством нескольких пассажей без селекции, обеспечивая рост еСРР-СРТ рекомбинантного МУА.

Получение МУАТС18355 проводили путем гомологичной рекомбинации в первичных фибробластах эмбрионов курицы (СЕР), инфицированных МУА и трансфицированных нуклеофекцией рТС18355 (согласно технологии Атаха Ж1с!еоГес1ог). Селекцию вируса проводили путем очистки бляшек после роста в присутствии селективной среды, содержащей микофеноловую кислоту, ксантин и гипоксантин. Как упомянуто выше, селективный маркер затем устраняют посредством пассажа в неселективной среде. Отсутствие загрязнения родительским МУА подтверждали ПЦР.

Конструкция МУАТС18364 (гибрид № 13 плюс гибрид № 4).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 4 (8К-КРРВГОйуЬ*-Ад85В*-ТВ10.4Е8АТ6-ТМК, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО N0: 32 от 1 до 23, с последующими 32-855 и 866932), помещали под контроль промотора рН5К (8ЕЦ ГО N0: 85, ТТТАТТСТАТАСТТААААААТСААААТАААТАСАААССТТСТТСАСССТТСТСТТАААТТСАААСССАСАААТААТСАТАААТТАТТТСАТТАТССССАТАТСССТТААСТТТС), клонированного из геномной ДНК МУА дикого типа посредством ПЦР с парой праймеров 0ТС20445 (8ЕЦ ГО N0: 86) и 0ТС20446 (8ЕЦ ГО N0: 87). Амплифицированный продукт расщепляли и Рас! Последовательность, кодирующую гибрид № 4, амплифицировали из рТС18339 посредством ПЦР с использованием праймеров 0ТС20447 (8ЕЦ ГО N0: 88) и 0ТС20380 (8ЕЦ ГО N0: 89). Амплифицированный продукт расщепляли Рас! и ХйоР Оба фрагмента вместе клонировали в рТС18355, расщепленную ^Л и ХЬой что приводило

- 33 029492

к образованию рТО18364.

Получение вируса МУАТО18364 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18365 (гибрид № 13 плюс гибрид № 11).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 11 (КРРВ-ПйуЬ*-А§85В*-ТВ10.4Е8АТ6, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО N0: 33 от положения 10 до положения 833, которой предшествовал Меί инициатор в положении 1), помещали под контроль промотора рН5К. Данный промотор получали из рТО18364 посредством ПЦР с праймерами ОТО20445 (8ЕЦ ГО N0: 86) и ОТО20446 (8ЕЦ ГО N0: 87), и амплифицированный фрагмент расщепляли ΝοίΙ и Рас1. Последовательность, кодирующую гибрид № 11, клонировали из рТО18297 посредством ПЦР с использованием пары праймеров ОТО20448 (8ЕЦ ГО N0: 90) и ОТО20382 (8ЕЦ ГО N0: 91), и амплифицированный продукт расщепляли Рас1 и Хйо1. Оба фрагмента вместе клонировали в рТО18355, расщепленную ΝοίΙ и Хйо1, с получением рТО18365.

Получение вируса МУЛТО18365 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУЛТО18376 (гибрид № 13 плюс гибрид № 4 плюс гибрид № 5).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 5 (§Κ-Κν0569-Κν1813*-Κν3407Ру3478-Ру1807-ТМР, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО N0: 34 от положений 1 до 23, с последующими 32-1115 и 1126-1192), помещали под контроль промотора В2К (8ЕЦ ГО N0: 92, ТАТАТТАТТЛЛОТОТООТОТТТООТСОАТОТААААТТТТТОТСОАТАЛЛААТТААААААТААСТТААТТТАТТАТТОАТСТСОТОТОТАСЛЛССОАААТС). Данный промотор амплифицировали из ДНК штамма ХУеЧегп Рехегуе УУ посредством ПЦР с использованием пары праймеров ОТО20469 (8ЕЦ ГО N0: 93) и ОТО20470 (8ЕЦ ГО N0: 94), и амплифицированный фрагмент расщепляли Хйо1 и ΝΙκΙ. Последовательность, кодирующую гибрид № 5, амплифицировали из рТО18340 с использованием пары праймеров ОТО20472 (8ЕЦ ГО N0: 95) и ОТО20473 (8ЕЦ ГО N0: 96) перед рестрикцией ΝΙκΙ и ВатН1. Оба расщепленных фрагмента вместе клонировали в рТО18364, линеаризованную Хйо1 и ВатН1, с получением рТО18376.

Получение вируса МУЛТО18376 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18377 (гибрид № 13 плюс гибрид № 11 плюс гибрид № 5).

Промотор В2К амплифицировали из рТО18376 с использованием пары праймеров ОТО20469 и ОТО20470, описанных выше, и расщепляли Хйо1 и ΝΙκΙ. Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 5 (8Р-РуО569-Ру1813*-Ру34О7-Ру3478-Ру18О7-ТМР), амплифицировали, как описано выше, и клонировали под контролем промотора В2К в рТО18364, линеаризованную Хйо1 и ВатН1, с получением рТО18377.

Получение вируса МУАТО18377 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18378 (гибрид № 13 плюс гибрид № 4 плюс гибрид № 9).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 9 (Κν0569-Κν1813*-Κν3407-Κν3478Κν1807, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО N0: 35 от положения 10 до 1093, которой предшествовал Меί инициатор в положении 1), амплифицировали из рТО18295 посредством ПЦР с использованием пары праймеров ОТО20483 (8ЕЦ ГО NО: 97) и ОТО20474 (8ЕЦ ГО NО: 98). Амплифицированный продукт расщепляли ΝΙκΙ и ВатН1 и клонировали с промотором В2К, расщепленным Хйо1 и ΝΙκΙ (амплифицированным из рТО18376, как описано выше), в рТО18364, линеаризованную Хйо1 и ВатН1, что приводило к образованию рТО18378.

Получение вируса МУАТО 18378 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18379 (гибрид № 13 плюс гибрид № 11 плюс гибрид № 9).

И нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 9 (Κν0569-Κν1813*-Κν3407-Κν3478Κν1807), и промотор В2К амплифицировали, как описано выше, и совместно клонировали в рТО18365, линеаризованную Хйо1 и ВатН1, что приводило к образованию рТО18378.

Получение вируса МУАТО 18379 проводили в СЕР посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18404 (гибрид № 14 плюс гибрид № 6).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 14 (§Р-Ку2029*-ТВ10.4-Е§АТ6Κν0111*, как проиллюстрировано частью 8ЕЦ ГО NО: 39 от положения 1 до 28 и от 37 до 831), ампифицировали из рТО18343 посредством ПЦР с использованием пары праймеров ОТО20407 (8ЕЦ ГО NО: 83) и ОТО20525 (8ЕЦ ГО NО: 99). Промотор р7.5К получали из рТО18355 посредством ПЦР с праймерами ОТО20524 (8ЕЦ ГО NО: 100) и ОТО20406 (8ЕЦ ГО NО: 82). Последовательность, кодирующую гибрид № 14, затем клонировали под контролем промотора р7.5К посредством двойной ПЦР с использованием ОТО20524 (8ЕЦ ГО NО: 100) и ОТС20525 (8ЕЦ ГО N0: 99). Образующийся фрагмент расщепляли ВатН1 и и вставляли в сайты рестрикции Вд111 и №11 плазмиды переноса на основе вируса осповакцины,

- 34 029492

рТО17960, что приводило к образованию рТО18395.

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 6 (88-Ад85В*-Ку2626-КРРВ-ОЪуЪ*Ку1733*, как проиллюстрировано частью δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 36 от положения 1 до 23 и от 32 до 956), амплифицировали из рТО18341 посредством ПЦР с использованием пары праймеров ОТО20527 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 101) и ОТО20376 (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 102), и продукт амплификации расщепляли Рас1 и ΧΙιοΙ. Промотор рН5К амплифицировали из рТО18355, как описано выше, и расщепляли ΝοΐΙ и Рас! Оба расщепленных фрагмента вместе клонировали в рТО18395, линеаризованную ΝοίΙ и ΧΙιοΙ, что приводило к образованию плазмиды рТО18404.

Получение вируса МУАТО18404 проводили в ΟΕΕ посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18417 (гибрид № 14 плюс гибрид № 6 плюс гибрид № 5).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 5 (δΚ-Κν0569-Κν1813*-Κν3407Ку3478-Ке1807-ТМК), помещенную под контроль промотора В2К, получали расщеплением рТО18376 ΧΙιοΙ и ВатНЕ Образующийся фрагмент вставляли в рТО18404, расщепленную теми же ферментами, с получением РТО18417.

Получение вируса МУАТО18417 проводили в ΟΕΡ посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Конструкция МУАТО18418 (гибрид № 14 плюс гибрид № 6 плюс гибрид № 9).

Нуклеотидную последовательность, кодирующую гибрид № 9 (Κν0569-Κν1813*-Κν3407-Κν3478Κν1807), помещенную под контроль промотора В2К, получали расщеплением рТО18379 ΧΙιοΙ и ВатНЕ Образующийся фрагмент вставляли в рТО18404, расщепленную теми же ферментами, с получением РТО18418.

Получение вируса МУАТО18418 проводили в ΟΕΡ посредством гомологичной рекомбинации, как описано выше.

Продукция и очистка белка

Четыре штамма Ετο1ί тестировали на экспрессию индивидуальных антигенов М!Ъ. Все данные штаммы несут с их геноме профаг ΌΕ3, который обеспечивает индукцию экспрессии полимеразы Т7 посредством лактозы или аналога лактозы (т.е. ГРТО). Четыре штамма представляли собой ΕΙ21(ΟΕ3) (Ьцщдеп) в качестве классического штамма для экспрессии белка, ΕυΗΟΕ,!) (Ьишдеп) для экспрессии токсичного белка, ΕΙ21(ΌΕ3) ИпкеИа (Мегск СНет1са1) для экспрессии белка с применением кодонов, которое отличается от применения кодонов у Εχο1ί, и С43(ОР3) (Ьишдеп) для экспрессии белка с трансмембранными пептидами (например, Ку1733). Кроме того, для оптимизации продукции антигенов тестировали три разные температуры и времени продукции.

Анализы экспрессии для определения оптимальных условий.

Каждый штамм Εχο1ί трансформировали плазмидой, кодирующей антиген М!Ъ, подлежащий продукции. Со свежетрансформированной чашки выделяли пять колоний, инокулировали в 50 мл среды ЬВ (среда Луриа) в присутствии ампициллина и давали им расти в течение ночи при 37°С при встряхивании. Колбу с автоиндуцибельной средой (АЛ среда, содержащая глюкозу/лактозу и антибиотик; δΙηΟ^η 2005, Рго1ет Рxр^ РшгГ. 41: 207-34) инокулировали образцом предкультуры и затем культивировали при одной из температур 18°С, 30°С и 37°С в течение 24, 8 и 8 ч соответственно. В конце инкубации измеряли поглощение при 600 нм, и клетки отбирали центрифугированием. Клеточный осадок ресуспендировали в ΡВδ (фосфатно-солевой буферный раствор), и доводили ΟΌ (оптическая плотность) при 600 нм для каждого протестированного условия культуры примерно до 50 перед лизированием клеток посредством обработки ультразвуком. Клеточный лизат затем центрифугировали при 10000 д в течение 10 мин при 4°С, и образец супернатанта (типично 10 мкл), и осадок затем загружали на гель δ^δ-ΡΑОР для оценки оптимальных условий.

Продукция и очистка антигенов М!Ъ.

Очистку антигенов М!Ъ, содержащих Ηίδ метку, осуществляли из 500 мл культуры, выращенной в 2 л колбах, применяя определенные ранее оптимальные условия. Клетки отбирали центрифугированием, и осадки, соответствующие 250 мл культуры, выдерживали при -20°С до применения. Отобранные бактерии ресуспендировали в ΡВδ или в гуанидине, в зависимости от растворимости антигена, подвергали обработке ультразвуком для лизиса клеток и очищали аффинной хроматографией ^АС (аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла) на смоле Νί керЪагоке 6 Газ1 Ε1ο\ν (ΟΕ НеаИЪсаге; ссылка 17-5318) либо при нативных, либо при денатурирующих условиях согласно рекомендациям поставщика. Белки элюировали путем применения возрастающих концентраций имидазола (50, 100 и 250 мМ). Фракции, содержащие чистый белок, объединяли и диализировали против ΡВδ или мочевины, в зависимости от растворимости антигена.

Характеризация белка.

Для оценки количества и качества очищенных антигенов М!Ъ, присутствующих в элюированных фракциях, можно проводить множество анализов.

Уровни эндотоксинов измеряли с использованием портативной системы анализа (ΡΤδ) от СЪаг1е8 Кщег ^аЪο^аΐο^^е8. Использовали картриджи с интервалом детекции от 0,005 до 0,5 Ευ/мл согласно реко- 35 029492

мендациям изготовителя.

Концентрации белка определяли анализом по Бредфорд (Вюгаб) согласно рекомендациям изготовителя. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин (В8А), растворенный в буфере для образца.

Чистоту элюированных фракций и диализованного раствора можно оценивать электрофорезом на геле 8Э8-РАСЕ (4-12%, 1пуПгодеп).

Массу очищенных белков измеряли с использованием МАБО1 (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) или электрораспылительных способов. Измеренные и расчетные массы сравнивали для того, чтобы определить, является ли белок интактным или нет. Идентичность белка либо в растворе, либо в полосе геля проверяли измерением массы пептидов, генерированных после расщепления трипсином. Массы пептидов определяли МАЬО1 и/или жидкостной хроматографией в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ/МС/МС). Измеренные и расчетные массы пептидов сравнивали для того, чтобы подтвердить идентичность белка.

Продукция антител против антигенов МИ)

Антитела, направленные против разных антигенов М!Ъ, получали после иммунизации кроликов смесью двух разных антигенспецифичных пептидов (Еигодеп!ес; 8ега1п§, Бельгия). Такие пептиды из 15 или 16 аминокислотных остатков отбирали после анализа программами для прогнозирования эпитопа В. Антисыворотки против антигенов Κν1733*, Κν2029*, Κν0569, Κν1807, Κν0111, КРРВ-ЭЬуЪ*, Κν1813* и Κν3407 получали после иммунизации кроликов двумя специфическими пептидами в сутки 0 и трех бустер-иммунизаций в сутки 7, 10 и 18. Образцы крови отбирали до первой инъекции пептидов и в сутки 21. Последний отбор крови у кроликов делали в сутки 29. В том, что касается Κν3478, кроликам проводили инъекцию в сутки 0, 22, 49 и 77 двумя специфическими 16-мерными пептидами. Образцы крови отбирали перед первой инъекцией пептидов и в сутки 31 и 59. Конечный отбор крови у кроликов делали в сутки 87.

Конечные сыворотки оценивали ЕЫ8А с использованием специфических пептидов и анализа вестерн-блоттингом с использованием плазмид, экспрессирующих индивидуальные гены М!Ъ.

Тестирование слитых белков МО) ΐη νϊΐΐ'ο

Вестерн-блоттинг на продуктах экспрессии, опосредованной ДНК 2х10⁶ клеток НЕК293 трансфицировали 5 мкг разных плазмид, кодирующих слияния антигенов М!Ъ или индивидуальные гены, с использованием Ыро£ес!атше 2000 (ЧпуПгодеп; #11668-019) в присутствии ингибитора протеасом МС132 (10 мкМ), добавленного в ростовую среду через 18 ч после трансфекции. Плазмиду рС\У1/ использовали в качестве негативного контроля. Через 48 ч среду отбрасывали, и клетки лизировали 450 мкл/чашку 2 х буфера Тп8-глицин-8О8 (ссылка: ЬС2676; Nονеx), дополненного β-меркаптоэтанолом (5% об./об.). Лизат затем обрабатывали ультразвуком и кипятили в течение 5 мин при 95°С. 30 мкл клеточных лизатов подвергали электрофорезу на преформированном 10%-ном геле СгПепоп с использованием системы преформированного геля СгПепоп (Вюгаб). После электрофореза белки переносили на РУЭР (поливинилиденфторид) мембрану (МасЬегеу Ыаде1, 741260). Иммунодетекцию проводили с использованием разведенного 1/500 моноклонального антитела против Р1ад М2, конъюгированного с пероксидазой (НИР) (пероксидаза хрена) (81дта; #А8592), или с использованием разведенного 1/5000 моноклонального антитела против ΗΪ8, конъюгированного с пероксидазой (ЧпуПгодеп; #И931-25).

Иммунокомплексы выявляли с использованием набора 1ттип8!аг \Уе81егпС (Вюгаб, ссылка 170.5070).

Сыворотку (разведенную 1/1000), полученную после иммунизации кролика, как описано выше, также использовали для детекции Κν1733*, Κν2029*, Κν0569, Κν1807, Κν0111*, КрГ-В-Ω, Κν1813*, Κν3407 и Κν3478 вестерн-блоттингом. Для детекции Е8АТ6, Ад85В *, ТВ10.4 и Κν2626 использовали имеющиеся в продаже антитела, соответственно, мышиное моноклональное антитело НУВ076-08 (8ап!аСгих; #8с-57730, разведенное 1/500) для Е8АТ6, кроличью поликлональную антисыворотку ΝΚ-13800 (ВЕ1, разведенную 1/5000) для Ад85В*, мышиное моноклональное антитело 26А11 (Ы£е8рап-Вю8аепсе8; #Ь8-С91052, разведенное 1/1000) для Κν2626 и поликлональное кроличье антитело АВШ361292 (АпОЪоб1е8-оп1ше, разведенное 1/1000) для ТВ10.4.

Вестерн-блоттинг продуктов экспрессии, опосредованной МУА 10⁶ клеток А549 инфицировали разными МУА, продуцирующими слияния антигенов М!Ъ, при МО1 (множественность заражения) 1 в присутствии ингибитора протеасом МС132 (10 мкМ), добавленного в ростовую среду через 30 мин после инфекции. В качестве негативного контроля использовали пустой вектор МУАТСИ33.1. Через 24 часа среду отбрасывали, и клетки лизировали 300 мкл/чашку 2 X буфера Тп8-глицин-8О8 (ссылка: ЬС2676; Nονеx), дополненного β-меркаптоэтанолом (5% об./об.). Лизат затем обрабатывали ультразвуком и нагревали в течение 5 мин при 95°С. 20 мкл клеточных лизатов подвергали электрофорезу на преформированном 4-15%-ном геле СгПепоп с использованием системы преформированного геля СгПепоп (Вюгаб). После электрофореза белки переносили на РУЭР мембрану (система переноса Тгап8-Ыо1® ТигЪо™ (#1704155, Вюгаб)). Иммунодетекцию проводили с использованием антител, специфичных в отношении М!Ъ, как описано выше в связи с экспрессионными продуктами ДНК-плазмид. Иммунокомплексы выявляли с

- 36 029492

использованием набора 1шшииЗ1аг ХУсЯстС.’ (Вюгаб, ссылка 170.5070).

Оценка иммуногенности в мышиной модели

Протоколы ДНК-иммунизации.

Мышей иммунизировали три раза с 2- или 3-недельным интервалом либо плазмидой, кодирующей гибрид, либо смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены М(Ь, включенные в гибрид. 100 мкг ДНК в 100 мкл стерильного РВЗ инъецировали внутримышечным путем в переднюю большеберцовую мышцу. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен.

Протоколы иммунизации посредством МУА.

Иммуногенность вакцин-кандидатов на основе МУА против ТВ оценивали у мышей ВАЬВ/с, трансгеных мышей НЬА-А2, С57ВЬ/6 и С.'3Н/НсИ Каждый вектор на основе МУА вводили подкожно в основание хвоста один раз в дозе 1 х 10⁷ рГи в буфере Тп5-НС1, содержащем сахарозу. Клеточные иммунные ответы оценивали через 7 суток после инъекции МУА посредством анализа ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен.

Библиотеки пептидов.

Для повторной стимуляции спленоцитов из иммунизированных мышей ех-у|уо использовали библиотеку пептидов. Более точно, синтезировали 679 пептидов (15меры, перекрывающиеся 11 аминокислотами), покрывающих все 14 антигенов М(Ь, содержащихся в описанных выше слияниях (Рго1штиис). Пулы пептидов получали в ЭМЗО (диметилсульфоксид) с конечной концентрацией 1 мкмоль/л. Для покрытия всей длины каждого антигена М(Ь требовалось от 1 до 4 пулов.

Κν1733 был покрыт 2 пулами из 18 и 17 пептидов. Пул 1: 18 пептидов, покрывающих остатки 62144 Κν1733; пул 2: 17 пептидов, покрывающих остатки 134-210 Κν1733.

Κν2029 был покрыт 4 пулами из 19 пептидов. Пул 1: 19 пептидов, покрывающих остатки 1-87 Κν2029; пул 2: 19 пептидов, покрывающих остатки 77-163 Κν2029; пул 3: 19 пептидов, покрывающих остатки 153-239 Κν2029; пул 4: 19 пептидов, покрывающих остатки 229-314 Κν2029.

Κν0569 был покрыт 1 пулом из 20 пептидов, покрывающих Κν0569 от остатка 1 до 88.

Κν1807 был покрыт 4 пулами из 25 пептидов для первых 3 пулов и 22 пептидов для четвертого пула. Пул 1: 25 пептидов, покрывающих остатки 1-111 Κν1807; пул 2: 25 пептидов, покрывающих остатки 101-211 Κν1807; пул 3: 25 пептидов, покрывающих остатки 201-311 Κν1807; пул 4: 22 пептида, покрывающих остатки 301-399 Κν1807.

Κν0111 был покрыт 4 пулами из 20 пептидов для первых 3 пулов и 19 пептидов для четвертого пула. Пул 1: 20 пептидов, покрывающих остатки 361-451

Κν0111; пул 2: 20 пептидов, покрывающих остатки 441-531 Κν0111; пул 3: 20 пептидов, покрывающих остатки 521-611 Κν0111; пул 4: 19 пептидов, покрывающих остатки 601-685 Κν0111.

РрГВ-ЭНуЬ был покрыт 4 пулами из 22 пептидов для первых 3 пулов и 19 пептидов для четвертого пула. Пул 1: 22 пептида, покрывающих остатки 30-127 КрГВ; пул 2: 22 пептида, покрывающих остатки 117-215 КрГВ; пул 3: 22 пептида, покрывающих остатки 205-284 КрГВ и остатки 53-71 КрГО; пул 4: 19 пептидов, покрывающих остатки 61-146 КрГО.

Κν1813 был покрыт 1 пулом из 25 пептидов, покрывающих остатки 34-143 Κν1813.

Κν3407 был покрыт 1 пулом из 22 пептидов, покрывающих остатки 1-99 Κν3407.

Κν3478 был покрыт 4 пулами из 24 пептидов. Пул 1: 24 пептида, покрывающих остатки 1-107 Κν3478; пул 2: 24 пептида, покрывающих остатки 97-203 Κν3478; пул 3: 24 пептида, покрывающих остатки 193-299 Κν3478; пул 4: 24 пептида, покрывающих остатки 289-393 Κν3478.

Κν2626 был покрыт 2 пулами из 17 и 16 пептидов. Пул 1: 17 пептидов, покрывающих остатки 1-79 Κν2626; пул 2: 16 пептидов, покрывающих остатки 69-143 Κν2626.

Ад85В был покрыт 3 пулами из 23 пептидов. Пул 1: 23 пептида, покрывающих остатки 39-141 Ад85В; пул 2: 23 пептида, покрывающих остатки 131-233 Ад85В; пул 3: 23 пептида, покрывающих остатки 223-325 Ад85В.

ЕЗАТ-6 был покрыт 1 пулом из 21 пептида, покрывающего остатки 1-95 ЕЗАТ-6.

ТВ10.4 был покрыт 1 пулом из 21 пептида, покрывающего остатки 1-95 ТВ10.4.

Анализы ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен.

Отбирали спленоциты из иммунизированных мышей и лизировали эритроциты (З1дша, Κ7757). 2х10⁵ клеток на лунку культивировали в тройной повторности в течение 40 ч на планшетах МиШксгсси (Мййрогс, МЗНА З4510), покрытых моноклональным антителом против мышиного ΙΡΝγ (ВО Вюксюисск; 10 мкг/мл, 551216), в культуральной среде аМЕМ (ОШсо, 22571), дополненной 10% РСЗ (фетальная телячья сыворотка) (ЖН, 12003-100М), 80 и/мл пенициллина / 80 мкг/мл стрептомицина (РАД Р06-07-100), 2 мМ Ь-глутамином (ОШсо, 25030), 1х заменимыми аминокислотами (Оксо, 11140), 10 мМ Нсрск (Оксо, 15630), 1 мМ пируватом натрия (Оксо, 31350) и 50 мкМ β-меркаптоэтанолом (ОтЬсо, 31350), и в присутствии 10 единиц/мл рекомбинантного мышиного 1Ь2 (РсргоксЬ, 212-12), одни, в качестве негативного контроля, или:

с вышеописанным пулом пептидов в конечной концентрации 1 мкмоль/л;

- 37 029492

с 5 мкг/мл конканавалина А (З1дта, С5275) в качестве позитивного контроля; с иррелевантным пептидом.

Т-клетки, продуцирующие ΓΡΝγ, количественно измеряли методом иммуноферментных пятен (метод иммуноферментных пятен, специфичный в отношении цитокина), как описано ранее (Н1тоиб1 е! а1., 2002, I. Упо1. 76: 12735-46). Результаты показаны в виде среднего значения, полученного для лунок в тройной повторности. Экспериментальный порог позитивности для наблюдаемых ответов (или порог отсечения) определяли путем расчета порогового значения, которое соответствует среднему значению пятен, наблюдаемому с одной средой плюс два стандартных отклонения, приведенному для 10⁶ клеток. Также был определен технический порог, связанный с ридером для метода иммуноферментных пятен СТЬ, составляющий 50 пятен/10⁶ клеток (который представляет собой значение, выше которого СУ (коэффициент вариации) ридера был систематически меньше чем 20%). Статистические анализы ответов метода иммуноферментных пятен проводили с использованием критерия Крускалла-Уоллиса, после которого, в случае получения значимого различия, следовал критерий Манна-Уитни. Значимым будет считаться значение Р, равное или меньшее 0,05.

Оценка терапевтической эффективности вакцин, содержащих антигены МГЬ, против инфекции МусоЪасГепиш 1иЪегси1омх у мышей

Самок мышей С57ВБ/6 (6-8-недельных) заражали в неделю 0 посредством аэрозоля, содержащегося в аппарате Хендерсона в сочетании с контрольным устройством для аэрозоля (Нат1шд8 е! а1., 2004, I. РЬагтасо1 Тох1со1 Ме!Ьоб8 49: 39-55). Заражающий штамм МусоЪас!етшт !иЪегси1о818 Η37Κν (Ж.’ТС 7416) культивировали в хемостате (1ате8 е! а1., 2000, I. Арр1 МютоЪю1 88: 669-77), и мелкие частицы со средним диаметром 2 мкм получали в небулайзере СоШ8оп и доставляли непосредственно в нос животного. Суспензию в небулайзере СоШ8оп корректировали так, чтобы доставлять каждой группе мышей оценочную ингалируемую дозу, составляющую приблизительно 100 СРИ/легкое.

Мышей иммунизировали в 10 и 14 недель после инфекции МУАТС18364, МУАТС18376 или МУАТС18377, которые давали подкожно в одно место у основания хвоста (10⁷ рГи/100 мкл/мышь). Группе мышей инъецировали МУАТСИ33.1 в качестве негативного контроля (10⁷ рГи/100 мкл/мышь).

Мышей обрабатывали изониазидом (ΕΝΗ, 25 мг на 1 кг массы тела) и рифапентином (КГР, 10 мг на 1 кг массы тела) один раз в неделю посредством перорального искусственного кормления в течение 10 недель с недели 6 до недели 15 (протокол адаптирован из Аадаагб е! а1., 2011, Ν;·ιΙ Меб, 17: 189-194). 5 мышей умерщвляли в неделю 6 перед обработкой лекарственным средством.

Мышей из каждой группы умерщвляли: пять - в конце обработки антибиотиком (15 недель после инфекции) для определения клиренса в конце фазы обработки, а других - в неделю 21. Органы (например, селезенку) асептически удаляли, замораживали в сутки вскрытия и обрабатывали для анализа бактериальной нагрузки. Серийные разведения образцов гомогенатов органов переносили на чашки на селективный агар 7Н11 М1бб1еЪгоок ОАЭС и инкубировали в течение вплоть до 3 недель для подсчета жизнеспособных микобактерий (СРИ). Данные по бактериальной нагрузке выражали как Ьод10 общего числа колониеобразующих единиц (СРИ).

Терапевтические эффективности кандидатов на основе МУА сравнивали и ранжировали с использованием критерия Манна-Уитни. Значимым считалось значение р меньше 0,05.

Результаты

Пример 1: выбор подходящих антигенов М!Ъ для иммуногенной комбинации.

Геном М!Ъ экспрессирует приблизительно 4000 генов, но функция и роль в жизненном цикле М!Ъ огромного большинства генных продуктов еще не охарактеризована. Как описано в материалах и методах, существующие данные по антигенам М!Ъ были исследованы из доступной литературы и баз данных с целью идентификации самого подходящего набора генов/антигенов из генома М!Ъ для предложения иммунотерапевтической вакцины, способной индуцировать иммунитет против ТВ на протяжении всех фаз природного хода инфекции.

Данные библиографические анализы позволяют "предварительно отобрать" набор из 33 антигенов М!Ъ, принадлежащих ко всем трем фазам инфекции, а именно семь антигенов активной фазы, пять антигенов фазы оживления (КрГ) и 19 антигенов латентной фазы, а также два антигена РЕ/РРЕ.

Антигены активной фазы: ЕЗАТ-6 (Κν3875), СРР-10 (Κν3874), ТВ10.4 (Κν0288), Ад85А (Κν3804), Ад85В, (Κν1886) и два "ЕЗАТ-6-подобных антигена" (Κν3620 и Κν3619);

Два антигена РЕ/РРЕ (Κν2608 и Κν3478), которые, по-видимому, ассоциированы с вирулентностью.

Антигены фазы оживления: предварительно отобрали пять существующих генов КрГ (КрГА (Кл'0867с). КрГВ (Κν1009), КрГС (Ку1884с), КрГЭ (Κν2389), КрГЕ (Ку2450с)). КрГ представляют собой секретируемые или мембраносвязанные муралитические ферменты, экспрессия которых требуется для оживления покоящихся клеток.

Предварительно отбирали девятнадцать антигенов латентной фазы из более чем 150 существующих описанных генов латентной фазы. Более конкретно, двенадцать принадлежат к регулону Ио8К, набору из 45 генов, экспрессия которых увеличивается на протяжении периода латентности, и пять были выбраны среди генов, экспрессия которых модулировалась на протяжении условий культуры, которые, как полагают, имитируют условия латентности, с которыми М!Ъ сталкивается ш νί\Ό. Три антигена латентной

- 38 029492

фазы также выбрали на основе недавно описанных доклинической и ранней клинической фаз (Вег11ю1е1 е! а1., 2008, I. 1ттипо1. 181: 7948-57; ВейЬо1е! е! а1., 2010, δα Тгап§1 Меб 2: 53га74, Мо11епкорГ е! а1., 2004, 1пГес! Гттип 72: 6471-9). Итак, 19 предварительно отобранными антигенами латентной фазы были Ку1733с, Ку2029с, Κν1735, Κν1737, Κν2628, Κν0569, Κν2032, Ку2627с, Κν0111, Κν3812, Κν1806, Κν1807, Κν0198, Κν2626, Κν0081, Ку2005с, Κν2660, Κν3407 и Κν1813.

Затем был предпринят второй отбор для того, чтобы ранжировать 33 предварительно отобранных антигена М!Ь. Второй отбор антигенов М!Ь был основан на способе отбора на основе анализа данных (см. Материалы и Методы), отражающих их иммунологический и защитный потенциал (наивысший сохраняющийся балл), а также на биохимическом прогнозировании.

Были выбраны следующие антигены.

Антигены латентной фазы: Κν1733, Κν2029, Κν0569, Κν0111, Κν1807 и Κν3407. Κν2626 и Κν1813 также были выбраны из-за их очень хорошего балла на основе анализа данных и балла биохимического прогнозирования.

Антигены активной фазы: Е8АТ-6 (Κν3875), ТВ10.4 (Κν0288), Ад85В (Κν1886) и Κν3478. Следует отметить, что предварительно отобранный антиген активной фазы Κν3619 имел хороший балл на основе анализа данных, но, будучи Е8АТ-6-подобным белком, не демонстрирующим лучший балл, чем сам Е8АТ-6, его не оставляли в выбранном списке. В качестве другого примера, антигены активной фазы Κν2608 и Κν3478 имели одинаковый балл на основе анализа данных, но Κν3478 был выбран на основе его способности индуцировать большую процентную долю респондеров в исследованиях на когортах людей.

Антигены фазы оживления: КрГВ и КрГБ. Среди 5 генных продуктов фазы оживления три КрГ выделялись (КрГВ, Б и Е) очень сходным баллом после осуществления способа бальной оценки на основе анализа данных, но выбрали только КрГВ и Б по двум главным причинам. Во-первых, описанная перекрестная реактивность в показателях клеточных и гуморальных ответов между 4 из 5 КрГ (Υе^етееν е! а1., 2003, ГпГес! Гттип 71: 4789-94), за исключением КрГВ, что, по мнению авторов изобретения, оправдывало выбор последнего. Во-вторых, КрГБ был выбран вместо КрГЕ после анализа последовательностей на основе меньшей гомологии последовательности в домене лизоцима (ЬБ) между КрГВ и Б, чем между КрГВ и Е. Таким образом, предполагается, что сохранение КрГ В и Б было бы достаточным для получения иммунного ответа к 5 данным КрГ.

Пример 2: конструкция гибрида.

Проводили обширные анализы прогнозирования структуры ш 51Ьсо и библиографические анализы для того, чтобы прогнозировать биохимические свойства и/или биологические функции выбранных антигенов М!Ь, как описано в материалах и методах.

14 выбранных антигенов-кандидатов классифицировали на три группы, для которых требовались разные типы анализа.

Антигены с доступными данными, касающимися их экспрессии в разных вирусных векторах, а именно Ад85В, Е8АТ-6 и ТВ10-4 в МУА (КоШаЬ е! а1. 2010, СЬп Уассше 1ттипо1 17: 793-801); вирусе осповакцины (МаЬп е! а1. 2000, М1сгоЬе5 ГпГес! 2: 1677-85) и аденовирусе (Ми е! а1., 2009, Мо1 ТЬег 17: 1093-100; Б1еЬгсЬ е! а1. 2005, Р 1ттипо1 174: 6332-9 и Науепда е! а1. 2006; ί Сеп У1го1 87: 2135-43). В данных случаях анализ библиографии был главным источником информации для конструирования последовательности для вставки в конструкции векторов.

Антигены без приведенных данных относительно применения в вирусных векторах, но идентичные или гомологичные белку с известной структурой. В данных случаях структурные данные были главным источником информация для конструирования последовательности М!Ь для вставки в конструкции векторов (Κν2626, Κν2029, КрГВ, КрГБ и Κν0569).

Антигены без приведенных данных относительно применения в вирусных векторах и без гомологии с каким-либо белком с известной структурой. В данных случаях использовали биохимические анализы и прогнозирование ш 5Шсо для того, чтобы охарактеризовать антигены и для конструирования последовательности М!Ь для вставки в конструкции векторов (Κν0111, Κν3407, Κν3478, Κν1807 и Κν1813).

Конструкция антигена Ад85В.

Ад85В демонстрирует пептидный сигнал длиной 40 остатков, который был консервативным в векторе на основе МУА от КоЫаЬ, но не в вирусе осповакцины МаЬп и аденовирусных конструкциях. Поскольку сигнальный пептид Ад85В прогнозировали в виде ТМ домена, авторы изобретения рекомендовали не сохранять сигнальный пептид Ад85В в конструкциях векторов по данному изобретению. Рекомендованная первичная структура Ад85В*, подлежащего применению в описанных здесь конструкциях векторов, соответствует аминокислотной последовательности, показанной в 8ЕЦ ГБ ΝΟ: 20.

Конструкция антигена Е8АТ-6.

Е8АТ-6 образует гетеродимерный комплекс с СРР-10, и ожидается, что данное гетеродимерное взаимодействие индуцирует сворачивание обоих белков. Один Е8АТ-6 принимает состояние, подобное расплавленной глобуле, и структуру спираль-поворот-спираль при образовании комплекса с СРР10. Таким образом, Е8АТ-6, связанный с его партнером, мог бы быть более стабильным, чем Е8АТ-6, экспрессируемый один. Однако рекомендованная первичная структура Е8АТ-6, подлежащего применению в опи- 39 029492

санных здесь конструкциях векторов, соответствует полноразмерному белку (аминокислотная последовательность, показанная в 8ЕО ГО N0: 14), в конечном счете без его инициирующего Ме! (например, если он занимает внутреннее положение в слиянии).

Конструкция ТВ10-4 (Κν0288).

ТВ10-4 принадлежит к тому же самому семейству белков, что и Е8АТ-6. ЯМР (ядерный магнитный резонанс) структура ТВ10-4 продемонстрировала то, что он образует гетеродимерный комплекс с Κν0287, который, как ожидается, стабилизирует структуру. Нет публикаций, описывающих экспрессию ТВ10-4 вирусами оспы, тогда как экспрессия полноразмерного ТВ10-4 была описана в аденовирусных векторах в форме слияния с С-концевой частью либо Ад85А, либо Ад85В. На этой основе рекомендованная первичная структура ТВ10.4, подлежащего применению в описанных здесь конструкциях векторов, соответствует полноразмерному белку (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ГО N0: 2), в конечном счете, без его инициирующего Ме!.

Конструкция Κν2626.

Кристаллизация Κν2626 (8йагре е! а1., 2008, 1. Мо1. Вю1. 383: 822-36) продемонстрировала то, что он экспрессируется в виде гомодимера с внутри- и межсубъединичными дисульфидными связями. Для Κν2626 не прогнозировали сигнального пептида. Поскольку Κν2626 имеет очень хорошо определенное сворачивание, рекомендованная первичная структура Κν2626, подлежащего применению в описанных здесь конструкциях векторов, соответствует полноразмерному белку (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ГО N0: 10), в конечном счете, без его инициирующего Ме!.

Конструкция Κν0569.

Структура Κν0569 не известна, но этот белок демонстрирует 62%-ную идентичность (81%-ное сходство) с Κν2302 в перекрывающейся области из 76 аминокислот (из 88 остатков). Структура последней была определена ЯМР (Висйко е! а1., 2006, Вас!епо1 188: 5993-6001) и продемонстрировала очень хорошо свернутую структуру в растворе с ядром в виде антипараллельной β-складчатой структуры и Сконцевой α-спиралью. С данным белком не ассоциирован прогноз суперспирали. С белком Κν0569 не ассоциирована известная функция. Из-за потенциального очень хорошо определенного сворачивания рекомендованная первичная структура Κν0569 М!Ь, подлежащего применению в описанных здесь конструкциях векторов, соответствует полноразмерному белку (аминокислотная последовательность, показанная в 8Е0 ГО N0: 3), в конечном счете, без его инициирующего Ме!.

Конструкция Κν2029.

Структура Κν2029 не известна, но данный белок демонстрирует 35%-ную идентичность с фосфофруктокиназой-2 (рГк2) ЕзсйепсЫа сой в перекрывающейся области из 310 ак (аминокислоты) (из 339). Кроме того, поиск в ΡК0δСАN дал идентификацию полностью консервативной сигнатуры киназ углеводов. Следовательно, Κν2029 вероятно имеет в М!Ь фосфофруктокиназную активность.

Фосфофруктокиназа катализирует фосфорилирование фруктозо-6-фосфата во время гликолиза. Структура рГк2 Е.сой является тетрамерной при связывании АТФ и димерной при отсутствии АТФ в среде (аллостерическая регуляция ферментативной активности). В ферменте Е.сой делеция последних 4 С-концевых остатков полностью ингибирует тетрамеризацию, индуцированную АТФ. Таким образом, для того чтобы избежать гетерогенности олигомеризации Κν2029 (смеси димерной и тетрамерной форм), рекомендуется делеция С-концевой части (т.е. делеция последних 25 остатков). Кроме того, для устранения ферментативной активности Κν2029 рекомендована мутация Э26.^ (положение 265, начиная от инициирующего Ме!, или 264 без Ме!), так как она почти полностью устраняет ферментативную активность рГк-2 Е. сой (СаЬгега е! а1., 2010, Агсй Вюсйет Вюрйуз 502: 23-30). На этой основе рекомендованная первичная структура антигена Κν2029 (Κν2029*), подлежащего применению в описанных здесь конструкциях векторов, соответствует аминокислотной последовательности, показанной в 8Е0 ГО N0: 21.

Конструкция КрГВ и КрГО.

Факторы, стимулирующие оживление (КрГ), представляют собой секретируемые белки, которые образуются во время фазы реактивации бактерий (переход от покоя к росту). М. !иЬегси1оз13 имеет пять разных КрГ (от А до Е), которые все содержат консервативный каталитический домен (лизоцимоподобный домен). Помимо данного домена, среди этих пяти белков нет значимого сходства. Структура КрГВ была получена примерно для половины молекулы (остатки 194-362) и прогнозировали сигнальный пептид (остатки 1-29; Кидщего е! а1. 2009, ί. Мо1. Вю1. 385: 153-62). Полноразмерный белок (без его сигнального пептида) при экспрессии в Е.сой ведет себя как мономер.

На КрГВ провели прогнозирование и анализы ίη зШсо для того, чтобы проанализировать часть белка (30-193), для которой не была доступна структура. За исключением сигнального пептида, не прогнозировали трансмембранный домен. Графики НСА, прогноз вторичной структуры и прогнозы неупорядоченных областей в нативном состоянии согласуются с хорошо определенным сворачиванием области 30193. Прогнозы суперспирали и поиск известных мотивов с использованием ΡК0δСАN не дали какоголибо значимого результата.

Было показано, что активность каталитического домена зависит от консервативного остатка, существенного в активности оживления КрГ Мюгососсиз 1и!еиз в анализе оживления МусоЬас!егшт зтедтайз

- 40 029492

(мутация Е292К; Микато1оуа е1 а1. 2006, Μο1 М1сгоЫо1 59: 84-98). Кроме того, два остатка - Т315 и 0347 участвуют в связывании субстрата в лизоциме и являются консервативными в ΚρίΒ (Сойеп-Сопкаий, е1 а1. 2005, №1 8йис1 Мо1 ΒΦ1 12, 270-3).

Кроме того, выбрали конструирование гибрида ΚΡΡΒ-Л, который соответствует молекуле ΚρίΒ с ее каталитическим доменом, замененным самым дивергирующим каталитическим доменом среди Κρί (т.е. каталитическим доменом ΚρίΠ). Следовательно, гибрид ΚΡΡΒ-Л, подлежащий экспрессии в вирусных векторах, представляет собой гибридный белок с нейтрализованной каталитической активностью посредством трех мутаций (Е292К, Т315А и Ο347Λ) и без сигнального пептида. Рекомендованная первичная структура для этого гибридного белка ΚΡΡΒ-Л, используемого в слияниях, соответствует аминокислотной последовательности, показанной в δΕΟ ΙΌ ΝΌ: 31 от остатка 10 до остатка 283 ΚρίΒ, слитого с остатком 51 - остатком 147 ΚρίΠ, в конечном счете, без инициирующего Ме1.

Конструкция Κν1807.

Структура Κν1807 не является общедоступной, но поиск ΒΡΆδΤ в базе данных ΡΠΒ дал соответствие только с первыми 150 остатками белка РРЕ М(Ь (Κν2430). ΡΕ/ΡΡΕ представляет собой большое семейство белков М(Ь (приблизительно 100 членов РЕ и 60 членов РРЕ), которое имеет общий мотив РЕ (пролин, глутаминовая кислота) или РРЕ (пролин, пролин, глутаминовая кислота) в их Ν-концевых частях. Белки РЕ экспрессируются в виде гетеродимеров с РРЕ, и их функции еще не известны. Поиск ΒΡΆδΤ в υNIΡΚОΤ-δАIδδΡΚОΤ дал несколько соответствий, но все из них представляли собой дополнительные РРЕ М(Ь, что не позволяло получать дополнительную информацию.

В Е.соН экспрессия растворимого РРЕ (Κν2430) или РЕ (Κν2431), по-видимому, возможна только при экспрессии в виде гетеродимера ЭТгопд е1 а1. 2006, Ριυα Ν;·ιΐ1. ^ай δ^ 103: 8060-5). Эти авторы сообщили о том, что Κν1807, экспрессируемый в Е.соН один, образует тельца включения. Поиск ΡΚОδСΛN не дал какого-либо значимого соответствия с известным мотивом. Для данного белка не сообщали или прогнозировали сигнальный пептид или трансмембранный домен. Графики НСА, а также прогнозы вторичной структуры согласовались с хорошо определенным сворачиванием всего белка, за исключением области последних 60-70 остатков. Кроме того, с использованием прогнозирования неупорядоченных областей в нативном состоянии прогнозируется, что последние 60 остатков являются несвернутыми, тогда как прогнозирование суперспирали Κν1807 не дало какого-либо значимого результата.

Что касается ΕδΆΤ6 и ТВ10-4, соэкспрессия Κν1807 с его партнером (т.е. Κν1806) вероятно оказала бы благоприятное влияние на стабильность белка и, следовательно, потенциально на его иммуногенность. Экспрессия неправильно свернутого белка (мономерного белка) могла бы ухудшить стабильность рекомбинантного вектора (токсичность белка). Кроме того, несвернутая С-концевая часть Κν1807 также могла бы оказывать неблагоприятное влияние или на иммуногенность, и/или на стабильность рекомбинантного вируса. Рекомендованная первичная структура Κν1807, используемого в слияниях, соответствует полноразмерному белку (δΕΟ ΙΌ NО: 6). В случае проблемы, с которой сталкиваются при использовании полноразмерного белка, можно использовать антиген с усеченным С-концом с удаленными последними 60 остатками (как показано в δΕΟ ΙΌ NО: 18).

Конструкция Κν3478.

Κν3478 представляет собой другой белок РРЕ. Его домен РРЕ на 57% идентичен домену РРЕ Κν1807 (41%-ная идентичность между двумя целыми белками). Поиск ΒΡΆδΤ в υNIΡΚОΤ-δАIδδΡΚОΤ дал несколько соответствий, которые все представляли собой другие РРЕ ΜΐΗ. График НСА продемонстрировал присутствие гидрофобных участков вдоль всей последовательности белка. Другими словами график НСА не указывает наличие в Κν3478 несвернутой гидрофильной области. Но, как и для Κν1807, прогнозируется, что последние 40-50 остатков Κν3478 являются несвернутыми (на основе прогнозирования и вторичной структуры, и неупорядоченных областей в нативном состоянии). Для этого белка не сообщали или прогнозировали сигнальный пептид или трансмембранный домен. Предсказание суперспирали на Κν3478 не дали какого-либо значимого результата. Как и для Κν1807, рекомендованной первичной структурой является полноразмерный белок (δΕΟ ΙΌ NО: 13) или, при наличии проблем, усеченный на С-конце антиген с удаленными последними 40 остатками (как показано в δΕΟ ΙΌ NО: 24).

Конструкция Κν0111.

Прогнозируется, что Κν0111 представляет собой мембранный белок с возможной ацилтрансферазной активностью. Посредством ΌΆδ, ΤΜΗΜΜ и ^ρΡι^ прогнозируются десять трансмембранных доменов, охватывающих остатки 58-427. Сигнальный пептид не прогнозировался. Вторичные структуры прогнозируются вдоль всей первичной структуры с пробелом 449-469, который соответствует прогнозируемой неупорядоченной области в нативном состоянии. Прогнозирования суперспирали на Κν0111 не дали какого-либо значимого результата.

Анализ Ριό^απ дал четыре совпадения со сходством, большим или равным 80%: сайт фермента альдо/кеторедуктазы, липоил связывающий сайт ацилтрансферазы, сигнатура белка транспорта сахаров и белки липокалины эукариот. Поскольку три первые сигнатуры находятся в первых 300 остатках белка, рекомендуется, таким образом, удалять, по меньшей мере, данную часть белка для того, чтобы избежать любой потенциальной биологической активности. Это также позволило бы избавиться от большинства трансмембранных доменов белка. Следовательно, рекомендованная первичная структура Κν0111, под- 41 029492

лежащего применению в вирусных векторах, представляет собой С-концевую часть белка (например, остатки 393-685 нативного антигена, как показано в 8Еф ГО Ν0: 15) с только одним ТМ для заякоривания в плазматической мембране в случае секретируемой конструкции. В случае проблем с экспрессией можно использовать даже более усеченный антиген без какого-либо ТМ домена (остатки 429-685 нативного Κν0111, начиная с остатка 37 8Еф ГО Ν0: 15).

Конструкция Κν1813.

Структура Κν1813 не является общедоступной, и поиск ВЬА8Т в РЭВ не дал соответствия. Κν1813 представляет собой маленький белок (143 остатка), для которого прогнозируется наличие сигнального пептида (1-32) и отсутствие трансмембранного домена. Он не демонстрирует значимой гомологии с другими белками в базе данных ишрго1-8\\г55рго1. И графики НСА, и прогнозирование вторичной структуры, и прогнозирование неупорядоченных областей в нативном состоянии согласуются с хорошо определенным сворачиванием всего белка. Прогнозирование суперспирали не дало какого-либо значимого результата. В базе данных ТВ не приводится функция, и поиск РΚОδСАN не дал значимого соответствия с известным мотивом. Следовательно, рекомендованная первичная структура Κν1813, подлежащего применению в вирусных векторах, представляет собой полноразмерный белок без его сигнального пептида (остатки 1-34), аминокислотная последовательность которого показана в 8Еф ГО Ν0: 19.

Конструкция Κν3407.

Структура Κν3407 не является общедоступной, и поиск ВЬАЗТ в РИВ не дал какого-либо соответствия. Κν3407 представляет собой маленький белок (99 остатков) без значимой гомологии с другим белком в базе данных итргок-Зтеккргок Для данного белка не сообщали или прогнозировали сигнальный пептид или трансмембранный домен. График НСА и прогнозирование вторичной структуры согласовались с хорошо определенным сворачиванием всего белка. Однако прогнозирование неупорядоченных областей в нативном состоянии показало то, что последние 33 остатка могут быть несвернутыми в определенную структуру. Этот последний результат, который не согласуется с НСА и прогнозированием вторичной структуры, мог бы быть сигнатурой МОΚЕ ("элемент молекулярного распознавания"), который сворачивается при связывании с белком-партнером. В случае Κν3407 С-концевая альфа-спираль могла бы присутствовать только при связывании Κν3407 с его партнером. Прогнозирование спирали спиралей не дало какого-либо значимого результата. В базе данных ТВ для этого белка не приведена функция, и поиск РΚОδСАN не дал какого-либо значимого соответствия с известным мотивом. Рекомендованной первичной структурой Κν3407 является полноразмерный белок (8Еф ГО Ν0: 12). При наличии проблемы со стабильностью можно использовать антиген, усеченный на С-конце, с делецией последних 33 остатков (как показано в 8Еф ГО Ν0: 23).

Конструкция Κν 1733.

Согласно и\1РИ0Т-8У188РИ0Т и базе данных ТВ Κν1733 прогнозируется как мембранный белок с двумя трансмембранными доменами (которые также прогнозируются с использованием ИА8, ТМИММ и ТорРгеб). Первый ТМ домен прогнозировался в виде сигнального пептида. Помимо данных трансмембранных доменов для этого белка прогнозируется мало вторичных структур. График НСА демонстрирует присутствие небольшого числа гидрофобных участков между двумя трансмембранными спиралями. Наконец, между двумя трансмембранными спиралями прогнозировали неупорядоченную область в нативном состоянии (длиной примерно 20 остатков). В совокупности данные результаты указывают на вероятно слабое сворачивание помимо трансмембранных доменов. Поиск РΚОδСАN по Κν1733 без его сигнального пептида не дал какого-либо значимого соответствия с известным мотивом. Прогнозирование суперспирали в Κν1733 не дало какого-либо значимого результата. Таким образом, рекомендованной первичной структурой Κν1733, подлежащего применению в вирусных векторах, является весь белок минус его сигнальный пептид (62 первых остатка), как показано в 8Еф ГО Ν0: 17. В качестве альтернативы, также можно использовать полноразмерный Κν1733 (8Еф ГО Ν0: 5).

Пример 3: конструирование гибридов генов МкЬ.

Конструировали двенадцать разных слитых белков, как проиллюстрировано на фиг. 1 и в табл. 3. Более конкретно, 5 гибридов конструировали на основании биохимических соображений, как описано ниже, соответственно:

гибрид № 3 (РРРВ-ОВуЬ*);

гибрид № 5 (Κν0569-Κν1813*-Κν3407-Κν3478-Κν1807); гибрид № 6 (А§85В*-Κν2626-ΚРΡВ-^ЬуЬ*-Κν1733*); гибрид № 8 (А§85В*-Κν2626- Κν1733*) и гибрид № 14 (Κν2029*-ТВ10.4-ЕδАТ6-Κν0111*).

Для конструирования гибридов следовали следующим биохимическим соображениям.

В том же самом слиянии не следует сливать два димерных белка (т.е. Κν2626 и Κν2929*) для того, чтобы избежать каких-либо стерических конфликтов.

В том же самом слиянии не следует использовать два мембранных белка (т.е. Κν1733* и Κν0111*) для того, чтобы избежать потенциальной проблемы с токсичностью.

Белки с ТМ (Κν1733* и Κν0111*) следует вставлять в конце слияния для обеспечения заякоривания секретируемых конструкций в плазматической мембране.

- 42 029492

Если это возможно, слитый белок должен начинаться с хорошо свернутого белка (т.е. Ад85В*, Κν2029*, Κν2626, Κν0569, гибрид КРРВ-Ώ*) для того, чтобы иметь эффект "шаперона" на остальную часть слияния. Сделать три слияния, два из которых с минимальным набором антигенов (т.е. Ад85В*, Κν2029*, Κν2626, Κν0111*, Κν1733*, ТВ10-4, ЕЗАТ-6, гибрид КРРВ-Ώ*) и последнее гибрид - с остальными (используемыми в качестве опции) антигенами (т.е. Κν0569, Κν1813*, Κν3407, Κν1807, Κν3478). С другой стороны, слияния также конструировали относительно фазы заболевания ТВ. Гибрид № 2 содержит антигены активной фазы (Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТ6), тогда как гибрид № 4 содержит антигены активной фазы и фазы оживления (КРРВ-ПЬуЬ*-А§85В*-ТВ10.4-ЕЗАТ6). Гибрид № 13 составлено антигенами латентной фазы (Κν2029*-Κν2626-Κν1733*-Κν0111*).

Как описано в материалах и методах, к гибриду антигенов М1Ь добавляли ряд пептидов, соответственно, пептиды ^концевой метки Р1ад и С-концевых с-тус и Ηίδ метки, с целью облегчения детекции кодируемых генных продуктов, а также ^концевой сигнальный и С-концевой заякоривающий в мембране пептиды для усиления иммуногенной активности (следует отметить, что добавление ТМ домена не было необходимым для гибридов, оканчивающихся Κν0111* или Κν1733*, поскольку данные белки уже содержат такие домены).

С целью сравнения также были сконструированы слияния без каких-либо ЗЗ и ТМ пептидов для того, чтобы оценить цитоплазматическую экспрессию кодируемых антигенов М1Ь. У гибридов № 3 (рТО18267), № 5 (рТО18269), № 2 (рТО18266) и № 4 (рТО18268) были подвергнуты делеции ЗЗ и ТМ пептиды, давая слияния № 12 (рТС18307), № 9 (рТО18295), № 10 (рТО18296) и № 11 (рТО18297). В данных конструкциях сохраняли ^концевую метку Р1ад и С-концевые с-тус и Ηίδ метки.

В табл. 3 приведено резюме разных гибридов, сконструированных в данном исследовании.

Таблица 3

	Гибрид №	Антигены ТВ	плазмиды
Слияние на основе фазы	13	Βν2029*- Βν2626- Βν1733*- Βν011Г	рТС 18323
2	Ад85В*-ТВ10.4-Е5АТ6	рТС 18266
4	ВРЕВ-ОпуЬ-Ад85В*-ТВЮ.4-Е5АТ6	рТС 18268
Максималь ный список	5	Βν0569- Βν 1813*- Βν3407- Βν3478- Βν1807	рТС 18269
Слияние на основе биохимических правил	6	Ад85В*-Ву2626-ВРЕВ-ОИуЬ-Ву1733*	рТС 18270
14	Βν2029-ΤΒ10.4-Ε5ΑΤ6-Βν0111*	рТС 18324
8	Ад85В*-Ву2626-Ву1733*	рТС 18272
3	ВРГВ-ОИуЬ	рТС 18267
Слияние без 55 и ТМ	9	Βν0569- Βν 1813*- Βν3407- Βν3478- Βν1807	рТС 18295
10	Ад85В*-ТВ10.4-Е5АТ6	рТС 18296
11	ВРЕВ-ОпуЬ-Ад85В*-ТВ10.4-Е5АТ6	рТС 18297
12	ВРЕВ-ОИуЬ	рТС 18307

С целью сравнения плазмиды, кодирующие индивидуальные гены М1Ь, использованные в вышеописанных слияниях, амплифицировали ПЦР, или последовательность гена была синтезирована ОепеагБ Более точно, рТО18269 использовали в качестве матрицы для амплификации Κν3407, Κν0569, Κν1807, Κν1813* и Κν3478, тогда как рТО18323 использовали для амплификации Κν2626. ЕЗАТ6, Κν1733*, Ад85В*, ТВ10-4, Κν0111* и Κν2029* получали в виде синтетических генов.

Индивидуальные гены помещали в тот же самый контекст, что и слияния, т.е. вставляли в ρΟΑίζ ниже промотора СМУ и сливали с Р1ад в 5' и с-тус-Ηίδ последовательностями в 3'. Поскольку белки Κν1733* и Κν0111* содержат ТМ домен, сигнальный пептид, присутствующий на Оконце предшественника гликопротеина штамма ЕКА вируса бешенства, сливали выше последовательности Р1ад для того, чтобы избежать проблем с экспрессией. Полученные плазмиды называли соответственно рТС18300 (Κν3407), рТС18301 (Κν0569), рТС18302 (Κν1807), рТС18303 (Κν1813*), рТС18304 (Κν3478), рТС18305 (Κν2626), рТС18308 (ЕЗАТ6), рТС18309 (Κν1733*), рТС18310 (А§85В*), рТО18315 (ТВ10.4), рТО18329 (κν0111*), рТО18317 (Κν2029*).

Разные слитые белки оценивали в эукариотической системе экспрессии после введения соответствующих экспрессионных плазмид. Экспрессию оценивали вестерн-блоттингом, тогда как иммуногенную активность оценивали анализами методом иммуноферментных пятен после ДНК-иммунизации

мышей. При возможности сравнивали экспрессию и иммуногенность цитоплазматических (без ЗЗ и ТМ) и заякоренных в мембране версий, а также иммуногенность, предоставленную гибридами, с иммуногенностью, полученной с использованием смеси плазмид, экспрессирующих индивидуальные антигены М1Ь.

Пример 4: анализ экспрессии антигенов М1Ь и гибридов.

Независимо от того, экспрессировались ли они индивидуально или в слиянии, экспрессию генов М1Ь анализировали посредством вестерн-блоттинга из лизатов клеток, полученных из трансфицирован- 43 029492

ных клеток НЕК293.

4.1. Анализ вестерн-блоттингом лизата клетки, трансфицированной плазмидами, кодирующими индивидуальные антигены М!Ь.

Иммунодетекцию индивидуальных антигенов М!Ь проводили либо с использованием антител, направленных на пептиды меток, включенных в экспрессионные кассеты (например, антитело против Р1ад М2, конъюгированное с пероксидазой (НКР), моноклональное антитело против с-тус, конъюгированное с пероксидазой, и моноклональное антитело против ΗΪ8, конъюгированное с пероксидазой), либо антител, специфичных в отношении антигенов М!Ь. В частности, сыворотки, полученные после иммунизации кроликов (см. Материалы и Методы), использовали для детекции Κν1733*, Κν2029*, Κν0569, Κν1807, Κν0111*, КрГ-В-Ό, Κν1813*, Κν3407 и Κν3478, тогда как имеющиеся в продаже антитела использовали для детекции Е8АТ6, Ад85В *, ТВ10.4 и Κν2626.

Результаты обобщены в таблице 4. Более конкретно, полоса, соответствующая ожидаемому размеру, была детектирована для всех индивидуальных белков, какой бы ни была использованная система иммунодетекции (антитела против Р1ад, против ΗΪ8, специфичные кроличьи сыворотки и имеющиеся в продаже антитела). Для некоторых белков и, в зависимости от использованной системы иммунодетекции, также были детектированы дополнительные продукты. Кроме того, были детектированы высокие уровни экспрессии, за исключением Κν3407 и, в меньшей степени, ТВ10.4 и Е8АТ6. Примеры детекции экспрессии показаны на фиг. 2 для ряда репрезентативных антигенов М!Ь, а именно - Κν2029* (фиг. 2А), КРРВЭйуЬ (фиг. 2В), е8аТ6 (фиг. 2С) и Κν2626 (фиг. 2Ό).

Таблица 4

Антиген ТВ (плазмид а)	Ожидаемый размер (уровень экспр.)	Дополнительные продукты при использовании антител против Над и против Ηίδ	Дополнительные продукты при использовании антител против М(Ь
Βν3407 (рТС 18300)	14,4 кДа (+)
Βν0569 (рТС 18301)	12,9 кДа (+++)		1 слабая полоса «10 кДа
Щ/1807 (рТС 18302)	43,3 кДа (++)
Βν1813* (рТС 18303)	15,1 кДа (+++)
Βν3478 (рТС 18304)	42,8 кДа (+++)	2 Ν-концевых расщепленных продукта (распознаваемых антителом против Над), имеющих размер примерно 16 и 26 кДа	1 полоса ~ 30 кДа
Κν2626 (рТС 18305)	18,9 кДа (+++)	Дополнительная полоса, соответствующая димерам	Димер «43 кДа

- 44 029492

		Βν2626
Е5АТ6 (рТС 18308)	13,0 кДа (++)
Щ/1733* (рТС 18309)	21,2 кДа (+++)	Один Ν-концевой расщепленный продукт, имеющий размер примерно 20 кДа, и 3 С-концевых продукта, имеющих размер, составляющий от 8 до 10 кДа	2 полосы «10 и 20 кДа
Ад85В* (РТС18310)	33,9 кДа (+++)	5 минорных Ν-концевых расщепленных продуктов, имеющих размер примерно 26, 24, 20, 17 и 12 кДа, а также Сконцевой расщепленный продукт (детектированный антителом против Ηΐδ), имеющий размер примерно 34 кДа.	3 слабые полосы «26, 28 и 34 кДа
ТВ10.4 (рТС18315)	13,5 кДа (++)
Щ/011Г (рТС 18329)	37,6 кДа (+++)	один Ν-концевой расщепленный продукт, имеющий размер примерно 8 кДа, и один С-концевой продукт, имеющий размер примерно 34 кДа	1 полоса «34 кДа и 2 очень слабые полосы «18 и 20 кДа
Εν2029* (рТС18317)	35,8 кДа (+++)
ЩрВ-ОИуЬ* (рТС 18307)	39,4 кДа (+++)		2 слабые полосы «40 кДа

4.2. Анализ вестерн-блоттингом лизата клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими слияния антигенов МТЪ.

Клетки НЕК293 трансфицировали плазмидами, экспрессирующими разные слияния генов М!Ъ, и продукты экспрессии анализировали вестерн-блоттингом в таких же условия, которые описаны выше. Трансфекции проводили в присутствии, но также и в отсутствие ингибитора протеасом МО132. Здесь иммунодетекцию опять проводили с использованием антитела против Р1а§ М2, конъюгированного с пероксидазой (НРР), моноклинального антитела против с-тус, конъюгированного с пероксидазой, и моноклинального антитела против Ηΐδ, конъюгированного с пероксидазой, а также антител, специфичных в отношении антигенов М!Ъ. Ожидаемые размеры меченых гибридов указаны ниже:

гибрид № 2 (рТО18266): 63,6 кДа; гибрид № 3 (рТО18267): 49,0 кДа; гибрид № 4 (рТО18268): 99,7 кДа; гибрид № 5 (рТО18269): 122,0 кДа; гибрид № 6 (рТО18270): 103,5 кДа; гибрид № 8 (рТО18272): 67,3 кДа; гибрид № 9 (рТО18295): 112,9 кДа; гибрид № 10 (рТО18296): 53,8 кДа; гибрид № 11 (рТО18297): 90,0 кДа; гибрид № 12 (рТО18307): 39,3 кДа; гибрид № 13 (рТО18323): 101,5 кДа; гибрид № 14 (рТО18324): 90,6 кДа.

Все слияния антигенов М!Ъ детектировали моноклинальными антителами против Р1а§ и против Ηΐδ. Слитые продукты МФ также детектировали моноклональным антителом против с-тус, за исключением рТО18266, рТО18267, рТО18268 и рТО18269. Эпитоп с-тус возможно является недоступным в данных слияниях из-за смежных ТМ доменов, так как цитоплазматические аналоги (рТО18296, рТО18307, рТО18297 и рТО18295) хорошо детектируются антителом против тус. На фиг. 3 проиллюстрирован анализ вестерн-блоттингом гибридов М!Ъ, охватывающих антигены латентной фазы (рТО18295, кодирующая гибрид № 9), антигены активной фазы (рТО18296, кодирующая гибрид № 10), антигены фазы оживления (рТО18307, кодирующая гибрид № 12) и антигены и фазы оживления, и активной фазы (рТО18297,

- 45 029492

кодирующая гибрид № 11) после иммунодетекции антителами против Р1ад. Иммунодетекция антителами против Ηίκ давала такую же картину экспрессии.

На фиг. 4 проиллюстрирован анализ вестерн-блоттингом гибридов МЛ, включающих ТВ10.4 (фиг. 4А), Κν0569 (фиг. 4В) и Κν2626 (фиг. 4С), после иммунодетекции соответствующими специфичными сыворотками, соответственно, ТВ10.4-содержащих гибридов № 2 (рТС18266), № 10 (рТС18296), № 4 (рТС18268), № 11 (рТС18297), № 14 (рТС18324); Лу0569-содержащих гибридов № 5 (рТС18269) и № 9 (рТС18295) и Ру2626-содержащих гибридов № 13 (рТС18323), № 6 (рТС18270) и № 8 (рТС18272). рСЖ/ показана в качестве негативного контроля, и рТС18315, кодирующая ТВ10.4, в качестве позитивного контроля.

Какой бы ни была система иммунодетекции, для всех гибридов отмечена полоса, соответствующая ожидаемому размеру, и в некоторых случаях также наблюдали дополнительные слитые продукты. В частности, для рТС18270, рТС18272 и рТС18323 детектировали димеры. Эти три слияния содержат Κν2626, который имеет способность образовать димеры, устойчивые к восстанавливающим условиям. Иммунодетекция антителами против Р1ад и против Ηίκ выявляла некоторые дополнительные минорные протеолитические продукты для рТС18323 и рТС18269. Кроме того, дополнительные продукты, имеющие размер больший, чем ожидаемый, детектировали для рТС18266, рТС18268, рТС18269, рТС18270, рТС18272, рТС18323 и рТС18324 антителами против Р1ад и против Ηίκ. Данные полосы соответствуют Ν-гликозилированным продуктам, поскольку это было продемонстрировано обработкой Ν-гликозидазой Ρ ίη νίίτο (т.е. после обработки клеточных экстрактов Ν-гликозидазой были получены продукты экспрессии ожидаемого размера). Все слияния, содержащие сигнальный пептид, приводили к Νгликозилированным продуктам, за исключением слияния № 4 (рТС18267, ВрГВ-Ό*). Νгликозилированные продукты также детектировали антигенспецифичными антителами, как и димеры для гибридов рТС18270, рТС18272 и рТС18323, содержащих Κν2626. Для некоторых гибридов с использованием специфичных сывороток также были доказаны протеолитические продукты (данные не показаны), в зависимости от гибридов и сывороток. Например, с использованием сыворотки, специфичной в отношении Κν3407, детектировали дополнительные полосы «40 кДа для рТС18269 и «36 и 38 кДа для рТС18295, но они не видны при использовании сыворотки, специфичной в отношении Κν0569.

В присутствии МС132 получали аналогичные и более высокие уровни экспрессии для всех гибридов и детектировали большие количества продуктов. Уровни экспрессии гибридов, заякоренных в мембране (рТС18269, рТС18268) были сопоставимыми с уровнями, детектированными с их цитоплазматическими эквивалентами (рТС18295, рТС18297), за исключением рТС18266, которая экспрессировалась лучше, чем цитоплазматическое гибрид (рТС18296). Гибрид № 5 (рТС18269) очень слабо детектировалось антителом, специфичным в отношении Κν1807, в то время как это было не так для цитоплазматического слияния (рТС18295). Специфические эпитопы Κν1807 возможно являются недоступными в данном слиянии из-за смежной ТМ последовательности.

Пример 5: оценка ДНК-иммунизации.

Иммуногенную активность разных гибридов антигенов МЛ оценивали в разных мышиных моделях после ДНК-иммунизации.

5.1. Оценка иммуногенности, индуцированной гибридами на основе антигенов МЛ активной фазы.

Мышей ВАРВ/е три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидой, экспрессирующей гибрид "А§85В - ТВ10.4 - Е8АТ6", либо в форме, заякоренной в клеточной мембране (δδ/ТМ: рТС18266), либо в цитоплазматической форме (рТС18296) посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены МЛ, включенные в гибрид (рТС18310 (А§85В) плюс рТС18315 (ТВ10.4) плюс рТС18308 (Е8АТ6)), и пустой рСЖ/ в качестве негативного контроля. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νίνο разными пептидными пулами, описанными в материалах и методах.

Как проиллюстрировано на фиг. 5, сильный клеточный ответ против антигенов Ад85В и ТВ10.4 был индуцирован у всех мышей, иммунизированных рТС18266 (экспрессирующей заякоренную версию слияния А§85В-ТВ10.4-Е§АТ), тогда как ΙΡΝγ-продуцирующие клетки против Е8АТ-6 генерировались у 6 из 8 животных (фиг. 5а). У мышей, иммунизированных рТС18296 (экспрессирующей цитоплазматическую версию слияния А§85В-ТВ10.4-Е§АТ), также была детектирована активация ΙΡΝγ-продуцирующих клеток против антигенов Ад85В и ТВ10.4, но на меньшем уровне по сравнению с активацией, индуцированной заякоренным гибридом, тогда как против Е8АТ-6 были детектированы очень слабые ответы (фиг. 5Ъ). Очень интересно то, что при сравнении фиг. 5а/Ъ и с самые сильные ответы против всех трех антигенов были детектированы при экспрессии А§85В, ТВ10.4 и Е8АТ-6 в виде слитого белка (рТС18266 и рТС18296), а не при независимой экспрессии из индивидуальных плазмид (смесь рТС18310, рТС18315 и рТС18308). Как и ожидалось, иммунизация пустой плазмидой не индуцировала какого-либо специфичного иммунного ответа (фиг. 5й).

Таким образом, по меньшей мере, для антигенов МЛ активной фазы, данные результаты подчеркивают пользу конструирования гибридов антигенов, экспрессируемых на поверхности клетки (с пептида- 46 029492

ми δδ и ТМ), для оптимизации иммуногенной активности образующихся гибридов антигенов М!Ь.

5.2. Оценка иммуногенности, индуцированной гибридами на основе антигенов М!Ь активной фазы и фазы оживления.

Мышей ВАЬВ/с три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидой, экспрессирующей гибрид "КрГВ-ЭЬуЬ - А§85В - ТВ10.4 - ЕδΑТ6" либо в форме, заякоренной в клеточной мембране (δδ/ТМ: рТО18268), либо в цитоплазматической форме (рТО18297), посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены ТВ, включенные в гибрид (рТО18307 (КрГВ-ЭЬуЬ) плюс рТО18310 (А§85В) плюс рТО18315 (ТВ10.4) плюс рТО18308 (ЕδΑТ6)), и пустой рО\У1/ в качестве негативного контроля. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό разными пептидными пулами, описанными в материалах и методах.

Как проиллюстрировано на фиг. 6, иммунизация плазмидой рТО18268 (экспрессирующей заякоренную версию слияния КρГВ-^ΗуЬ-Α§85В-ТВ10.4-ЕδΑТ6) приводила к сильному ответу, специфичному в отношении антигенов КрГВ-ЭНуЬ, Ад85В и ТВ10.4, характеризующемуся детекцией высоких уровней ΙΡΝγ-продуцирующих клеток после повторной стимуляции ех νί\Ό соответствующими пептидными пулами, тогда как ΙΡΝγ-продуцирующие клетки против ЕδΑТ-6 индуцировались у меньшего числа животных и с меньшими уровнями индукции (фиг. 6а). У мышей, иммунизированных рТО18297 (экспрессирующей цитоплазматическую версию слияния КρГВ-^ΗуЬ-Α§85В-ТВ10.4-ЕδΑТ6), также была детектирована активация ΙΡΝγ-продуцирующих клеток против антигенов КрГВ-ЭНуЬ, Ад85В и ТВ 10.4, но с меньшим уровнем по сравнению с активацией, индуцированной заякоренным гибридом, тогда как против ЕδΑТ-6 генерировались очень слабые ответы (фиг. 6Ь). За исключением ЕδΑТ-6, как проиллюстрировано на фиг. 6с, самые сильные ответы против М!Ь были получены против КрГВ-ЭНуЬ, Ад85В и ТВ10.4 при экспрессии в виде слитого белка (рТО18268 и рТО18297, фиг. 6а и 6Ь), а не при независимой экспрессии из индивидуальных плазмид (смесь рТО18307 плюс рТО18310 плюс рТО18315 плюс рТО18308). Как и ожидалось, иммунизация пустой плазмидой не индуцировала какого-либо специфичного иммунного ответа (фиг. 6ά).

5.3. Оценка иммуногенности, индуцированной гибридами на основе антигенов М!Ь фазы оживления.

Мышей ВАЬВ/с три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидой, экспрессирующей гибрид "КрГВ-ЭЬуЬ" либо в форме, заякоренной в клеточной мембране (δδ/ТМ: рТО18267), либо в цитоплазматической форме (рТО18307), посредством внутримышечного пути. Пустую рО\У1/ использовали в качестве негативного контроля. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό четырьмя пептидными пулами, описанными в материалах и методах.

Как проиллюстрировано на фиг. 7, высокие уровни ΙΡΝγ-продуцирующих клеток наблюдали у мышей, вакцинированных рТО18267 (экспрессирующей заякоренную версию слияния КрГВ-ЭНуЬ с пептидами δδ/ТМ), указывая на то, что у данных мышей устанавливался сильный специфичный клеточный ответ (фиг. 7А). Иммунизация рТО18307 (экспрессирующей цитоплазматическую версию слияния КрГВЭНуЬ) также приводила к активации ΙΡΝγ-продуцирующих клеток, но немного в меньшей степени (фиг. 7В). Кроме того, данный ответ казался более гомогенным в группе животных, обработанных рТО18267, чем в группе, обработанной рТО18307. Как и ожидалось, иммунизация пустой плазмидой не индуцировала какого-либо специфичного иммунного ответа (фиг. 7С).

5.4. Оценка иммуногенности, индуцированной гибридами на основе антигенов М!Ь латентной фазы.

Мышей ВАЬВ/с три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидой, экспрессирующей

гибрид "Κν0569 - Κν1813 - Κν3407 - Κν3478 -Κν1807" либо в форме, заякоренной в клеточной мембране (рТО18269), либо в цитоплазматической форме (рТО18295), посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены М!Ь, включенные в гибрид (рТО18300 (Κν3407) плюс рТО18301 (Κν0569) плюс рТО18302 (Κν1807) плюс рТО18303 (Κν1813) плюс рТО18304 (Κν3478)), и пустой рО\У1/ в качестве негативного контроля. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό разными пептидными пулами, описанными в материалах и методах.

Как проиллюстрировано на фиг. 8, иммунизация плазмидой рТО18269 (экспрессирующей заякоренную версию слияния Κν0569 - Κν1813 - Κν3407 -Κν3478 - Κν1807) приводила к сильному ответу, специфичному в отношении антигенов Κν3407 и Κν3478, и в меньшей степени - в отношении Κν1807 (фиг. 8а). Аналогичные уровни ΙΡΝγ-продуцирующих клеток против этих трех антигенов были получены у мышей, иммунизированных рТО18295 (экспрессирующей цитоплазматическую версию слияния Κν0569 Κν1813 - Κν3407 - Κν3478 -Κν1807), (фиг. 8Ь). Ответы у мышей, которым инъецировали смесь плазмид, находились в пределах того же порядка (фиг. 8с). С другой стороны, во всех случаях не могли быть детектированы значимые ответы против Κν1813 и Κν0569 (фиг. 8а, Ь и с). Как и ожидалось, иммунизация

- 47 029492

пустой плазмидой не индуцировала какого-либо специфичного иммунного ответа (фиг. 86).

Для исследования ответов против антигенов Мй также использовали другие линии мышей для того, чтобы покрыть разные гаплотипы МНС: мышей ВАЬВ/с, являющихся Н-2⁶, мышей С57ВЬ/6, являющихся Н-2^Ъ, мышей СВАЛ и С.’3Н/НеК являющихся Н-2^к

Мышей три раза с 2-недельным интервалом иммунизировали рТС18323, экспрессирующей антигены из латентной фазы "Κν2029 - Κν2626 - Κν1733 -Κν0111", либо пустой рС\У1/ в качестве негативного контроля посредством внутримышечного пути. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό разными пептидными пулами, описанными в разделе Материалов и Методов. Как проиллюстрировано на фиг. 10, иммунизация мышей С3Η/ΗеN плазмидой рТС18323 приводила к сильному иммунному ответу, специфичному в отношении антигенов Κν2029 (позитивный пул пептидов № 1), Κν2626 (позитивный пул № 2) и Κν1733 (позитивный пул № 2) (фиг. 10а). После иммунизации рС\У1/ и повторной стимуляции ех νί\Ό пептидными пулами Κν0111 детектировали неспецифичный фоновый ответ (фиг. 10Ъ), таким образом, затрудняющий детекцию специфичного ответа против Κν0111 после вакцинации рТС18323.

Иммунные ответы, специфичные в отношении антигенов Κν2029, Κν2626 и Κν1733, также детектировали с аналогичными уровнями, что и наблюдаемые у мышей Н-2^к СВАЛ, иммунизированных рТС18323. В отличие от этого, у мышей ВАЬВ/с ΙΡΝγ-продуцирующие клетки специфично детектировали только после повторной стимуляции пептидами Κν2626, тогда как у мышей С57ВЬ/6 не был детектирован сигнал.

В целом данные результаты подчеркивают тот факт, что протестированные последовательности гибридов антигенов Мй способны индуцировать надежные основанные на клетках иммунные ответы у мышей разных гаплотипов.

5.5. Оценка иммуногенности, индуцированной гибридами, сконструированными на основе биохимических правил.

Мышей ВАЬВ/с или мышей С57ВЬ/6 три раза с 2-недельным интервалом иммунизировали плазмидами, кодирующими гибрид номер 6, 8 или 14, сконструированное согласно биохимическим свойствам антигенов Мй, т.е. рТС18270 (А§85В - Κν2626 - КрГВГОБуЪ - Κν1733), рТС18272 (А§85В - Κν2626 Κν1733) и рТС18324 (Κν2029 - ТВ10.4 - Е8АТ-6 - Κν0111), посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали пустой рС\У1/ в качестве негативного контроля. Клеточный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции ех νί\Ό разными пептидными пулами, описанными в разделе материалов и методов.

Сильный клеточный ответ, специфичный в отношении антигенов Ад85В и КрГВ-ЭБуЪ, индуцировался и у ВАЬВ/с, и у С57ВЬ/6 мышей, иммунизированных рТС18270, тогда как высокий уровень ΙΡΝγпродуцирующих клеток, специфичных в отношении Κν2626, детектировали только у мышей ВАЬВ/с. Иммунизация рТС18272 приводила к активации ΙΡΝγ-продуцирующих клеток, специфичных в отношении Ад85В, у мышей ВАЬВ/с и специфичных в отношении антигенов Ад85В и Κν2626 у мышей С57ВЬ/6, но до меньшего уровня по сравнению с ответом, индуцированным рТС18270. У мышей, иммунизированных рТС18324, детектировали высокие уровни ΙΡΝγ-продуцирующих клеток, специфичных в отношении антигенов ТВ10.4 и Е8АТ-6, тогда как ΙΡΝγ-продуцирующие клетки, специфичные в отношении Κν2029 и Κν0111, также индуцировались, но до меньших уровней. Как и ожидалось, иммунизация пустой плазмидой не индуцировала какого-либо специфичного иммунного ответа.

В целом протестированные слияния, сконструированные согласно соображениям, основанным на биохимии, для того, чтобы увеличивать стабильность и продукцию гибридов, демонстрируют хороший иммуногенный ответ, специфичный в отношении антигенов Мй из разных фаз инфекции.

5.6. Оценка гуморального ответа против Κν1733, индуцированного гибридами антигенов Мй.

Мышей ВАЬВ/с три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидами, экспрессирующими гибрид "Ад85В*- Κν2626-Κν1733*" (рТС18270) и гибрид "Ад85В* - Κν2626 - КРЕВ-ОНуЬ*Κν1733* (рТС18272), посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены Мй, включенные в гибрид (РТС18310 (Ад85В*) плюс рТС18305 (Κν2626) плюс рТС18309 (Κν1733*)), и пустой рС\V^Ζ в качестве негативного контроля. Гуморальный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК. Сыворотки иммунизированных мышей объединяли и анализировали вестерн-блоттингом. Более конкретно, 100 нг / полосу рекомбинантного белка Κν1733 (продуцированного в Е.соП, см. пример № 8) загружали на актиламидный гель, и иммунодетецию проводили с использованием сывороток, разведенных 1/200. В результате наблюдали специфичную детекцию белка Κν1733 с использованием сывороток мышей, иммунизированных рТС18270, рТС18272 и смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены Мй.

5.7. Оценка гуморального ответа против Κν1813, индуцированного гибридами антигенов Мй.

Мышей ВАЬВ/с три раза с 3-недельным интервалом иммунизировали плазмидой, экспрессирующей

гибрид "Κν0569 - Κν1813 - Κν3407 - Κν3478 -Κν1807" либо в форме, заякоренной в клеточной мембране

- 48 029492

(88/ТМ: рТС18269), либо в цитоплазматической форме (рТС18295), посредством внутримышечного пути. С целью сравнения мышей также иммунизировали смесью плазмид, кодирующих индивидуальные антигены М!Ъ, включенные в гибрид (рТС18300 (Κν3407) плюс рТС18301 (Κν0569) плюс рТС18302 (Κν1807) плюс рТС18303 (Κν1813) плюс рТС18304 (Κν3478)), и пустой рС\У1/ в качестве негативного контроля. Гуморальный иммунный ответ оценивали через 2 недели после последней инъекции ДНК. Сыворотки иммунизированных мышей объединяли и анализировали вестерн-блоттингом с использованием 100 нг / полосу рекомбинантного белка Κν1813 (продуцированного в Ε.οοίί, см. пример № 8), загруженного на акриламидный гель. Иммунодетекцию проводили с использованием сывороток, разведенных 1/200. В результате белок Κν1813 специфично детектировался с использованием сывороток мышей, иммунизированных рТС18269 (кодирующей гибрид в форме, заякоренной в клеточной мембране).

Пример 6: получение рекомбинантного МУА, экспрессирующего антигены М!Ъ.

Для экспрессии одного или вплоть до трех гибридов М!Ъ конструировали всего 10 вакцинкандидатов на основе МУА, и экспрессию разных антигенов М!Ъ анализировали вестерн-блоттингом из клеточных лизатов, полученных из инфицированных клеток А549.

6.1. Получение рекомбинантного МУА на основе фазы заболевания ТВ.

Конструировали семь рекомбинантных кандидатов на основе МУА так, чтобы они содержали одну, две или три кассеты для экспрессии гибридов М!Ъ, репрезентативных для разных фаз заболевания ТВ. И гибрид № 4, и гибрид № 11 содержат антигены активной фазы и фазы оживления (КРРВ-ОйуЪ*-А§85В*ТВ10.4-Е8АТ6), экспрессируемые либо заякоренными в клеточной мембране (гибрид № 4, оснащенный ^концевым сигнальным пептидом и С-концевым заякоривающим в мембране пептидом), либо в цитоплазме (гибрид № 11 соответствует цитоплазматической версии слияния № 4). Гибрид № 13 содержит антигены латентной фазы (Κν2029*-Κν2626-Κν1733*-Κν0111*). И гибрид № 5, и гибрид № 9 содержит дополнительные антигены латентной фазы (Κν056-Κν1813*-Κν3407-Κν3478-Κν1807), экспрессируемые в разной клеточной локализации: либо заякоренными в клеточной мембране (гибрид № 5 содержит N концевой сигнальный и С-концевой заякоривающий в мембране пептиды), либо в цитоплазме (гибрид № 9).

В целом семь кандидатов на основе МУА являются следующими.

МУАТС18355 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К.

МУАТС18364 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К и гибрид № 4 под контролем промотора рН5К.

МУАТС18365 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К и гибрид № 11 под контролем промотора рН5К.

МУАТС18376 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 4 под контролем промотора рН5К и гибрид № 5 под контролем промотора В2К.

МУАТС18377 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 11 под контролем промотора рН5К и гибрид № 5 под контролем промотора В2К.

МУАТС18378 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 4 под контролем промотора рН5К и гибрид № 9 под контролем промотора В2К.

МУАТС18379 содержит гибрид № 13 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 11 под контролем промотора рН5К и гибрид № 9 под контролем промотора В2К.

6.2. Получение рекомбинантного МУА на основе биохимических соображений.

Конструировали три рекомбинантных кандидата на основе МУА так, чтобы они содержали две или

три кассеты для экспрессии гибридов М!Ъ, разработанных в связи с биохимическими соображениями. Гибрид № 6 содержит следующие антигены А§85В*-Ку2626-КРРВ-ОйуЪ*-Ку1733*, тогда как гибрид № 14 содержит Ру2029*-ТВ10.4-Е8АТ6-Ру0111*. Для обоих гибридов добавляли ^концевые сигнальные пептиды, тогда как ТМ домен не добавляли, так как данные слияния заканчиваются Κν0111 или Κν1733, которые уже содержат заякоривающие в мембране пептиды.

МУАТС18404 содержит гибрид № 14 под контролем промотора р7.5К и гибрид № 6 под контролем промотора рН5К

МУАТС18417 содержит гибрид № 14 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 6 под контролем промотора рН5К и гибрид № 5 под контролем промотора В2К.

МУАТС18418 содержит гибрид № 14 под контролем промотора р7.5К, гибрид № 6 под контролем промотора рН5К и гибрид № 9 под контролем промотора В2К.

6.3. Анализ вестерн-блоттингом антигенов М!Ъ и гибридов, экспрессируемых МУА.

Клетки А549 инфицировали (М01 1) разными кандидатами на основе МУА, описанными выше, и продукты экспрессии анализировали вестерн-блоттингом при условиях, описанных в материалах и методах. Иммунодетекцию проводили антителами, специфичными в отношении разных описанных здесь антигенов М!Ъ. Конкретно, сыворотки, полученные после иммунизации кроликов (см. материалы и методы), использовали для детекции Κν1733*, Κν2029*, Κν0569, Κν1807, Κν0111*, КРРВ-ЭйуЪ*, Κν1813*, Κν3407 и Κν3478, тогда как имеющиеся в продаже антитела использовали для детекции Е8АТ6, Ад85В *, ТВ10.4 и Κν2626.

В результате для всех гибридов была выявлена полоса, соответствующая ожидаемому размеру, ка- 49 029492

ким бы ни был тестируемый рекомбинантный МУА. Более конкретно, полоса, соответствующая приблизительно 98,4 кДа (ожидаемый размер для слияния № 13), была детектирована в клеточных лизатах, происходящих из клеток, инфицированных МУАТС18355, МУАТС18364, МУАТС18365, МУАТС18376, МУАТС18377, МУАТС18378 и МУАТС18379, после иммунодетекции антителами против К'2626 и К'0111. Полоса, соответствующая приблизительно 96,7 кДа (ожидаемый размер для слияния № 4), и полоса, соответствующая приблизительно 87 кДа (ожидаемый размер для слияния № 11), была детектирована в клеточных лизатах, происходящих из клеток, инфицированных, соответственно, МУАТС18364, МУАТС 18376 и МУАТС 18378, содержащими гибрид № 4, и МУАТС 18365, МУАТС18377 и МУАТС18379, содержащими гибрид № 11, после иммунодетекции антителами против Е8АТ6. Кроме того, полоса, соответствующая приблизительно 119,7 кДа (ожидаемый размер для слияния № 5), и полоса, соответствующая приблизительно 109,9 кДа (ожидаемый размер для слияния № 9), была детектирована в клеточных лизатах, происходящих из клеток, инфицированных, соответственно, МУАТС 18376 и МУАТС 18377, содержащими гибрид № 5, и МУАТС 18378 и МУАТС 18379, содержащими гибрид № 9, после иммунодетекции антителами против К'3407. Наконец, полоса, соответствующая приблизительно 100,4 кДа (ожидаемый размер для слияния № 6), и полоса, соответствующая приблизительно 87,5 кДа (ожидаемый размер для слияния № 14), была детектирована в клеточных лизатах, происходящих из клеток, инфицированных МУАТС18404, после иммунодетекции антителами против К'2626 и К'0111 соответственно.

Кроме того, в некоторых случаях также наблюдали дополнительные слитые продукты. В частности, для слияния № 13 и слияния № 6 детектировали димеры, вероятно образующиеся в результате способности К'2626 формировать димеры, устойчивые к восстанавливающим условиям. Что касается слияния № 13, экспрессия всего слияния № 13 (ожидаемый размер 98,4 кДа) была в самом деле детектирована, но на низком уровне. Мажорные протеолитические продукты, свидетельствующие о протеолитическом расщеплении слияния № 13, наблюдали при использовании антитела против К'2626 (примерно 70 кДа) и при использовании антитела против К'0111 (примерно 30 кДа).

Аналогичный уровень экспрессии детектировали для гибридов № 4 и 11, которые содержат те же самые антигены (КРРВ-ПНуЪ*-А§85В*-ТВ10.4-Е8АТ6), но либо заякоренные в мембране (гибрид № 4), либо цитоплазматические (гибрид № 11). Для гибрида № 4 наблюдали полосу, имеющую размер, больший, чем ожидаемый (115 вместо 96,7 кДа), вероятно соответствующую Ν-гликозилированным продуктам. Для обоих гибридов также детектировали минорные протеолитические продукты.

Аналогичный уровень экспрессии также выявляли с использованием антитела против К'3407 в клеточных лизатах МУА, экспрессирующего слияния № 5 и 9 (которые оба соответствуют слиянию антигенов Ку0569-Ку1813*-Ку3407-Ку3478-Ку1807, но экспрессируемых в форме, заякоренной в мембране (гибрид № 5) или в цитоплазматической форме (гибрид № 9)). В лизатах клеток, экспрессирующих гибрид № 5, присутствовала полоса, имеющая размер, больший, чем ожидаемый (120 кДа вместо 98,4 кДа), вероятно соответствующая Ν-гликозилированным продуктам. С другой стороны, гибрид № 5 очень слабо детектировалось антителом против К'1807, тогда как это было не так для цитоплазматической версии. Предполагается, что эпитопы, специфичные для К'1807, могут быть недоступными в заякоренном в мембране слиянии из-за смежной последовательности ТМК.

Пример 7: оценка иммуногенности вакцин-кандидатов на основе МУА, экспрессирующих антигены

М!Ъ.

7.1. Оценка иммуногенности вакцин-кандидатов на основе МУА, экспрессирующих антигены М!Ъ, у мышей ВЛЬВ/с.

Мышей ВАЬВ/с иммунизировали МУАТС18365 и МУАТС18364, которые обе экспрессировали "Ку2029-Ку2626-Ку1733-Ку0111" (соответствующее слиянию № 13), а также "Кр£В-ОНуЪ-А§85В-ТВ10.4Е8АТ6" (соответствующее слиянию № 4 или № 11). В слиянии № 13 домен 88 присутствует на Ν-конце, и К'1733 и К'0111 экспрессируются с ТМ доменом, который должен направлять экспрессию слияния к поверхности клетки. Гибрид № 4, экспрессируемый МУАТС 18364, содержит и 88, и ТМ домен, тогда как гибрид № 11 (МУАТС18365) не содержит и теоретически должен сохранять цитоплазматическую экспрессию. Специфичные клеточные иммунные ответы оценивали через одну неделю после инъекции посредством анализа ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции описанными здесь пулами пептидов. Мышей также иммунизировали пустым вектором на основе МУА (МУАТС№3.1) в качестве негативного контроля.

Как проиллюстрировано на фиг. 11а и Ъ соответственно, оба вектора, МУАТС18365 и МУАТС18364, индуцировали у мышей ВАЬВ/с позитивные ответы ΙΡΝγ, специфичные в отношении К'2626, К'0111, КрГВ-ЭНуЪ, Ад85В и ТВ10.4, по сравнению с вектором МУАТС№3.1. Данные ответы были систематически сильнее при использовании МУАТС18364 (заякоренная версия) по сравнению с МУАТС18365 (цитоплазматическая версия), за исключением того, что К'2626 демонстрировал аналогичные ответы. Детектировали более слабые и спорадические ответы, специфичные в отношении К'2029, К'1733 и Е8АТ6.

Кроме того, все рекомбинантные вакцины-кандидаты на основе МУА, описанные в разделе "При- 50 029492

мер 6", инъецировали мышам ВЛЬВ/с, и клеточные иммунные ответы, специфичные в отношении всех антигенов МкЬ, оценивали посредством анализов ΙΡΝγ методом иммуноферментных пятен, как описано в разделе материалов и методов. Краткий обзор охвата и интенсивности ответов, индуцированных у мышей ВАЬВ/с каждым кандидатом на основе МУА, описан на фиг. 12. Все вакцины на основе МУА с гибридами антигенов МкЬ, сконструированными согласно фазе заболевания ТВ или биохимическим соображениям, могли индуцировать у мышей ВАЬВ/с ответ ΙΡΝγ, специфичный в отношении 12 из 14 антигенов. Не детектировали позитивный клеточный ответ, специфичный в отношении двух антигенов латентной фазы: Κν1733 и Κν0569.

7.2. Оценка иммуногенности вакцин-кандидатов на основе МУА, экспрессирующих антигены МкЬ, у трансгенных мышей 4^^2.

Как авторы изобретения наблюдали в исследованиях на основе ДНК, гаплотип мышей имеет влияние на иммуногенность выбранных антигенов МкЬ (см. раздел 5). Для того чтобы дополнительно проанализировать иммуногенность антигенов Κν1733 и Κν0569, индуцированную кандидатами на основе МУА, трансгенным мышам, экспрессирующим человеческую молекулу МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса I, 4^^2, инъецировали рекомбинантные МУА, экспрессирующие оба антигена. Клеточный иммунный ответ оценивали через одну неделю после инъекции посредством анализа ΙΝΡγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции описанными здесь пулами пептидов. Мышей также иммунизировали пустым вектором на основе МУА (МУАТО№3.1) в качестве негативного контроля. В частности, мышей 4^^2 иммунизировали вакцинами МУАТО18376 или МУАТО18378, экспрессирующими "Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111" (соответствующее слиянию № 13), "РрГВ-ОНуЬА§85В-ТВ10.4-Е§АТ6" (соответствующее слиянию № 4), а также " Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478Κν1807" (соответствующее слиянию № 5 или № 9). В слиянии № 5, экспрессируемом МУАТО 18376, домены δδ и ТМ экспрессировались на Ν-концевой и С-концевой части соответственно. На фиг. 13 проиллюстрирован ответ ΙΝΡγ, индуцированный у мышей 4^^2, иммунизированных вакциной МУАТО18376. Детектировали иммунный ответ, специфичный в отношении 7 из 14 антигенов (фиг. 13а). Высокие уровни клеток, продуцирующих ΙΝΡγ, детектировали при повторной стимуляции спленоцитов пептидами, специфичными в отношении антигенов РрГВ-ОНуЬ и Ад85В (1397 пятен/10⁶ клеток и 1160 пятен/10⁶ клеток соответственно). В отличие от этого, вакцина МУАТО18376 индуцировала меньшие уровни клеточных ответов, специфичных в отношении Κν1807, Κν1813, Κν3407 и Е8АТ6. Кроме того, низкий (1х порог отсечения < медиана < 2х порог отсечения, 186 пятен/10⁶ клеток, фиг. 13а), но значимый уровень клеток, продуцирующих ΙΝΡγ, детектировали при повторной стимуляции клеток Κν0569специфичными пептидами по сравнению с сигналом, детектированным при использовании пустой вакцины МУАТО№3.1 (36 пятен/10⁶ клеток, фиг. 13Ь). Аналогичные результаты также были индуцированы у мышей 4^^2, вакцинированных кандидатом МУАТО18378, который индуцировал дополнительные слабые ответы, специфичные в отношении антигенов Κν0111 и ТВ10.4. Ответы ΙΡΝγ, индуцированные обеими вакцинами, МУАТО18376 и МУАТО18378, обобщены на фиг. 15. Каким бы ни был инъецированный кандидат на основе МУА, у трансгенных мышей 4^^2 не могли наблюдать детектируемого ответа, специфичного в отношении Κν1733, Κν2029, Κν2626 и Κν3478.

7.3. Оценка иммуногенности вакцин-кандидатов на основе МУА, экспрессирующих антигены МкЬ, у мышей С57В1/6.

Мышей С57ВЬ/6 гаплотипа Н-2^Ь иммунизировали вакцинами МУАТО18377 или МУАТО18379, экспрессирующими "Κν2029-Κν2626-Κν1733-Κν0111" (соответствующее слиянию № 13), "РрГВ-ОНуЬА§85В-ТВ10.4-Е8АТ6" (соответствующее слиянию № 11), а также "Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478Κν1807" (соответствующее слиянию № 5 или 9), для того, чтобы продемонстрировать иммуногенность антигенов Κν0569 и Κν1733. Клеточный иммунный ответ оценивали через одну неделю после инъекции посредством анализов ΙΝΡγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции описанными здесь пулами пептидов. Мышей также иммунизировали пустым вектором на основе МУА (МУАТО№3.1) в качестве негативного контроля. Клеточные ответы ΙΝΡγ обобщены на фиг. 15. Обе вакцины на основе МУА могли запускать сильный иммунный ответ, специфичный в отношении антигенов Κν1807, ИрГВ-ОШЬ, Κν3478, Ад85В и Е8АТ6 (варьирующий от 92 до 861 пятна/10⁶ клеток), тогда как позитивный ответ ΙΝΡγ, специфичный в отношении антигенов ТВ10.4 и Κν0569, детектировали только у мышей, иммунизированных кандидатом МУАТО18379 (78 и 58 пятен/10⁶ клеток соответственно). У иммунизированных мышей С57ВЬ/6 не детектировали позитивный ответ, специфичный в отношении Κν1733, Κν2029, Κν2626, Κν0111, Κν1813 и Κν3407.

7.4. Оценка иммуногенности вакцин-кандидатов на основе МУА, экспрессирующих антигены МкЬ, у мышей С3Η/ΗеN.

Поскольку иммуногенность, специфичная в отношении Κν1733, была продемонстрирована у мышей С3Η/ΗеN гаплотипа Н-2^к, вакцинированных плазмидами (см. раздел 5,4), данной линии мышей инъецировали МУАТО18376, МУАТО18378, МУАТО18377 и МУАТО18379, экспрессирующие слияния, содержащие белок Κν1733. Клеточный иммунный ответ оценивали через одну неделю после инъекции посредством анализов ΙΝΡγ методом иммуноферментных пятен после повторной стимуляции описанны- 51 029492

ми здесь пулами пептидов. Мышей также иммунизировали пустым вектором МУАТОШ3.1 в качестве негативного контроля. Как проиллюстрировано на фиг. 14, вакцина МУАТО18377 индуцировала ответы ΙΝΕγ у мышей С3Η/ΗеN по сравнению с МУАТОШ3.1. Высокие уровни клеток, продуцирующих ΙΝΕγ, детектировали при повторной стимуляции спленоцитов пептидами Κν2029 и Κν2626 (660 и 353 пятна/10⁶ клеток соответственно). У иммунизированных мышей С3Η/ΗеN также индуцировался слабый клеточный иммунный ответ, специфичный в отношении антигенов КрГВ-ЭВуЪ, Κν1813, Κν3407 и Κν3478, варьирующий от 78 до 250 пятен/10⁶ клеток. Как продемонстрировано у мышей С3Н/НеН вакцинированных ДНК, у данной линии мышей запускался ответ ΙΝΕγ, специфичный в отношении Κν1733 (183 пятна/10⁶ клеток), по сравнению с сигналами, возникающими у мышей, которым инъецировали пустую вакцину МУАТОШ3.1 (9 пятен/10⁶ клеток, фиг. 14Ъ). После иммунизации МУАТОШ3.1 и повторной стимуляции ех νΐνο пулами пептидов Κν0111, Ад85В и Κν1807 детектировали неспецифичный фоновый ответ (фиг. 14Ъ), затрудняющий детекцию ответа, специфичного в отношении данных антигенов, после вакцинации МУАТО18377.

Помимо МУАТО18377, на фиг. 15 проиллюстрированы иммунные ответы, индуцированные у мышей С3Η/ΗеN МУАТО 18376, МУАТО18378 и МУАТО 18379. Среди четырех протестированных кандидатов на основе МУА МУАТО18377 был самым иммуногенным (7 из 14 антигенов). МУАТО 18376 и МУАТО 18378 индуцировали клеточные иммунные ответы, специфичные только в отношении 2 (Κν2029 и Κν2626) из 14 антигенов, тогда как МУАТО18379 мог запускать ответ не только в отношении обоих антигенов, но и Κν1733. МУАТО 18377 и МУАТО 18379 экспрессируют те же самые слитые белки, за исключением слияния "Κν0569-Κν1813-Κν3407-Κν3478-Κν1807". В МУАТО18377 домены δδ и ТМ экспрессируются на Ν-концевой и С-концевой части слияния № 5 соответственно, тогда как у МУАТО 18379 оба домена отсутствуют. 3 из 5 антигенов, присутствующих в данном слиянии, были иммуногенными у МУАТО18377, тогда как ни один не был иммуногенным у МУАТО18379. Данные результаты демонстрируют то, что адресование слитого белка в клеточную мембрану улучшает его иммуногенность.

В целом иммунизация векторами на основе МУА, а также ДНК-плазмидами приводит к индукции сильных и специфичных клеточных ответов, направленных на все антигены М!Ъ, включенные в слияния, описанные в настоящей заявке. У мышей, иммунизированных ДНК, также детектировали гуморальные иммунные ответы, специфичные в отношении двух протестированных антигенов. Как и в случае с ДНКплазмидами, заякоривание в мембране гибридов М!Ъ, экспрессируемых МУА, в некоторой степени улучшает уровень индукции специфичных иммунных ответов.

Пример 8: продукция и очистка антигенов М(Ь.

8.1. Оптимальные условия для продукции биомассы выбранных антигенов М(Ь.

Четыре штамма Ε^ο1ί тестировали на экспрессию индивидуальных атигенов М(Ь, а также при разных условиях культуры (например, температура).

Данные анализы подчеркивают то, что все 14 выбранных антигенов могли экспрессироваться по меньшей мере в одном бактериальном штамме при одной определенной температуре, но наблюдали значительные различия от одного антигена М(Ь до другого. В самом деле, некоторые антигены М(Ь могли легко продуцироваться в разных штаммах Ε^ο1ί и какими бы ни были культуральные условия (например, гибрид Κν0111, Κν0569, Κν1807, Κν2029, Κν2626, КрГВ-Ό), тогда как для других антигенов требуются очень специфические клетки-хозяева и условия (например, Κν1733, Κν1813, ТВ10-4). С другой стороны, высокие уровни экспрессии могли быть получены для большинства антигенов М(Ь в разных штаммах Ε^ο1ί, за исключением того, что Κν3407, Ад85В и Κν1813 экспрессировались с низкими, но детектируемыми уровнями. Кроме того, определенные антигены М!Ъ продуцируются в виде растворимого вещества (например, Κν2626, Κν3407 и Ад85В, которые могли быть отобраны непосредственно из супернатантов клеточных лизатов), тогда как другие находятся в нерастворимом веществе (например, КРЕВ-Э, Κν0111, Κν1733, Κν2029, Κν3478, Κν1807, РδΑΤ6 и ТВ10.4, которые отбирают из осадка после лизиса клеток). Интересно то, что Κν0569 является растворимым при получении из трансформированных клеток Ы21, культивируемых при 18°С, и находится и в растворимом, и в нерастворимом веществе (в супернатанте и осадке после лизиса) при культивировании клеток ΕΙ21 при 37°С.

8.2. Очистка антигенов М(Ь.

Как описано в материалах и методах, антигены М!Ъ очищали посредством хроматографии ГМАС на никелевых колонках, после которой, в конечном счете, следовала очистка на гель-фильтрационных колонках.

Репрезентативные анализы очистки показаны для Κν2626 (очищен из растворимого вещества, продуцированного в клетках С41 (ΌΕ3) при 37°С), слияния КРЕВ-Ό (денатурированный КрГВ-Ό, очищенный из солюбилизированных телец включения, продуцированных в ΕΙ21 (ΌΕ3) при 37°С) и ТВ10.4 (очищен из растворимого и нерастворимого вещества, продуцированного в клетках С41 (ΌΕ3) при 37°С. Элюированные фракции анализировали на δ^δ-ΡΑΟР, как показано на фиг. 9А, В и в соответственно.

Как проиллюстрировано на фиг. 9А, очищенный пул Κν2626 не демонстрировал каких-либо видимых примесей. Мажорную полосу наблюдали при ожидаемой для Κν2626 молекулярной массе, также как и минорную полосу (так называемую полосу В), которая была идентифицирована МС (масс- 52 029492

спектрометрия) как Κν2626. Известно, что Κν2626 образует димеры, которые являются частично устойчивыми к денатурации и восстановлению. Следовательно, предполагается, что минорная полоса В соответствует димерной форме Κν2626.

При визуализации на ЗБЗ-РАОЕ (полосы 1-8 представляют собой промежуточные фракции в ходе очистки, и полосы 9-11 - 5, 10 и 15 мкл очищенного пула) очищенный пул ΚΡΡΒ-^йуЬ не демонстрировал каких-либо видимых примесей (см. фиг. 9В).

ТВ10-4 очищали при денатурирующих условиях с последующей конечной стадией при нативных условиях. Как проиллюстрировано на фиг. 9С, анализ геля очищенного пула не демонстрировал какихлибо видимых примесей (полосы 2-6 представляют собой промежуточные фракции в ходе очистки, и полосы 7-9 - 1, 3 и 6 мкл очищенного пула).

В трех данных случаях в очищенных пулах измеряли уровни эндотоксинов, и они продемонстрировали максимальный уровень 10 ЕИ/мг белка.

Следовательно, три белка были очищены в приемлемом количестве, с приемлемой чистотой и уровнем эндотоксинов.

В заключение, согласно настоящему изобретению предложена оптимизированная комбинация антигенов М1Ь. 14 антигенов М1Ь отбирали после обширных библиографических анализов, бальной оценки анализа данных и биохимических анализов т зШсо и клонировали в плазмидные векторы либо индивидуально, либо в форме гибридов. Как продемонстрировано вестерн-блоттингом, все слияния экспрессировались с высокими уровнями и детектировались с правильным ожидаемым размером с последующей иммунодетекцией серией антител, направленных против меток, присутствующих на Ν- и С-концах, или против каждого антигена М1Ь, присутствующего в слиянии. Анализы иммунизации у мышей ВАЬВ/с поддерживают иммуногенный потенциал выбранных комбинаций антигенов М1Ь и гибридов для индуцирования ответов Т-клеток.

Кроме того, выбранные антигены М1Ь (ПрИЗ и ИрГ) в слиянии) индивидуально продуцировали в бактериях способами генной инженерии. Условия для экспрессии в Е.еой были оптимизированы путем исследования таких критериев, как бактериальные штаммы и культуральные условия (например, ростовая температура). Все белки были успешно экспрессированы и продуцированы в масштабе литров.

Пример 9: оценка терапевтической эффективности вакцин, содержащих антигены М1Ь, против инфекции МуеоЬаеΐе^^ит ΐиЬе^еи1оз^з у мышей.

Терапевтические эффективности трех кандидатов на основе МУА, экспрессирующих М1Ь: МУАТО18364, МУАТО18376 и МУАТО18377, исследовали при плане лечения, включающем совместное введение с антибиотиками, у мышей, которых ранее инфицировали штаммом I Ι37Κν М1Ь. В качестве негативного контроля, в одной группе также инъецировали МУАТО№3.1. Бактериальную нагрузку оценивали в селезенках, отобранных у мышей, подвергавшихся лечению, в конце лечения антибиотиками (в неделю 15 после инфекции) и через 6 недель (в неделю 21 после инфекции). Группы мышей, схема введения лекарственного средства и схема иммунизации описаны в табл. 5.

Таблица 5

Группа	Число мышей	Лечение	Неделя 0 заражения аэрозолем	сги до лечения (сутки 1, неделя 6)	Лечение ΙΝΗ/ΗΙΡ (от недели 6 до недели 15)	сги (рецидив) неделя 21
МУА неделя 10	МУА неделя 14	сги неделя 15
1	5	Нет	5	5
2	20	ΙΝΗ/ΗΙΡ	20	-			5	15
3	20	ΙΝΗ/ΗΙΡ плюс МУАТС18376	20		20	20	5	15
4	20	ΙΝΗ/ΗΙΡ плюс МУАТС 18377	20		20	20	5	15
5	20	ΙΝΗ/ΗΙΡ плюс МУАТС 18364	20		20	20	5	15
6	20	ΙΝΗ/ΗΙΡ плюс МУАТСЫ33.1	20		20	20	5	15

Через шесть недель после инфекции М1Ь и перед началом химиотерапии и иммунизации МУА микобактерии развивались в селезенке у всех групп мышей (2,64 1о§ю общего числа сГи). Как и ожидалось, микобактериальная нагрузка уменьшалась во время химиотерапевтического лечения. В группе 2, которую лечили только химиотерапией, уровень М1Ь прогрессирующе снижался с достижением 1,18 1о§ю общего числа сГи в неделю 15 и 0,70 1о§ю общего числа сГи в неделю 21. Интересно то, что в неделю 15 микобактериальные нагрузки были ниже у мышей, которых лечили совместно антибиотиками и МУА, экспрессирующими антигены М1Ь (0,70 1о§ю общего числа сГи в неделю 15 в группах 3-5), чем у мышей, которых лечили только антибиотиками (группа 2), и контроля с пустым вектором на основе МУА в комбинации с антибиотиками (группа 6), свидетельствуя о том, что МУА, экспрессирующие антигены М1Ь,

- 53 029492

способствовали более сильному антибактериальному эффекту. Примечательно то, что через 6 недель после завершения лечения (неделя 21) микобактерии не пролиферировали, и нагрузки у мышей, вакцинированных ΜνΆ, контролировались (варьируя от 0,70 до 0,85 1од₃₀ общего числа с£и) на уровне, аналогичном уровню, наблюдаемому у мышей, которых лечили терапией одними антибиотиками. В качестве контроля пустой вектор ΜνΆΤΟΝ33.1, объединенный с терапией лекарственными средствами, не индуцировал какого-либо антимикобактериального эффекта, лучшего, чем схема лечения только антибиотиками в неделю 15 и неделю 21.

Перечень последовательностей

<110> ΤΚΑΝ33ΕΝΕ ЗА

<120> МусоЬасНег1а1 апЫдеп чассьпе

<130> 363353Ώ32654

<150> ЕР 12305825.7 <151> 2012-07-10

<150> ЕР 12306539.3 <151> 2012-12-07

<150> ЕР 13305737.2 <151> 2013-06-03

<160> 102

<170> РаНепЫп чегзьоп 3.5

<210> 1 <211> 685

<212> ПРТ

<213> МусоЬасНег1ит НиЬегси1оз1з

<400> 1

МеН 1

Рго

А1а

Агд

Зег 5

Ча1

Рго

Агд

Рго

Агд 10

Тгр

Ча1

А1а

Рго

Ча1 15

Агд

Агд

Ча1

С1у

Агд 20

Ьеи

А1а

Ча1

Тгр

Азр 25

Агд

Рго

С1и

Агд

Агд 30

Зег

С1у

Не

Рго

А1а 35

Ьеи

Азр

С1у

Ьеи

Агд 40

А1а

11е

А1а

Ча1

А1а 45

Ьеи

Ча1

Ьеи

А1а

Зег 50

ΗΪ3

С1у

С1у

11е

Рго 55

С1у

МеН

С1у

С1у

С1у 60

РНе

11е

С1у

Ча1

Азр 65

А1а

РНе

РНе

Ча1

Ьеи 70

Зег

С1у

РНе

Ьеи

11е 75

ТНг

Зег

Ьеи

Ьеи

Ьеи 80

Азр

С1и

Ьеи

С1у

Агд 85

ТНг

С1у

Агд

11е

Азр 90

Ьеи

Зег

С1у

РНе

Тгр 95

11е

Агд

Агд

А1а

Агд 100

Агд

Ьеи

Ьеи

Рго

А1а 105

Ьеи

Ча1

Ьеи

МеН

Ча1 110

Ьеи

ТНг

Ча1

Зег

А1а 115

А1а

Агд

А1а

Ьеи

РНе 120

Рго

Азр

С1п

А1а

Ьеи 125

ТНг

С1у

Ьеи

Агд

Зег

Азр

А1а

11е

А1а

А1а

РНе

Ьеи

Тгр

ТНг

А1а

Азп

Тгр

Агд

РНе

- 54 029492

130 135 140

Уа1 А1а 01η Азп ТНг Азр Туг РНе ТНг <31п <31у А1а Рго Рго Зег Рго 145 150 155 160

Ьеи <31п ΗΪ3 ТНг Тгр Зег Ьеи <31у Уа1 <31и <31и <31п Туг Туг Уа1 Уа1 165 170 175

Тгр Рго Ьеи Ьеи Ьеи Не <31у А1а ТНг Ьеи Ьеи Ьеи А1а А1а Агд А1а 180 185 190

Агд Агд Агд Суз Агд Агд А1а ТНг Уа1 СЯу СЯу Уа1 Агд РНе А1а А1а 195 200 205

РНе Ьеи 11е А1а Зег Ьеи СЯу ТНг МеН А1а Зег А1а ТНг А1а А1а Уа1 210 215 220

А1а РНе ТНг Зег А1а А1а ТНг Агд Азр Агд 11е Туг РНе <31у ТНг Азр 225 230 235 240

ТНг Агд А1а СЯп А1а Ьеи Ьеи 11е СЯу Зег А1а А1а А1а А1а Ьеи Ьеи 245 250 255

Уа1 Агд Азр Тгр Рго Зег Ьеи Азп Агд СЯу Тгр Суз Ьеи 11е Агд ТНг 260 265 270

Агд Тгр СЯу Агд Агд 11е А1а Агд Ьеи Ьеи Рго РНе Уа1 СЯу Ьеи А1а 275 280 285

СЯу Ьеи А1а Уа1 ТНг ТНг Шз Уа1 А1а ТНг СЯу Зег Уа1 СЯу СЯи РНе 290 295 300

Агд Шз СЯу Ьеи Ьеи 11е Уа1 Уа1 А1а СЯу А1а А1а Уа1 11е Уа1 Уа1 305 310 315 320

А1а Зег Уа1 А1а МеН СЯи СЯп Агд СЯу А1а Уа1 А1а Агд 11е Ьеи А1а 325 330 335

Тгр Агд Рго Ьеи Уа1 Тгр Ьеи СЯу ТНг 11е Зег Туг СЯу Уа1 Туг Ьеи 340 345 350

Тгр Шз Тгр Рго 11е РНе Ьеи А1а Ьеи Азп СЯу СЯп Агд ТНг СЯу Тгр 355 360 365

Зег СЯу Рго А1а Ьеи РНе А1а А1а Агд Суз А1а А1а ТНг Уа1 Уа1 Ьеи 370 375 380

- 55 029492

А1а С1у А1а Зег Тгр Тгр Ьеи Не С1и С1п Рго Не Агд Агд Тгр Агд 385 390 395 400

Рго А1а Агд Уа1 Рго Ьеи Ьеи Рго Ьеи А1а А1а А1а ТНг Уа1 А1а Зег 405 410 415

А1а А1а А1а Уа1 ТНг МеН Ьеи Уа1 Уа1 Рго Уа1 С1у А1а О1у Рго С1у 420 425 430

Ьеи Агд <31и Не О1у Ьеи Рго Рго С1у Уа1 Зег А1а Уа1 А1а А1а Уа1 435 440 445

Зег Рго Зег Рго Рго С1и А1а Зег <31п Рго А1а Рго С1у Рго Агд Азр 450 455 460

Рго Азп Агд Рго РНе ТНг Уа1 Зег Уа1 РНе С1у Азр Зег Не С1у Тгр 465 470 475 480

ТНг Ьеи МеН Шз Туг Ьеи Рго Рго ТНг Рго С1у РНе Агд РНе Не Азр 485 490 495

Шз ТНг Уа1 Не О1у Суз Зег Ьеи Уа1 Агд <31у ТНг Рго Туг Агд Туг 500 505 510

Не С1у С1п ТНг Ьеи С1и С1п Агд А1а С1и Суз Азр С1у Тгр Рго А1а 515 520 525

Агд Тгр Зег А1а С1п Уа1 Азп Агд Азр С1п Рго Азр Уа1 А1а Ьеи Ьеи 530 535 540

Не Уа1 С1у Агд Тгр С1и ТНг Уа1 Азр Агд Уа1 Азп С1и С1у Агд Тгр 545 550 555 560

ТНг Шз Не С1у Азр Рго ТНг РНе Азр А1а Туг Ьеи Азп А1а С1и Ьеи 565 570 575

С1п Агд А1а Ьеи Зег Не Уа1 С1у Зег ТНг С1у Уа1 Агд Уа1 МеН Уа1 580 585 590

ТНг ТНг Уа1 Рго Туг Зег Агд С1у С1у С1и Ьуз Рго Азр С1у Агд Ьеи 595 600 605

Туг Рго С1и Азр С1п Рго С1и Агд Уа1 Азп Ьуз Тгр Азп А1а МеН Ьеи 610 615 620

- 56 029492

- 57 029492

- 58 029492

Азр (Пу СПу Ьеи Уа1 Агд ТНг Уа1 Ηίδ Ьеи Рго А1а Рго Азп Уа1 А1а 145 150 155 160

СПу Ьеи Ьеи Зег А1а А1а СПу Уа1 Рго Ьеи Ьеи СПп Зег Азр Ηίδ Уа1 165 170 175

Уа1 Рго А1а А1а ТНг А1а Рго Не Уа1 (Ли СПу МеН СПп Не СПп Уа1 180 185 190

ТНг Агд Азп Агд Не Ьуз Ьуз Уа1 ТНг СПи Агд Ьеи Рго Ьеи Рго Рго 195 200 205

Азп А1а Агд Агд Уа1 СПи Азр Рго СПи МеН Азп МеН Зег Агд СПи Уа1 210 215 220

Уа1 СПи Азр Рго СПу Уа1 Рго СПу ТНг СПп Азр Уа1 ТНг РНе А1а Уа1 225 230 235 240

А1а СПи Уа1 Азп СПу Уа1 СПи ТНг СПу Агд Ьеи Рго Уа1 А1а Азп Уа1 245 250 255

Уа1 Уа1 ТНг Рго А1а Ηίδ СПи А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 СПу ТНг Ьуз Рго 260 265 270

СПу ТНг СПи Уа1 Рго Рго Уа1 Не Азр СПу Зег Не Тгр Азр А1а Не 275 280 285

А1а (Пу Суз (Пи А1а (Пу (Пу Азп Тгр А1а Не Азп ТНг (Пу Азп (Пу 290 295 300

Туг Туг (Пу (Пу Уа1 (Пп РНе Азр (Пп (Пу ТНг Тгр (Ли А1а Азп (Пу 305 310 315 320

(Пу Ьеи Агд Туг А1а Рго Агд А1а Азр Ьеи А1а ТНг Агд (Ли (Ли СПп 325 330 335

Не А1а Уа1 А1а (Ли Уа1 ТНг Агд Ьеи Агд (Пп (Пу Тгр (Пу А1а Тгр 340 345 350

Рго Уа1 Суз А1а А1а Агд А1а (Пу А1а Агд 355 360

<210> 5

<211> 210

<212> ПРТ

<213> МусоЪасНеНит НиЬегси1оз1з

- 59 029492

<400> 5

Мей Не А1а ТНг ТНг Агд Азр Агд 1 5

С1и С1у А1а ТНг МеН Не ТНг РНе 10 15

Агд Ьеи Агд Ьеи Рго Суз Агд ТНг 20

Не Ьеи Агд Уа1 РНе Зег Агд Азп 25 30

Рго Ьеи Уа1 Агд 61у ТНг Азр Агд 35 40

Ьеи С1и А1а Уа1 Уа1 МеН Ьеи Ьеи 45

А1а Уа1 ТНг Уа1 Зег Ьеи Ьеи ТНг 50 55

Не Рго РНе А1а А1а А1а А1а С1у 60

ТНг А1а Уа1 С1п Азр Зег Агд Зег 65 70

Шз Уа1 Туг А1а Шз С1п А1а С1п 75 80

ТНг Агд Шз Рго А1а ТНг А1а ТНг 85

Уа1 Не Азр Шз С1и С1у Уа1 Не 90 95

Азр Зег Азп ТНг ТНг А1а ТНг Зег 100

А1а Рго Рго Агд ТНг Ьуз Не ТНг 105 110

Уа1 Рго А1а Агд Тгр Уа1 Уа1 Азп 115 120

С1у Не С1и Агд Зег С1у С1и Уа1 125

Азп А1а Ьуз Рго 61у ТНг Ьуз Зег 130 135

С1у Азр Агд Уа1 С1у Не Тгр Уа1 140

Азр Зег А1а С1у <31п Ьеи Уа1 Азр 145 150

<31и Рго А1а Рго Рго А1а Агд А1а 155 160

Не А1а Азр А1а А1а Ьеи А1а А1а 165

Ьеи С1у Ьеи Тгр Ьеи Зег Уа1 А1а 170 175

А1а Уа1 А1а С1у А1а Ьеи Ьеи А1а 180

Ьеи ТНг Агд А1а Не Ьеи Не Агд 185 190

Уа1 Агд Азп А1а Зег Тгр <31п Шз 195 200

Азр Не Азр Зег Ьеи РНе Суз ТНг 205

С1п Агд 210

<210> 6 <211> 399

<212> ПРТ

- 60 029492

<213> МусоЬасНег1ит НиЬегси1оз1з

<400> 6

Ьеи Азр РНе А1а ТНг Ьеи Рго Рго (Ли Не Азп Зег А1а Агд МеН Туг 15 10 15

Зег (Лу А1а (Лу Зег А1а Рго МеН Ьеи А1а А1а А1а Зег А1а Тгр Шз 20 25 30

(Лу Ьеи Зег А1а (Ли Ьеи Агд А1а Зег А1а Ьеи Зег Туг Зег Зег Уа1 35 40 45

Ьеи Зег ТНг Ьеи ТНг (Лу (Ли (Ли Тгр Шз (Лу Рго А1а Зег А1а Зег 50 55 60

МеН ТНг А1а А1а А1а А1а Рго Туг Уа1 А1а Тгр МеН Зег Уа1 ТНг А1а 65 70 75 80

Уа1 Агд А1а (Ли (Лп А1а (Лу А1а (Лп А1а (Ли А1а А1а А1а А1а А1а 85 90 95

Туг (Ли А1а А1а РНе А1а А1а ТНг Уа1 Рго Рго Рго Уа1 11е (Ли А1а 100 105 110

Азп Агд А1а (Лп Ьеи МеН А1а Ьеи 11е А1а ТНг Азп Уа1 Ьеи (Лу (Лп 115 120 125

Азп А1а Рго А1а 11е А1а А1а ТНг (Ли А1а (Лп Туг А1а (Ли МеН Тгр 130 135 140

Зег (Лп Азр А1а МеН А1а МеН Туг (Лу Туг А1а (Лу А1а Зег А1а А1а 145 150 155 160

А1а ТНг (Лп Ьеи ТНг Рго РНе ТНг (Ли Рго Уа1 (Лп ТНг ТНг Азп А1а 165 170 175

Зег (Лу Ьеи А1а А1а (Лп Зег А1а А1а 11е А1а Шз А1а ТНг (Лу А1а 180 185 190

Зег А1а (Лу А1а (Лп (Лп ТНг ТНг Ьеи Зег (Лп Ьеи 11е А1а А1а 11е 195 200 205

Рго Зег Уа1 Ьеи (Лп (Лу Ьеи Зег Зег Зег ТНг А1а А1а ТНг РНе А1а 210 215 220

Зег (Лу Рго Зег (Лу Ьеи Ьеи (Лу 11е Уа1 (Лу Зег (Лу Зег Зег Тгр

- 61 029492

- 62 029492

- 63 029492

115 120 125

Ьуз А1а С1у Суз С1п ТНг Туг Ьуз Тгр <31и ТНг РНе Ьеи ТНг Зег <31и 130 135 140

Ьеи Рго С1п Тгр Ьеи Зег А1а Азп Агд А1а Уа1 Ьуз Рго ТНг <31у Зег 145 150 155 160

А1а А1а Не С1у Ьеи Зег МеН А1а С1у Зег Зег А1а МеН Не Ьеи А1а 165 170 175

А1а Туг Ηί3 Рго (31η (31п РНе Не Туг А1а <31у Зег Ьеи Зег А1а Ьеи 180 185 190

Ьеи Азр Рго Зег <31п <31у МеН <31у Рго Зег Ьеи Не <31у Ьеи А1а МеН 195 200 205

<31у Азр А1а <31у <31у Туг Ьуз А1а А1а Азр МеН Тгр <31у Рго Зег Зег 210 215 220

Азр Рго А1а Тгр <31и Агд Азп Азр Рго ТНг <31п <31п Не Рго Ьуз Ьеи 225 230 235 240

Уа1 А1а Азп Азп ТНг Агд Ьеи Тгр Уа1 Туг Суз <31у Азп 61у ТНг Рго 245 250 255

Азп <31и Ьеи <31у <31у А1а Азп Не Рго А1а <31и РНе Ьеи 61и Азп РНе 260 265 270

Уа1 Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РНе С1п Азр А1а Туг Азп А1а А1а С1у 275 280 285

С1у ΗΪ3 Азп А1а Уа1 РНе Азп РНе Рго Рго Азп С1у ТНг Ηίδ Зег Тгр 290 295 300

С1и Туг Тгр С1у А1а С1п Ьеи Азп А1а МеН Ьуз С1у Азр Ьеи С1п Зег 305 310 315 320

Зег Ьеи С1у А1а С1у 325

<210> 9

<211> 339

<212> ПРТ

<213> МусоЪасНеНит НиЬегси1оз1з

<400> 9

- 64 029492

МеЬ ТЬг <31и Рго А1а А1а Тгр Азр 1 5

С1и С1у Ьуз Рго Агд 11е 11е ТЬг 10 15

Ьеи ТЬг МеЬ Азп Рго А1а Ьеи Азр 20

11е ТЬг ТЬг Зег Уа1 Азр Уа1 Уа1 25 30

Агд Рго ТЬг <31и Ьуз МеЬ Агд Суз 35 40

С1у А1а Рго Агд Туг Азр Рго С1у 45

<31у <31у <31у Не Азп Уа1 А1а Агд 50 55

11е Уа1 Шз Уа1 Ьеи С1у С1у Суз 60

Зег ТЬг А1а Ьеи Рке Рго А1а С1у 65 70

С1у Зег ТЬг С1у Зег Ьеи Ьеи МеЬ 75 80

А1а Ьеи Ьеи С1у Азр А1а С1у Уа1 85

Рго Рке Агд Уа1 11е Рго 11е А1а 90 95

А1а Зег ТЬг Агд <31и Зег Рке ТЬг 100

Уа1 Азп С1и Зег Агд ТЬг А1а Ьуз 105 110

<31п Туг Агд Рке Уа1 Ьеи Рго С1у 115 120

Рго Зег Ьеи ТЬг Уа1 А1а С1и С1п 125

<31и С1п Суз Ьеи Азр С1и Ьеи Агд 130 135

С1у А1а А1а А1а Зег А1а А1а РЬе 140

Уа1 Уа1 А1а Зег С1у Зег Ьеи Рго 145 150

Рго С1у Уа1 А1а А1а Азр Туг Туг 155 160

С1п Агд Уа1 А1а Азр 11е Суз Агд 165

Агд Зег Зег ТЬг Рго Ьеи 11е Ьеи 170 175

Азр ТЬг Зег С1у С1у С1у Ьеи С1п 180

Шз 11е Зег Зег С1у Уа1 РЬе Ьеи 185 190

Ьеи Ьуз А1а Зег Уа1 Агд С1и Ьеи 195 200

Агд С1и Суз Уа1 С1у Зег С1и Ьеи 205

Ьеи Ткг С1и Рго С1и С1п Ьеи А1а 210 215

А1а А1а Шз С1и Ьеи 11е Азр Агд 220

С1у Агд А1а С1и Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 225 230

Зег Ьеи С1у Зег С1п С1у А1а Ьеи 235 240

- 65 029492

- 66 029492

Не Уа1 ТНг <31и А1а Азр 11е А1а Агд Шз Ьеи Рго С1и Шз А1а 11е 115 120 125

Уа1 С1п РНе Уа1 Ьуз А1а 11е Суз Зег Рго Мер А1а Ьеи А1а Зег 130 135 140

<210> 11

<211> 154

<212> ПРТ

<213> МусоНасРеглит РиЬегси1оз1з

<400> 11

Мер ТНг Рго С1у Ьеи Ьеи ТНг ТНг А1а С1у А1а С1у Агд Рго Агд Азр 15 10 15

Агд Суз А1а Агд 11е Уа1 Суз ТНг Уа1 РНе 11е С1и ТНг А1а Уа1 Уа1 20 25 30

А1а ТНг МеН РНе Уа1 А1а Ьеи Ьеи С1у Ьеи Зег ТНг 11е Зег Зег Ьуз 35 40 45

А1а Азр Азр 11е Азр Тгр Азр А1а 11е А1а С1п Суз С1и Зег С1у С1у 50 55 60

Азп Тгр А1а А1а Азп ТНг С1у Азп С1у Ьеи Туг С1у С1у Ьеи С1п 11е 65 70 75 80

Зег С1п А1а ТНг Тгр Азр Зег Азп С1у С1у Уа1 С1у Зег Рго А1а А1а 85 90 95

А1а Зег Рго С1п С1п С1п 11е С1и Уа1 А1а Азр Азп 11е Мер Ьуз ТНг 100 105 110

С1п С1у Рго С1у А1а Тгр Рго Ьуз Суз Зег Зег Суз Зег С1п С1у Азр 115 120 125

А1а Рго Ьеи С1у Зег Ьеи ТНг Шз 11е Ьеи ТНг РНе Ьеи А1а А1а С1и 130 135 140

ТНг С1у С1у Суз Зег С1у Зег Агд Азр Азр 145 150

<210> 12

<211> 99

<212> ПРТ

<213> МусоЬасРегтит РиЬегси1оз1з

- 67 029492

- 68 029492

- 69 029492

А1а А1а	Агд А1а 340	Ьеи	Рго	Ьеи	ТНг	Зег Ьеи 345	ТНг	Зег А1а	А1а 350	С1п	ТНг
А1а Рго	(31у ΗΪ3	МеН	Ьеи	С1у	С1у	Ьеи Рго	Ьеи	(31у ΗΪ3	Зег	Уа1	Азп
	355				360			365
А1а О1у	Зег <31у	11е	Азп	Азп	А1а	Ьеи Агд	Уа1	Рго А1а	Агд	А1а	Туг
370				375				380
А1а 11е	Рго Агд	ТНг	Рго	А1а	А1а	С1у
385			390
<210>	14
<211>	95
<212> :	ПРТ
<213> 1	МусоЬасНеггит НиЬегсиТозгз
<400>	14
МеН ТНг	С1и С1п	С1п	Тгр	Азп	РНе	А1а О1у	11е	(31и А1а	А1а	А1а	Зег
1		5				10				15
А1а 11е	С1п С1у	Азп	Уа1	ТНг	Зег	11е ΗΪ3	Зег	Ьеи Ьеи	Азр	С1и	С1у
	20					25			30
Ьуз <31п	Зег Ьеи	ТНг	Ьуз	Ьеи	А1а	А1а А1а	Тгр	(31у С1у	Зег	С1у	Зег
	35				40			45
(31и А1а	Туг <31п	С1у	Уа1	С1п	С1п	Ьуз Тгр	Азр	А1а ТНг	А1а	ТНг	С1и
50				55				60
Ьеи Азп	Азп А1а	Ьеи	С1п	Азп	Ьеи	А1а Агд	ТНг	Ые Зег	С1и	А1а	С1у
65			70				75				80
<31п А1а	МеЬ А1а	Зег	ТНг	С1и	С1у	Азп Уа1	ТНг	(31у МеН	РНе	А1а
		85				90				95

<210> 15

<211> 293

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по Ν-концу антиген ΕνΟΙΙΙ (393-685)

<400> 15

<31и <31п Рго Не Агд Агд Тгр Агд Рго А1а Агд Уа1 Рго Ьеи Ьеи Рго 15 10 15

- 70 029492

Ьеи А1а А1а А1а ТНг Уа1 А1а Зег А1а А1а А1а Уа1 ТНг МеН Ьеи Уа1 20 25 30

Уа1 Рго Уа1 С1у А1а С1у Рго С1у Ьеи Агд С1и Не С1у Ьеи Рго Рго 35 40 45

(Пу Уа1 Зег А1а Уа1 А1а А1а Уа1 Зег Рго Зег Рго Рго (Пи А1а Зег 50 55 60

<31п Рго А1а Рго (Пу Рго Агд Азр Рго Азп Агд Рго РНе ТНг Уа1 Зег 65 70 75 80

Уа1 РНе (Пу Азр Зег 11е (Пу Тгр ТНг Ьеи МеН Шз Туг Ьеи Рго Рго 85 90 95

ТНг Рго (Пу РНе Агд РНе 11е Азр Шз ТНг Уа1 11е (Пу Суз Зег Ьеи 100 105 110

Уа1 Агд 61у ТНг Рго Туг Агд Туг Не (Пу (Пп ТНг Ьеи (Пи (Пп Агд 115 120 125

А1а (Пи Суз Азр (Пу Тгр Рго А1а Агд Тгр Зег А1а (Пп Уа1 Азп Агд 130 135 140

Азр (Пп Рго Азр Уа1 А1а Ьеи Ьеи Ые Уа1 (Пу Агд Тгр (Пи ТНг Уа1 145 150 155 160

Азр Агд Уа1 Азп (Пи (Пу Агд Тгр ТНг Шз 11е (Пу Азр Рго ТНг РНе 165 170 175

Азр А1а Туг Ьеи Азп А1а С1и Ьеи (Пп Агд А1а Ьеи Зег 11е Уа1 (Пу 180 185 190

Зег ТНг 61у Уа1 Агд Уа1 МеН Уа1 ТНг ТНг Уа1 Рго Туг Зег Агд (Пу 195 200 205

(Пу (Ли Ьуз Рго Азр (Пу Агд Ьеи Туг Рго (Ли Азр (Пп Рго (Ли Агд 210 215 220

Уа1 Азп Ьуз Тгр Азп А1а МеН Ьеи Шз Азп А1а 11е Зег (Лп Шз Зег 225 230 235 240

Азп Уа1 (Пу МеН 11е Азр Ьеи Азп Ьуз Ьуз Ьеи Суз Рго Азр (Пу Уа1 245 250 255

Туг ТНг А1а Ьуз Уа1 Азр (Пу 11е Ьуз Уа1 Агд Зег Азр СПу Уа1 Шз

- 71 029492

260 265 270

Ьеи ТНг <31п <31и <31у Уа1 Ьуз Тгр Ьеи Не Рго Тгр Ьеи <31и Азр Зег 275 280 285

Уа1 Агд Уа1 А1а Зег 290

<210> 16

<211> 254

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> ;	усеченный по	N и	С-концу	Ер£В
<400>	16
ТНг Уа1	Азр <31у ТНг	А1а	МеЕ Агд	Уа1 ТНг ТНг МеЕ Ьуз Зег Агд Уа1
1	5			10 15
11е Азр	11е Уа1 (31и	С1и	Азп <31у	РНе Зег Уа1 Азр Азр Агд Азр Азр
	20			25 30
Ьеи Туг	Рго А1а А1а	С1у	Уа1 <31п	Уа1 ΗΪ3 Азр А1а Азр ТНг 11е Уа1
	35		40	45
Ьеи Агд	Агд Зег Агд	Рго	Ьеи (31п	11е Зег Ьеи Азр <31у Шз Азр А1а
50			55	60
Ьуз <31п	Уа1 Тгр ТНг	ТНг	А1а Зег	ТНг Уа1 Азр <31и А1а Ьеи А1а <31п
65		70		75 80
Ьеи А1а	МеЕ ТНг Азр	ТНг	А1а Рго	А1а А1а А1а Зег Агд А1а Зег Агд
	85			90 95
Уа1 Рго	Ьеи Зег <31у	МеЕ	А1а Ьеи	Рго Уа1 Уа1 Зег А1а Ьуз ТНг Уа1
	100			105 110
(31п Ьеи	Азп Азр <31у	С1у	Ьеи Уа1	Агд ТНг Уа1 Шз Ьеи Рго А1а Рго
	115		120	125
Азп Уа1	А1а (31у Ьеи	Ьеи	Зег А1а	А1а <31у Уа1 Рго Ьеи Ьеи <31п Зег
130			135	140
Азр ΗΪ3	Уа1 Уа1 Рго	А1а	А1а ТНг	А1а Рго 11е Уа1 (31и (31у МеЕ (31п
145		150		155 160

- 72 029492

Не

С1п

Уа1

ТНг

Агд Азп Агд 165

Не

Ьуз

Ьуз 170

Уа1

ТНг

С1и

Агд

Ьеи 175

Рго

Ьеи

Рго

Рго

Азп

А1а

Агд

Агд

Уа1

С1и

Азр

Рго

С1и

МеН

Азп

МеН

Зег

180

185

190

Агд

С1и

Уа1

Уа1

С1и

Азр

Рго

С1у

Уа1

Рго

С1у

ТНг

С1п

Азр

Уа1

ТНг

195

200

205

РНе

А1а

Уа1

А1а

С1и

Уа1

Азп

С1у

Уа1

С1и

ТНг

С1у

Агд

Ьеи

Рго

Уа1

210

215

220

А1а

Азп

Уа1

Уа1

Уа1

ТНг

Рго

А1а

Шз

С1и

А1а

Уа1

Уа1

Агд

Уа1

С1у

225

230

235

240

ТНг

Ьуз

Рго

С1у

ТНг

С1и

Уа1

Рго

Рго

Уа1

Не

Азр

С1у

Зег

245 250

<210> 17

<211> 148

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по Ν-концу Εν1733 (63-210) без

сигнального пептида

<400> 17

А1а <31у ТНг А1а Уа1 О1п Азр Зег Агд Зег Шз Уа1 Туг А1а Шз <31п 15 10 15

А1а О1п ТНг Агд Шз Рго А1а ТНг А1а ТНг Уа1 Не Азр Шз <31и <31у 20 25 30

Уа1 11е Азр Зег Азп ТНг ТНг А1а ТНг Зег А1а Рго Рго Агд ТНг Ьуз 35 40 45

Не ТНг Уа1 Рго А1а Агд Тгр Уа1 Уа1 Азп <31у Не <31и Агд Зег <31у 50 55 60

<31и Уа1 Азп А1а Ьуз Рго <31у ТНг Ьуз Зег <31у Азр Агд Уа1 <31у Не 65 70 75 80

Тгр Уа1 Азр Зег А1а <31у <31п Ьеи Уа1 Азр <31и Рго А1а Рго 85 90

Рго А1а 95

Агд А1а Не А1а Азр А1а А1а Ьеи А1а А1а Ьеи <31у Ьеи Тгр Ьеи Зег 100 105 110

- 73 029492

Уа1 А1а А1а Уа1 А1а С1у А1а Ьеи Ьеи А1а Ьеи ТНг Агд А1а Не Ьеи 115 120 125

11е Агд Уа1 Агд Азп А1а Зег Тгр <31п Шз Азр 11е Азр Зег Ьеи РНе 130 135 140

Суз ТНг <31п Агд 145

<210> 18

<211> 339

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность <220>

<223> усеченный по С-концу Εν1807 (1-339)

<400> 18

Ьеи 1

Азр

РНе

А1а

ТНг 5

Ьеи

Рго

Рго

С1и

11е 10

Азп

Зег

А1а

Агд

МеН 15

Туг

Зег

С1у

А1а

С1у 20

Зег

А1а

Рго

МеЬ

Ьеи 25

А1а

А1а

А1а

Зег

А1а 30

Тгр

ΗΪ3

С1у

Ьеи

Зег 35

А1а

С1и

Ьеи

Агд

А1а 40

Зег

А1а

Ьеи

Зег

Туг 45

Зег

Зег

Уа1

Ьеи

Зег 50

ТНг

Ьеи

ТНг

С1у

С1и 55

С1и

Тгр

ΗΪ3

С1у

Рго 60

А1а

Зег

А1а

Зег

МеН 65

ТНг

А1а

А1а

А1а

А1а 70

Рго

Туг

Уа1

А1а

Тгр 75

МеН

Зег

Уа1

ТНг

А1а 80

Уа1

Агд

А1а

С1и

С1п 85

А1а

С1у

А1а

С1п

А1а 90

С1и

А1а

А1а

А1а

А1а 95

А1а

Туг

С1и

А1а

А1а 100

РНе

А1а

А1а

ТНг

Уа1 105

Рго

Рго

Рго

Уа1

11е но

С1и

А1а

Азп

Агд

А1а 115

С1п

Ьеи

МеН

А1а

Ьеи 120

11е

А1а

ТНг

Азп

Уа1 125

Ьеи

С1у

С1п

Азп

А1а 130

Рго

А1а

11е

А1а

А1а 135

ТНг

С1и

А1а

С1п

Туг 140

А1а

С1и

МеН

Тгр

Зег 145

С1п

Азр

А1а

МеН

А1а 150

МеН

Туг

С1у

Туг

А1а 155

С1у

А1а

Зег

А1а

А1а 160

- 74 029492

А1а

ТЬг С1п

Ьеи ТЬг 165

Рго

РЬе

ТЬг

С1и

Рго 170

Уа1

С1п

ТЬг

ТЬг

Азп 175

А1а

Зег

С1у

Ьеи

А1а

А1а

С1п

Зег

А1а

А1а

11е

А1а

ΗΪ3

А1а

ТЬг

С1у

А1а

180

185

190

Зег

А1а

С1у

А1а

С1п

С1п

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Зег

С1п

Ьеи

11е

А1а

А1а

11е

195

200

205

Рго

Зег

Уа1

Ьеи

С1п

С1у

Ьеи

Зег

Зег

Зег

ТЬг

А1а

А1а

ТЬг

РЬе

А1а

210

215

220

Зег

С1у

Рго

Зег

С1у

Ьеи

Ьеи

С1у

Не

Уа1

С1у

Зег

С1у

Зег

Зег

Тгр

225

230

235

240

Ьеи

Азр

Ьуз

Ьеи

Тгр

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Азп

Зег

Азп

РЬе

Тгр

Азп

245

250

255

ТЬг

Не

А1а

Зег

Зег

С1у

Ьеи

РЬе

Ьеи

Рго

Зег

Азп

ТЬг

11е

А1а

Рго

260

265

270

РЬе

Ьеи

С1у

Ьеи

Ьеи

С1у

С1у

Уа1

А1а

А1а

А1а

Азр

А1а

А1а

С1у

Азр

275

280

285

Уа1

Ьеи

С1у

С1и

А1а

ТЬг

Зег

С1у

С1у

Ьеи

С1у

С1у

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

290

295

300

Рго

Ьеи

С1у

Зег

А1а

С1у

С1у

Ьеи

С1у

С1у

ТЬг

Уа1

А1а

А1а

С1у

Ьеи

305

310

315

320

С1у

Азп

А1а

А1а

ТЬг

Уа1

С1у

ТЬг

Ьеи

Зег

Уа1

Рго

Рго

Зег

Тгр

ТЬг

325 330 335

А1а А1а А1а

<210> 19

<211> 109

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223>	усеченный по	Ν-концу	Εν1813	(35-	143)	без	сигнального	пептида
<400>	19
А1а Азп	. <31у Зег МеЬ	Зег <31и	Уа1 МеЬ	МеЬ	Зег	С1и	Не А1а О1у	Ьеи

- 75 029492

1	5	10	15
Рго Не Рго Рго	Не Не Шз Туг	С1у А1а Не А1а	Туг А1а Рго Зег
20		25	30
СЯу А1а Зег С1у	Ьуз А1а Тгр Шз	С1п Агд ТНг Рго	А1а Агд А1а С1и
35	40		45
С1п Уа1 А1а Ьеи	С1и Ьуз Суз С1у	Азр Ьуз ТНг Суз	Ьуз Уа1 Уа1 Зег
50	55	60
Агд РНе ТНг Агд	Суз С1у А1а Уа1	А1а Туг Азп СЯу	Зег Ьуз Туг С1п
65	70	75	80
СЯу СЯу ТНг СЯу	Ьеи ТНг Агд Агд	А1а А1а С1и Азр	Азр А1а Уа1 Азп
	85	90	95
Агд Ьеи С1и С1у	С1у Агд Не Уа1	Азп Тгр А1а Суз	Азп
100		105
<210> 20
<211> 286
<212> ПРТ
<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по Ν-концу Ад85В (40-325) без сигнального пептида

<400> 20

А1а РНе Зег Агд Рго С1у Ьеи Рго Уа1 С1и Туг Ьеи С1п Уа1 Рго Зег 15 10 15

Рго Зег Меб С1у Агд Азр Не Ьуз Уа1 С1п РНе С1п Зег <31у <31у Азп 20 25 30

Азп Зег Рго А1а Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр С1у Ьеи Агд А1а С1п Азр Азр 35 40 45

Туг Азп СЯу Тгр Азр 11е Азп ТНг Рго А1а РНе С1и Тгр Туг Туг <31п 50 55 60

Зег СЯу Ьеи Зег Не Уа1 Меб Рго Уа1 С1у С1у С1п Зег Зег РНе Туг 65 70 75 80

Зег Азр Тгр Туг Зег Рго А1а Суз С1у Ьуз А1а С1у Суз С1п ТНг Туг 85 90 95

76 029492

Ьуз

Тгр

С1и

ТНг 100

РНе

Ьеи

ТНг

Зег

С1и 105

Ьеи

Рго

С1п

Тгр

Ьеи но

Зег

А1а

Азп

Агд

А1а

Уа1

Ьуз

Рго

ТНг

С1у

Зег

А1а

А1а

11е

С1у

Ьеи

Зег

МеН

115

120

125

А1а

С1у

Зег

Зег

А1а

МеН

11е

Ьеи

А1а

А1а

Туг

ΗΪ3

Рго

С1п

С1п

РНе

130

135

140

11е

Туг

А1а

С1у

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Зег

С1п

С1у

МеН

145

150

155

160

С1у

Рго

Зег

Ьеи

11е

С1у

Ьеи

А1а

МеН

С1у

Азр

А1а

С1у

С1у

Туг

Ьуз

165

170

175

А1а

А1а

Азр

МеН

Тгр

С1у

Рго

Зег

Зег

Азр

Рго

А1а

Тгр

С1и

Агд

Азп

180

185

190

Азр

Рго

ТНг

С1п

С1п

11е

Рго

Ьуз

Ьеи

Уа1

А1а

Азп

Азп

ТНг

Агд

Ьеи

195

200

205

Тгр

Уа1

Туг

Суз

С1у

Азп

С1у

ТНг

Рго

Азп

С1и

Ьеи

С1у

С1у

А1а

Азп

210

215

220

11е

Рго

А1а

С1и

РНе

Ьеи

С1и

Азп

РНе

Уа1

Агд

Зег

Зег

Азп

Ьеи

Ьуз

225

230

235

240

РНе

С1п

Азр

А1а

Туг

Азп

А1а

А1а

С1у

С1у

ΗΪ3

Азп

А1а

Уа1

РНе

Азп

245

250

255

РНе

Рго

Рго

Азп

С1у

ТНг

ΗΪ3

Зег

Тгр

С1и

Туг

Тгр

С1у

А1а

С1п

Ьеи

260

265

270

Азп

А1а

МеН

Ьуз

С1у

Азр

Ьеи

С1п

Зег

Зег

Ьеи

С1у

А1а

С1у

275

280

285

<210> 21

<211> 313

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по С-концу (2-314) и мутированный Ώ265Ν Εν2029

<400> 21

ТНг <31и Рго А1а А1а Тгр Азр С1и С1у Ьуз Рго Агд Не 11е ТНг Ьеи 15 10 15

- 77 029492

ТНг МеН Азп Рго А1а Ьеи Азр Не ТНг ТНг Зег Уа1 Азр Уа1 Уа1 Агд 20 25 30

Рго ТНг <31и Ьуз МеН Агд Суз С1у А1а Рго Агд Туг Азр Рго С1у С1у 35 40 45

<31у <31у Не Азп Уа1 А1а Агд Не Уа1 Шз Уа1 Ьеи С1у С1у Суз Зег 50 55 60

ТНг А1а Ьеи РНе Рго А1а С1у С1у Зег ТНг С1у Зег Ьеи Ьеи МеН А1а 65 70 75 80

Ьеи Ьеи С1у Азр А1а С1у Уа1 Рго РНе Агд Уа1 Не Рго Не А1а А1а 85 90 95

Зег ТНг Агд С1и Зег РНе ТНг Уа1 Азп С1и Зег Агд ТНг А1а Ьуз С1п 100 105 110

Туг Агд РНе Уа1 Ьеи Рго С1у Рго Зег Ьеи ТНг Уа1 А1а С1и С1п С1и 115 120 125

С1п Суз Ьеи Азр С1и Ьеи Агд С1у А1а А1а А1а Зег А1а А1а РНе Уа1 130 135 140

Уа1 А1а Зег С1у Зег Ьеи Рго Рго С1у Уа1 А1а А1а Азр Туг Туг С1п 145 150 155 160

Агд Уа1 А1а Азр Не Суз Агд Агд Зег Зег ТНг Рго Ьеи Не Ьеи Азр 165 170 175

ТНг Зег С1у С1у С1у Ьеи С1п Шз Не Зег Зег С1у Уа1 РНе Ьеи Ьеи 180 185 190

Ьуз А1а Зег Уа1 Агд С1и Ьеи Агд С1и Суз Уа1 С1у Зег С1и Ьеи Ьеи 195 200 205

ТНг <31и Рго С1и С1п Ьеи А1а А1а А1а Шз С1и Ьеи Не Азр Агд С1у 210 215 220

Агд А1а С1и Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Зег Ьеи С1у Зег С1п С1у А1а Ьеи Ьеи 225 230 235 240

А1а ТНг Агд Шз А1а Зег Шз Агд РНе Зег Зег Не Рго МеН ТНг А1а 245 250 255

Уа1 Зег С1у Уа1 С1у А1а С1у Азп А1а МеН Уа1 А1а А1а Не ТНг Уа1

- 78 029492

260

270

265

<31у Ьеи Зег Агд <31у Тгр Зег Ьеи 11е Ьуз Зег Уа1 Агд Ьеи С1у Азп 275 280 285

А1а А1а С1у А1а А1а МеН Ьеи Ьеи ТНг Рго С1у ТНг А1а А1а Суз Азп 290 295 300

Агд Азр Азр Уа1 С1и Агд РНе РНе С1и 305 310

<210> 22

<211> 95

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> каталитический домен в Ερ£ϋ

<400> 22

11е Тгр Азр А1а 11е А1а СЛп Суз Ьуз Зег С1у С1у Азп Тгр А1а А1а 15 10 15

Азп ТНг С1у Азп С1у Ьеи Туг С1у С1у Ьеи С1п 11е Зег С1п А1а А1а 20 25 30

Тгр Азр Зег Азп С1у С1у Уа1 С1у Зег Рго А1а А1а А1а Зег Рго С1п 35 40 45

С1п С1п 11е С1и Уа1 А1а Азр Азп 11е Ме£ Ьуз ТНг А1а С1у Рго С1у 50 55 60

А1а Тгр Рго Ьуз Суз Зег Зег Суз Зег С1п С1у Азр А1а Рго Ьеи С1у 65 70 75 80

Зег Ьеи ТНг Шз 11е Ьеи ТНг РНе Ьеи А1а А1а С1и ТНг С1у С1у 85 90 95

<210> 23

<211> 65

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по С-концу Εν3407 (2-66)

<400> 23

Агд А1а ТНг Уа1 С1у Ьеи Уа1 С1и А1а 11е С1у 11е Агд С1и Ьеи Агд 15 10 15

- 79 029492

(31η Ηϊξ А1а Зег Агд Туг Ьеи А1а Агд Уа1 СЯи А1а СЯу СЯи СЯи Ьеи 20 25 30

СЯу Уа1 ТНг Азп Ьуз СЯу Агд Ьеи Уа1 А1а Агд Ьеи 11е Рго Уа1 СЯп 35 40 45

А1а А1а (31и Агд Зег Агд (31и А1а Ьеи 11е (31и Зег (31у Уа1 Ьеи 11е 50 55 60

Рго

65

<210> 24

<211> 352

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> усеченный по С-концу Εν3478 (2-353)

<400> 24

Уа1 Азр РНе СЯу А1а Ьеи Рго Рго СЯи 11е Азп Зег А1а Агд МеН Туг 15 10 15

А1а СЯу Рго СЯу Зег А1а Зег Ьеи Уа1 А1а А1а А1а Ьуз МеН Тгр Азр 20 25 30

Зег Уа1 А1а Зег Азр Ьеи РНе Зег А1а А1а Зег А1а РНе СЯп Зег Уа1 35 40 45

Уа1 Тгр СЯу Ьеи ТНг Уа1 СЯу Зег Тгр 11е СЯу Зег Зег А1а СЯу Ьеи 50 55 60

МеН А1а А1а А1а А1а Зег Рго Туг Уа1 А1а Тгр МеН Зег Уа1 ТНг А1а 65 70 75 80

СЯу СЯп А1а СЯп Ьеи ТНг А1а А1а СЯп Уа1 Агд Уа1 А1а А1а А1а А1а

85 90 95

Туг 61и ТНг А1а Туг Агд Ьеи ТНг Уа1 Рго Рго Рго Уа1 11е А1а СЯи 100 105 110

Азп Агд ТНг 61и Ьеи МеН ТНг Ьеи ТНг А1а ТНг Азп Ьеи Ьеи СЯу СЯп 115 120 125

Азп ТНг Рго А1а 11е СЯи А1а Азп СЯп А1а А1а Туг Зег О1п МеН Тгр

- 80 029492

130

135

140

С1у

С1п

Азр

А1а

С1и

А1а

МеН

Туг

С1у

Туг

А1а

А1а

ТНг

А1а

А1а

ТНг

145

150

155

160

А1а

ТНг

С1и

А1а

Ьеи

Ьеи

Рго

РНе

С1и

Азр

А1а

Рго

Ьеи

11е

ТНг

Азп

165

170

175

Рго

С1у

С1у

Ьеи

Ьеи

С1и

С1п

А1а

Уа1

А1а

Уа1

С1и

С1и

А1а

11е

Азр

180

185

190

ТНг

А1а

А1а

А1а

Азп

О1п

Ьеи

МеН

Азп

Азп

Уа1

Рго

О1п

А1а

Ьеи

О1п

195

200

205

С1п

Ьеи

А1а

С1п

Рго

А1а

С1п

С1у

Уа1

Уа1

Рго

Зег

Зег

Ьуз

Ьеи

С1у

210

215

220

С1у

Ьеи

Тгр

ТНг

А1а

Уа1

Зег

Рго

ΗΪ3

Ьеи

Зег

Рго

Ьеи

Зег

Азп

Уа1

225

230

235

240

Зег

Зег

11е

А1а

Азп

Азп

ΗΪ3

МеН

Зег

МеН

МеН

С1у

ТНг

С1у

Уа1

Зег

245

250

255

МеН

ТНг

Азп

ТНг

Ьеи

ΗΪ3

Зег

МеН

Ьеи

Ьуз

С1у

Ьеи

А1а

Рго

А1а

А1а

260

265

270

А1а

С1п

А1а

Уа1

С1и

ТНг

А1а

А1а

С1и

Азп

С1у

Уа1

Тгр

А1а

МеН

Зег

275

280

285

Зег

Ьеи

С1у

Зег

С1п

Ьеи

С1у

Зег

Зег

Ьеи

С1у

Зег

Зег

С1у

Ьеи

С1у

290

295

300

А1а

С1у

Уа1

А1а

А1а

Азп

Ьеи

С1у

Агд

А1а

А1а

Зег

Уа1

С1у

Зег

Ьеи

305

310

315

320

Зег

Уа1

Рго

Рго

А1а

Тгр

А1а

А1а

А1а

Азп

С1п

А1а

Уа1

ТНг

Рго

А1а

325

330

335

А1а

Агд

А1а

Ьеи

Рго

Ьеи

ТНг

Зег

Ьеи

ТНг

Зег

А1а

А1а

С1п

ТНг

А1а

340

345

350

<210> 25

<211> 8

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

<220>

- 81 029492

- 82 029492

Зег Рго А1а Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр С1у Ьеи Агд А1а С1п Азр Азр Туг 65 70 75 80

Азп <31у Тгр Азр Не Азп ТНг Рго А1а РНе С1и Тгр Туг Туг <31п Зег 85 90 95

С1у Ьеи Зег 11е Уа1 МеР Рго Уа1 С1у С1у С1п Зег Зег РНе Туг Зег 100 105 110

Азр Тгр Туг Зег Рго А1а Суз С1у Ьуз А1а С1у Суз С1п ТНг Туг Ьуз 115 120 125

Тгр С1и ТНг РНе Ьеи ТНг Зег С1и Ьеи Рго С1п Тгр Ьеи Зег А1а Азп 130 135 140

Агд А1а Уа1 Ьуз Рго ТНг С1у Зег А1а А1а 11е С1у Ьеи Зег МеР А1а 145 150 155 160

С1у Зег Зег А1а МеР 11е Ьеи А1а А1а Туг Шз Рго С1п С1п РНе 11е 165 170 175

Туг А1а С1у Зег Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи Азр Рго Зег С1п С1у МеР <31у 180 185 190

Рго Зег Ьеи 11е С1у Ьеи А1а МеР С1у Азр А1а С1у С1у Туг Ьуз А1а 195 200 205

А1а Азр МеР Тгр С1у Рго Зег Зег Азр Рго А1а Тгр С1и Агд Азп Азр 210 215 220

Рго ТНг С1п С1п 11е Рго Ьуз Ьеи Уа1 А1а Азп Азп ТНг Агд Ьеи Тгр 225 230 235 240

Уа1 Туг Суз С1у Азп С1у ТНг Рго Азп С1и Ьеи С1у С1у А1а Азп 11е 245 250 255

Рго А1а С1и РНе Ьеи С1и Азп РНе Уа1 Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РНе 260 265 270

<31п Азр А1а Туг Азп А1а А1а С1у С1у Шз Азп А1а Уа1 РНе Азп РНе 275 280 285

Рго Рго Азп С1у ТНг Шз Зег Тгр С1и Туг Тгр С1у А1а С1п Ьеи Азп 290 295 300

- 83 029492

А1а МеР Ьуз С1у Азр Ьеи С1п Зег Зег Ьеи С1у А1а С1у Зег <31п 11е 305 310 315 320

МеР Туг Азп Туг Рго А1а Мер Ьеи С1у Шз А1а С1у Азр Мер А1а С1у 325 330 335

Туг А1а <31у ТНг Ьеи С1п Зег Ьеи С1у А1а С1и 11е А1а Уа1 С1и С1п 340 345 350

А1а А1а Ьеи С1п Зег А1а Тгр С1п С1у Азр ТНг <31у 11е ТНг Туг <31п 355 360 365

А1а Тгр <31п А1а С1п Тгр Азп С1п А1а МеР С1и Азр Ьеи Уа1 Агд А1а 370 375 380

Туг Шз А1а МеР Зег Зег ТНг Шз С1и А1а Азп ТНг МеР А1а МеР МеР 385 390 395 400

А1а Агд Азр ТНг А1а С1и А1а А1а Ьуз Тгр <31у <31у ТНг <31и С1п С1п 405 410 415

Тгр Азп РНе А1а С1у 11е С1и А1а А1а А1а Зег А1а 11е С1п С1у Азп 420 425 430

Уа1 ТНг Зег 11е Шз Зег Ьеи Ьеи Азр С1и С1у Ьуз С1п Зег Ьеи ТНг 435 440 445

Ьуз Ьеи А1а А1а А1а Тгр <31у С1у Зег <31у Зег <31и А1а Туг <31п С1у 450 455 460

Уа1 С1п <31п Ьуз Тгр Азр А1а ТНг А1а ТНг <31и Ьеи Азп Азп А1а Ьеи 465 470 475 480

<31п Азп Ьеи А1а Агд ТНг 11е Зег <31и А1а С1у С1п А1а МеР А1а Зег 485 490 495

ТНг <31и <31у Азп Уа1 ТНг <31у МеР РНе А1а С1и С1п Ьуз Ьеи 11е Зег 500 505 510

<31и С1и Азр Ьеи Зег Туг Уа1 Ьеи Ьеи Зег А1а С1у А1а Ьеи ТНг А1а 515 520 525

Ьеи МеР Ьеи 11е 11е РНе Ьеи МеР ТНг Суз Суз Агд Агд Уа1 Азп Агд 530 535 540

Зег <31и Рго ТНг <31п Шз Азп Ьеи Агд С1у ТНг С1у Агд С1и Уа1 Зег

- 84 029492

545 550 555 560

Уа1 ТНг Рго (Пп Зег (Пу Ьуз 11е 11е Зег Зег Тгр <31и Зег Ηίδ Ьуз 565 570 575

Зег (Пу СПу СПи ТНг Агд Ьеи Ηίδ Ηίδ Шз Шз Шз Шз 580 585

<210> 29

<211> 500

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "Р1ад-Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТб-Мус-Шз Над"

<400> 29

МеН 1

Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз А1а

РНе

Зег Агд

Рго

(Пу 15

Ьеи

5

10

Рго

Уа1

(Пи

Туг

Ьеи

(Пп

Уа1

Рго

Зег

Рго

Зег

МеН

(Пу

Агд

Азр

11е

20

25

30

Ьуз

Уа1

(Пп

РНе

(Пп

Зег

(Пу

(Пу

Азп

Азп

Зег

Рго

А1а

Уа1

Туг

Ьеи

35

40

45

Ьеи

Азр

(Пу

Ьеи

Агд

А1а

(Пп

Азр

Азр

Туг

Азп

(Пу

Тгр

Азр

11е

Азп

50

55

60

ТНг

Рго

А1а

РНе

(Пи

Тгр

Туг

Туг

(Пп

Зег

(Пу

Ьеи

Зег

11е

Уа1

МеН

65

70

75

80

Рго

Уа1

(Пу

(Пу

(Пп

Зег

Зег

РНе

Туг

Зег

Азр

Тгр

Туг

Зег

Рго

А1а

85

90

95

Суз

(Пу

Ьуз

А1а

(Пу

Суз

(Пп

ТНг

Туг

Ьуз

Тгр

(Пи

ТНг

РНе

Ьеи

ТНг

100

105

110

Зег

(Пи

Ьеи

Рго

(Пп

Тгр

Ьеи

Зег

А1а

Азп

Агд

А1а

Уа1

Ьуз

Рго

ТНг

115

120

125

(Пу

Зег

А1а

А1а

11е

(Пу

Ьеи

Зег

МеН

А1а

(Пу

Зег

Зег

А1а

МеН

11е

130

135

140

Ьеи

А1а

А1а

Туг

ΗΪ3

Рго

(Пп

(Пп

РНе

11е

Туг

А1а

(Пу

Зег

Ьеи

Зег

145

150

155

160

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Зег

(Пп

(Пу

МеН

(Пу

Рго

Зег

Ьеи

11е

(Пу

Ьеи

- 85 029492

- 86 029492

Ьеи

Ьеи

Азр

(Ли 420

(Лу Ьуз

(Лп

Зег Ьеи ТНг 425

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а 430

А1а

Тгр

(Лу

(Лу

Зег

(Лу

Зег

(Ли

А1а

Туг

(Лп

(Лу

Уа1

(Лп

(Лп

Ьуз

Тгр

Азр

435

440

445

А1а

ТНг

А1а

ТНг

(Ли

Ьеи

Азп

Азп

А1а

Ьеи

(Лп

Азп

Ьеи

А1а

Агд

ТНг

450

455

460

11е

Зег

(Ли

А1а

(Лу

(Лп

А1а

Мер

А1а

Зег

ТНг

(Ли

(Лу

Азп

Уа1

ТНг

465

470

475

480

(Лу

Мер

РНе

А1а

(Ли

(Лп

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

(Ли

(Ли

Азр

Ьеи

ΗΪ3

ΗΪ3

485

490

495

ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 ΗΪ3 500

<210> 30

<211> 463

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "33-Р1ад-КРРВ-ОНуЬ-Мус-ТМ-Н1з Рад"

<400> 30

Мер Уа1 Рго (Лп А1а Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Рго	Ьеи Ьеи (Лу РНе Зег Ьеи
1	5	10	15

Суз РНе (Лу Ьуз РНе Рго 11е Азр Туг Ьуз	Азр Азр Азр Азр Ьуз ТНг
20	25	30

Уа1 Азр (Лу ТНг 35

А1а Мер Агд Уа1 40

ТНг ТНг Мер Ьуз

Зег Агд Уа1 11е 45

Азр 11е Уа1 (Ли 50

(Ли Азп (Лу РНе 55

Зег Уа1 Азр Азр 60

Агд Азр Азр Ьеи

Туг Рго А1а А1а 65

С1у Уа1 С1п Уа1 70

Шз Азр А1а Азр 75

ТНг 11е Уа1 Ьеи 80

Агд Агд Зег Агд

Рго Ьеи С1п 11е 85

Зег Ьеи Азр (Лу 90

Шз Азр А1а Ьуз 95

(Лп Уа1 Тгр ТНг 100

ТНг А1а Зег ТНг

Уа1 Азр (Ли А1а 105

Ьеи А1а (Лп Ьеи 110

- 87 029492

А1а МеЕ ТНг Азр ТНг А1а Рго А1а А1а А1а Зег Агд А1а Зег Агд Уа1 115 120 125

Рго Ьеи Зег <31у МеЕ А1а Ьеи Рго Уа1 Уа1 Зег А1а Ьуз ТНг Уа1 <31п 130 135 140

Ьеи Азп Азр <31у <31у Ьеи Уа1 Агд ТНг Уа1 Шз Ьеи Рго А1а Рго Азп 145 150 155 160

Уа1 А1а <31у Ьеи Ьеи Зег А1а А1а <31у Уа1 Рго Ьеи Ьеи <31п Зег Азр 165 170 175

Шз Уа1 Уа1 Рго А1а А1а ТНг А1а Рго 11е Уа1 <31и <31у МеЕ <31п 11е 180 185 190

<31п Уа1 ТНг Агд Азп Агд 11е Ьуз Ьуз Уа1 ТНг <31и Агд Ьеи Рго Ьеи 195 200 205

Рго Рго Азп А1а Агд Агд Уа1 <31и Азр Рго <31и МеЕ Азп МеЕ Зег Агд 210 215 220

<31и Уа1 Уа1 <31и Азр Рго <31у Уа1 Рго <31у ТНг <31п Азр Уа1 ТНг РНе 225 230 235 240

А1а Уа1 А1а <31и Уа1 Азп <31у Уа1 <31и ТНг <31у Агд Ьеи Рго Уа1 А1а 245 250 255

Азп Уа1 Уа1 Уа1 ТНг Рго А1а Шз <31и А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 <31у ТНг 260 265 270

Ьуз Рго <31у ТНг <31и Уа1 Рго Рго Уа1 11е Азр <31у Зег 11е Тгр Азр 275 280 285

А1а 11е А1а <31п Суз Ьуз Зег С1у С1у Азп Тгр А1а А1а Азп ТНг <31у 290 295 300

Азп <31у Ьеи Туг <31у <31у Ьеи С1п 11е Зег С1п А1а А1а Тгр Азр Зег 305 310 315 320

Азп <31у <31у Уа1 С1у Зег Рго А1а А1а А1а Зег Рго С1п <31п С1п 11е 325 330 335

С1и Уа1 А1а Азр Азп 11е МеЕ Ьуз ТНг А1а С1у Рго С1у А1а Тгр Рго 340 345 350

- 88 029492

Ьуз

Суз

Зег 355

Зег

Суз

Зег

СПп

С1у 360

Азр

А1а

Рго

Ьеи

(Пу 365

Зег

Ьеи

ТНг

ΗΪ3

11е 370

Ьеи

ТНг

РНе

Ьеи

А1а 375

А1а

С1и

ТНг

(Пу

(Пу 380

(Пи

С1п

Ьуз

Ьеи

11е 385

Зег

(Пи

(Пи

Азр

Ьеи 390

Зег

Туг

Уа1

Ьеи

Ьеи 395

Зег

А1а

(Пу

ТНг

Ьеи 400

11е

А1а

Ьеи

МеН

Ьеи 405

11е

11е

РНе

Ьеи

11е 410

ТНг

Суз

Суз

Ьуз

Агд 415

Уа1

Азр

Агд

Рго

(Пи 420

Зег

ТНг

С1п

Агд

Зег 425

Ьеи

Агд

(Пу

ТНг

(Пу 430

Агд

Азп

Уа1

Зег

Уа1 435

ТНг

Зег

С1п

Зег

С1у 440

Ьуз

РНе

Ые

Зег

Зег 445

Тгр

(Пи

Зег

ΗΪ3

Ьуз

Зег

(Пу

(Пу

С1и

ТНг

Агд

Ьеи

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

Шз

ΗΪ3

ΗΪ3

450 455 460

<210> 31

<211> 374

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность <220>

<223>	гибрид "Р1ад-КРРВ-ОНуЪ-Мус-Шз Над"
<400>	31
МеН Азр 1	Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз ТНг Уа1 Азр (Пу ТНг А1а МеН 5 10 15
Агд Уа1	ТНг ТНг МеН Ьуз Зег Агд Уа1 Ые Азр Ые Уа1 С1и С1и Азп 20 25 30
(Пу РНе	Зег Уа1 Азр Азр Агд Азр Азр Ьеи Туг Рго А1а А1а (Пу Уа1 35 40 45
(Пп Уа1 50	Шз Азр А1а Азр ТНг Ые Уа1 Ьеи Агд Агд Зег Агд Рго Ьеи 55 60
С1п Ые 65	Зег Ьеи Азр (Пу Шз Азр А1а Ьуз (Пп Уа1 Тгр ТНг ТНг А1а 70 75 80
Зег ТНг	Уа1 Азр (Ли А1а Ьеи А1а (Пп Ьеи А1а МеН ТНг Азр ТНг А1а 85 90 95

- 89 029492

Рго А1а А1а А1а Зег Агд А1а Зег Агд Уа1 Рго Ьеи Зег <31у МеН А1а 100 105 110

Ьеи Рго Уа1 Уа1 Зег А1а Ьуз ТНг Уа1 С1п Ьеи Азп Азр С1у С1у Ьеи 115 120 125

Уа1 Агд ТНг Уа1 Шз Ьеи Рго А1а Рго Азп Уа1 А1а С1у Ьеи Ьеи Зег 130 135 140

А1а А1а С1у Уа1 Рго Ьеи Ьеи С1п Зег Азр Шз Уа1 Уа1 Рго А1а А1а 145 150 155 160

ТНг А1а Рго 11е Уа1 С1и С1у МеН С1п 11е С1п Уа1 ТНг Агд Азп Агд 165 170 175

11е Ьуз Ьуз Уа1 ТНг <31и Агд Ьеи Рго Ьеи Рго Рго Азп А1а Агд Агд 180 185 190

Уа1 <31и Азр Рго С1и МеН Азп МеН Зег Агд <31и Уа1 Уа1 С1и Азр Рго 195 200 205

<31у Уа1 Рго С1у ТНг <31п Азр Уа1 ТНг РНе А1а Уа1 А1а С1и Уа1 Азп 210 215 220

<31у Уа1 С1и ТНг <31у Агд Ьеи Рго Уа1 А1а Азп Уа1 Уа1 Уа1 ТНг Рго 225 230 235 240

А1а Шз С1и А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 С1у ТНг Ьуз Рго С1у ТНг <31и Уа1 245 250 255

Рго Рго Уа1 11е Азр С1у Зег 11е Тгр Азр А1а 11е А1а <31п Суз Ьуз 260 265 270

Зег <31у С1у Азп Тгр А1а А1а Азп ТНг С1у Азп С1у Ьеи Туг С1у С1у 275 280 285

Ьеи <31п 11е Зег С1п А1а А1а Тгр Азр Зег Азп С1у С1у Уа1 С1у Зег 290 295 300

Рго А1а А1а А1а Зег Рго С1п С1п С1п 11е С1и Уа1 А1а Азр Азп 11е 305 310 315 320

МеН Ьуз ТНг А1а С1у Рго С1у А1а Тгр Рго Ьуз Суз Зег Зег Суз Зег 325 330 335

- 90 029492

С1п С1у Азр

А1а Рго 340

Ьеи

С1у

Зег

Ьеи 345

ТЬг

Шз

11е

Ьеи

ТЬг 350

РЬе

Ьеи

А1а А1а С1и 355

ТЬг С1у

С1у

С1и

С1п 360

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

С1и 365

С1и

Азр

Ьеи

Шз Шз Шз 370

Шз Шз

Шз

<210> 32 <211> 938 <212> ПРТ <213> искусственная

: последовательность

<220>

<223> гибрид "33-Р1ад-КРРВ-ОЬуЬ-Ад85В*-ТВЮ.4-ЕЗАТ6-Мус-ТМ-Шз бад"

<400> 32

Меб Уа1 Рго С1п А1а Ьеи Ьеи Ьеи Уа1 Рго Ьеи Ьеи С1у РЬе Зег Ьеи 15 10 15

Суз РЬе С1у Ьуз РЬе Рго 11е Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз ТЬг 20 25 30

Уа1 Азр С1у ТЬг А1а Меб Агд Уа1 ТЬг ТЬг Меб Ьуз Зег Агд Уа1 11е 35 40 45

Азр 11е Уа1 С1и С1и Азп С1у РЬе Зег Уа1 Азр Азр Агд Азр Азр Ьеи 50 55 60

Туг Рго А1а А1а С1у Уа1 С1п Уа1 Шз Азр А1а Азр ТЬг 11е Уа1 Ьеи 65 70 75 80

- 91

029492

Уа1 А1а СЯу Ьеи Ьеи Зег А1а А1а СЯу Уа1 Рго Ьеи Ьеи СЯп Зег Азр 165 170 175

Шз Уа1 Уа1 Рго А1а А1а ТНг А1а Рго 11е Уа1 СЯи СЯу МеН СЯп 11е 180 185 190

СЯп Уа1 ТНг Агд Азп Агд 11е Ьуз Ьуз Уа1 ТНг О1и Агд Ьеи Рго Ьеи 195 200 205

Рго Рго Азп А1а Агд Агд Уа1 СЯи Азр Рго СЯи МеН Азп МеН Зег Агд 210 215 220

СЯи Уа1 Уа1 СЯи Азр Рго СЯу Уа1 Рго СЯу ТНг О1п Азр Уа1 ТНг РНе 225 230 235 240

А1а Уа1 А1а СЯи Уа1 Азп СЯу Уа1 СЯи ТНг СЯу Агд Ьеи Рго Уа1 А1а 245 250 255

Азп Уа1 Уа1 Уа1 ТНг Рго А1а Шз СЯи А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 СЯу ТНг 260 265 270

Ьуз Рго СЯу ТНг 61и Уа1 Рго Рго Уа1 11е Азр СЯу Зег 11е Тгр Азр 275 280 285

А1а 11е А1а С1п Суз Ьуз Зег С1у С1у Азп Тгр А1а А1а Азп ТНг <31у 290 295 300

Азп СЯу Ьеи Туг СЯу СЯу Ьеи СЯп 11е Зег СЯп А1а А1а Тгр Азр Зег 305 310 315 320

Азп СЯу СЯу Уа1 СЯу Зег Рго А1а А1а А1а Зег Рго СЯп СЯп СЯп 11е 325 330 335

СЯи Уа1 А1а Азр Азп 11е МеН Ьуз ТНг А1а СЯу Рго СЯу А1а Тгр Рго 340 345 350

Ьуз Суз Зег Зег Суз Зег 61п СЯу Азр А1а Рго Ьеи СЯу Зег Ьеи ТНг 355 360 365

Шз 11е Ьеи ТНг РНе Ьеи А1а А1а СЯи ТНг СЯу СЯу А1а РНе Зег Агд 370 375 380

Рго СЯу Ьеи Рго Уа1 СЯи Туг Ьеи СЯп Уа1 Рго Зег Рго Зег МеН СЯу 385 390 395 400

Агд Азр 11е Ьуз Уа1 СЯп РНе СЯп Зег СЯу СЯу Азп Азп Зег Рго А1а

- 92 029492

- 93 029492

О1у Азр Ьеи <31п Зег Зег Ьеи О1у А1а О1у Зег <31п 11е МеЬ Туг Азп 660 665 670

Туг Рго А1а МеЬ Ьеи О1у Шз А1а О1у Азр МеЬ А1а О1у Туг А1а О1у 675 680 685

ТНг Ьеи С1п Зег Ьеи С1у А1а С1и 11е А1а Уа1 С1и С1п А1а А1а Ьеи 690 695 700

<31п Зег А1а Тгр <31п <31у Азр ТНг <31у 11е ТНг Туг <31п А1а Тгр <31п 705 710 715 720

А1а <31п Тгр Азп <31п А1а МеЬ <31и Азр Ьеи Уа1 Агд А1а Туг Шз А1а 725 730 735

МеЬ Зег Зег ТНг Шз <31и А1а Азп ТНг МеЬ А1а МеЬ МеЬ А1а Агд Азр 740 745 750

ТНг А1а <31и А1а А1а Ьуз Тгр <31у <31у ТНг <31и <31п <31п Тгр Азп РНе 755 760 765

А1а <31у 11е <31и А1а А1а А1а Зег А1а 11е <31п <31у Азп Уа1 ТНг Зег 770 775 780

11е Шз Зег Ьеи Ьеи Азр <31и <31у Ьуз <31п Зег Ьеи ТНг Ьуз Ьеи А1а 785 790 795 800

А1а А1а Тгр <31у <31у Зег <31у Зег <31и А1а Туг <31п <31у Уа1 <31п <31п 805 810 815

Ьуз Тгр Азр А1а ТНг А1а ТНг <31и Ьеи Азп Азп А1а Ьеи <31п Азп Ьеи 820 825 830

А1а Агд ТНг 11е Зег <31и А1а <31у <31п А1а МеЬ А1а Зег ТНг <31и О1у 835 840 845

Азп Уа1 ТНг С1у МеЬ РНе А1а <31и <31п Ьуз Ьеи 11е Зег <31и <31и Азр 850 855 860

Ьеи Зег Туг Уа1 Ьеи Ьеи Зег А1а <31у ТНг Ьеи 11е А1а Ьеи МеЬ Ьеи 865 870 875 880

11е 11е РНе Ьеи 11е ТНг Суз Суз Ьуз Агд Уа1 Азр Агд Рго С1и Зег 885 890 895

- 94 029492

ТНг (31η Агд Зег Ьеи Агд <31у ТНг <31у Агд Азп Уа1 Зег Уа1 ТНг Зег 900 905 910

(31п Зег <31у Ьуз РНе Не Зег Зег Тгр <31и Зег Шз Ьуз Зег <31у <31у 915 920 925

<31и ТНг Агд Ьеи Шз Шз Шз Шз Шз Шз 930 935

<210> 33

<211> 849

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "Р1ад-КРРВ-ОНуЬ-Ад85В*-ТВЮ . 4-ЕЗАТб-Мус-Шз Над"

<400> 33

МеН Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр 1 5

Ьуз ТНг Уа1 Азр С1у ТНг А1а МеН 10 15

Агд Уа1 ТНг ТНг МеН Ьуз Зег Агд 20

Уа1 11е Азр 11е Уа1 <31и <31и Азп 25 30

<31у РНе Зег Уа1 Азр Азр Агд Азр 35 40

Азр Ьеи Туг Рго А1а А1а <31у Уа1 45

<31п Уа1 Шз Азр А1а Азр ТНг 11е 50 55

Уа1 Ьеи Агд Агд Зег Агд Рго Ьеи 60

<31п 11е Зег Ьеи Азр <31у Шз Азр 65 70

А1а Ьуз <31п Уа1 Тгр ТНг ТНг А1а 75 80

Зег ТНг Уа1 Азр <31и А1а Ьеи А1а 85

<31п Ьеи А1а МеН ТНг Азр ТНг А1а 90 95

Рго А1а А1а А1а Зег Агд А1а Зег 100

Агд Уа1 Рго Ьеи Зег <31у МеН А1а 105 110

Ьеи Рго Уа1 Уа1 Зег А1а Ьуз ТНг 115 120

Уа1 <31п Ьеи Азп Азр <31у <31у Ьеи 125

Уа1 Агд ТНг Уа1 Шз Ьеи Рго А1а 130 135

Рго Азп Уа1 А1а <31у Ьеи Ьеи Зег 140

А1а А1а (31у Уа1 Рго Ьеи Ьеи (31п 145 150

Зег Азр Шз Уа1 Уа1 Рго А1а А1а 155 160

- 95 029492

ТНг А1а Рго 11е Уа1 С1и С1у МеН С1п 11е С1п Уа1 ТНг Агд Азп Агд 165 170 175

11е Ьуз Ьуз Уа1 ТНг <31и Агд Ьеи Рго Ьеи Рго Рго Азп А1а Агд Агд 180 185 190

Уа1 С1и Азр Рго С1и МеН Азп МеН Зег Агд <31и Уа1 Уа1 С1и Азр Рго 195 200 205

<31у Уа1 Рго С1у ТНг <31п Азр Уа1 ТНг РНе А1а Уа1 А1а С1и Уа1 Азп 210 215 220

<31у Уа1 С1и ТНг <31у Агд Ьеи Рго Уа1 А1а Азп Уа1 Уа1 Уа1 ТНг Рго 225 230 235 240

А1а Шз С1и А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 С1у ТНг Ьуз Рго С1у ТНг <31и Уа1 245 250 255

Рго Рго Уа1 11е Азр С1у Зег 11е Тгр Азр А1а 11е А1а С1п Суз Ьуз 260 265 270

Зег <31у <31у Азп Тгр А1а А1а Азп ТНг <31у Азп <31у Ьеи Туг <31у <31у 275 280 285

Ьеи С1п 11е Зег <31п А1а А1а Тгр Азр Зег Азп <31у <31у Уа1 С1у Зег 290 295 300

Рго А1а А1а А1а Зег Рго С1п С1п <31п 11е С1и Уа1 А1а Азр Азп 11е 305 310 315 320

МеН Ьуз ТНг А1а С1у Рго С1у А1а Тгр Рго Ьуз Суз Зег Зег Суз Зег 325 330 335

С1п С1у Азр А1а Рго Ьеи С1у Зег Ьеи ТНг Шз 11е Ьеи ТНг РНе Ьеи 340 345 350

А1а А1а С1и ТНг С1у С1у А1а РНе Зег Агд Рго С1у Ьеи Рго Уа1 С1и 355 360 365

Туг Ьеи С1п Уа1 Рго Зег Рго Зег МеН С1у Агд Азр 11е Ьуз Уа1 С1п 370 375 380

РНе С1п Зег С1у С1у Азп Азп Зег Рго А1а Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр С1у 385 390 395 400

- 96 029492

Ьеи Агд А1а <31п Азр Азр Туг Азп 405

СЯу Тгр Азр 11е Азп ТНг Рго А1а 410 415

РНе С1и Тгр Туг Туг <31п Зег <31у 420

Ьеи Зег 11е Уа1 Меб Рго Уа1 С1у 425 430

СЯу <31п Зег Зег РНе Туг Зег Азр 435 440

Тгр Туг Зег Рго А1а Суз С1у Ьуз 445

А1а С1у Суз С1п ТНг Туг Ьуз Тгр 450 455

С1и ТНг РНе Ьеи ТНг Зег С1и Ьеи 460

Рго С1п Тгр Ьеи Зег А1а Азп Агд 465 470

А1а Уа1 Ьуз Рго ТНг С1у Зег А1а 475 480

А1а 11е СЯу Ьеи Зег Меб А1а СЯу 485

Зег Зег А1а Меб 11е Ьеи А1а А1а 490 495

Туг Шз Рго С1п С1п РНе 11е Туг 500

А1а СЯу Зег Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи 505 510

Азр Рго Зег СЯп СЯу Меб СЯу Рго 515 520

Зег Ьеи 11е С1у Ьеи А1а Меб С1у 525

Азр А1а СЯу СЯу Туг Ьуз А1а А1а 530 535

Азр Меб Тгр СЯу Рго Зег Зег Азр 540

Рго А1а Тгр СЯи Агд Азп Азр Рго 545 550

ТНг СЯп СЯп 11е Рго Ьуз Ьеи Уа1 555 560

А1а Азп Азп ТНг Агд Ьеи Тгр Уа1 565

Туг Суз СЯу Азп СЯу ТНг Рго Азп 570 575

С1и Ьеи С1у С1у А1а Азп 11е Рго 580

А1а СЯи РНе Ьеи СЯи Азп РНе Уа1 585 590

Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РНе СЯп 595 600

Азр А1а Туг Азп А1а А1а СЯу СЯу 605

Шз Азп А1а Уа1 РНе Азп РНе Рго 610 615

Рго Азп СЯу ТНг Шз Зег Тгр С1и 620

Туг Тгр СЯу А1а С1п Ьеи Азп А1а 625 630

Меб Ьуз С1у Азр Ьеи С1п Зег Зег 635 640

- 97 029492

Ьеи

С1у

А1а

С1у

Зег 645

С1п

11е

МеН

Туг

Азп 650

Туг

Рго

А1а

МеН

Ьеи 655

С1у

ΗΪΞ

А1а

С1у

Азр 660

МеН

А1а

С1у

Туг

А1а 665

С1у

ТНг

Ьеи

С1п

Зег 670

Ьеи

С1у

А1а

С1и

11е 675

А1а

Уа1

С1и

С1п

А1а 680

А1а

Ьеи

С1п

Зег

А1а 685

Тгр

С1п

С1у

Азр

ТНг 690

С1у

11е

ТНг

Туг

С1п 695

А1а

Тгр

С1п

А1а

С1п 700

Тгр

Азп

С1п

А1а

МеН 705

С1и

Азр

Ьеи

Уа1

Агд 710

А1а

Туг

ΗΪ3

А1а

МеН 715

Зег

Зег

ТНг

ΗΪ3

С1и 720

А1а

Азп

ТНг

МеН

А1а 725

МеН

МеН

А1а

Агд

Азр 730

ТНг

А1а

С1и

А1а

А1а 735

Ьуз

Тгр

С1у

С1у

ТНг 740

С1и

С1п

С1п

Тгр

Азп 745

РНе

А1а

С1у

11е

С1и 750

А1а

А1а

А1а

Зег

А1а 755

11е

С1п

С1у

Азп

Уа1 760

ТНг

Зег

11е

ΗΪ3

Зег 765

Ьеи

Ьеи

Азр

С1и

С1у 770

Ьуз

С1п

Зег

Ьеи

ТНг 775

Ьуз

Ьеи

А1а

А1а

А1а 780

Тгр

С1у

С1у

Зег

С1у 785

Зег

С1и

А1а

Туг

С1п 790

С1у

Уа1

С1п

С1п

Ьуз 795

Тгр

Азр

А1а

ТНг

А1а 800

ТНг

С1и

Ьеи

Азп

Азп 805

А1а

Ьеи

С1п

Азп

Ьеи 810

А1а

Агд

ТНг

11е

Зег 815

С1и

А1а

С1у

С1п

А1а 820

МеН

А1а

Зег

ТНг

С1и 825

С1у

Азп

Уа1

ТНг

С1у 830

МеН

РНе

А1а

С1и

С1п 835

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

С1и 840

С1и

Азр

Ьеи

ΗΪ3

ΗΪ3 845

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

<210> 34

<211> 1198

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

- 98 029492

<220>

<223> гибрид " 33 - Р1ад-ΕνΟ 5 6 9 - Ενί 813 * - Εν3 4 0 7 - Εν3 4 7 8 - Ενί 8 0 7 - Мус - ТМ-Ш з Рад"

<400> 34

МеР Уа1 Рго 01η А1а Ьеи Ьеи РНе Уа1 Рго Ьеи Ьеи Уа1 РНе Рго Ьеи 15 10 15

Суз РНе С1у Ьуз РНе Рго 11е Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз Ьуз 20 25 30

А1а Ьуз Уа1 С1у Азр Тгр Ьеи Уа1 11е Ьуз С1у А1а ТНг 11е Азр С1п 35 40 45

Рго Азр Шз Агд С1у Ьеи 11е 11е С1и Уа1 Агд Зег Зег Азр С1у Зег 50 55 60

Рго Рго Туг Уа1 Уа1 Агд Тгр Ьеи С1и ТНг Азр Шз Уа1 А1а ТНг Уа1 65 70 75 80

11е Рго С1у Рго Азр А1а Уа1 Уа1 Уа1 ТНг А1а С1и С1и С1п Азп А1а 85 90 95

А1а Азр С1и Агд А1а (31η Шз Агд РНе С1у А1а Уа1 С1п Зег А1а 11е 100 105 110

Ьеи Шз А1а Агд С1у ТНг А1а Азп С1у Зег МеН Зег С1и Уа1 МеН МеН 115 120 125

Зег С1и 11е А1а С1у Ьеи Рго 11е Рго Рго 11е 11е Шз Туг С1у А1а 130 135 140

11е А1а Туг А1а Рго Зег С1у А1а Зег С1у Ьуз А1а Тгр Шз С1п Агд 145 150 155 160

ТНг Рго А1а Агд А1а <31и С1п Уа1 А1а Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Азр Ьуз 165 170 175

ТНг Суз Ьуз Уа1 Уа1 Зег Агд РНе ТНг Агд Суз С1у А1а Уа1 А1а Туг 180 185 190

Азп С1у Зег Ьуз Туг <31п С1у С1у ТНг С1у Ьеи ТНг Агд Агд А1а А1а 195 200 205

(31и Азр Азр А1а Уа1 Азп Агд Ьеи (31и С1у С1у Агд 11е Уа1 Азп Тгр 210 215 220

- 99

029492

А1а Суз Азп Агд А1а ТНг Уа1 С1у Ьеи Уа1 С1и А1а Не С1у Не Агд 225 230 235 240

С1и Ьеи Агд С1п Шз А1а Зег Агд Туг Ьеи А1а Агд Уа1 С1и А1а С1у 245 250 255

С1и С1и Ьеи С1у Уа1 ТНг Азп Ьуз С1у Агд Ьеи Уа1 А1а Агд Ьеи Не 260 265 270

Рго Уа1 С1п А1а А1а С1и Агд Зег Агд С1и А1а Ьеи Не С1и Зег С1у 275 280 285

Уа1 Ьеи Не Рго А1а Агд Агд Рго С1п Азп Ьеи Ьеи Азр Уа1 ТНг А1а 290 295 300

С1и Рго А1а Агд С1у Агд Ьуз Агд ТНг Ьеи Зег Азр Уа1 Ьеи Азп С1и 305 310 315 320

МеР Агд Азр С1и С1п Уа1 Азр РНе С1у А1а Ьеи Рго Рго С1и Не Азп 325 330 335

Зег А1а Агд МеР Туг А1а С1у Рго С1у Зег А1а Зег Ьеи Уа1 А1а А1а 340 345 350

А1а Ьуз МеР Тгр Азр Зег Уа1 А1а Зег Азр Ьеи РНе Зег А1а А1а Зег 355 360 365

А1а РНе С1п Зег Уа1 Уа1 Тгр С1у Ьеи ТНг Уа1 С1у Зег Тгр Не С1у 370 375 380

Зег Зег А1а С1у Ьеи МеР А1а А1а А1а А1а Зег Рго Туг Уа1 А1а Тгр 385 390 395 400

МеР Зег Уа1 ТНг А1а С1у С1п А1а С1п Ьеи ТНг А1а А1а С1п Уа1 Агд 405 410 415

Уа1 А1а А1а А1а А1а Туг С1и ТНг А1а Туг Агд Ьеи ТНг Уа1 Рго Рго 420 425 430

Рго Уа1 Не А1а <31и Азп Агд ТНг <31и Ьеи МеР ТНг Ьеи ТНг А1а ТНг 435 440 445

Азп Ьеи Ьеи С1у С1п Азп ТНг Рго А1а Не С1и А1а Азп С1п А1а А1а 450 455 460

- 100 029492

- 101 029492

705 710 715 720

ТНг Ьеи Рго Рго <31и 11е Азп Зег А1а Агд МеН Туг Зег <31у А1а <31у 725 730 735

Зег А1а Рго МеН Ьеи А1а А1а А1а Зег А1а Тгр Шз <31у Ьеи Зег А1а 740 745 750

<31и Ьеи Агд А1а Зег А1а Ьеи Зег Туг Зег Зег Уа1 Ьеи Зег ТНг Ьеи 755 760 765

ТНг СЯу СЯи СЯи Тгр Шз СЯу Рго А1а Зег А1а Зег МеН ТНг А1а А1а 770 775 780

А1а А1а Рго Туг Уа1 А1а Тгр МеН Зег Уа1 ТНг А1а Уа1 Агд А1а СЯи 785 790 795 800

СЯп А1а СЯу А1а СЯп А1а СЯи А1а А1а А1а А1а А1а Туг СЯи А1а А1а

805 810 815

РНе А1а А1а ТНг Уа1 Рго Рго Рго Уа1 11е СЯи А1а Азп Агд А1а СЯп 820 825 830

Ьеи МеН А1а Ьеи 11е А1а ТНг Азп Уа1 Ьеи СЯу СЯп Азп А1а Рго А1а 835 840 845

11е А1а А1а ТНг <31и А1а <31п Туг А1а <31и МеН Тгр Зег <31п Азр А1а 850 855 860

МеН А1а МеН Туг СЯу Туг А1а СЯу А1а Зег А1а А1а А1а ТНг СЯп Ьеи 865 870 875 880

ТНг Рго РНе ТНг СЯи Рго Уа1 СЯп ТНг ТНг Азп А1а Зег СЯу Ьеи А1а 885 890 895

А1а <31п Зег А1а А1а 11е А1а Шз А1а ТНг <31у А1а Зег А1а <31у А1а 900 905 910

СЯп СЯп ТНг ТНг Ьеи Зег СЯп Ьеи Не А1а А1а 11е Рго Зег Уа1 Ьеи 915 920 925

СЯп СЯу Ьеи Зег Зег Зег ТНг А1а А1а ТНг РНе А1а Зег СЯу Рго Зег 930 935 940

СЯу Ьеи Ьеи СЯу 11е Уа1 СЯу Зег СЯу Зег Зег Тгр Ьеи Азр Ьуз Ьеи 945 950 955 960

- 102 029492

Тгр А1а Ьеи Ьеи Азр Рго Азп Зег Азп РНе Тгр Азп ТНг 11е А1а Зег 965 970 975

Зег <31у Ьеи РНе Ьеи Рго Зег Азп ТНг 11е А1а Рго РНе Ьеи С1у Ьеи 980 985 990

Ьеи С1у С1у Уа1 А1а А1а А1а Азр А1а А1а С1у Азр Уа1 Ьеи С1у С1и 995 1000 1005

А1а ТНг Зег <31у <31у Ьеи С1у С1у А1а Ьеи Уа1 А1а Рго Ьеи С1у 1010 1015 1020

Зег А1а С1у <31у Ьеи С1у С1у ТНг Уа1 А1а А1а С1у Ьеи С1у Азп 1025 1030 1035

А1а А1а ТНг Уа1 С1у ТНг Ьеи Зег Уа1 Рго Рго Зег Тгр ТНг А1а 1040 1045 1050

А1а А1а Рго Ьеи А1а Зег Рго Ьеи <31у Зег А1а Ьеи С1у С1у ТНг 1055 1060 1065

Рго МеР Уа1 А1а Рго Рго Рго А1а Уа1 А1а А1а С1у МеР Рго С1у 1070 1075 1080

МеР Рго РНе <31у ТНг МеР С1у С1у <31п С1у РНе С1у Агд А1а Уа1 1085 1090 1095

Рго С1п Туг <31у РНе Агд Рго Азп РНе Уа1 А1а Агд Рго Рго А1а 1100 1105 1110

А1а С1у С1и <31п Ьуз Ьеи 11е Зег <31и С1и Азр Ьеи Зег Туг Уа1 1115 1120 1125

Ьеи Ьеи Зег А1а С1у ТНг Ьеи 11е А1а Ьеи МеР Ьеи 11е 11е РНе ИЗО 1135 1140

Ьеи 11е ТНг Суз Суз Ьуз Агд Уа1 Азр Агд Рго С1и Зег ТНг С1п 1145 1150 1155

Агд Зег Ьеи Агд С1у ТНг С1у Агд Азп Уа1 Зег Уа1 ТНг Зег С1п 1160 1165 1170

Зег С1у Ьуз РНе 11е Зег Зег Тгр <31и Зег Шз Ьуз Зег С1у С1у 1175 1180 1185

- 103 029492

61и ТЬг Агд Ьеи Шз Шз Шз Шз Шз Шз 1190 1195

<210> <211> <212> <213>	35 1109 ПРТ искусственная
<220>
<223>	гибрид "Р1адЬ
<400>	35
Меб Азр	) Туг Ьуз Азр .

10

15

Ьеи Уа1 11е Ьуз С1у А1а ТЬг 11е Азр 61п Рго Азр Шз Агд <31у Ьеи 20 25 30

11е 11е С1и Уа1 Агд Зег Зег Азр С1у Зег Рго Рго Туг Уа1 Уа1 Агд 35 40 45

Тгр Ьеи С1и ТЬг Азр Шз Уа1 А1а ТЬг Уа1 11е Рго С1у Рго Азр А1а 50 55 60

Уа1 Уа1 Уа1 ТЬг А1а С1и С1и С1п Азп А1а А1а Азр С1и Агд А1а С1п 65 70 75 80

Шз Агд РЬе С1у А1а Уа1 С1п Зег А1а Не Ьеи Шз А1а Агд <31у ТЬг 85 90 95

А1а Азп <31у Зег Меб Зег <31и Уа1 Меб Меб Зег <31и 11е А1а С1у Ьеи 100 105 110

Рго 11е Рго Рго 11е 11е Шз Туг <31у А1а 11е А1а Туг А1а Рго Зег 115 120 125

61у А1а Зег <31у Ьуз А1а Тгр Шз С1п Агд ТЬг Рго А1а Агд А1а С1и 130 135 140

61п Уа1 А1а Ьеи С1и Ьуз Суз С1у Азр Ьуз ТЬг Суз Ьуз Уа1 Уа1 Зег 145 150 155 160

Агд РЬе ТЬг Агд Суз С1у А1а Уа1 А1а Туг Азп С1у Зег Ьуз Туг С1п 165 170 175

61у С1у ТЬг С1у Ьеи ТЬг Агд Агд А1а А1а С1и Азр Азр А1а Уа1 Азп 180 185 190

- 104

029492

Агд Ьеи С1и С1у С1у Агд Не Уа1 195 200

Азп Тгр А1а Суз Азп Агд А1а ТНг 205

Уа1 (31у Ьеи Уа1 С1и А1а 11е С1у 210 215

11е Агд С1и Ьеи Агд С1п Шз А1а 220

Зег Агд Туг Ьеи А1а Агд Уа1 С1и 225 230

А1а С1у С1и С1и Ьеи С1у Уа1 ТНг 235 240

Азп Ьуз С1у Агд Ьеи Уа1 А1а Агд 245

Ьеи 11е Рго Уа1 С1п А1а А1а С1и 250 255

Агд Зег Агд <31и А1а Ьеи 11е С1и 260

Зег С1у Уа1 Ьеи 11е Рго А1а Агд 265 270

Агд Рго С1п Азп Ьеи Ьеи Азр Уа1 275 280

ТНг А1а С1и Рго А1а Агд С1у Агд 285

Ьуз Агд ТНг Ьеи Зег Азр Уа1 Ьеи 290 295

Азп С1и МеН Агд Азр С1и С1п Уа1 300

Азр РНе С1у А1а Ьеи Рго Рго С1и 305 310

11е Азп Зег А1а Агд МеН Туг А1а 315 320

<31у Рго С1у Зег А1а Зег Ьеи Уа1 325

А1а А1а А1а Ьуз МеН Тгр Азр Зег 330 335

Уа1 А1а Зег Азр Ьеи РНе Зег А1а 340

А1а Зег А1а РНе С1п Зег Уа1 Уа1 345 350

Тгр <31у Ьеи ТНг Уа1 С1у Зег Тгр 355 360

11е С1у Зег Зег А1а С1у Ьеи МеН 365

А1а А1а А1а А1а Зег Рго Туг Уа1 370 375

А1а Тгр МеН Зег Уа1 ТНг А1а С1у 380

<31п А1а С1п Ьеи ТНг А1а А1а С1п 385 390

Уа1 Агд Уа1 А1а А1а А1а А1а Туг

395 400

<31и ТНг А1а Туг Агд Ьеи ТНг Уа1 405

Рго Рго Рго Уа1 11е А1а С1и Азп 410 415

Агд ТНг <31и Ьеи МеН ТНг Ьеи ТНг 420

А1а ТНг Азп Ьеи Ьеи С1у С1п Азп 425 430

- 105 029492

ТНг Рго А1а 11е <31и А1а Азп <31п А1а А1а Туг Зег <31п МеЕ Тгр <31у 435 440 445

С1п Азр А1а С1и А1а МеЕ Туг С1у Туг А1а А1а ТНг А1а А1а ТНг А1а 450 455 460

ТНг <31и А1а Ьеи Ьеи Рго РНе <31и Азр А1а Рго Ьеи 11е ТНг Азп Рго 465 470 475 480

<31у <31у Ьеи Ьеи <31и <31п А1а Уа1 А1а Уа1 <31и <31и А1а 11е Азр ТНг 485 490 495

А1а А1а А1а Азп <31п Ьеи МеЕ Азп Азп Уа1 Рго <31п А1а Ьеи <31п <31п 500 505 510

Ьеи А1а <31п Рго А1а <31п <31у Уа1 Уа1 Рго Зег Зег Ьуз Ьеи <31у <31у 515 520 525

Ьеи Тгр ТНг А1а Уа1 Зег Рго Шз Ьеи Зег Рго Ьеи Зег Азп Уа1 Зег 530 535 540

Зег 11е А1а Азп Азп Шз МеЕ Зег МеЕ МеЕ <31у ТНг <31у Уа1 Зег МеЕ 545 550 555 560

ТНг Азп ТНг Ьеи Шз Зег МеЕ Ьеи Ьуз <31у Ьеи А1а Рго А1а А1а А1а 565 570 575

С1п А1а Уа1 С1и ТНг А1а А1а С1и Азп С1у Уа1 Тгр А1а МеЕ Зег Зег 580 585 590

Ьеи <31у Зег <31п Ьеи <31у Зег Зег Ьеи <31у Зег Зег <31у Ьеи <31у А1а 595 600 605

<31у Уа1 А1а А1а Азп Ьеи <31у Агд А1а А1а Зег Уа1 <31у Зег Ьеи Зег 610 615 620

Уа1 Рго Рго А1а Тгр А1а А1а А1а Азп <31п А1а Уа1 ТНг Рго А1а А1а 625 630 635 640

Агд А1а Ьеи Рго Ьеи ТНг Зег Ьеи ТНг Зег А1а А1а <31п ТНг А1а Рго 645 650 655

<31у Шз МеЕ Ьеи <31у <31у Ьеи Рго Ьеи <31у Шз Зег Уа1 Азп А1а <31у 660 665 670

- 106 029492

- 107 029492

915 920 925

СЯу Зег СЯу Бег Бег Тгр Ьеи Авр Ьув Ьеи Тгр А1а Ьеи Ьеи Авр Рго 930 935 940

Азп Зег Азп РНе Тгр Азп ТНг 11е А1а Зег Зег СЯу Ьеи РНе Ьеи Рго 945 950 955 960

Зег Азп ТНг 11е А1а Рго РНе Ьеи СЯу Ьеи Ьеи СЯу СЯу Уа1 А1а А1а 965 970 975

А1а Азр А1а А1а СЯу Азр Уа1 Ьеи СЯу СЯи А1а ТНг Зег СЯу СЯу Ьеи 980 985 990

СЯу СЯу А1а Ьеи Уа1 А1а Рго Ьеи СЯу Зег А1а СЯу СЯу Ьеи СЯу СЯу 995 1000 1005

ТНг Уа1 1010

А1а

А1а

(Ну

Ьеи

(Иу 1015

Азп

А1а А1а

ТНг

Уа1 1020

(Ну

ТНг

Ьеи

Зег Уа1

Рго

Рго

Зег

Тгр

ТНг

А1а

А1а А1а

Рго

Ьеи

А1а

Зег

Рго

1025

1030

1035

Ьеи (31у

Зег

А1а

Ьеи

(Иу

(Иу

ТНг

Рго МеН

Уа1

А1а

Рго

Рго

Рго

1040

1045

1050

А1а Уа1

А1а

А1а

(Ну

МеН

Рго

(Иу

МеН Рго

РНе

(Ну

ТНг

МеН

(Иу

1055

1060

1065

С1у (Ип

(Ну

РНе

(Ну

Агд

А1а

Уа1

Рго 61п

Туг

(Ну

РНе

Агд

Рго

1070

1075

1080

Азп РНе

Уа1

А1а

Агд

Рго

Рго

А1а

А1а СЯу

(31и

С1п

Ьуз

Ьеи

Не

1085

1090

1095

Зег 01и

С1и

Азр

Ьеи

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3 ΗΪ3

ΗΪ3

1100

1105

<210> 36

<211> 973

<212> ПРТ

<213> искусственная

последовательность

<220>

<223> гибрид "88-Е1ад-Ад85В*-БПл2626-КРЕВ-ЬНуЪ-1И1733*-Мус-Н1з Над"

<400> 36

- 108 029492

Мей Уа1 Рго С1п А1а Ьеи Ьеи РНе Уа1 Рго Ьеи Ьеи Уа1 РНе Рго Ьеи 15 10 15

Суз РНе С1у Ьуз РНе Рго 11е Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз А1а 20 25 30

РНе Зег Агд Рго С1у Ьеи Рго Уа1 61и Туг Ьеи С1п Уа1 Рго Зег Рго 35 40 45

Зег МеН С1у Агд Азр 11е Ьуз Уа1 61п РНе С1п Зег С1у С1у Азп Азп 50 55 60

Зег Рго А1а Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр 61у Ьеи Агд А1а С1п Азр Азр Туг 65 70 75 80

Азп С1у Тгр Азр 11е Азп ТНг Рго А1а РНе С1и Тгр Туг Туг С1п Зег 85 90 95

С1у Ьеи Зег 11е Уа1 МеН Рго Уа1 61у С1у С1п Зег Зег РНе Туг Зег 100 105 110

Азр Тгр Туг Зег Рго А1а Суз С1у Ьуз А1а С1у Суз С1п ТНг Туг Ьуз 115 120 125

Тгр С1и ТНг РНе Ьеи ТНг Зег С1и Ьеи Рго С1п Тгр Ьеи Зег А1а Азп 130 135 140

Агд А1а Уа1 Ьуз Рго ТНг С1у Зег А1а А1а 11е С1у Ьеи Зег МеН А1а 145 150 155 160

С1у Зег Зег А1а МеН 11е Ьеи А1а А1а Туг Шз Рго С1п С1п РНе 11е 165 170 175

Туг А1а С1у Зег Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи Азр Рго Зег С1п С1у МеН С1у 180 185 190

Рго Зег Ьеи 11е С1у Ьеи А1а МеН 61у Азр А1а С1у С1у Туг Ьуз А1а 195 200 205

А1а Азр МеН Тгр С1у Рго Зег Зег Азр Рго А1а Тгр С1и Агд Азп Азр 210 215 220

Рго ТНг С1п С1п 11е Рго Ьуз Ьеи Уа1 А1а Азп Азп ТНг Агд Ьеи Тгр 225 230 235 240

Уа1 Туг Суз С1у Азп С1у ТНг Рго Азп С1и Ьеи С1у С1у А1а Азп 11е

- 109 029492

245 250 255

Рго А1а (Ли РНе Ьеи (Ли Азп РНе Уа1 Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РНе 260 265 270

СЛп Азр А1а Туг Азп А1а А1а СЛу СЛу Шз Азп А1а Уа1 РНе Азп РНе 275 280 285

Рго Рго Азп (Лу ТНг Шз Зег Тгр (Ли Туг Тгр (Лу А1а (Лп Ьеи Азп 290 295 300

А1а МеР Ьуз (Лу Азр Ьеи (Лп Зег Зег Ьеи (Лу А1а (Лу ТНг ТНг А1а 305 310 315 320

Агд Азр Не Мер Азп А1а (Лу Уа1 ТНг Суз Уа1 (Лу (Ли Шз (Ли ТНг 325 330 335

Ьеи ТНг А1а А1а А1а СЛп Туг Мер Агд (Ли Шз Азр Не (Лу А1а Ьеи 340 345 350

Рго 11е Суз (Лу Азр Азр Азр Агд Ьеи Шз (Лу Мер Ьеи ТНг Азр Агд 355 360 365

Азр Не Уа1 Не Ьуз (Лу Ьеи А1а А1а (Лу Ьеи Азр Рго Азп ТНг А1а 370 375 380

ТНг А1а (Лу (Ли Ьеи А1а Агд Азр Зег Не Туг Туг Уа1 Азр А1а Азп 385 390 395 400

А1а Зег Не СЛп (Ли Мер Ьеи Азп Уа1 Мер (Ли (Ли Шз СЛп Уа1 Агд 405 410 415

Агд Уа1 Рго Уа1 Не Зег (Ли Шз Агд Ьеи Уа1 (Лу Не Уа1 ТНг (Ли 420 425 430

А1а Азр Не А1а Агд Шз Ьеи Рго (Ли Шз А1а Не Уа1 СЛп РНе Уа1 435 440 445

Ьуз А1а Не Суз Зег Рго Мер А1а Ьеи А1а Зег ТНг Уа1 Азр (Лу ТНг 450 455 460

А1а МеР Агд Уа1 ТНг ТНг Мер Ьуз Зег Агд Уа1 Не Азр Не Уа1 (Ли 465 470 475 480

(Ли Азп (Лу РНе Зег Уа1 Азр Азр Агд Азр Азр Ьеи Туг 485 490

Рго А1а А1а 495

- 110 029492

<31у Уа1 О1п Уа1 Шз Азр А1а Азр ТЬг 11е Уа1 Ьеи Агд Агд Зег Агд 500 505 510

Рго Ьеи <31п 11е Зег Ьеи Азр <31у Шз Азр А1а Ьуз <31п Уа1 Тгр ТЬг 515 520 525

ТЬг А1а Зег ТЬг Уа1 Азр <31и А1а Ьеи А1а <31п Ьеи А1а МеЬ ТЬг Азр 530 535 540

ТЬг А1а Рго А1а А1а А1а Зег Агд А1а Зег Агд Уа1 Рго Ьеи Зег <31у 545 550 555 560

МеЬ А1а Ьеи Рго Уа1 Уа1 Зег А1а Ьуз ТЬг Уа1 <31п Ьеи Азп Азр <31у 565 570 575

<31у Ьеи Уа1 Агд ТЬг Уа1 Шз Ьеи Рго А1а Рго Азп Уа1 А1а <31у Ьеи 580 585 590

Ьеи Зег А1а А1а <31у Уа1 Рго Ьеи Ьеи <31п Зег Азр Шз Уа1 Уа1 Рго 595 600 605

А1а А1а ТЬг А1а Рго 11е Уа1 <31и <31у МеЬ <31п 11е <31п Уа1 ТЬг Агд 610 615 620

Азп Агд 11е Ьуз Ьуз Уа1 ТЬг <31и Агд Ьеи Рго Ьеи Рго Рго Азп А1а 625 630 635 640

Агд Агд Уа1 <31и Азр Рго <31и МеЬ Азп МеЬ Зег Агд <31и Уа1 Уа1 <31и 645 650 655

Азр Рго <31у Уа1 Рго <31у ТЬг <31п Азр Уа1 ТЬг РЬе А1а Уа1 А1а <31и 660 665 670

Уа1 Азп <31у Уа1 <31и ТЬг <31у Агд Ьеи Рго Уа1 А1а Азп Уа1 Уа1 Уа1 675 680 685

ТЬг Рго А1а Шз <31и А1а Уа1 Уа1 Агд Уа1 <31у ТЬг Ьуз Рго <31у ТЬг 690 695 700

<31и Уа1 Рго Рго Уа1 11е Азр <31у Зег 11е Тгр Азр А1а 11е А1а <31п 705 710 715 720

Суз Ьуз Зег <31у <31у Азп Тгр А1а А1а Азп ТЬг <31у Азп 725 730

С1у Ьеи Туг 735

- 111 029492

61у <31у Ьеи <31п Не Зег <31п А1а А1а Тгр Азр Зег Азп <31у <31у Уа1 740 745 750

61у Зег Рго А1а А1а А1а Зег Рго <31п <31п <31п Не <31и Уа1 А1а Азр 755 760 765

Азп Не МеР Ьуз ТНг А1а <31у Рго <31у А1а Тгр Рго Ьуз Суз Зег Зег 770 775 780

Суз Зег С1п С1у Азр А1а Рго Ьеи С1у Зег Ьеи ТНг Шз Не Ьеи ТНг 785 790 795 800

РНе Ьеи А1а А1а С1и ТНг С1у С1у А1а С1у ТНг А1а Уа1 С1п Азр Зег 805 810 815

Агд Зег Шз Уа1 Туг А1а Шз С1п А1а С1п ТНг Агд Шз Рго А1а ТНг 820 825 830

А1а ТНг Уа1 Не Азр Шз С1и С1у Уа1 Не Азр Зег Азп ТНг ТНг А1а 835 840 845

ТНг Зег А1а Рго Рго Агд ТНг Ьуз Не ТНг Уа1 Рго А1а Агд Тгр Уа1 850 855 860

Уа1 Азп С1у Не С1и Агд Зег С1у С1и Уа1 Азп А1а Ьуз Рго С1у ТНг 865 870 875 880

Ьуз Зег С1у Азр Агд Уа1 С1у Не Тгр Уа1 Азр Зег А1а С1у С1п Ьеи 885 890 895

Уа1 Азр С1и Рго А1а Рго Рго А1а Агд А1а Не А1а Азр А1а А1а Ьеи 900 905 910

А1а А1а Ьеи С1у Ьеи Тгр Ьеи Зег Уа1 А1а А1а Уа1 А1а С1у А1а Ьеи 915 920 925

Ьеи А1а Ьеи ТНг Агд А1а Не Ьеи Не Агд Уа1 Агд Азп А1а Зег Тгр 930 935 940

(31η Шз Азр Не Азр Зег Ьеи РНе Суз ТНг (31п Агд (31и (31п Ьуз Ьеи 945 950 955 960

Не Зег (31и (31и Азр Ьеи Зег Шз Шз Шз Шз Шз Шз 965 970

- 112 029492

<210> 37

<211> 624

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "33-Р1ад-Ад85В*-Εν2626-Εν1733*-Мус-Шз бад"

<400> 37

Меб Уа1 Рго (31η А1а Ьеи Ьеи РНе Уа1 Рго Ьеи Ьеи Уа1 РНе Рго 15 10 15

Суз РНе С1у Ьуз РНе Рго 11е Азр Туг Ьуз Азр Азр Азр Азр Ьуз 20 25 30

РНе Зег Агд Рго 61у Ьеи Рго Уа1 С1и Туг Ьеи С1п Уа1 Рго Зег 35 40 45

Зег Меб СЯу Агд Азр 11е Ьуз Уа1 СЯп РНе СЯп Зег СЯу СЯу Азп 50 55 60

Зег Рго А1а Уа1 Туг Ьеи Ьеи Азр СЯу Ьеи Агд А1а СЯп Азр Азр 65 70 75

Азп СЯу Тгр Азр 11е Азп ТНг Рго А1а РНе С1и Тгр Туг Туг С1п 85 90 95

СЯу Ьеи Зег 11е Уа1 Меб Рго Уа1 СЯу СЯу СЯп Зег Зег РНе Туг 100 105 110

Азр Тгр Туг Зег Рго А1а Суз С1у Ьуз А1а С1у Суз С1п ТНг Туг 115 120 125

Тгр СЯи ТНг РНе Ьеи ТНг Зег СЯи Ьеи Рго СЯп Тгр Ьеи Зег А1а 130 135 140

Агд А1а Уа1 Ьуз Рго ТНг СЯу Зег А1а А1а 11е СЯу Ьеи Зег Меб 145 150 155

СЯу Зег Зег А1а Меб 11е Ьеи А1а А1а Туг Шз Рго СЯп СЯп РНе 165 170 175

Туг А1а СЯу Зег Ьеи Зег А1а Ьеи Ьеи Азр Рго Зег СЯп СЯу Меб 180 185 190

Рго Зег Ьеи 11е СЯу Ьеи А1а Меб СЯу Азр А1а СЯу СЯу Туг Ьуз 195 200 205

Ьеи

А1а

Рго

Азп

Туг

80

Зег

Зег

Ьуз

Азп

А1а

160

11е

С1у

А1а

- 113 029492

А1а Азр МеЬ Тгр С1у Рго Зег Зег Азр Рго А1а Тгр <31и Агд Азп Азр 210 215 220

Рго ТНг <31п <31п 11е Рго Ьуз Ьеи Уа1 А1а Азп Азп ТНг Агд Ьеи Тгр 225 230 235 240

Уа1 Туг Суз С1у Азп С1у ТНг Рго Азп <31и Ьеи С1у С1у А1а Азп 11е 245 250 255

Рго А1а <31и РНе Ьеи <31и Азп РНе Уа1 Агд Зег Зег Азп Ьеи Ьуз РНе 260 265 270

<31п Азр А1а Туг Азп А1а А1а <31у <31у Шз Азп А1а Уа1 РНе Азп РНе 275 280 285

Рго Рго Азп С1у ТНг Шз Зег Тгр <31и Туг Тгр <31у А1а <31п Ьеи Азп 290 295 300

А1а МеЬ Ьуз С1у Азр Ьеи <31п Зег Зег Ьеи <31у А1а <31у ТНг ТНг А1а 305 310 315 320

Агд Азр 11е МеЬ Азп А1а <31у Уа1 ТНг Суз Уа1 <31у <31и Шз (31и ТНг 325 330 335

Ьеи ТНг А1а А1а А1а <31п Туг МеЬ Агд <31и Шз Азр 11е С1у А1а Ьеи 340 345 350

Рго 11е Суз С1у Азр Азр Азр Агд Ьеи Шз С1у МеЬ Ьеи ТНг Азр Агд 355 360 365

Азр 11е Уа1 11е Ьуз С1у Ьеи А1а А1а С1у Ьеи Азр Рго Азп ТНг А1а 370 375 380

ТНг А1а С1у С1и Ьеи А1а Агд Азр Зег 11е Туг Туг Уа1 Азр А1а Азп 385 390 395 400

А1а Зег 11е С1п <31и МеЬ Ьеи Азп Уа1 МеЬ <31и <31и Шз <31п Уа1 Агд 405 410 415

Агд Уа1 Рго Уа1 11е Зег <31и Шз Агд Ьеи Уа1 С1у 11е Уа1 ТНг <31и 420 425 430

А1а Азр 11е А1а Агд Шз Ьеи Рго <31и Шз А1а 11е Уа1 <31п РНе Уа1 435 440 445

- 114 029492

Ьуз

А1а 450

11е

Суз

Зег

Рго МеН А1а 455

Ьеи А1а

Зег А1а 460

(Пу

ТНг

А1а

Уа1

СПп

Азр

Зег

Агд

Зег

Шз

Уа1

Туг

А1а

Шз

(Лп

А1а

(Лп

ТНг

Агд

Шз

465

470

475

480

Рго

А1а

ТНг

А1а

ТНг

Уа1

11е

Азр

Шз

С1и

(Пу

Уа1

11е

Азр

Зег

Азп

485

490

495

ТНг

ТНг

А1а

ТНг

Зег

А1а

Рго

Рго

Агд

ТНг

Ьуз

11е

ТНг

Уа1

Рго

А1а

500

505

510

Агд

Тгр

Уа1

Уа1

Азп

СПу

11е

С1и

Агд

Зег

(Пу

(Пи

Уа1

Азп

А1а

Ьуз

515

520

525

Рго

СПу

ТНг

Ьуз

Зег

СПу

Азр

Агд

Уа1

СПу

11е

Тгр

Уа1

Азр

Зег

А1а

530

535

540

СПу

(Пп

Ьеи

Уа1

Азр

С1и

Рго

А1а

Рго

Рго

А1а

Агд

А1а

11е

А1а

Азр

545

550

555

560

А1а

А1а

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

(Пу

Ьеи

Тгр

Ьеи

Зег

Уа1

А1а

А1а

Уа1

А1а

565

570

575

(Пу

А1а

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

ТНг

Агд

А1а

11е

Ьеи

11е

Агд

Уа1

Агд

Азп

580

585

590

А1а

Зег

Тгр

(Лп

Шз

Азр

11е

Азр

Зег

Ьеи

РНе

Суз

ТНг

(Лп

Агд

(Пи

595

600

605

(Пп

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

С1и

С1и

Азр

Ьеи

Зег

Шз

Шз

Шз

Шз

Шз

Шз

610

615

620

<210> 38

<211> 949

<212> ΠΡΤ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "33-Εΐ39-Κν2029*-Κν2626-Κν1733*-Κν0111*-]Υ^ο-ΗίΞ Над"

<400> 38

МеН СПу Ьеи Ьуз Уа1 Азп Уа1 Зег А1а 11е РНе МеН А1а Уа1 Ьеи Ьеи 15 10 15

ТНг Ьеи СПп ТНг Рго ТНг (Пу СПп 11е Шз Тгр СПу Азр Туг Ьуз Азр 20 25 30

- 115 029492

Азр Азр Азр Ьуз ТНг <31и Рго А1а А1а Тгр Азр С1и С1у Ьуз Рго Агд 35 40 45

11е 11е ТНг Ьеи ТНг МеН Азп Рго А1а Ьеи Азр 11е ТНг ТНг Зег Уа1 50 55 60

Азр Уа1 Уа1 Агд Рго ТНг <31и Ьуз МеН Агд Суз С1у А1а Рго Агд Туг 65 70 75 80

Азр Рго С1у С1у С1у С1у 11е Азп Уа1 А1а Агд 11е Уа1 Шз Уа1 Ьеи 85 90 95

С1у С1у Суз Зег ТНг А1а Ьеи РНе Рго А1а С1у С1у Зег ТНг С1у Зег 100 105 110

Ьеи Ьеи МеН А1а Ьеи Ьеи С1у Азр А1а С1у Уа1 Рго РНе Агд Уа1 11е 115 120 125

Рго 11е А1а А1а Зег ТНг Агд С1и Зег РНе ТНг Уа1 Азп С1и Зег Агд 130 135 140

ТНг А1а Ьуз С1п Туг Агд РНе Уа1 Ьеи Рго С1у Рго Зег Ьеи ТНг Уа1 145 150 155 160

А1а С1и С1п С1и С1п Суз Ьеи Азр С1и Ьеи Агд С1у А1а А1а А1а Зег 165 170 175

А1а А1а РНе Уа1 Уа1 А1а Зег С1у Зег Ьеи Рго Рго С1у Уа1 А1а А1а 180 185 190

Азр Туг Туг С1п Агд Уа1 А1а Азр 11е Суз Агд Агд Зег Зег ТНг Рго 195 200 205

Ьеи 11е Ьеи Азр ТНг Зег С1у С1у С1у Ьеи С1п Шз 11е Зег Зег С1у 210 215 220

Уа1 РНе Ьеи Ьеи Ьуз А1а Зег Уа1 Агд С1и Ьеи Агд С1и Суз Уа1 С1у 225 230 235 240

Зег С1и Ьеи Ьеи ТНг С1и Рго С1и С1п Ьеи А1а А1а А1а Шз С1и Ьеи 245 250 255

11е Азр Агд С1у Агд А1а С1и Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Зег Ьеи С1у Зег С1п 260 265 270

- 116 029492

<31у А1а Ьеи Ьеи А1а ТНг Агд Шз А1а Зег Шз Агд РНе Зег Зег 11е 275 280 285

Рго МеН ТНг А1а Уа1 Зег <31у Уа1 С1у А1а С1у Азп А1а МеН Уа1 А1а 290 295 300

А1а 11е ТНг Уа1 С1у Ьеи Зег Агд <31у Тгр Зег Ьеи 11е Ьуз Зег Уа1 305 310 315 320

Агд Ьеи С1у Азп А1а А1а С1у А1а А1а МеН Ьеи Ьеи ТНг Рго С1у ТНг 325 330 335

А1а А1а Суз Азп Агд Азр Азр Уа1 С1и Агд РНе РНе С1и ТНг ТНг А1а 340 345 350

Агд Азр 11е МеН Азп А1а С1у Уа1 ТНг Суз Уа1 С1у С1и Шз С1и ТНг 355 360 365

Ьеи ТНг А1а А1а А1а С1п Туг МеН Агд С1и Шз Азр 11е С1у А1а Ьеи 370 375 380

Рго 11е Суз С1у Азр Азр Азр Агд Ьеи Шз С1у МеН Ьеи ТНг Азр Агд 385 390 395 400

Азр 11е Уа1 11е Ьуз С1у Ьеи А1а А1а С1у Ьеи Азр Рго Азп ТНг А1а 405 410 415

ТНг А1а С1у С1и Ьеи А1а Агд Азр Зег 11е Туг Туг Уа1 Азр А1а Азп 420 425 430

А1а Зег 11е С1п С1и МеН Ьеи Азп Уа1 МеН С1и С1и Шз С1п Уа1 Агд 435 440 445

Агд Уа1 Рго Уа1 11е Зег С1и Шз Агд Ьеи Уа1 С1у 11е Уа1 ТНг С1и 450 455 460

А1а Азр 11е А1а Агд Шз Ьеи Рго С1и Шз А1а 11е Уа1 С1п РНе Уа1 465 470 475 480

Ьуз А1а 11е Суз Зег Рго МеН А1а Ьеи А1а Зег А1а С1у ТНг А1а Уа1 485 490 495

С1п Азр Зег Агд Зег Шз Уа1 Туг А1а Шз С1п А1а С1п ТНг Агд Шз 500 505 510

Рго А1а ТНг А1а ТНг Уа1 11е Азр Шз С1и С1у Уа1 11е Азр Зег Азп

- 117 029492

515 520 525

ТНг ТНг А1а ТНг Зег А1а Рго Рго Агд ТНг Ьуз Не ТНг Уа1 Рго А1а 530 535 540

Агд Тгр Уа1 Уа1 Азп <31у Не С1и Агд Зег <31у <31и Уа1 Азп А1а Ьуз 545 550 555 560

Рго С1у ТНг Ьуз Зег <31у Азр Агд Уа1 С1у Не Тгр Уа1 Азр Зег А1а 565 570 575

СЯу 01η Ьеи Уа1 Азр СЯи Рго А1а Рго Рго А1а Агд А1а Не А1а Азр 580 585 590

А1а А1а Ьеи А1а А1а Ьеи СЯу Ьеи Тгр Ьеи Зег Уа1 А1а А1а Уа1 А1а 595 600 605

СЯу А1а Ьеи Ьеи А1а Ьеи ТНг Агд А1а Не Ьеи Не Агд Уа1 Агд Азп 610 615 620

А1а Зег Тгр СЯп Шз Азр Не Азр Зег Ьеи РНе Суз ТНг С1п Агд С1и 625 630 635 640

С1п Рго Не Агд Агд Тгр Агд Рго А1а Агд Уа1 Рго Ьеи Ьеи Рго Ьеи 645 650 655

А1а А1а А1а ТНг Уа1 А1а Зег А1а А1а А1а Уа1 ТНг МеН Ьеи Уа1 Уа1 660 665 670

- 118 029492

(Ли Суз 770

Азр СПу Тгр

Рго А1а Агд Тгр 775

Зег

А1а

(Пп 780

Уа1

Азп

Агд

Азр

(Пп

Рго

Азр

Уа1

А1а

Ьеи

Ьеи

11е

Уа1

(Пу

Агд

Тгр

(Пи

ТНг

Уа1

Азр

785

790

795

800

Агд

Уа1

Азп

(Пи

(Пу

Агд

Тгр

ТНг

ΗΪ3

11е

(Пу

Азр

Рго

ТНг

РНе

Азр

805

810

815

А1а

Туг

Ьеи

Азп

А1а

(Пи

Ьеи

(Пп

Агд

А1а

Ьеи

Зег

11е

Уа1

(Пу

Зег

820

825

830

ТНг

(Пу

Уа1

Агд

Уа1

МеН

Уа1

ТНг

ТНг

Уа1

Рго

Туг

Зег

Агд

(Пу

(Пу

835

840

845

(Пи

Ьуз

Рго

Азр

(Пу

Агд

Ьеи

Туг

Рго

(Пи

Азр

(Пп

Рго

(Пи

Агд

Уа1

850

855

860

Азп

Ьуз

Тгр

Азп

А1а

МеН

Ьеи

ΗΪ3

Азп

А1а

11е

Зег

(Пп

ΗΪ3

Зег

Азп

865

870

875

880

Уа1

(Пу

МеН

11е

Азр

Ьеи

Азп

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Суз

Рго

Азр

(Пу

Уа1

Туг

885

890

895

ТНг

А1а

Ьуз

Уа1

Азр

(Пу

11е

Ьуз

Уа1

Агд

Зег

Азр

(Пу

Уа1

ΗΪ3

Ьеи

900

905

910

ТНг

(Пп

(Пи

(Пу

Уа1

Ьуз

Тгр

Ьеи

11е

Рго

Тгр

Ьеи

(Пи

Азр

Зег

Уа1

915

920

925

Агд

Уа1

А1а

Зег

(Пи

(Пп

Ьуз

Ьеи

11е

Зег

(Пи

(Пи

Азр

Ьеи

Зег

ΗΪ3

930

935

940

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

ΗΪ3

945

<210> 39

<211> 848

<212> ПРТ

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> гибрид "33-Р1ад-Ш2029*-ТВ10.4-ЕЗАТ6-ΕνΟΙ 11*-Мус-ΗίΞ Над"

<400> 39

МеН (Пу Ьеи Ьуз Уа1 Азп Уа1 Зег А1а 11е РНе МеН А1а Уа1 Ьеи Ьеи

- 119 029492

15 10 15

ТНг Ьеи С1п ТНг Рго ТНг <31у <31п 11е Шз Тгр <31у Азр Туг Ьуз Азр 20 25 30

Азр Азр Азр Ьуз ТНг <31и Рго А1а А1а Тгр Азр С1и С1у Ьуз Рго Агд 35 40 45

11е 11е ТНг Ьеи ТНг МеН Азп Рго А1а Ьеи Азр 11е ТНг ТНг Зег Уа1 50 55 60

Азр Уа1 Уа1 Агд Рго ТНг <31и Ьуз МеН Агд Суз С1у А1а Рго Агд Туг 65 70 75 80

Азр Рго С1у С1у С1у С1у 11е Азп Уа1 А1а Агд 11е Уа1 Шз Уа1 Ьеи 85 90 95

С1у С1у Суз Зег ТНг А1а Ьеи РНе Рго А1а С1у С1у Зег ТНг С1у Зег 100 105 110

Ьеи Ьеи МеН А1а Ьеи Ьеи <31у Азр А1а С1у Уа1 Рго РНе Агд Уа1 11е 115 120 125

Рго 11е А1а А1а Зег ТНг Агд С1и Зег РНе ТНг Уа1 Азп С1и Зег Агд 130 135 140

ТНг А1а Ьуз С1п Туг Агд РНе Уа1 Ьеи Рго С1у Рго Зег Ьеи ТНг Уа1 145 150 155 160

А1а С1и С1п С1и С1п Суз Ьеи Азр С1и Ьеи Агд С1у А1а А1а А1а Зег 165 170 175

А1а А1а РНе Уа1 Уа1 А1а Зег С1у Зег Ьеи Рго Рго С1у Уа1 А1а А1а 180 185 190

Азр Туг Туг С1п Агд Уа1 А1а Азр 11е Суз Агд Агд Зег Зег ТНг Рго 195 200 205

Ьеи 11е Ьеи Азр ТНг Зег <31у С1у С1у Ьеи С1п Шз 11е Зег Зег С1у 210 215 220

Уа1 РНе Ьеи Ьеи Ьуз А1а Зег Уа1 Агд С1и Ьеи Агд С1и Суз Уа1 С1у 225 230 235 240

Зег С1и Ьеи Ьеи ТНг С1и Рго С1и С1п Ьеи А1а А1а А1а Шз С1и Ьеи 245 250 255

- 120 029492

11е Азр Агд (Пу Агд А1а (Пи Уа1 Уа1 Уа1 Уа1 Зег Ьеи (Пу Зег СПп 260 265 270

(Пу А1а Ьеи Ьеи А1а ТЬг Агд Шз А1а Зег Шз Агд РЬе Зег Зег Ие 275 280 285

Рго Меб ТЬг А1а Уа1 Зег (Пу Уа1 (Пу А1а (Пу Азп А1а Меб Уа1 А1а 290 295 300

А1а 11е ТЬг Уа1 (Пу Ьеи Зег Агд (Пу Тгр Зег Ьеи 11е Ьуз Зег Уа1 305 310 315 320

Агд Ьеи (Пу Азп А1а А1а (Пу А1а А1а Меб Ьеи Ьеи ТЬг Рго (Пу ТЬг 325 330 335

А1а А1а Суз Азп Агд Азр Азр Уа1 С1и Агд РЬе РЬе (Пи Зег (Пп Ие 340 345 350

Меб Туг Азп Туг Рго А1а Меб Ьеи С1у Шз А1а (Пу Азр Меб А1а (Пу 355 360 365

Туг А1а (Пу ТЬг Ьеи СПп Зег Ьеи (Пу А1а (Пи 11е А1а Уа1 (Пи СПп 370 375 380

А1а А1а Ьеи (Пп Зег А1а Тгр (Пп (Пу Азр ТЬг (Пу 11е ТЬг Туг (Пп 385 390 395 400

А1а Тгр СПп А1а СПп Тгр Азп СПп А1а Меб (Пи Азр Ьеи Уа1 Агд А1а 405 410 415

Туг Шз А1а Меб Зег Зег ТЬг Шз (Ли А1а Азп ТЬг Меб А1а Меб Меб 420 425 430

А1а Агд Азр ТЬг А1а (Пи А1а А1а Ьуз Тгр (Пу (Пу ТЬг (Ли (Пп (Пп 435 440 445

Тгр Азп РЬе А1а (Пу 11е (Ли А1а А1а А1а Зег А1а 11е СПп (Пу Азп 450 455 460

Уа1 ТЬг Зег 11е Шз Зег Ьеи Ьеи Азр (Пи (Пу Ьуз СПп Зег Ьеи ТЬг 465 470 475 480

Ьуз Ьеи А1а А1а А1а Тгр (Пу (Пу Зег (Пу Зег (Ли А1а Туг (Пп (Пу 485 490 495

- 121 029492

Уа1 (31η (31п Ьуз Тгр Азр А1а ТНг А1а ТНг (31и Ьеи Азп Азп А1а Ьеи 500 505 510

(31п Азп Ьеи А1а Агд ТНг Не Зег (31и А1а (31у (31п А1а МеР А1а Зег 515 520 525

ТНг (31и (31у Азп Уа1 ТНг (31у МеР РНе А1а (31и (31п Рго Не Агд Агд 530 535 540

Тгр Агд Рго А1а Агд Уа1 Рго Ьеи Ьеи Рго Ьеи А1а А1а А1а ТНг Уа1 545 550 555 560

А1а Зег А1а А1а А1а Уа1 ТНг МеР Ьеи Уа1 Уа1 Рго Уа1 (31у А1а (31у 565 570 575

Рго (31у Ьеи Агд (31и Не (31у Ьеи Рго Рго (31у Уа1 Зег А1а Уа1 А1а 580 585 590

А1а Уа1 Зег Рго Зег Рго Рго (31и А1а Зег (31п Рго А1а Рго (31у Рго 595 600 605

Агд Азр Рго Азп Агд Рго РНе ТНг Уа1 Зег Уа1 РНе (31у Азр Зег Не 610 615 620

(31у Тгр ТНг Ьеи МеР Нтз Туг Ьеи Рго Рго ТНг Рго (31у РНе Агд РНе 625 630 635 640

Не Азр ΗΪ3 ТНг Уа1 Не (31у Суз Зег Ьеи Уа1 Агд С1у ТНг Рго Туг 645 650 655

Агд Туг Не С1у С1п ТНг Ьеи С1и С1п Агд А1а С1и Суз Азр С1у Тгр 660 665 670

Рго А1а Агд Тгр Зег А1а С1п Уа1 Азп Агд Азр С1п Рго Азр Уа1 А1а 675 680 685

Ьеи Ьеи Не Уа1 С1у Агд Тгр С1и ТНг Уа1 Азр Агд Уа1 Азп С1и С1у 690 695 700

Агд Тгр ТНг ΗΪ3 Не С1у Азр Рго ТНг РНе Азр А1а Туг Ьеи Азп А1а 705 710 715 720

С1и Ьеи С1п Агд А1а Ьеи Зег Не Уа1 С1у Зег ТНг С1у Уа1 Агд Уа1 725 730 735

- 122 029492

МеН Уа1

ТНг

ТНг Уа1 740

Рго

Туг

Зег Агд 745

С1у

С1у

С1и

Ьуз

Рго 750

Азр

С1у

Агд Ьеи

Туг

Рго С1и

Азр

С1п

Рго С1и

Агд

Уа1

Азп

Ьуз

Тгр

Азп

А1а

755

760

765

МеН Ьеи

ΗΪ3

Азп А1а

11е

Зег

С1п Шз

Зег

Азп

Уа1

С1у

МеН

11е

Азр

770

775

780

Ьеи Азп

Ьуз

Ьуз Ьеи

Суз

Рго

Азр С1у

Уа1

Туг

ТНг

А1а

Ьуз

Уа1

Азр

785

790

795

800

С1у Не

Ьуз

Уа1 Агд

Зег

Азр

С1у Уа1

ΗΪ3

Ьеи

ТНг

С1п

С1и

С1у

Уа1

805

810

815

Ьуз Тгр

Ьеи

11е Рго

Тгр

Ьеи

С1и Азр

Зег

Уа1

Агд

Уа1

А1а

Зег

С1и

820

825

830

<31п Ьуз

Ьеи

11е Зег

С1и

С1и

Азр Ьеи

Зег

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

Нгз

835

840

845

<210>

40

<211>

1770

<212> ,

цнк

<213> :

искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотидная последовательность, кодирующая гибрид п°2 "33-Р1ад-Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТ6-Мус-ТМ-Шз Над" (рТС18266)

<400> 40

аНддННссНс аддсНсНссН дНННдНассс сННсНддННН ННссаННдНд ННННдддааа 60

ННсссНаННд аННасаадда НдасдасдаН ааддссННсН сНадассНдд ссНдсссдНд 120

дааНассНдс аддНсссаад ссссадсаНд ддссдддаНа НсааддНдса дНННсададс 180

ддсддсааса асадсссНдс сдНдНаНсНд сНддаНддсс Ндададссса ддасдасНас 240

аасддсНддд асаНсаасас сссНдссННс дадНддНасН ассададсдд ссНдНссаНс 300

дНдаНдссНд Ндддсддсса дадсадсННс НасадсдасН ддНасадссс сдссНдНддс 360

ааадссддсН дссадассНа саадНдддад асаННссНда ссНссдадсН дссссадНдд 420

сНдадсдсса аНададссдН даадссНаса ддсНсНдссд ссаНсддасН дадсаНддсс 480

- 123 029492

ддаадсНсНд ссаНдаНссН ддссдссНаН сасссНсадс адННсаНсНа сдссддсадс 540

сНдНсНдссс НдсНддассс ННсНсадддс аНдддсссНН сНсНдаНсдд асНддсНаНд 600

ддсдасдсНд дсддаНасаа ддссдссдаН аНдНддддсс сНадсадсда НссНдссНдд 660

дададааасд ассссассса дсадаНсссс аадсНддНдд ссаасаасас ссддсНдНдд 720

дНдНасНдсд дсаасддсас сссНааНдаа сНдддсддад ссааНаНссс сдссдадННс 780

сНддаааасН НсдНдсддад садсаассНд аадННссадд аНдссНасаа сдссдсНддс 840

ддссасаасд ссдНдННсаа сННсссНссс ааНддсассс асадсНддда дНасНдддда 900

дсссадсНда асдссаНдаа дддсдаНсНд садНссНсНс Ндддадссдд садссадаНс 960

аНдНасаасН ассссдссаН дсНдддссас дссддсдаНа НддсНддаНа Ндссддсаса 1020

сНдсададсс НдддНдссда даННдссдНд даасаддсНд сссНссадНс НдссНддсад 1080

ддсдаНассд дсаНсасаНа ссаддсННдд саддсссадН ддаассаддс саНддаадаН 1140

сНсдНдсддд ссНассасдс саНдадсадс асасасдадд ссаасассаН ддссаНдаНд 1200

дсссдддаНа садссдаддс сдсНаадНдд ддаддаассд адсадсадНд даасННсдсс 1260

ддааННдадд ссдсНдссад сдссаНссад ддсаасдНда саНссаНсса садссНдсНд 1320

дасдадддса адсададссН дасаааасНд дсНдсНдссН ддддсддсНс НддсНсНдаа 1380

дсННаНсадд дсдНдсадса даадНдддас дссассдсса ссдадсНдаа саасдсссНд 1440

садаассНдд сссддасааН сНсНдаадсс ддасаддсса Нддссадсас сдадддсааН 1500

дНдассддса НдНННдссда асааааасНс аНсНсадаад аддаНсНдад сНаНдНаННа 1560

сНдадНдсад дддсссНдас НдссННдаНд ННдаНааННН НссНдаНдас аНдННдНада 1620

ададНсааНс даНсадаасс Насдсаасас ааНсНсадад ддасадддад ддаддНдНса 1680

- 124 029492

дЕсасЕсссс ааадсдддаа даЕсаЕаЕсЕ ЕсаЕдддааЕ сасасаадад ЕдддддЕдад 1740

ассадасЕдс аЕсаЕсаЕса ЕсаЕсаЕЕда

1770

<210> 41

<211> 1503

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°10

"К1ад-Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТ6-Мус-Н1з Еад" (рТС18296)

<400> 41

аЕддаЕЕаса аддаЕдасда сдаЕааддсс ЕЕсЕсЕадас сЕддссЕдсс сдЕддааЕас 60

сЕдсаддЕсс саадссссад саЕдддссдд даЕаЕсаадд ЕдсадЕЕЕса дадсддсддс 120

аасаасадсс сЕдссдЕдЕа ЕсЕдсЕддаЕ ддссЕдадад сссаддасда сЕасаасддс 180

ЕдддасаЕса асассссЕдс сЕЕсдадЕдд ЕасЕассада дсддссЕдЕс саЕсдЕдаЕд 240

ссЕдЕдддсд дссададсад сЕЕсЕасадс дасЕддЕаса дссссдссЕд Еддсааадсс 300

ддсЕдссада ссЕасаадЕд ддадасаЕЕс сЕдассЕссд адсЕдсссса дЕддсЕдадс 360

дссааЕадад ссдЕдаадсс ЕасаддсЕсЕ дссдссаЕсд дасЕдадсаЕ ддссддаадс 420

ЕсЕдссаЕда ЕссЕддссдс сЕаЕсасссЕ садсадЕЕса ЕсЕасдссдд садссЕдЕсЕ 480

дсссЕдсЕдд асссЕЕсЕса дддсаЕдддс ссЕЕсЕсЕда ЕсддасЕддс ЕаЕдддсдас 540

дсЕддсддаЕ асааддссдс сдаЕаЕдЕдд ддсссЕадса дсдаЕссЕдс сЕдддадада 600

аасдасссса сссадсадаЕ ссссаадсЕд дЕддссааса асасссддсЕ дЕдддЕдЕас 660

Едсддсаасд дсассссЕаа ЕдаасЕдддс ддадссааЕа Ессссдссда дЕЕссЕддаа 720

аасЕЕсдЕдс ддадсадсаа ссЕдаадЕЕс саддаЕдссЕ асаасдссдс Еддсддссас 780

аасдссдЕдЕ ЕсаасЕЕссс ЕсссааЕддс асссасадсЕ дддадЕасЕд дддадсссад 840

сЕдаасдсса Едаадддсда ЕсЕдсадЕсс ЕсЕсЕдддад ссддсадсса даЕсаЕдЕас 900

- 125 029492

аасбассссд

960

адссбдддбд

1020

ассддсабса

1080

сдддссбасс

1140

дабасадссд

1200

даддссдсбд

1260

ддсаадсада

1320

садддсдбдс

1380

сбддсссдда

1440

ддсабдбббд

1500

ссабдсбддд

ссдадаббдс

сабассаддс

асдссабдад

аддссдсбаа

ссадсдссаб

дссбдасааа

адсадаадбд

саабсбсбда

ссдаасаааа

ссасдссддс

сдбддаасад

ббддсаддсс

садсасасас

дбддддадда

ссадддсаас

асбддсбдсб

ддасдссасс

адссддасад

асбсабсбса

дабабддсбд

дсбдсссбсс

садбддаасс

даддссааса

ассдадсадс

дбдасабсса

дссбддддсд

дссассдадс

дссабддсса

даададдабс

дабабдссдд

адбсбдссбд

аддссабдда

ссабддссаб

адбддаасбб

бссасадссб

дсбсбддсбс

бдаасаасдс

дсассдаддд

бдсабсабса

сасасбдсад

дсадддсдаб

адабсбсдбд

дабддсссдд

сдссддаабб

дсбддасдад

бдаадсббаб

ссбдсадаас

саабдбдасс

бсабсабсаб

бда

1503

<210> 42

<211> 1392

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°3 "88-К1ад-КРКВ-ПкуЪМус-ТМ-ΗίΞ

Над" (рТС18267)

<400> 42

абддбассас аадсдсбдбб асббдбссса сбдсббддбб бсбсбббабд ббббддаааа 60

ббсссаабад аббасаадда бдасдасдаб аадассдбдд асддсассдс сабдададбд 120

ассассабда адбссададб дабсдасабс дбддаадада асддсббсад сдбддасдас 180

сдддасдасс бдбабссбдс бдсбддадбд саддбссасд асдссдабас аабсдбдсбд 240

сддадаадса дассссбдса дабсадссбд дабддссасд асдссаадса ддбсбддасс 300

- 126 029492

асадссадса садРддаРда адсссРддсс садсРддсса РдассдаРас адсРссадсс 360

дссдсРадса дадсРадсад адРдссРсРд РсРддсаРдд сссРдссРдР ддРдРсРдсс 420

аадассдРдс адсРдаасда РддсддссРс дрдсддасад РдсаРсРдсс РдсРссРааР 480

дрддссддсс РдсРдРсРдс адсаддсдРд ссасРдсРдс ададсдаРса РдРддРдссР 540

дссдссасад ссссРаРсдР ддааддсаРд садаРссадд Рсасасддаа ссддаРсаад 600

ааадРдассд адсддсРдсс ссРдссРссс аасдсРадаа дадРддаада РсссдадаРд 660

аасаРдадса дададдРддР сдаддасссР ддсдРдссад дсасасадда РдРдасаРРс 720

дссдРддссд аадРдаасдд сдРддааасс ддсадасРдс ссдРддссаа РдРддРддРс 780

асассадссс аРдаддссдР сдРсададРд ддсасааадс сРддсасада ддрдссассс 840

дРдаРсдасд дсадсаРсРд ддаРдссаРР дсссадРдса ададсддсдд ааасРдддсс 900

дссааРассд дсааРддссР сРаРддсддс сРдсадаРсР сРсаддссдс сРдддаРРсР 960

ааРддсддсд РдддаРсРсс РдссдсРдсс РсРссасадс адсадаРсда ддрддссдас 1020

аасаРсаРда адасадссдд ассРддсдсс РддсссаадР дРадсадРРд РРсРсадддс 1080

дасдссссРс РдддсадссР дасасасаРс сРдасаРРРс Рддссдссда дасаддсдда 1140

даасааааас РсаРсРсада ададдаРсРд адсРаРдРРс РРсРсРсРдс РддаасРРРа 1200

аРадсРРРаа РдРРааРааР аРРсРРааРа асдРдсРдРа ааадддРада ссдРссадад 1260

РсаасРсадс дсадссРРад дддРасРддд адаааРдРРР ссдРдасаРс асададРдда 1320

аааРРРаРсР сдРсРРддда аРсРсаРаад адрддаддсд ааасасдРсР РсаРсаРсаР 1380

саРсаРсаРР да

1392

<210> 43

<211> 1125

<212> ДНК

- 127 029492

Р1ад-КРРВ-ОкуЪ-Мусадбдассасс

сдассдддас

дсбдсддада

дассасадсс

адссдссдсб

бдссаадасс

баабдбддсс

дссбдссдсс

саадааадбд

дабдаасабд

аббсдссдбд

ддбсасасса

асссдбдабс

ддссдссааб

ббсбаабддс

сдасаасабс

дддсдасдсс

сддадаасаа

- 128 029492

ааасНсаНсН садаададда 1125
<210>	44
<211>	2817
<212>	ДНК
<213>	искусственная ι
<220>
<223>	нк последовате.

"33-Р1ад-КРРВ-Ш1уЬ-Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТб-Мус-ТМ-Н13 Над" (рТ(318268)

<400> 44

аНддНассас аадсдсНдНН асННдНссса сНдсННддНН НсНсНННаНд ННННддаааа 60

ННсссааНад аННасаадда НдасдасдаН аадассдНдд асддсассдс саНдададНд 120

ассассаНда адНссададН даНсдасаНс дНддаадада асддсННсад сдНддасдас 180

сдддасдасс НдНаНссНдс НдсНддадНд саддНссасд асдссдаНас ааНсдНдсНд 240

сддадаадса дассссНдса даНсадссНд даНддссасд асдссаадса ддНсНддасс 300

асадссадса садНддаНда адсссНддсс садсНддсса НдассдаНас адсНссадсс 360

дссдсНадса дадсНадсад адНдссНсНд НсНддсаНдд сссНдссНдН ддНдНсНдсс 420

аадассдНдс адсНдаасда НддсддссНс дНдсддасад НдсаНсНдсс НдсНссНааН 480

дНддссддсс НдсНдНсНдс адсаддсдНд ссасНдсНдс ададсдаНса НдНддНдссН 540

дссдссасад ссссНаНсдН ддааддсаНд садаНссадд Нсасасддаа ссддаНсаад 600

ааадНдассд адсддсНдсс ссНдссНссс аасдсНадаа дадНддаада НсссдадаНд 660

аасаНдадса дададдНддН сдаддасссН ддсдНдссад дсасасадда НдНдасаННс 720

дссдНддссд аадНдаасдд сдНддааасс ддсадасНдс ссдНддссаа НдНддНддНс 780

асассадссс аНдаддссдН сдНсададНд ддсасааадс сНддсасада ддНдссассс 840

дНдаНсдасд дсадсаНсНд ддаНдссаНН дсссадНдса ададсддсдд ааасНдддсс 900

- 129 029492

дссааНассд дсааНддссН сНаНддсддс сНдсадаНсН сНсаддссдс сНдддаННсН 960

ааНддсддсд НдддаНсНсс НдссдсНдсс НсНссасадс адсадаНсда ддНддссдас 1020

аасаНсаНда адасадссдд ассНддсдсс НддсссаадН дНадсадННд ННсНсадддс 1080

дасдссссНс НдддсадссН дасасасаНс сНдасаНННс Нддссдссда дасаддсдда 1140

дссННсНсНа дассНддссН дсссдНддаа НассНдсадд Нсссаадссс садсаНдддс 1200

сдддаНаНса аддНдсадНН Нсададсддс ддсаасааса дсссНдссдН дНаНсНдсНд 1260

даНддссНда дадсссадда сдасНасаас ддсНдддаса Нсаасасссс НдссННсдад 1320

НддНасНасс ададсддссН дНссаНсдНд аНдссНдНдд дсддссадад садсННсНас 1380

адсдасНддН асадссссдс сНдНддсааа дссддсНдсс адассНасаа дНдддадаса 1440

ННссНдассН ссдадсНдсс ссадНддсНд адсдссааНа дадссдНдаа дссНасаддс 1500

НсНдссдсса НсддасНдад саНддссдда адсНсНдсса НдаНссНддс сдссНаНсас 1560

ссНсадсадН НсаНсНасдс сддсадссНд НсНдсссНдс НддасссННс НсадддсаНд 1620

ддсссННсНс НдаНсддасН ддсНаНдддс дасдсНддсд даНасааддс сдссдаНаНд 1680

НддддсссНа дсадсдаНсс НдссНдддад адааасдасс ссасссадса даНссссаад 1740

сНддНддсса асаасасссд дсНдНдддНд НасНдсддса асддсасссс НааНдаасНд 1800

ддсддадсса аНаНссссдс сдадННссНд даааасННсд Ндсддадсад саассНдаад 1860

ННссаддаНд ссНасаасдс сдсНддсддс сасаасдссд НдННсаасНН сссНсссааН 1920

ддсасссаса дсНдддадНа сНддддадсс садсНдаасд ссаНдааддд сдаНсНдсад 1980

НссНсНсНдд дадссддсад ссадаНсаНд НасаасНасс ссдссаНдсН дддссасдсс 2040

ддсдаНаНдд сНддаНаНдс сддсасасНд сададссНдд дНдссдадаН НдссдНддаа 2100

- 130 029492

саддсбдссс бссадбсбдс сбддсадддс дабассддса бсасабасса ддсббддсад 2160

дсссадбдда ассаддссаб ддаадабсбс дбдсдддссб ассасдссаб дадсадсаса 2220

сасдаддсса асассабддс сабдабддсс сдддабасад ссдаддссдс баадбдддда 2280

ддаассдадс адсадбддаа сббсдссдда аббдаддссд сбдссадсдс сабссадддс 2340

аасдбдасаб ссабссасад ссбдсбддас дадддсаадс ададссбдас аааасбддсб 2400

дсбдссбддд дсддсбсбдд сбсбдаадсб бабсадддсд бдсадсадаа дбдддасдсс 2460

ассдссассд адсбдаасаа сдсссбдсад аассбддссс ддасаабсбс бдаадссдда 2520

саддссабдд ссадсассда дддсаабдбд ассддсабдб ббдссдааса аааасбсабс 2580

бсадаададд абсбдадсба бдббсббсбс бсбдсбддаа сбббаабадс бббаабдбба 2640

абаабаббсб баабаасдбд сбдбаааадд дбадассдбс сададбсаас бсадсдсадс 2700

сббаддддба сбдддадааа бдбббссдбд асабсасада дбддаааабб бабсбсдбсб 2760

бдддаабсбс абаададбдд аддсдаааса сдбсббсабс абсабсабса бсаббда 2817

<210> 45

<211> 2550

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°11

"Р1ад-КРРВ-ОЬуЬ-Ад85В*-ТВ10.4-ЕЗАТ6-Мус-Н1з Над" (рТС18297)

<400> 45

абддаббаса аддабдасда сдабаадасс дбддасддса ссдссабдад адбдассасс 60

абдаадбсса дадбдабсда сабсдбддаа дадаасддсб бсадсдбдда сдассдддас 120

дассбдбабс сбдсбдсбдд адбдсаддбс сасдасдссд абасаабсдб дсбдсддада 180

адсадасссс бдсадабсад ссбддабддс сасдасдсса адсаддбсбд дассасадсс 240

адсасадбдд абдаадсссб ддсссадсбд дссабдассд абасадсбсс адссдссдсб 300

- 131 029492

адсададсЬа 360	дсададЬдсс	ЬсЬдЬсЬддс	аЬддсссЬдс	сЬдЬддЬдЬс	Ьдссаадасс
дЬдсадсЬда 420	асдаЬддсдд	ссЬсдЬдсдд	асадЬдсаЬс	ЬдссЬдсЬсс	ЬааЬдЬддсс
ддссЬдсЬдЬ 480	сЬдсадсадд	сдЬдссасЬд	сЬдсададсд	аЬсаЬдЬддЬ	дссЬдссдсс
асадссссЬа 540	ЬсдЬддаадд	саЬдсадаЬс	саддЬсасас	ддаассддаЬ	саадааадЬд
ассдадсддс 600	ЬдссссЬдсс	ЬсссаасдсЬ	адаададЬдд	аадаЬсссда	даЬдаасаЬд
адсадададд 660	ЬддЬсдадда	сссЬддсдЬд	ссаддсасас	аддаЬдЬдас	аЬЬсдссдЬд
дссдаадЬда 720	асддсдЬдда	аассддсада	сЬдсссдЬдд	ссааЬдЬддЬ	ддЬсасасса
дсссаЬдадд 780	ссдЬсдЬсад	адЬдддсаса	аадссЬддса	сададдЬдсс	асссдЬдаЬс
дасддсадса 840	ЬсЬдддаЬдс	саЬЬдсссад	Ьдсаададсд	дсддааасЬд	ддссдссааЬ
ассддсааЬд 900	дссЬсЬаЬдд	сддссЬдсад	аЬсЬсЬсадд	ссдссЬддда	ЬЬсЬааЬддс
ддсдЬдддаЬ 960	сЬссЬдссдс	ЬдссЬсЬсса	садсадсада	ЬсдаддЬддс	сдасаасаЬс
аЬдаадасад 1020	ссддассЬдд	сдссЬддссс	аадЬдЬадса	дЬЬдЬЬсЬса	дддсдасдсс
ссЬсЬдддса 1080	дссЬдасаса	саЬссЬдаса	ЬЬЬсЬддссд	ссдадасадд	сддадссЬЬс
ЬсЬадассЬд 1140	дссЬдсссдЬ	ддааЬассЬд	саддЬсссаа	дссссадсаЬ	дддссдддаЬ
аЬсааддЬдс 1200	адЬЬЬсадад	сддсддсаас	аасадсссЬд	ссдЬдЬаЬсЬ	дсЬддаЬддс
сЬдададссс 1260	аддасдасЬа	саасддсЬдд	дасаЬсааса	ссссЬдссЬЬ	сдадЬддЬас
Ьассададсд 1320	дссЬдЬссаЬ	сдЬдаЬдссЬ	дЬдддсддсс	ададсадсЬЬ	сЬасадсдас
ЬддЬасадсс 1380	ссдссЬдЬдд	сааадссддс	ЬдссадассЬ	асаадЬддда	дасаЬЬссЬд
ассЬссдадс 1440	ЬдссссадЬд	дсЬдадсдсс	ааЬададссд	ЬдаадссЬас	аддсЬсЬдсс
дссаЬсддас	ЬдадсаЬддс	сддаадсЬсЬ	дссаЬдаЬсс	ЬддссдссЬа	ЬсасссЬсад

1500

- 132 029492

садДДсаДсД асдссддсад ссДдДсДдсс сДдсДддасс сДДсДсаддд саДдддсссД 1560

ДсДсДдаДсд дасДддсДаД дддсдасдсД ддсддаДаса аддссдссда ДаДдДддддс 1620

ссДадсадсд аДссДдссДд ддададааас дассссассс адсадаДссс саадсДддДд 1680

дссаасааса сссддсДдДд ддДдДасДдс ддсаасддса ссссДааДда асДдддсдда 1740

дссааДаДсс ссдссдадДД ссДддаааас ДДсдДдсдда дсадсаассД даадДДссад 1800

даДдссДаса асдссдсДдд сддссасаас дссдДдДДса асДДсссДсс сааДддсасс 1860

сасадсДддд адДасДдддд адсссадсДд аасдссаДда адддсдаДсД дсадДссДсД 1920

сДдддадссд дсадссадаД саДдДасаас Дассссдсса ДдсДдддсса сдссддсдаД 1980

аДддсДддаД аДдссддсас асДдсададс сДдддДдссд адаДДдссдД ддаасаддсД 2040

дсссДссадД сДдссДддса дддсдаДасс ддсаДсасаД ассаддсДДд дсаддсссад 2100

Дддаассадд ссаДддаада ДсДсдДдсдд дссДассасд ссаДдадсад сасасасдад 2160

дссаасасса ДддссаДдаД ддсссдддаД асадссдадд ссдсДаадДд дддаддаасс 2220

дадсадсадД ддаасДДсдс сддааДДдад дссдсДдсса дсдссаДсса дддсаасдДд 2280

асаДссаДсс асадссДдсД ддасдадддс аадсададсс ДдасаааасД ддсДдсДдсс 2340

ДддддсддсД сДддсДсДда адсДДаДсад ддсдДдсадс адаадДддда сдссассдсс 2400

ассдадсДда асаасдсссД дсадаассДд дсссддасаа ДсДсДдаадс сддасаддсс 2460

аДддссадса ссдадддсаа ДдДдассддс аДдДДДдссд аасааааасД саДсДсадаа 2520

даддаДсДдс аДсаДсаДса ДсаДсаДДда

2550

<210> 46

<211> 3597

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

- 133 029492

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°5

"33-Р1ад-Еу0569-Еу1813*-Еу3407-Еу3478-Еу1807-Мус-ТМ-Н1з Рад" (рТС18269)

<400> 46

аРддРассдс аадсссРдсР аРРсдРассР РРаРРддРсР РРссссРсРд РРРсддРаад 60

РРРссРаРад аРРасаадда РдасдасдаР аадааддсса аадРсддсда сРддсРддРс 120

аРсаадддсд ссассаРсда ссадсссдаР сасададдсс РдаРсаРсда адРдсддадс 180

адсдасддса дсссРссРРа сдРсдРсада РддсРддааа ссдассасдР ддссассдРд 240

аРсссРддас сРдаРдссдР ддрддрсасс дссдаддаас адааРдссдс сдаРдадада 300

дсссадсаса даРРсддадс сдРдсададс дссаРссРдс асдссададд аасадссаас 360

ддсадсаРда дсдаадРдаР даРдадсдад аРсдссддсс РдсссаРссс РсссаРсаРс 420

сасРаРддсд ссаРРдссРа сдссссРадс ддсдссРсРд даааадссРд дсассадада 480

асасссдсса дадссдааса ддРддсссРд даааадРдсд дсдасаадас сРдсааддРд 540

дрдрсссддр РсассадаРд РддсдссдРд дссРасаасд дсРссаадРа Рсадддсддс 600

ассддссРда саадаадддс сдсРдаддас дасдссдРда асадасРдда аддсддсада 660

аРсдРдаасР дддссРдсаа сададссасс дРдддасРдд РддаадссаР сддсаРсада 720

дадсРдадас адсасдссад садаРассРд дссададРдд аадссддсда ддаасРдддс 780

дрдассааса адддсадасР ддрддссада сРдаРсссРд Рдсаддссдс сдададаадс 840

адададдссс РдаРРдадад сддсдРдсРд аРсссРдсса дасддссРса даассРдсРд 900

даРдРдасад ссдадсссдс сададдссдд аададаассс РдадсдасдР дсРдаасдад 960

аРдсдддаРд аасаддРдда сРРсддсдсс сРдссРсссд адаРРааРад сдссаддаРд 1020

Расдссддсс сРддсадсдс РРсРсРддРд дссдсРдсса адаРдРддда РадсдРддсс 1080

адсдассРдР РсРсРдссдс садсдсаРРР сададсдРсд РдРддддасР сасРдРдддс 1140

- 134 029492

НсННддаНсд 1200	даНсННсНдс	сддНсНдаНд	дссдсНдсНд	ссНсНссННа	НдНддссНдд
аНдадсдНда 1260	ссдссддаса	ддсасадсНд	асадсНдсас	аддНссдадН	ддсНдссдсс
дсННасдада 1320	садссНасад	асНдасадНд	ссНссасссд	НдаНсдссда	дааНсддасс
дадсНсаНда 1380	сссНдассдс	сассааНсНд	сНсддссада	асассссНдс	саНсдаддсс
ааНсаддссд 1440	ссНасНсНса	ааНдНддддс	саадаНдссд	аддсНаНдНа	сддсНаНдса
дссасадссд 1500	ссасНдсНас	адаадсссНд	сНдсссННсд	аадаНдсссс	НсНдаНсаса
аасссНддсд 1560	дссНдсНдда	асаддссдНд	дсНдНддаад	аддссаНсда	НассдсНдсс
дссаассаас 1620	НсаНдаасаа	сдНдссасад	дсссНссадс	адсНддсНса	дссНдсНсад
ддсдНддНдс 1680	сННсНадсаа	дсНсддсдда	сНдНддассд	ссдНдНсНсс	НсаНсНдадс
ссНсНдадса 1740	асдНдНссНс	НаНсдссаас	аассасаНда	дсаНдаНддд	сассддсдНд
НссаНдасса 1800	асасссНдса	садсаНдсНд	аадддасНдд	ссссНдсНдс	НдсссаддсН
дНддааасад 1860	ссдссдаааа	НддсдНдНдд	дссаНдадса	дссНдддсНс	НсадсНддда
адсНсссНсд 1920	дННсННсНдд	асНдддадсН	ддсдНддссд	ссааНсНддд	аададсНдсН
НсНдНсддса 1980	дссНдНсНдН	дссНссНдсН	НдддссдсНд	сНаассаддс	НдНдасасса
дсНдсНадад 2040	сссНдссНсН	дассадссНд	асаНсНдссд	сНсадасадс	сссНддссас
аНдсНдддад 2100	дасНдссНсН	дддссасНсН	дНдааНдссд	дсадсддсаН	саасаасдсс
сНдададНдс 2160	сНдссададс	сНасдссаНс	сссадаасНс	садссдсНдд	сдаННННдсс
асссНсссас 2220	сНдадаНсаа	ННссдсНада	аНдНаНадсд	дадссдддНс	НдсНссНаНд
сНддсНдсНд 2280	сННсНдссНд	дсасддасНд	НсНдссдаас	Ндададссад	сдсссНдадс
Насадсадсд 2340	НдсНдадНас	ссНдассддс	даададНддс	асддассНдс	садсдссНсН

- 135 029492

аГдасадсад ссдсГдсссс аГаГдГсдса ГддаГдГсад ГсасГдсадГ дсдддссдаа 2400

саддсаддсд сГсаддсГда адсГдсадса дсадсГГаГд аадссдссГГ ГдссдсГаса 2460

дГсссассГс сГдГсаГГда ддссаассдд дсссадсГда ГддсГсГдаГ Гдссасааас 2520

дГдсГдддас адааГдсссс адссаГГдсс дсГасадаад сссадГаГдс сдадаГдГдд 2580

Гсссаддасд сГаГддсааГ дГаГдддГаГ дсГддсдссГ ссдссдсГдс сасасадсГд 2640

асассГГГса ссдадсссдГ дсадассасс ааГдссГсГд дасГддссдс ссадГсГдсс 2700

дссаГГдсГс аГдсГасадд сдссГсГдсГ ддддсГсадс адасаасасГ дГсссадсГд 2760

аГсдссдсса ГсссГадсдГ дсГдсаддда сГдадсадсГ сГассдссдс сасаГГГдсс 2820

ГсГддсссГа дсддасГдсГ дддсаГсдГд ддсадГддаа дсГссГддсГ ддаГаадсГд 2880

ГдддсссГдс Гддассссаа садсаасГГс Гддаасасаа ГсдссадсГс сддссГдГГГ 2940

сГдсссадса асассаГГдс сссаГГГсГд ддссГдсГдд дсддадГддс ГдсГдсадаГ 3000

дсГдсГдддд аГдГдсГддд сдаадссаса адсддаддас Гдддаддсдс ГсГддГддса 3060

ссГсГдддаГ сГдсаддсдд асГсддадда асадГддсГд саддасГддд сааГдсГдсс 3120

асадГдддса сасГдадсдГ дссассаГсГ ГддасадсГд ссдссссГсГ ддсГГсГссГ 3180

сГсддаГсГд сГсГдддсдд сассссГаГд дГддсГссас сГссГдсГдГ ддсГдссдда 3240

аГдссГддса ГдссГГГсдд сасааГдддс ддасадддсГ Гсддсададс сдГдссГсад 3300

ГасддсГГсс ддссГаасГГ сдГддссада ссГссГдсад сГддсдааса аааасГсаГс 3360

Гсадаададд аГсГдадсГа сдГасГдсГа Гсддсаддса сдГГдаГсдс асГааГдсГГ 3420

аГсаГсГГсс ГааГаассГд сГдсаадсдд дГГдаГаддс ссдааадГас ссаааддГсс 3480

ГГдададдГа ссддасдсаа сдГаГсддГа асдГсдсааа дсддсаадГГ саГГадсадГ 3540

- 136 029492

РдддадРсдс асаааРсадд 3597
<210>	47
<211>	3330
<212>	ДНК
<213>	искусственная ι
<220>
<223>	нк последовате.

"Κΐ39-Εν0569-Εν1813*-Εν3407-Εν3478-Εν1807-Μγσ-ΗίΞ Рад" (рТС18295)

<400> 47

аРддаРРаса аддаРдасда сдаРаадаад дссааадРсд дсдасРддсР ддРсаРсаад 60

ддсдссасса Рсдассадсс сдаРсасада ддссРдаРса РсдаадРдсд дадсадсдас 120

ддсадсссРс сРРасдРсдР садаРддсРд дааассдасс асдРддссас сдРдаРсссР 180

ддассРдаРд ссдРддРддР сассдссдад даасадааРд ссдссдаРда дададсссад 240

сасадаРРсд дадссдРдса дадсдссаРс сРдсасдсса даддаасадс саасддсадс 300

аРдадсдаад РдаРдаРдад сдадаРсдсс ддссРдссса РсссРсссаР саРссасРаР 360

ддсдссаРРд ссРасдсссс Радсддсдсс РсРддаааад ссРддсасса дадаасассс 420

дссададссд аасаддРддс ссРддаааад Рдсддсдаса адассРдсаа ддрддрдрсс 480

сддРРсасса даРдРддсдс сдРддссРас аасддсРсса адРаРсаддд сддсассддс 540

сРдасаадаа дддссдсРда ддасдасдсс дРдаасадас Рддааддсдд садааРсдРд 600

аасРдддссР дсаасададс сассдРддда сРддРддаад ссаРсддсаР садададсРд 660

адасадсасд ссадсадаРа ссРддссада дрддаадссд дсдаддаасР дддсдРдасс 720

аасаадддса дасРддРддс садасРдаРс ссРдРдсадд ссдссдадад аадсададад 780

дсссРдаРРд ададсддсдР дсРдаРсссР дссадасддс сРсадаассР дсРддаРдРд 840

асадссдадс ссдссададд ссддаадада асссРдадсд асдРдсРдаа сдадаРдсдд 900

даРдаасадд РддасРРсдд сдсссРдссР сссдадаРРа аРадсдссад даРдРасдсс 960

- 137 029492

ддсссбддса дсдсббсбсб ддбддссдсб дссаадабдб дддабадсдб ддссадсдас 1020

сбдббсбсбд ссдссадсдс абббсададс дбсдбдбддд дасбсасбдб дддсбсббдд 1080

абсддабсбб сбдссддбсб дабддссдсб дсбдссбсбс сббабдбддс сбддабдадс 1140

дбдассдссд дасаддсаса дсбдасадсб дсасаддбсс дадбддсбдс сдссдсббас 1200

дадасадссб асадасбдас адбдссбсса сссдбдабсд ссдадаабсд дассдадсбс 1260

абдасссбда ссдссассаа бсбдсбсддс садаасассс сбдссабсда ддссаабсад 1320

дссдссбасб сбсааабдбд дддссаадаб дссдаддсба бдбасддсба бдсадссаса 1380

дссдссасбд сбасадаадс ссбдсбдссс ббсдаадабд ссссбсбдаб сасааасссб 1440

ддсддссбдс бддаасаддс сдбддсбдбд даададдсса бсдабассдс бдссдссаас 1500

саасбсабда асаасдбдсс асаддсссбс садсадсбдд сбсадссбдс бсадддсдбд 1560

дбдссббсба дсаадсбсдд сддасбдбдд ассдссдбдб сбссбсабсб дадсссбсбд 1620

адсаасдбдб ссбсбабсдс саасаассас абдадсабда бдддсассдд сдбдбссабд 1680

ассаасассс бдсасадсаб дсбдааддда сбддссссбд сбдсбдссса ддсбдбддаа 1740

асадссдссд аааабддсдб дбдддссабд адсадссбдд дсбсбсадсб дддаадсбсс 1800

сбсддббсбб сбддасбддд адсбддсдбд дссдссаабс бдддаададс бдсббсбдбс 1860

ддсадссбдб сбдбдссбсс бдсббдддсс дсбдсбаасс аддсбдбдас ассадсбдсб 1920

ададсссбдс сбсбдассад ссбдасабсб дссдсбсада садссссбдд ссасабдсбд 1980

ддаддасбдс сбсбдддсса сбсбдбдааб дссддсадсд дсабсаасаа сдсссбдада 2040

дбдссбдсса дадссбасдс сабссссада асбссадссд сбддсдаббб бдссасссбс 2100

ссассбдада бсааббссдс бадаабдбаб адсддадссд ддбсбдсбсс бабдсбддсб 2160

- 138 029492

дсЕдсЕЕсЕд ссЕддсасдд асЕдЕсЕдсс даасЕдадад ссадсдсссЕ дадсЕасадс 2220

адсдЕдсЕда дЕасссЕдас сддсдаадад Еддсасддас сЕдссадсдс сЕсЕаЕдаса 2280

дсадссдсЕд ссссаЕаЕдЕ сдсаЕддаЕд ЕсадЕсасЕд садЕдсдддс сдаасаддса 2340

ддсдсЕсадд сЕдаадсЕдс адсадсадсЕ ЕаЕдаадссд ссЕЕЕдссдс ЕасадЕссса 2400

ссЕссЕдЕса ЕЕдаддссаа ссдддсссад сЕдаЕддсЕс ЕдаЕЕдссас ааасдЕдсЕд 2460

ддасадааЕд ссссадссаЕ ЕдссдсЕаса даадсссадЕ аЕдссдадаЕ дЕддЕсссад 2520

дасдсЕаЕдд сааЕдЕаЕдд дЕаЕдсЕддс дссЕссдссд сЕдссасаса дсЕдасассЕ 2580

ЕЕсассдадс ссдЕдсадас сассааЕдсс ЕсЕддасЕдд ссдсссадЕс ЕдссдссаЕЕ 2640

дсЕсаЕдсЕа саддсдссЕс ЕдсЕддддсЕ садсадасаа сасЕдЕссса дсЕдаЕсдсс 2700

дссаЕсссЕа дсдЕдсЕдса дддасЕдадс адсЕсЕассд ссдссасаЕЕ ЕдссЕсЕддс 2760

ссЕадсддас ЕдсЕдддсаЕ сдЕдддсадЕ ддаадсЕссЕ ддсЕддаЕаа дсЕдЕдддсс 2820

сЕдсЕддасс ссаасадсаа сЕЕсЕддаас асааЕсдсса дсЕссддссЕ дЕЕЕсЕдссс 2880

адсаасасса ЕЕдссссаЕЕ ЕсЕдддссЕд сЕдддсддад ЕддсЕдсЕдс адаЕдсЕдсЕ 2940

ддддаЕдЕдс Едддсдаадс сасаадсдда ддасЕдддад дсдсЕсЕддЕ ддсассЕсЕд 3000

ддаЕсЕдсад дсддасЕсдд аддаасадЕд дсЕдсаддас ЕдддсааЕдс ЕдссасадЕд 3060

ддсасасЕда дсдЕдссасс аЕсЕЕддаса дсЕдссдссс сЕсЕддсЕЕс ЕссЕсЕсдда 3120

ЕсЕдсЕсЕдд дсддсасссс ЕаЕддЕддсЕ ссассЕссЕд сЕдЕддсЕдс сддааЕдссЕ 3180

ддсаЕдссЕЕ ЕсддсасааЕ дддсддасад ддсЕЕсддса дадссдЕдсс ЕсадЕасддс 3240

ЕЕссддссЕа асЕЕсдЕддс садассЕссЕ дсадсЕддсд аасааааасЕ саЕсЕсадаа 3300

даддаЕсЕдс аЕсаЕсаЕса ЕсаЕсаЕЕда

3330

- 139 029492

<210> 48

<211> 2922

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид η° β

"33-Р1ад-Ад85В*-БЬл262б-КРРВ-Об1уЪ-1И1733*-Мус-Ηϊξ бад" (рТС18270)

<400> 48

абддббссбс аддсбсбссб дбббдбассс сббсбддббб ббссаббдбд ббббдддааа 60

ббсссбаббд аббасаадда бдасдасдаб ааддссббсб сбадассбдд ссбдсссдбд 120

даабассбдс аддбсссаад ссссадсабд ддссдддаба бсааддбдса дбббсададс 180

ддсддсааса асадсссбдс сдбдбабсбд сбддабддсс бдададссса ддасдасбас 240

аасддсбддд асабсаасас сссбдссббс дадбддбасб ассададсдд ссбдбссабс 300

дбдабдссбд бдддсддсса дадсадсббс басадсдасб ддбасадссс сдссбдбддс 360

ааадссддсб дссадассба саадбдддад асаббссбда ссбссдадсб дссссадбдд 420

сбдадсдсса абададссдб даадссбаса ддсбсбдссд ссабсддасб дадсабддсс 480

ддаадсбсбд ссабдабссб ддссдссбаб сасссбсадс адббсабсба сдссддсадс 540

сбдбсбдссс бдсбддассс ббсбсадддс абдддсссбб сбсбдабсдд асбддсбабд 600

ддсдасдсбд дсддабасаа ддссдссдаб абдбддддсс сбадсадсда бссбдссбдд 660

дададааасд ассссассса дсадабсссс аадсбддбдд ссаасаасас ссддсбдбдд 720

дбдбасбдсд дсаасддсас сссбаабдаа сбдддсддад ссаабабссс сдссдадббс 780

сбддаааасб бсдбдсддад садсаассбд аадббссадд абдссбасаа сдссдсбддс 840

ддссасаасд ссдбдббсаа сббсссбссс аабддсассс асадсбддда дбасбдддда 900

дсссадсбда асдссабдаа дддсдабсбд садбссбсбс бдддадссдд сасаассдсс 960

ададасабса бдаасдссдд сдбдассбдб дбдддсдадс асдадасасб дасадссдсс 1020

- 140 029492

дсЬсадЬаса Ьдадададса сдасаЬсддс дсссЬдссса ЬсЬдсддсда 1080

сЬдсасддса ЬдсЬдассда ссдддасаЬс дЬдаЬсаадд дссЬддсЬдс 1140

сссааЬасЬд сЬасадсЬдд сдадсЬддса ададасадса ЬсЬасЬасдЬ 1200

дссадсаЬсс аддаааЬдсЬ даасдЬдаЬд даадаасасс аддЬссдасд 1260

аЬсадсдаас асадасЬсдЬ дддсаЬсдЬд ассдаддссд аЬаЬсдссад 1320

дадсасдсса ЬсдЬдсадЬЬ сдЬдааддсс аЬсЬдсадсс ссаЬддсссЬ 1380

дЬддасддса ссдссаЬдад адЬдассасс аЬдаадЬсса дадЬдаЬсда 1440

дадаасддсЬ ЬсадсдЬдда сдассдддас дассЬдЬаЬс сЬдсЬдсЬдд 1500

сасдасдссд аЬасааЬсдЬ дсЬдсддада адсадасссс ЬдсадаЬсад 1560

сасдасдсса адсаддЬсЬд дассасадсс адсасадЬдд аЬдаадсссЬ 1620

дссаЬдассд аЬасадсЬсс адссдссдсЬ адсададсЬа дсададЬдсс 1680

аЬддсссЬдс сЬдЬддЬдЬс Ьдссаадасс дЬдсадсЬда асдаЬддсдд 1740

асадЬдсаЬс ЬдссЬдсЬсс ЬааЬдЬддсс ддссЬдсЬдЬ сЬдсадсадд 1800

сЬдсададсд аЬсаЬдЬддЬ дссЬдссдсс асадссссЬа ЬсдЬддаадд 1860

саддЬсасас ддаассддаЬ саадааадЬд ассдадсддс ЬдссссЬдсс 1920

адаададЬдд аадаЬсссда даЬдаасаЬд адсадададд ЬддЬсдадда 1980

ссаддсасас аддаЬдЬдас аЬЬсдссдЬд дссдаадЬда асддсдЬдда 2040

сЬдсссдЬдд ссааЬдЬддЬ ддЬсасасса дсссаЬдадд ссдЬсдЬсад 2100

аадссЬддса сададдЬдсс асссдЬдаЬс дасддсадса ЬсЬдддаЬдс 2160

Ьдсаададсд дсддааасЬд ддссдссааЬ ассддсааЬд дссЬсЬаЬдд 2220

сдаЬдаЬада

ЬддссЬддас

ддасдссаас

ддЬдсссдЬд

асаЬсЬдссс

ддссЬсЬасс

саЬсдЬддаа

адЬдсаддЬс

ссЬддаЬддс

ддсссадсЬд

ЬсЬдЬсЬддс

ссЬсдЬдсдд

сдЬдссасЬд

саЬдсадаЬс

ЬсссаасдсЬ

сссЬддсдЬд

аассддсада

адЬдддсаса

саЬЬдсссад

сддссЬдсад

- 141 029492

аНсНсНсадд ссдссНддда ННсНааНддс ддсдНдддаН сНссНдссдс НдссНсНсса 2280

садсадсада НсдаддНддс сдасаасаНс аНдаадасад ссддассНдд сдссНддссс 2340

аадНдНадса дННдННсНса дддсдасдсс ссНсНдддса дссНдасаса саНссНдаса 2400

НННсНддссд ссдадасадд сддадсНдда асадссдНдс аддаНадссд дНсссасдНд 2460

НасдсНсасс аддсссадас аадасасссН дссасадсса ссдНдаНсда ссасдадддс 2520

дНдаНсдаса дсаасассас сдссасаНсН дссссасссс ддассаадаН сасадНдссН 2580

дсНадаНддд НддНсаасдд саНсдадсдд адсддсдаад НдааНдссаа дсссддсасс 2640

аададсддсд асададНддд ааНсНдддНд дасНсНдссд дссадсНддН ддаНдаассН 2700

дссссНссНд ссададссаН НдссдаНдсН дсНсНддсНд сасНдддссН дНддсНдНсН 2760

дНддсадсНд НддсНддсдс асНдсНддсН сНдасаадад ссаНссНдаН сададНдсдд 2820

аасдссадНН ддсадсасда НаНсдасадс сНдННсНдса сссадсддда асааааасНс 2880

аНсНсадаад аддаНсНдад ссаНсаНсаН саНсаНсаНН да

2922

<210> 49

<211> 1875

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°8

"55-Р1ад-Ад85В*-Εν2626-Ενί733 *-Мус-Ηίз Над" (рТС18272)

<400> 49

аНддННссНс аддсНсНссН дНННдНассс сННсНддННН 60

ННсссНаННд аННасаадда НдасдасдаН ааддссННсН 120

дааНассНдс аддНсссаад ссссадсаНд ддссдддаНа 180

ддсддсааса асадсссНдс сдНдНаНсНд сНддаНддсс 240

аасддсНддд асаНсаасас сссНдссННс дадНддНасН 300

ННссаННдНд

сНадассНдд

НсааддНдса

Ндададссса

ассададсдд

ННННдддааа

ссНдсссдНд

дНННсададс

ддасдасНас

ссНдНссаНс

- 142 029492

дНдаНдссНд Ндддсддсса дадсадсННс НасадсдасН ддНасадссс сдссНдНддс 360

ааадссддсН дссадассНа саадНдддад асаННссНда ссНссдадсН дссссадНдд 420

сНдадсдсса аНададссдН даадссНаса ддсНсНдссд ссаНсддасН дадсаНддсс 480

ддаадсНсНд ссаНдаНссН ддссдссНаН сасссНсадс адННсаНсНа сдссддсадс 540

сНдНсНдссс НдсНддассс ННсНсадддс аНдддсссНН сНсНдаНсдд асНддсНаНд 600

ддсдасдсНд дсддаНасаа ддссдссдаН аНдНддддсс сНадсадсда НссНдссНдд 660

дададааасд ассссассса дсадаНсссс аадсНддНдд ссаасаасас ссддсНдНдд 720

дНдНасНдсд дсаасддсас сссНааНдаа сНдддсддад ссааНаНссс сдссдадННс 780

сНддаааасН НсдНдсддад садсаассНд аадННссадд аНдссНасаа сдссдсНддс 840

ддссасаасд ссдНдННсаа сННсссНссс ааНддсассс асадсНддда дНасНдддда 900

дсссадсНда асдссаНдаа дддсдаНсНд садНссНсНс Ндддадссдд сасаассдсс 960

ададасаНса Ндаасдссдд сдНдассНдН дНдддсдадс асдадасасН дасадссдсс 1020

дсНсадНаса Ндадададса сдасаНсддс дсссНдссса НсНдсддсда сдаНдаНада 1080

сНдсасддса НдсНдассда ссдддасаНс дНдаНсаадд дссНддсНдс НддссНддас 1140

сссааНасНд сНасадсНдд сдадсНддса ададасадса НсНасНасдН ддасдссаас 1200

дссадсаНсс аддаааНдсН даасдНдаНд даадаасасс аддНссдасд ддНдсссдНд 1260

аНсадсдаас асадасНсдН дддсаНсдНд ассдаддссд аНаНсдссад асаНсНдссс 1320

дадсасдсса НсдНдсадНН сдНдааддсс аНсНдсадсс ссаНддсссН ддссНсНдсН 1380

ддаасадссд НдсаддаНад ссддНсссас дНдНасдсНс ассаддссса дасаадасас 1440

ссНдссасад ссассдНдаН сдассасдад ддсдНдаНсд асадсаасас сассдссаса 1500

- 143 029492

РсРдссссас сссддассаа даРсасадРд ссРдсРадаР дддрддрсаа 1560

сддадсддсд аадРдааРдс саадсссддс ассаададсд дсдасададР 1620

дРддасРсРд ссддссадсР ддРддаРдаа ссРдссссРс сРдссададс 1680

дсРдсРсРдд сРдсасРддд ссРдРддсРд РсРдРддсад сРдРддсРдд 1740

дсРсРдасаа дадссаРссР даРсададРд сддаасдсса дррддсадса 1800

адссРдРРсР дсасссадсд ддаасааааа сРсаРсРсад аададдаРсР 1860

саРсаРсаРс аРРда

1875

сддсаРсдад

дддааРсРдд

саРРдссдаР

сдсасРдсРд

сдаРаРсдас

дадссаРсаР

<210> 50

<211> 2845

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид №13

"33-Р1ад-Еу2029*-Еу2626-Еу1733*-Еу0111*-Мус-Н1з

<400> 50

аРдддРсРса аддРдаасдР сРсРдссаРа РРсаРддсад РасРдРРаас 60

сссассддРс аааРссаРРд дддсдаРРас ааддаРдасд асдаРаадас 120

дссРдддаРд адддсаадсс садааРсаРс асссРдасса Рдаассссдс 180

ассассадсд РддасдРсдР дсддсссасс дадаадаРда даРдРддсдс 240

дасссРддсд дсддаддааР саасдРддсс адааРсдРдс асдРдсРддд 300

ассдсссРдР РРссадсРдд сддсРсРаса ддсРсРсРдс РдаРддсссР 360

дссддсдРдс ссРРсададР даРсссРаРс дссдссадса сссдсдадад 420

ааРдададсс ддассдссаа дсадРасада РРсдРдсРдс сРддссссад 480

дссдаасадд аасадРдссР ддасдадсРд ададдсдссд сРдссРсРдс 540

дРддссРсРд дсРсРсРдсс РссРддсдРд дссдссдасР асРаРсадад 600

Рад" (рТС18323)

РсРссаааса

сдадссРдсс

ссРддасаРс

сссРадаРас

сддсРдРадс

дсРдддадаР

сРРсассдРд

ссРдасадРд

РдсРРРРдРд

адРддссдас

144 029492

аНсНдссддс ддадсадсас ассНсНдаНс сНддаНасаа дсддсддадд ссНдсадсаН 660

аНсадсадсд дадНдННссН дсНдааддсс адсдНссдсд адсНдаддда аНдНдНддда 720

адсдадсНдс Ндассдадсс сдаасадсНд дссдсНдссс асдадсНдаН сдаНададдс 780

ададссдадд НддНддНддН дНсНсНддда НсНсадддсд сНсНдсНддс сасаадасас 840

дссадссасс ддННсадсад саНсссНаНд асадссдНдН сНддсдНддд адссддсааН 900

дсНаНддНдд ссдссаНсас адНдддссНд НсНададдсН ддНсссНдаН саадНсНдНд 960

сддсНдддса аНдссдсНдд сдсНдсНаНд сНдсНдасас сНддаассдс сдссНдсаас 1020

адддасдасд НддаасддНН сННсдадаса ассдссадад асаНсаНдаа сдссддсдНд 1080

ассНдНдНдд дсдадсасда дасасНдаса дссдссдсНс адНасаНдад ададсасдас 1140

аНсддсдссс НдсссаНсНд сддсдасдаН даНадасНдс асддсаНдсН дассдассдд 1200

дасаНсдНда НсаадддссН ддсНдсНддс сНддасссса аНасНдсНас адсНддсдад 1260

сНддсаадад асадсаНсНа сНасдНддас дссаасдсса дсаНссадда ааНдсНдаас 1320

дНдаНддаад аасассаддН ссдасдддНд сссдНдаНса дсдаасасад асНсдНдддс 1380

аНсдНдассд аддссдаНаН сдссадасаН сНдсссдадс асдссаНсдН дсадННсдНд 1440

ааддссаНсН дсадссссаН ддсссНддсс НсНдсНддаа садссдНдса ддаНадссдд 1500

НсссасдНдН асдсНсасса ддсссадаса адасасссНд ссасадссас сдНдаНсдас 1560

сасдадддсд НдаНсдасад саасассасс дссасаНсНд ссссассссд дассаадаНс 1620

асадНдссНд сНадаНдддН ддНсаасддс аНсдадсдда дсддсдаадН дааНдссаад 1680

сссддсасса ададсддсда сададНддда аНсНдддНдд асНсНдссдд ссадсНддНд 1740

даНдаассНд ссссНссНдс сададссаНН дссдаНдсНд сНсНддсНдс асНдддссНд 1800

- 145 029492

бддсбдбсбд бддсадсбдб ддсбддсдса сбдсбддсбс бдасаададс сабссбдабс 1860

ададбдсдда асдссадббд дсадсасдаб абсдасадсс бдббсбдсас ссадсдддад 1920

садсссабса даадабддсд дссбдссада дбдссасбдс бдссасбддс бдсбдсбаса 1980

дбддсббсбд ссдссдсбдб дассабдсбд дбддбдссбд бдддадсбдд ассбддссбд 2040

адададабсд дасбдссасс аддсдбдбса дссдбддсбд сбдбдбсбсс бадсссбссб 2100

даадссбсбс адссбдсссс бддсссаада дабсссааса дасссббсас сдбдбссдбд 2160

ббсддсдаса дсабсддсбд дасссбдабд сасбассбдс сбсссасссс бддсббссдд 2220

ббсабсдасс асасадбдаб сддсбдсадб сбсдбдсддд дсассссбба садабабабс 2280

ддссадассс бддаасадсд ддссдадбдб дабддабддс сбдсбаддбд дбссдсссад 2340

дбсаасадад абсадсссда сдбддсасбд сбдабсдбдд дсадабддда дасадбддас 2400

ададбдаасд адддссддбд дасссасабс ддсдасссба ссбббдасдс сбассбдаас 2460

дссдадсбдс адсдддсссб дбсбабсдбд ддаадсасад дсдбсададб дабддбсасс 2520

ассдбдсссб асадсададд сддсдадаад ссбдасддса дасбдбассс бдаддассад 2580

сссдадсдсд бдаасаадбд даасдссабд сбдсасаасд ссабсадсса дсасадсаас 2640

дбдддсабда бсдассбдаа саадаадсбд бдссссдасд дсдбдбасас сдссааддбд 2700

дасддаабса аадбдсддад сдасддсдбд сассбдассс аддааддсдб даадбддсбд 2760

абссссбддс бддаадабад сдбдсдддбд дссбсбдаас ааааасбсаб сбсадаадад 2820

дабсбдадсс абсабсабса бсабс

2845

<210> 51

<211> 2547

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

- 146 029492

<223> нк последовательность, кодирующая гибрид п°14

"33-Е1ад-К\л2029*-ТВ10.4-ЕЗАТ6-ΚνΟ 111*-Мус-Нгз Рад" (рТС18324)

<400> 51 аРдддРсРса 60	аддРдаасдР	сРсРдссаРа	РРсаРддсад	РасРдРРаас	РсРссаааса
сссассддРс 120	аааРссаРРд	дддсдаРРас	ааддаРдасд	асдаРаадас	сдадссРдсс
дссРдддаРд 180	адддсаадсс	садааРсаРс	асссРдасса	Рдаассссдс	ссРддасаРс
ассассадсд 240	РддасдРсдР	дсддсссасс	дадаадаРда	даРдРддсдс	сссРадаРас
дасссРддсд 300	дсддаддааР	саасдРддсс	адааРсдРдс	асдРдсРддд	сддсРдРадс
ассдсссРдР 360	РРссадсРдд	сддсРсРаса	ддсРсРсРдс	РдаРддсссР	дсРдддадаР
дссддсдРдс 420	ссРРсададР	даРсссРаРс	дссдссадса	сссдсдадад	сРРсассдРд
ааРдададсс 480	ддассдссаа	дсадРасада	РРсдРдсРдс	сРддссссад	ссРдасадРд
дссдаасадд 540	аасадРдссР	ддасдадсРд	ададдсдссд	сРдссРсРдс	РдсРРРРдРд
дРддссРсРд 600	дсРсРсРдсс	РссРддсдРд	дссдссдасР	асРаРсадад	адРддссдас
аРсРдссддс 660	ддадсадсас	ассРсРдаРс	сРддаРасаа	дсддсддадд	ссРдсадсаР
аРсадсадсд 720	дадРдРРссР	дсРдааддсс	адсдРссдсд	адсРдаддда	аРдРдРддда
адсдадсРдс 780	Рдассдадсс	сдаасадсРд	дссдсРдссс	асдадсРдаР	сдаРададдс
ададссдадд 840	РддРддРддР	дРсРсРддда	РсРсадддсд	сРсРдсРддс	сасаадасас
дссадссасс 900	ддРРсадсад	саРсссРаРд	асадссдРдР	сРддсдРддд	адссддсааР
дсРаРддРдд 960	ссдссаРсас	адРдддссРд	РсРададдсР	ддРсссРдаР	саадРсРдРд
сддсРдддса 1020	аРдссдсРдд	сдсРдсРаРд	сРдсРдасас	сРддаассдс	сдссРдсаас
адддасдасд 1080	РддаасддРР	сРРсдададс	садаРсаРдР	асаасРассс	сдссаРдсРд
ддссасдссд	дсдаРаРддс	РддаРаРдсс	ддсасасРдс	ададссРддд	РдссдадаРР

1140

- 147 029492

дссдЕддаас аддсЕдсссЕ ссадЕсЕдсс Еддсадддсд аЕассддсаЕ сасаЕассад 1200

дсЕЕддсадд сссадЕддаа ссаддссаЕд даадаЕсЕсд ЕдсдддссЕа ссасдссаЕд 1260

адсадсасас асдаддссаа сассаЕддсс аЕдаЕддссс дддаЕасадс сдаддссдсЕ 1320

аадЕддддад даассдадса дсадЕддаас ЕЕсдссддаа ЕЕдаддссдс Едссадсдсс 1380

аЕссадддса асдЕдасаЕс саЕссасадс сЕдсЕддасд адддсаадса дадссЕдаса 1440

ааасЕддсЕд сЕдссЕдддд сддсЕсЕддс ЕсЕдаадсЕЕ аЕсадддсдЕ дсадсадаад 1500

Едддасдсса ссдссассда дсЕдаасаас дсссЕдсада ассЕддсссд дасааЕсЕсЕ 1560

даадссддас аддссаЕддс садсассдад ддсааЕдЕда ссддсаЕдЕЕ Едссдадсад 1620

сссаЕсадаа даЕддсддсс ЕдссададЕд ссасЕдсЕдс сасЕддсЕдс ЕдсЕасадЕд 1680

дсЕЕсЕдссд ссдсЕдЕдас саЕдсЕддЕд дЕдссЕдЕдд дадсЕддасс ЕддссЕдада 1740

дадаЕсддас Едссассадд сдЕдЕсадсс дЕддсЕдсЕд ЕдЕсЕссЕад сссЕссЕдаа 1800

дссЕсЕсадс сЕдссссЕдд сссаададаЕ сссаасадас ссЕЕсассдЕ дЕссдЕдЕЕс 1860

ддсдасадса ЕсддсЕддас ссЕдаЕдсас ЕассЕдссЕс ссассссЕдд сЕЕссддЕЕс 1920

аЕсдассаса садЕдаЕсдд сЕдсадЕсЕс дЕдсддддса ссссЕЕасад аЕаЕаЕсддс 1980

садасссЕдд аасадсдддс сдадЕдЕдаЕ ддаЕддссЕд сЕаддЕддЕс сдсссаддЕс 2040

аасададаЕс адсссдасдЕ ддсасЕдсЕд аЕсдЕдддса даЕдддадас адЕддасада 2100

дЕдаасдадд дссддЕддас ссасаЕсддс дасссЕассЕ ЕЕдасдссЕа ссЕдаасдсс 2160

дадсЕдсадс дддсссЕдЕс ЕаЕсдЕддда адсасаддсд ЕсададЕдаЕ ддЕсассасс 2220

дЕдсссЕаса дсададдсдд сдадаадссЕ дасддсадас ЕдЕасссЕда ддассадссс 2280

дадсдсдЕда асаадЕддаа сдссаЕдсЕд сасаасдсса Есадссадса садсаасдЕд 2340

- 148 029492

ддсаДдаДсд ассДдаасаа даадсДдДдс сссдасддсд ДдДасассдс сааддДддас 2400

ддааДсааад Ддсддадсда сддсдДдсас сДдасссадд ааддсдДдаа дДддсДдаДс 2460

сссДддсДдд аадаДадсдД дсдддДддсс ДсДдаасааа аасДсаДсДс адаададдаД 2520

сДдадссаДс аДсаДсаДса ДсаДДда

2547

<210> 52

<211> 34

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 52

сдсддссдса ссаДддаДДа сааддаДдас дасд 34

<210> 53

<211> 34

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 53

сдДсдДсаДс сДДдДааДсс аДддДдсддс сдсд 34

<210> 54

<211> 39

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 54

саДсДсадаа даддаДсДдс аДсаДсаДса ДсаДсаДДд 39

<210>	55
<211>	39
<212>	ДНК
<213>	искусственная последовательность
<220> <223>	праймер
<400>	55

- 149 029492

саабдабдаб дабдабдабд садабссбсб бсбдадабд 39

<210> 56

<211> 40

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 56

дабдасдасд абааддсбад сададссасс дбдддасбдд 40

<210> 57

<211> 41

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 57

дабдадбббб бдббсдсбад ссбдббсабс ссдсабсбсд б 41

<210> 58

<211> 37

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 58

дабдасдасд абааддсбад сааддссааа дбсддсд 37

<210> 59

<211> 37

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 59

дабдадбббб бдббсдсбад сбдббссбсб ддсдбдс 37

<210> 60

<211> 41

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

- 150 029492

<220>

<223> праймер

<400> 60

дабдасдасд абааддсбад сдаббббдсс асссбсссас с 41

<210> 61

<211> 43

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 61

дадабдадбб бббдббсдсб адсдссадсб дсаддаддбс бдд 43

<210> 62

<211> 40

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 62

дабдасдасд абааддсбад сдссаасддс адсабдадсд 40

<210> 63

<211> 43

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 63

дадабдадбб бббдббсдсб адсдббдсад дсссадббса еда 43

<210> 64

<211> 40

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 64

дабдасдасд абааддсбад сдбддасббс ддсдсссбдс 40

<210> 65

- 151 029492

<211> 43

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 65

дадаНдадНН НННдННсдсН адсдссадсд дсНддадННс Ндд 43

<210> 66

<211> 42

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 66

даНдасдасд аНааддсНад сасаассдсс ададасаНса Нд 42

<210> 67

<211> 40

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 67

даНдадНННН НдННсдсНад сададдссад ддссаНдддд 40

<210> 68

<211> 35

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 68

дННННддааа аННсссааНа ассдНддасд дсасс

35
<210>	69
<211>	35
<212>	ДНК
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	праймер
<400>	69

- 152 029492

ддНдссдНсс асддННаННд ддааННННсс аааас 35

<210> 70

<211> 35

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 70

дассддсаНд НННдссадсН аНдННсННсН сНсНд 35

<210> 71

<211> 35

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 71

садададаад аасаНадсНд дсааасаНдс сддНс 35

<210> 72

<211> 38

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 72

дНННсддНаа дНННссНаНа ааддссааад Нсддсдас 38

<210> 73

<211> 38

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 73

дНсдссдасН ННддссНННа НаддааасНН ассдааас 38

<210> 74

<211> 32

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

- 153 029492

<220>

<223> праймер

<400> 74

ссНссНдсад сНддсадсНа сдНасНдсНа Нс 32

<210> 75

<211> 32

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 75

даНадсадНа сдНадсНдсс адсНдсадда дд 32

<210> 76

<211> 36

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 76

дННННдддаа аННсссНаНН дссННсНсНа дассНд 36

<210> 77

<211> 36

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер

<400> 77

саддНсНада дааддсааНа дддааНННсс саааас 36

<210> 78

<211> 44

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 78

даНсадаНаН сдсддссдсс дНасдассаН ддНассасаа деде

44
<210>	79
<211>	32
<212>	ДНК

- 154 029492

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 79

ддсддсаддс бсддбдсссс аабддабббд ас 32

<210> 80

<211> 124

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> промотор р7.5К

<400> 80

ссасссасбб бббабадбаа дбббббсасс сабааабааб ааабасааба аббаабббсб 60

сдбаааадба даааабабаб бсбаабббаб бдсасддбаа ддаадбадаа бсабааадаа 120

садб

124

<210> 81

<211> 30

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 81

дсбддбадаб сбсссассса сбббббабад 30

<210> 82

<211> 42

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 82

ссббдадасс сабддбддас бдббсбббаб даббсбасбб сс 42

<210> 83

<211> 43

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

- 155 029492

<223> праймер

<400> 83

дНадааНсаН ааадаасадН ссассаНддд НсНсааддНд аас 43

<210> 84

<211> 55

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 84

дадНсаННсН сдасННдсдд ссдсасаааа аНсаададдс сасссдсасд сНаНс 55

<210> 85

<211> 114

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> промотор рН5К

<400> 85

НННаННсНаН асННаааааа НдааааНааа НасаааддНН сННдадддНН дНдННаааНН 60

дааадсдада ааНааНсаНа ааННаНННса ННаНсдсдаН аНссдННаад НННд 114

<210> 86

<211> 56

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 86

ссНсННдаНН НННдНдсддс сдсНННаННс НаНасННааа аааНдааааН аааНас 56

<210> 87

<211> 39

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 87

ддасаННааН НаасааасНН аасддаНаНс дсдаНааНд 39

- 156 029492

<210> 88

<211> 36

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 88

ддсасННааН НаассассаН ддНассасаа дсдсНд 36

<210> 89

<211> 48

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 89

дННаасдсНа дссНсдадас аааааНсааа дасдНдНННс дссНссас 48

<210> 90

<211> 42

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 90

ддсасННааН НаассассаН дассдНддас ддсассдсса Кд 42

<210> 91

<211> 51

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 91

дККаасдсКа дссКсдадас аааааКсадд сааасаКдсс ддКсасаККд с

51
<210>	92
<211>	100
<212>	ДНК
<213>	искусственная последовательность
<220>
<223>	промотор В2Е
<400>	92

- 157 029492

ЬаЬаЬЬаЬЬа адЬдЬддЬдЬ ЬЬддЬсдаЬд ЬааааЬЬЬЬЬ дЬсдаЬаааа аЬЬааааааЬ 60

аасЬЬааЬЬЬ аЬЬаЬЬдаЬс ЬсдЬдЬдЬас аассдаааЬс

100

<210> 93

<211> 35

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 93

ддаЬссЬсда дЬаЬаЬЬаЬЬ аадЬдЬддЬд ЬЬЬдд 35

<210> 94

<211> 48

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 94

сЬЬдсддЬас саЬддЬдддс ЬадсдаЬЬЬс ддЬЬдЬасас асдадаЬс 48

<210> 95

<211> 45

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 95

дЬдЬдЬасаа ссдаааЬсдс Ьадсссасса ЬддЬассдса адссс 45

<210> 96

<211> 34

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 96

сЬЬЬссддаЬ ссасаааааЬ сасаддсддд ЬсЬс 34

<210> 97

<211> 52

- 158 029492

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 97

дрдрдрасаа ссдаааРсдс Радсссасса Рдааддссаа адРсддсдас Рд 52

<210> 98

<211> 33

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 98

дадРсддаРс сасаааааРс адссадсРдс адд 33

<210> 99

<211> 49

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 99

дадРсаРРсР сдасРРдсдд ссдсасаааа аРсаададдс сасссдсас 49

<210> 100

<211> 40

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность <220>

<223> праймер

<400> 100

дсРддРддаР сссасссасР РРРРаРадРа адРРРРРсас 40

<210> 101

<211> 37

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 101

ддсасРРааР РаассассаР ддРРссРсад дсРсРсс

37

<210> 102 <211> 44

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> праймер

<400> 102

дРРаасдсРа дссРсдадас аааааРсасс дсРдддРдса даас 44

- 159 029492

Claims (38)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Иммуногенная комбинация, содержащая по меньшей мере 5 разных антигенов, где указанные антигены независимо получены из видов рода микобактерий, где эти по меньшей мере 5 микобактериальных антигенов выбраны из группы, состоящей из Е8АТ-6 (Ку3875), ТВ10.4 (Ку0288), Ад85В (Ку1886), КрГВ, КрГО, Ку0111, Ку0569, Ку1733с, Ку1807, Ку1813, Ку2029с, Ку2626, Ку3407 и Ку3478.
2. 2. Иммуногенная комбинация, содержащая молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие по меньшей мере 5 антигенов, где указанные антигены независимо получены из видов рода микобактерий, где эти по меньшей мере 5 микобактериальных антигенов выбраны из группы, состоящей из Е8АТ-6 (Ку3875), ТВ10.4 (Ку0288), А§85В (Ку1886), КрГВ, КрГО, Ку0111, Ку0569, Ку1733с, Ку1807, Ку1813, Ку2029с, Ку2626, Ку3407 и Ку3478.
3. 3. Иммуногенная комбинация по любому из пп.1 или 2, где микобактериальные антигены получены из видов микобактерий туберкулезного комплекса, выбранных из группы, состоящей из М. !иЬегси1оз1з (М!Ь), М. Ьоу1з, М. Ьоу1з ВСС, М. айтсапит, М. сапе!!1, М. саргае и М. писгоЕ.
4. 4. Иммуногенная комбинация по п.1 или 2, где указанная иммуногенная композиция содержит или кодирует микобактериальные антигены по меньшей мере из 2 разных фаз инфекции, выбранных из группы, состоящей из активной фазы, фазы оживления и латентной фазы.
5. 5. Иммуногенная комбинация по п.4, где указанная иммуногенная композиция является многофазной, содержащей или кодирующей по меньшей мере один антиген из фазы активной инфекции, по меньшей мере один антиген из фазы оживления инфекции и по меньшей мере один антиген из фазы латентной инфекции.
6. 6. Иммуногенная комбинация по п.4 или 5, где указанный антиген(ы) активной фазы выбран(ы) из группы, состоящей из Е8АТ-6 (Ку3875), ТВ10.4 (Ку0288), Ад85В (Ку1886) и белка семейства РРЕ Ку3478.
7. 7. Иммуногенная комбинация по п.6, где указанная иммуногенная композиция содержит или экспрессирует, по меньшей мере, Е8АТ-6 (Ку3875), Ад85В (Ку1886) и ТВ10.4 (Ку0288).
8. 8. Иммуногенная комбинация по п.4 или 5, где указанный антиген(ы) латентной фазы выбран(ы) из группы, состоящей из Ку0111, Ку0569, Ку1733, Ку1807, Ку1813, Ку2029, Ку2626, Ку3407 и Ку3478.
9. 9. Иммуногенная комбинация по п.4 или 5, где указанный антиген(ы) фазы оживления выбран(ы) из группы, состоящей из КрГВ и КрГО.
10. 10. Иммуногенная комбинация по п.9, где указанная иммуногенная композиция содержит или экспрессирует, по меньшей мере, КрГВ и КрГО.
11. 11. Иммуногенная комбинация по п.1 или 2, где по меньшей мере 5 микобактериальных антигенов выбраны из группы полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% гомологичную или идентичную любой из 5>ЕС ГО N0: 1-11 и 13-24.
12. 12. Иммуногенная комбинация по любому из пп.1-9, которая содержит дополнительный микобактериальный антиген(ы).
13. 13. Иммуногенная комбинация по любому из пп.1-12, где указанная иммуногенная комбинация содержит или кодирует микобактериальные антигены в форме отдельных полипептидов, или в форме одного или более чем одного слитого полипептида, или в форме и отдельного(ных) антигена(нов) и гибрида(ов).
14. 14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере 5 указанных микобактериальных антигенов, содержащихся в иммуногенной комбинации по любому из пп.1-13.
15. 15. Молекула нуклеиновой кислоты по п.14, которая демонстрирует по меньшей мере 80%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью, показанной в любой из 5>ЕС ГО N0: 40-51, или ее фрагмент.
16. 16. Вектор, содержащий одну или более чем одну молекулу нуклеиновой кислоты по п.14 или 15.
17. 17. Вектор по п.16, где указанный вектор представляет собой плазмиду или вирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из ретровируса, аденовируса, аденосателлитного вируса (ААУ), вируса оспы, вируса герпеса, вируса кори, пенящего вируса, альфа-вируса, вируса везикулярного стоматита.
18. 18. Вектор по п.17, где указанный вектор представляет собой аденовирусный вектор, дефектный по Е1.
19. 19. Вектор по п.18, где указанный вектор представляет собой вектор на основе вируса оспы, выбранный из группы, состоящей из вектора на основе вируса оспы кур, вируса канарипокс и вируса осповакцины.
20. 20. Вектор по п.19, где указанный вектор на основе вируса осповакцины основан на штаммах Сорепйадеп, ХУуеЕт №УУАС и модифицированном штамме Анкара (МУА).
21. 21. Вектор по п.16, где указанный вектор представляет собой бактериальную клетку, выбранную из группы, состоящей из М. Ьоу1з ВСС, Ьас!оЬасШиз, Ыз!епа, 8а1топе11а и Рзеийотопаз.
22. 22. Вектор по любому из пп.16-21, который выбран из группы, состоящей из следующих:

    ί) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий Ку2029, Ку2626, Ку1733 и Ку0111, и слитый полипептид, содержащий КрГВ, КрГО, Ад85В, ТВ10.4 и Е8АТ-6;

    - 160 029492

    ίί) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий Κν2029, Κν2626, Κν1733 и Κν0111, слитый полипептид, содержащий ИрГВ, ИрГО, Ад85В, ТВ10.4 и Е8АТ-6, и слитый полипептид, содержащий Κν0569, Κν1813, Κν3407, Κν3478 и Κν1807;

    ίίί) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий Κν2029, Κν2626, Κν1733 и Κν0111, слитый полипептид, содержащий ИрГВ, ИрГО, Ад85В, ТВ10.4 и Е8АТ-6, и слитый полипептид, содержащий Κν0569, Κν1813, Κν3407, Κν3478 и Κν1807;

    ίν) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий Ад85В, Κν2626, ИрГВ, ИрГО и Κν1733, и слитый полипептид, содержащий Κν2029, ТВ 10.4, Е8АТ-6 и Κν0111;

    ν) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий Ад85В, Κν2626, ИрГВ, ИрГО и Κν1733, слитый полипептид, содержащий Κν2029, ТВ10.4, Е8АТ-6 и Κν0111, и слитый полипептид, содержащий Κν0569, Κν1813, Κν3407, Κν3478 и Κν1807; и

    νΐ) вектор, кодирующий слитый полипептид, содержащий ИрГВ, ИрГО, Ад85В, ТВ10.4 и Е8АТ-6, и слитый полипептид, содержащий Κν0569, Κν1813, Κν3407, Κν3478 и Κν1807.
23. 23. Вектор по любому из пп. 16-22, который находится в форме инфекционных вирусных частиц.
24. 24. Способ получения инфекционных вирусных частиц, включающий стадии (ί) введения вирусного вектора по любому из пп.17-20 и 22, 23 в подходящую линию клеток; (ίί) культивирования указанной линии клеток при подходящих условиях так, чтобы обеспечивать продукцию указанных инфекционных вирусных частиц; (ίίί) выделения продуцированной вирусной частицы из культуры указанной линии клеток.
25. 25. Способ по п.24, дополнительно содержащий стадию (ίν) очистки указанной выделенной вирусной частицы.
26. 26. Клетка-хозяин, содержащая иммуногенную комбинацию по любому из пп.1-13, молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.14, 15 или вектор по любому из пп.16-23.
27. 27. Способ рекомбинантной продукции микобактериальных антигенов, содержащихся в или кодируемых иммуногенной комбинацией по любому из пп.1-13, который включает стадии (ί) введения вектора в подходящую клетку-хозяина с получением трансфицированной или инфицированной клеткихозяина; (ίί) культивирования ίη νίΐΓο указанной трансфицированной или инфицированной клеткихозяина при подходящих условиях для роста клетки-хозяина; (ίίί) выделения клеточной культуры.
28. 28. Способ по п.27, дополнительно содержащий стадию (ίν) очистки микобактериального антигена(ов) или слитого полипептида из выделенной клетки и/или супернатанта культуры.
29. 29. Способ по п.27 или 28, в котором указанная подходящая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Е.соП и, в частности, штамм Е.соП, несущий в его геноме профаг Ό13.
30. 30. Композиция для предотвращения или лечения инфекции микобактерией или любого заболевания и патологического состояния, вызванного или ассоциированного с такой инфекцией микобактерией, содержащая по меньшей мере одну иммуногенную комбинацию по любому из пп.1-13, а также фармацевтически приемлемый носитель.
31. 31. Композиция для предотвращения или лечения инфекции микобактерией или любого заболевания и патологического состояния, вызванного или ассоциированного с такой инфекцией микобактерией, содержащая по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп.14, 15, а также фармацевтически приемлемый носитель.
32. 32. Композиция для предотвращения или лечения инфекции микобактерией или любого заболевания и патологического состояния, вызванного или ассоциированного с такой инфекцией микобактерией, содержащая, по меньшей мере, вектор по любому из пп.16-23, а также фармацевтически приемлемый носитель.
33. 33. Применение композиции по любому из пп.30-32 для предупреждения или лечения инфекции микобактерией или любого заболевания и патологического состояния, вызванного или ассоциированного с такой инфекцией микобактерией.
34. 34. Применение по п.33

    для предупреждения инфекции или откладывания риска инфекции микобактерией у субъекта, нуждающегося в этом, особенно субъекта, который находился в тесном контакте с инфицированным индивидом, имеющим развившееся активное заболевание;

    для лечения активного заболевания у субъекта, инфицированного видом микобактерии и особенно М. 1иЪегси1о818;

    для предупреждения или лечения реактивации у субъекта, латентно инфицированного видом микобактерии и особенно М. 1иЪегси1о818; или

    в качестве бустера ВСС.
35. 35. Применение по любому из пп.33, 34 в ассоциации с одной или более чем одной химиотерапией антибиотиками.
36. 36. Применение по любому из пп.33-35 для индуцирования или усиления иммунного ответа у субъекта, которому осуществлялось введение.
37. 37. Применение по п.36, где указанный индуцированный или стимулированный иммунный ответ представляет собой ответ Т-клеток, опосредованный СЭ4+ и/или СЭ8+, направленный на микобактери- 161 029492

    альный антиген/эпитоп.
38. 38. Набор реактивов для диагностики инфекции микобактерией, содержащий иммуногенную комбинацию по любому из пп.1-13 и инструкцию для диагностики инфекции микобактерией.