CN101198358A

CN101198358A - 具有增强的逃出内体能力的重组bcg菌株

Info

Publication number: CN101198358A
Application number: CNA2005800414383A
Authority: CN
Inventors: 孙荣改; 大卫·迈克尔·霍恩; 杰拉尔德·C·萨多夫
Original assignee: Aeras Global TB Vaccine Foundation
Current assignee: Aeras Global TB Vaccine Foundation
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2005-11-23
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2025-11-23
Also published as: AU2005338353A1; BRPI0518091A2; PE20061168A1; TW200637910A; JP5713523B2; KR20070101855A; TWI456057B; WO2007058663A2; CA2589204A1; EA012434B1; WO2007058663A3; AU2005338353B2; US20100233213A1; CA2589204C; CN101198358B; EP1827504A2; US20080095794A1; EP1827504B1; EA200701128A1; ES2366622T3

Abstract

本申请提供了具有增强的引起组织相容性－I型－限制性CD8⁺T细胞免疫应答能力的分枝杆菌菌株。该分枝杆菌菌株经过遗传工程化来表达在中性pH下具有活性的溶内体蛋白(例如，产气荚膜梭菌细胞溶素O)，允许分枝杆菌从内体中逃出到细胞胞质中。本发明还提供了含有分枝杆菌菌株的疫苗制剂。

Description

具有增强的逃出内体能力的重组BCG菌株

发明背景

发明领域

本发明提供了分枝杆菌菌株，其具有使引发免疫应答加强的能力。例如，体内实验已证明了其引发主要组织相容性-I型-限制性CD8⁺T细胞免疫应答。尤其是，本发明提供了分枝杆菌菌株，其表达产气荚膜梭菌细胞溶素O(PfoA)蛋白，该蛋白使分枝杆菌从内体中逃出，本发明还提供了含有分枝杆菌菌株的疫苗制备物。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染全球1/3的人口，导致每年有800万人患病，160-220万人丧生，其中大多数人生活在发展中国家。肺结核(TB)是全球范围的流行病，并且因为与HIV的传播相交叉影响范围正逐渐上升，致死率也更严重。TB是AIDS患者的头号杀手。

卡介苗(BCG)是牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的一种减毒株，并且是目前广泛使用的TB疫苗，开发于80年前，而且当对其进行测定时对肺结核具有变化很大的疗效，包括最近在印度开展的大范围的试验没有显示出功效(Fine et al.，Vaccine，16(20)：1923-1928；1998；Anonymous，Indian J Med Res.，Aug；110：56-69；1999)。尽管如此，世界卫生组织目前向在TB高发国的所有刚出生或初次接触卫生服务的儿童(除了那些具有HIV病/AIDS症状的儿童)推荐BCG。这项政策是基于BCG可保护儿童免受孩童形式的严重TB危害的证据(Lanchriet et al.，Int J Epidemiol，24(5)：1042-1049；1995；Rodrigues etal.，J Epidemiol Community Health 45(1)：78-80；1991)。BCG对比幼儿大的儿童的免于TB的保护作用确实有争议的主题，因为有限的数据给出混杂的结论。然而，在广泛实施婴儿BCG免疫的发展中国家，小儿和成年人TB的高发病率表明，目前施用的BCG在人们处于患TB疾病危险中的那些年没有明显的功效。因此，BCG被认为是一种干预和控制TB的不完善的公共卫生手段。

大约有70％的暴露于TB生物体但具有正常免疫系统的人，不会被感染，那些确实被感染的人，只有大约5％在头两年内会发病。多数受到感染的人可抑制感染，这与针对结核分枝杆菌发展强有力的细胞免疫应答有关。当免疫力降低时，另有5％在后来发病。HIV/AIDS患者初次患病以及后发病更常见，再次强调了免疫力在预防和控制感染中的作用。

因为大多数人能控制肺结核，因此就有理由期待通过诱导适当种类的长期免疫力，应该能够开发在暴露后阻止初次感染、阻止疾病早期发展、阻止从潜伏期发病以及阻止疾病治疗后复发的有效疫苗。最终，系统疫苗使用与化学干预相结合将最终清除作为人病原体的结核分枝杆菌。

鉴于儿童BCG疫苗接种被认为在预防急性肺结核中发挥关键作用，在没有压倒性证据证明新的肺结核疫苗是一种优越的产品的情况下，很难在试验中取代BCG来评价候选TB疫苗的。问题在于结核分枝杆菌是一种人特异性病原体，动物模型仅仅模拟宿主-病原体相互作用的一部分。因此，新的结核疫苗具有改进效力的明确证据只能获自受到制约的人类现场试验。这种现实引导许多研究者断定对结核疫苗改进的关键步骤将是提高BCG的免疫原性。

这种策略的一个实例是来改进BCG诱导或激活用来加强免疫应答的T细胞的能力。主要组织相容性复合体I型-限制性CD8⁺T细胞在对结核分枝杆菌进行免疫的重要作用得到β2-微球蛋白(β2m)缺陷型小鼠不能控制试验性结核分枝杆菌感染的证明(Flynn et al.，PNAS USA，89(24)：12013-12017；1992)。组织相容性I型-限制性CD8⁺T细胞的重要作用得到β2-微球蛋白(β2m)缺陷型小鼠不能控制试验性结核分枝杆菌的感染(Flynn et al.，supra，1992)令人信服的证明。因为这些突变的小鼠缺乏组织相容性I型，功能性CD8⁺T细胞不能发育。与结核分枝杆菌感染相比，β2m-缺陷型小鼠能够控制BCG疫苗菌株一定的感染剂量(Flynn et al.，supra，1992；Ladel C.H.，et al.，Eur J Immunol，25：377-384；1995)。而且，β2m缺陷型小鼠的BCG疫苗接种仅仅延长了结核分枝杆菌感染后的存活其，而BCG免疫的C57BL/6抗结核分枝杆菌(Flynn et al.，supra，1992)。

CD8⁺T细胞对结核分枝杆菌和BCG不同的依从性的解释如下：结核分枝杆菌抗原能比来自BCG的抗原更好地接近细胞质，引起组织相容性I型抗原更显著的呈递(Hess and Kaufmann，FEMS Microbiol.Immunol 7：95-103；1993)。因此，更有效的CD8⁺T细胞应答由结核分枝杆菌产生。近年来，这种观点近年来得到如下证据的证明：同时由结核分枝杆菌和BCG感染抗原呈递细胞(APC)，结核分枝杆菌而非BCG提高了组织相容性I型对不相干抗原，即卵白蛋白的呈递(Mazzaccaro et al.，Proc Natl Acad Sci USA，Oct 15：93(21)：11786-91；1996)。

因此，结核分枝杆菌抗原接近寄主细胞的能力要优于来自BCG的抗原，导致组织相容性I型呈递的增强(Hess et al.，supra，1993)以及对结核分枝杆菌CD8⁺T细胞应答的增强。此外，结核分枝杆菌刺激小鼠和人体的抗原特异性组织相容性II型限制性CD4⁺T辅助细胞，以及组织相容性I型限制性CD8⁺细胞毒性T细胞(Kaufmann，Annu RevImmunol 11：129-63；1993)。通过延伸，上述事实表明，结核分枝杆菌感染的细胞对组织相容性I型限制性CD8⁺细胞毒性T细胞的识别敏感。假定暴露于结核病原体的具有免疫活性的人有70％的人没有被感染，那么在大多数情况下，由结核分枝杆菌感染诱导的免疫对控制这种生物体是高度有效的。因此，相信现有的结核疫苗菌株BCG的功效将通过增加BCG诱导组织相容性I型-限制性CD8⁺细胞毒性T细胞应答的能力而得以改善(Kaufmann，Fundamental Immunology，1997)。

通常，由保留吞噬体结合的病原体表达的抗原主要由组织相容性II型分子呈递到CD4⁺T细胞，但CD8⁺T细胞对其的识别能力较差，CD8⁺T细胞通常识别由组织相容性I型分子呈递的抗原(Kaufmann，supra，1997)。相反，胞内细菌，诸如逃避吞噬体并在寄主细胞的胞质里复制的单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)(例如，ATCC#13932)，在进入组织相容性I型抗原呈递途径和引发CD8⁺T细胞应答上是有效的(Berche et al.，J Immunol，138：2266-2276；1987)。单核细胞增生李斯特菌的这种逃避内体的功能近年来通过引入编码李斯特溶素(Llo)的序列被转进减毒沙门氏菌中，该菌通常存在于吞噬体内；研究表明，所产生的这种菌株可逃逸内体并在诱导CD8⁺T细胞应答上更有效(Bielecki et al.，Nature(London)，354：175-176；1990；Gentschev et al.，Infect Immun 63(10)：4202-4205；1995；Hess et al.，Host Response to Intracellular Pathogens，75-90；1997)。近年来，这种方法被应用于BCG；因此分泌李斯特溶素的rBCG菌株被用来提高BCG诱导组织相容性I型-限制性免疫应答的能力(Hess et al.，PNAS USA，95(9)：5299-5304；1998)。尽管早期论据显示rBCG-Llo⁺菌株更适合于引发CD8⁺T细胞，这种菌株被证明不能逃逸内体。因此，这种方法的局限在于内体逃逸所需的李斯特溶素的溶血功能仅在pH 5.5时完全有活性，在pH 7.0时几乎无活性。因为分枝杆菌将内体的pH值保持在7.0左右，那么可以合理推断在已有报道的rBCG-Llo菌株里的李斯特溶素是功能紊乱的，因为表达它们的环境对于溶血活性量值来说不是最适的(Geoffroy et al.，Infect Immun 55(7)：1641-1646；1987)。因此，这种方法的免疫促进效果将不会被实现，除非开发出能够让李斯特溶素在BCG处理的内体中发挥作用的策略。

因此，现有技术远不能提供具有增强的内体逃逸能力的rBCG，而rBCG能增强例如主要组织相容性I型-限制性CD8⁺细胞毒性T细胞应答的诱导作用。

发明概要

本发明的一个示例性方面提供了重组体BCG(rBCG)菌株，该菌株具有引发主要组织相容性(MHC)I型-限制性CD8⁺T细胞免疫应答的增强能力。这些新型的rBCG菌株经遗传工程化来表达功能性的溶内体蛋白，该蛋白在pH值接近中性(例如，pH值约为6-8或约6.5-7.5)时具有生物活性。因此在含有具有典型的pH接近中性的内体的分枝杆菌中，这种溶内体蛋白是有活性的。由rBCG产生的溶内体蛋白的活性可导致内体破裂，从而允许rBCG从内体中逃出并进入细胞质中。因此，该rBCG暴露于细胞质中，并且引发强烈的T细胞应答，尤其是强烈的组织相容性I型-限制性CD8⁺细胞毒性T细胞应答。在本发明的一个实施方案中，通过遗传工程导入rBCG的溶内体蛋白是来源于产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的产气荚膜梭菌细胞溶素O(PfoA)。

因此，本发明提供了经遗传工程化来表达和分泌功能性的溶内体蛋白的分枝杆菌，该蛋白在中性pH下具有活性。在一些实施方案中，这种功能性的溶内体孔形成蛋白是PfoA或由SEQ ID NO：3编码的PfoA突变体(在本文称作PfoA_G137Q)。由分枝杆菌表达的功能性溶内体蛋白允许rBCG从内体逃出。这种经遗传工程化的分枝杆菌可胰是减毒的分枝杆菌，比如BCG。本发明还提供了经遗传工程化来表达和分泌PfoA的分枝杆菌；和经遗传工程化来表达和分泌由SEQ ID NO：3编码的PfoA_G137Q的分枝杆菌。

本发明进一步提供了能使分枝杆菌衍生物逃出内体的方法。该方法包括使分枝杆菌遗传工程化的步骤来包含、表达和分泌诸如PfoA或由SEQ ID NO：3编码的PfoA_G137Q的功能性溶内体蛋白。在一些实施方案中，分枝杆菌是减毒的分枝杆菌，比如BCG。

本发明还提供了疫苗制剂，包括经遗传工程化来表达和分泌在中性pH下具有活性的功能性溶内体蛋白的分枝杆菌。例如，该功能性溶内体蛋白可能是PfoA或由SEQ ID NO：3编码的PfoA_G137Q。由分枝杆菌表达功能性溶内体酶允许重组体分枝杆菌逃出内体。在一些实施方案中，分枝杆菌是减毒的分枝杆菌，比如BCG。

附图的简要说明

图1.该图是自杀载体pAF 102。每个DNA片段的含义如下：L-侧翼和R-侧翼：分别是ureC基因的左侧翼和右侧翼；pfoA是编码突变体形式的在137G(Q)位具有单个氨基酸改变的产气荚膜梭菌细胞溶素O基因(Genebank登录号BA000016)；LP_PAg85B是编码抗原85B(即，Rv1886c)前导肽的DNA序列；P_Ag85A是抗原85A基因的(即，Rv3804c)的启动子序列；aph是氨基糖苷磷酸转移酶基因(Genebank登录号：X06402)，其对质粒附予了卡那霉素抗性；OriE是pUC复制起始点(Genebank登录号AY234331)；Ble是为质粒附予Zeosin抗性的基因(Genebank登录号L36850)；SacB是编码果聚糖蔗糖转移酶的基因(Genebank登录号Y489048)，该基因使细菌对蔗糖敏感；P_hsp60是热休克蛋白基因(即，Rv0440)的启动子序列；MCS是指定的限制性酶的多克隆位点。注意在两个Pacl位点之间的基因盒在必要时可用其它内体溶素酶基因代替。

图2A和B.A，产气荚膜梭菌的PfoA基因序列(SEQ ID NO：1)；B，产气荚膜梭菌的PfoA蛋白序列(SEQ ID NO：2)。

图3.优选突变体的基因序列，PfoA_G137Q(SEQ ID NO：3)。

图4.等位基因交换的主要步骤流程图。

图5.限制性酶消化等位基因交换质粒pAF102。

泳道1：1kb plus DNA序列梯；泳道2：限制性酶EcoRI消化后的质粒pAF102；泳道3：未被消化的质粒pAF102对照；泳道4：限制性酶EcoRI消化后的不带有PFO插入盒的载体质粒pAF100；泳道5：未被消化的不带有PFO插入盒的载体质粒pAF100对照。从这张图可看出，正如所期望的那样，质粒pAF100可通过限制性酶EcoRI线性化产生一条大小为4.4kb的带。如所预料，质粒pAF102通过限制性酶EcoRI产生两条带，大小分别为2.3kb和6.0kb。

图6.对ΔureC::pfoA基因型选择性克隆的PCR分析。PCR如材料和方法中的描述。PCR产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳来分析。DNA序列梯使用的是Invitrogen公司的1kb plus DNA标准。泳道1-6：分别为克隆号从105-1到105-6的PCR；泳道7和泳道8：克隆号分别为142-7和142-10的PCR；泳道9：BCG丹麦1331菌株的PCR。

图7.AFV102的生长和对卡那霉素的敏感性。将来自于AFV102、BCG丹麦1331和PfoA构建体局部二倍体(Pfo105MI)的细菌接种到7H9生长培养基中，每个菌株的生长可通过测量其在不同时间点，600nm处的光密度来比较。对于卡那霉素敏感性的测定，将抗生素加入到培养基中，终浓度为50μg/ml，其生长的测量同上。图例中的缩写：Ctrl：未加任何细菌菌种的对照培养基；+Kan或-Kan：培养基中有或没有卡那霉素。

图8.AFV102在J774A.1中的细胞毒性测定。细胞用AFV102或BCG丹麦1331感染。在感染后的指定时间点，细胞存活率如材料和方法中描述的那样，通过与未感染对照的比较来测量。

图9.AFV102在巨噬细胞中存活能力的测定。J774A.1单层细胞用AFV102或BCG丹麦1331感染，在感染后的指定时间点，胞内细菌如同材料和方法所描述的那样计数。

图10.检验AFV102分泌带有pH非依赖性溶血活性的Pfo蛋白的能力。AFV102培养物如同以前所描述的那样来制备，并且上清对红细胞的溶解能力在pH 7.0和5.5下进行测定。溶血活性的测定如同材料和方法中的描述。

图11A-D.实施例3.的结果示意图。A，细菌(涂黑的椭圆)侵染胞内(六边形)巨噬细胞(灰色椭圆)，从而刺激早期内体的形成；B，BCG中断内体的成熟而且在早期内体内受到保护；C，表达PfoA的AFV102细菌在侵染后的早期内体中被初步发现；然而，它们开始分泌PfoA并逃出内体；D，可看见表达PfoA的AFV102细菌从内体中出来并游离在细胞中。

图12.该图为抗原过表达载体pAF105。每段DNA的定义如下：P_Rv3130是抗原Rv3130c的启动子序列；P_Ag85B是抗原Rv1886c的启动子序列。表达盒里的基因是Rv0288、Rv1886c和Rv3804c；aph是氨基糖苷磷酸转移酶基因(Genebank登录号X06402)，其附予了卡那霉素抗性；OriE是pUC复制的起始点(Genebank登录号AY234331)；leuD是编码3-异丙基苹果酸脱氢酶的基因(即，Rv2987c)；OriM是分枝杆菌中的复制起始点(Genebank登录号M23557)。

本发明优选实施方案的详细说明

本发明提供了能否逃出内体并进入感染的寄主细胞胞质的rBCG。结果，在该细胞中引发对rBCG的较高CD8⁺T细胞应答。

RBCG经基因工程化来含有一种功能性内体溶素，可由rBCG表达和分泌，并且介导rBCG逃出内体。溶内体素在本申请中指的是能够裂解内体膜足以使细菌细胞从内体进入细胞质的蛋白。溶内体在本申请中指的是具有所述裂解活性的蛋白。溶内体蛋白在pH值接近中性的环境下是有活性的，比如在分枝杆菌侵染的细胞的内体内，因此可介导细菌逃出进入细胞质中。

在本发明的一个实施方案中，导入本发明rBCG菌株的功能性溶内体蛋白是源自产气荚膜梭菌的PfoA，或其功能性的突变体。PfoA是由产气荚膜梭菌分泌的细胞溶素，可由pfo4基因编码(Genebank登录号CPE0163)。该基因和蛋白序列分别如附图2A和B所示。在梭菌(Clostridium)中以及当由枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)表达时，PfoA介导细菌逃出巨噬细胞(Portnoy et al.，Infect Immun.Jul；60(7)：2710-7；1992)。与Llo不同，PfoA在pH 5.0和pH 7.0下均有活性，因此可在细胞质中保持活性，从而损伤感染的寄主细胞(Portnoy et al.，supra，1992)。

因此，当PfoA在单核细胞增生李斯特菌中代替Llo表达时，能够使细菌逃出巨噬细胞(Yones and Portnoy，Infect Immun.Dec；62(12)：5608-13；1994)。然而，其表达也会引起对寄主细胞的损伤。Llo显示了与PfoA相似的特性，除了它可在pH 5.5下具有最佳活性而在pH 7.0下显示较低活性。因此，一旦内体的pH降到pH 5.5，Llo就会介导内体的逃出而且不会影响寄主细胞，因为细胞质的pH值接近中性，阻止了Llo的活性。

Portnoy等的研究已进一步表明，当PfoA在单核细胞增生李斯特菌中以带有一个氨基酸改变的突变体形式表达时，PfoA的突变体形式不再对寄主细胞有毒性，而且仍然可介导细菌逃出液泡并完成胞内生长(Portnoy et al.，supra，1992)。在Pfo中将Gly137突变为Gln137的具体菌株DP-12791(即，PfoA_G137Q)，能够以一种类似于野生型的方式从巨噬细胞中逃出，但不会对寄主细胞产生毒害作用。此外，PfoA_G137Q在pH 5.6和pH 7.4下均有活性，胞质半衰期减少一半。PfoA_G137Q基因序列如附图3所示(SEQ ID NO：3)。

PfoA的表达可允许逃出内体，因为PfoA的形成孔隙的活性可导致真核细胞膜的损伤。PfoA通过将结构域自发插入到双分子层中，从而在含有胆固醇的膜中形成孔隙。这可通过结合胆固醇来实现，胆固醇充当受体。结合后，毒素形成一种单体-单体界面(寡聚装配所需)，寡聚化并通过改变其结构分配到膜中，属于膜结合依赖性。膜结合寡聚体的形成导致膜损伤，最终裂解(Ramachandran et al.，NatureStructure and Molecular Biology，11(8)：697-705，1995)。PfoA_G137Q能以这种方式介导液泡的裂解。优选的PfoA_G137Q在感染寄主细胞胞质中的活性有限，因为它对寄主蛋白酶敏感。

在本发明的一个实施方案中，由rBCG表达的功能性溶内体酶是从产气荚膜梭菌(C.perfringens)中衍生或分离出的PfoA。然而，本领域技术人员应该认识到，其它在pH中性或接近中性的环境下有活性的溶内体蛋白也适合于本发明。这样的溶内体蛋白的例子包括但不限于肺炎球菌溶素(由肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)产生)、链溶素O(由酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)产生)、溶蜡素(由蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)产生)、α-溶血素(由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)产生)等，及其功能性变体。

对于蛋白的“功能性溶内体蛋白”或“功能型”(或基因“功能性表达”的基因产品)，我们指的是由rBCG细菌产生的蛋白型可对存在于在原初生物体内的天然或自发(“野生型”)蛋白显示特征性大小的活性。如本领域技术人员所认识到的，在标准条件下测定时，由rBCG产生的蛋白功能型的活性大小为野生型蛋白活性的至少约50％。蛋白的活性大小可通过任何物理观察，比如结合脂，或产生一种作用，比如rBCG逃出内体等来确定。优选地，本领域技术人员所认识的，在标准的测定条件下，活性大小是野生型蛋白的标准活性的至少约50％、60％、70％、80％、90％、100％，或更高。

对于一种蛋白的“功能性突变体”，我们指的是那些氨基酸序列与野生型“参考”蛋白至少有约70％同源性的多肽，而且其仍然保留野生型蛋白的功能活性(如以上所描述)。参考野生型蛋白的氨基酸序列通常用作由基因工程化引起的突变和改变起点。

优选地，功能性突变体是氨基酸序列与参考氨基酸序列具有约75％、80％、85％、90％、95％或更高同一性的多肽。这样的功能性变体包括但不限于多肽序列，其中有一个或多个保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是本领域技术人公知的，而且还包括，例如，用一个荷正电氨基酸代替另一个、一个荷负电氨基酸代替另一个、一个疏水性氨基酸代替另一个等。假定产生的变体多肽保留这里所定义的功能性活性大小，那么变体多肽可含有一个或更多这样的代替。“功能性变体”也包含目的多肽主要序列的其它变化。这种变化包括但不限于氨基酸的缺失、添加、或修饰(例如，诸如磺化作用、脱酰胺作用、磷酸化、羟化等化学修饰)。这种变化可能是遗传工程化参考氨基酸序列的结果，或者是蛋白翻译后修饰的结果，或者二者都有。再者，一种酶的功能性突变体可能是自发突变的结果，比如那些与从一个物种或不同物种或不同个体的生物体中分离到的不同菌株具有相同或相似活性的同功蛋白之间的突变体。来自这种自发变体的蛋白可能也会作为参考蛋白，以及这种自发变体的氨基酸序列可作为参考序列。无论如何，一种参考蛋白的所有功能性变体正如这儿所描述的那样，仍然保留蛋白的活力大小。

这儿所描述的序列同源性和同一性不包括异源氨基酸序列，这种氨基酸序列衍生于除了参考序列的来源，并且出于各种其它目的，被连接进或含进蛋白的多肽序列中。这种异源序列的实例包括但不限于促进多肽分离的序列(例如，组氨酸标签)、促进多肽在细胞中的分泌和定位的序列(例如，各种前导或靶序列)、编码糖基化位点的序列(糖基化序列)，等等。

无论如何，如本本领域技术人员所认识到的，在标准的测定条件下，功能性变体要保留所述蛋白的活性，所述蛋白是变体，改变程度是功能性变体表现作为变体的蛋白的活性大小至少约50％，优选约60％、70％、80％、90％、100％或更多。

本发明还包括编码蛋白和用于本发明的蛋白功能性变体的核酸序列。这种核酸序列可能是脱氧核糖核酸、核糖核酸或二者的修饰物，并且可能是单链或双链。本发明的核酸序列包括任何在这里所列举的序列，而且也包含其变体。例如，核酸的变体可能与所列序列相同，但因为基因码的冗余性，仍然可以编码相同的氨基酸序列。或者，只要编码的氨基酸序列是以上述参考氨基酸序列的功能性变体，本发明就可能会对一些序列做出变化(例如，替代、缺失或添加)，从而改变编码的氨基酸序列。实例包括但不限于：引起酶中保守氨基酸替代的改变；以及引起氨基酸序列中非保守替代、或缺失或添加等的改变。做出这种改变的原因很多，例如，为了改变酶的翻译后修饰；增加或降低溶解性；在翻译的多肽中阻止或引入空间相互作用，等等。通常，本发明的核酸序列突变体会至少呈现出与参考序列有至少约50％的同源性，优选60％、70％、80％、90％或100％，这可由本领域技术人员所熟知的比较程序来决定。这种变体也可在通过高严谨性条件下，显示其结合用于本发明中序列的能力来表征。高严谨性结合试验被本领域技术人员所熟知并可用来测定本发明中序列的潜在突变体。

这儿所述的序列同源性不是指编码衍生于除参考氨基酸序列外的来源的异源氨基酸序列的核酸序列，并且因为其它各种目的被附加或囊括进蛋白的多肽序列。例如，这样的核酸序列可编码异源氨基酸序列，包括但不限于：促进多肽分离的序列(例如，组氨酸标签)、促进多肽在细胞中分泌和定位的序列(例如，各种前导序列和靶向序列)、编码糖基化位点的序列(糖基化序列)等。

意图包括在本发明中的其他多种核酸序列是为了方便或改良，在核酸序列的遗传工程化中或者在表达由其编码的氨基酸序列中改变的序列。通常，这种改变不会影响最终由核酸序列所翻译的多肽序列；或者该多肽仍然会为一种功能性突变体实现以上所设定的标准。这种改变类型的例子包括但不限于：在核酸序列中包含方便的限制性内切酶位点促进序列的操纵(例如，用于将序列插入到载体中)；序列或者参与氨基酸表达的序列中的包含、缺失或其他改变(例如，任意多种启动子和/或增强子序列的包含、停止信号、超级启动子、诱导型启动子、以及其它各种修饰核酸序列表达的序列)；促进载体与寄主生物体核酸相互作用的序列的包含；等等。

此外，因为许多原因，本发明的核酸序列还可能是化学修饰的或包括为本领域技术人员所熟知的非传统碱基，例如，促进核酸的稳定性，或得到所期望的空间构象。

对于“在中性pH有活性”和“在pH大约7.0有活性”，我们是指该酶在pH值在约6.0-8.0的范围内是有活性的，优选范围为约6.5-7.5。

本发明提供了重组分枝杆菌。在本发明的优选实施例中，分枝杆菌是减毒的，可以BCG作为例证。本领域技术人员可以认识到，其它减毒和非减毒分枝杆菌也适用于本发明。其它类型的分枝杆菌的实例包括但不限于结核分枝杆菌(M.tuberculosis)菌株CDC1551(参照，例如Griffith et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.Aug；152(2)：808；1995)、结核分枝杆菌Beijing(Soolingen等，1995)、结核分枝杆菌菌株H37Ra(ATCC#：25177)、结核分枝杆菌菌株H37Rv(ATCC#：25618)、牛分枝杆菌(M.bovis)(ATCC#：19211和27291)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)(ATCC#：15073)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis((ATCC#：12051和12549)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(ATCC#：35772和13209)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)(ATCC#：21982和35775)、鸟分枝杆菌(M.avium)(ATCC#：19421和25291)、鹑鸡分枝杆菌(M.gallinarum)(ATCC#：19711)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)(ATCC#：15483和23024)、麻风分枝杆菌(M.leprae)(ATCC#：)、游泳池肉芽瘤分枝杆菌(M.marinarum)(ATCC#：11566和11567)、以及M.microtti(ATCC#：11152)。

减毒分枝杆菌菌株的实施例包括但不限于结核分枝杆菌泛酸盐缺陷型菌株(Sambandamurthy，Nat.Med.20028(10)：1171；2002)、结核分枝杆菌rpoV突变型菌株(Collins et al.，Proc Natl Acad Sci USA.92(17)：8036；1995)、结核分枝杆菌亮氨酸缺陷型菌株(Hondalus et al.，Infect.Immun.68(5)：2888；2000)、BCG丹麦菌株(ATCC#35733)、BCG日本菌株(ATCC#35737)、BCG芝加哥菌株(ATCC#27289)、BCG哥本哈根菌株(ATCC#：27290)、BCG巴斯德菌株(ATCC#：35734)、BCG葛兰素菌株(ATCC#：35741)、BCG Connaught菌株(ATCC#35745)、BCG蒙特利尔(ATCC#35746)。

在本发明的另一个实施例中，减毒分枝杆菌菌株经过修饰可增强细胞凋亡，其中这样的菌株可诱导强烈的细胞免疫应答。凋亡是指程序性细胞死亡，在诱导作用和结果上与细胞坏死有很大的区别。实际上，抗原包被细胞的凋亡诱导有效细胞免疫的过程被称为交叉致敏(cross-priming)(Heath et al.，Immunol Rev 199；2004；Gallucci et al.，Nature Biotechnology.5：1249；1999；Albert et al.，Nature 392：86；1998)。引导增强性抗原特异性细胞介导免疫的凋亡有若干诱导机制。Caspase8介导的凋亡可导致抗原特异性细胞的免疫保护(Sheridan et al.，Science 277：818；1997)。

因此，本发明的另一实施方案提供了表现增强型前细胞凋亡特性的减毒分枝杆菌菌株，例如，但不限于secA1分泌的SodA，缺乏来自肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)(Genebank登录号1068147)、大肠埃希杆菌(Escherichia coli)(Genebank登录号1250070)或弗氏志贺菌(Shigella flexneri)(Genebank登录号1079977)等的前导肽，或者，SodA蛋白，其天然不分泌诸如来自单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)EGD-e(Genebank登录号986791)的SodA。这样的减毒分枝杆菌菌株不能产生胞外Sod，因此不能抑制寄主免疫应答，然而它们确实表达胞内Sod，从而能使所述的分枝杆菌存活(Edwards et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.164(12)：2213-9；2001)。或者，表现增强型前细胞凋亡特性的减毒分枝杆菌菌株携带一种灭活的Rv3238c基因。

或者，通过本发明的减毒分枝杆菌，在宿主细胞的胞质中表达沙门氏菌SopE(Genebank登录号AAD54239、AAB51429或AAC02071)或caspase-8(Genebank登录号AAD24962或AAH06737)将为诱导程序性细胞死亡赋予一种强有力的方法，程序性细胞死亡在由已述的减毒分枝杆菌表达的抗原体系中产生高水平的抗原特异性细胞免疫。

死亡受体-5(DR-5)也称作TRAIL-R2(TRAIL受体2)或TNFR-SF-10B(肿瘤坏死因子-超家族成员10B)也介导caspase 8介导的细胞凋亡(Sheridan et al.，1997)。诱导细胞凋亡的呼肠病毒由TRAIL-DR5介导，TRAIL-DR5引起病毒随后的清除(Clarke et al.，J.Virol.74：8135；2000)。通过本发明的减毒分枝杆菌，DR-5的表达，诸如人类DR-5(Genebank登录号BAA33723)、疱疹病毒-6(HHV-6)DR-5同源物(Genebank登录号CAA58423)等，为诱发抗结核分枝杆菌抗原的抗原特异性细胞免疫提供了一种有效的辅助作用。

此外，寄主抗原递呈细胞(诸如巨噬细胞和树状突细胞)也能通过Fas连接诱发凋亡，这对诱发抗原特异性细胞免疫应答是一种很强的刺激(Chattergoon et al.，Nat.Biotechnol.18：974；2000)。因此，表达Fas或Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白的减毒分枝杆菌将诱导细胞凋亡和增强型抗原特异性细胞免疫应答。

概括来讲，促进诱导细胞凋亡的减毒分枝杆菌菌株为细胞应答的诱导提供一种强有力的工具，细胞应答引起受结核分枝杆菌感染细胞的免疫介导细胞的破坏，随后消除、降低或预防结核分枝杆菌的感染。

在本发明的另一实施例中，双组分TB疫苗可以包含至少过表达一个分枝杆菌抗原的减毒分枝杆菌，包含但不限于Rv0125、Rv0203、Rv0287、Rv0288、Rv0603、Rv1196、Rv1223、Rv1271c、Rv1733c、Rv1738、Rv1804c、Rv1886、Rv2031c、Rv2032、Rv2253、Rv2290、Rv2389c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2779c、Rv2873、Rv2875、Rv3017c、Rv3407、Rv3804c、Rv3810或Rv3841。可选地，过表达的分枝杆菌抗原可以融合蛋白的形式组成一个或更多已述的分枝杆菌融合蛋白，例如Mtb72f(Brandt et al.，Infect.Immun.，72：6622-6632；2004；Skeiky et al.，J.Immunol.，172：7618-7628；2004)、Hybrid-1(Olsen et al.，Infect，Immun.，72：6148-6150；2004；Langermans et al.，Vaccine，23：2740-2750；2005)、Hyvac-4(Dietrich et al.，J.Immunol.，174：6332-6339；2005)等。

本发明在发展抗病原性分枝杆菌类疫苗和抗原传递疫苗载体上具有功用。分枝杆菌载体在这儿被定义为至少表达一个组成DNA或RNA并且编码任意抗原复合物、免疫调节因子或辅剂的路过核苷酸序列(passenger nucleotide sequence)(这儿指作“PNS”)的任何分枝杆菌工程菌，这点由以下来陈述。PNS能被导入染色体或应用本发明已知的组分和方法作为表达载体部分(Jacobs et al.，Nature 327：532-535；1987；Barletta et al.，Res Microbiol.141：931-939；1990；Kawahara et al.，ClinImmunol.105：326-331；2002；Lim et al.，AIDS Res Hum Retroviruses.13：1573-1581；1997；Chujoh et al.Vaccine，20：797-804；2001；Matsumoto et al.，Vaccine，14：54-60；1996；Haeseleer et al.，Mol BiochemParasitol.，57：117-126；1993)。

在本发明中，分枝杆菌载体可能携带编码免疫原的PNS，其可能是来自病毒、细菌和寄生虫病原体的外源免疫原，或是内生免疫原，例如，但不限于自体抗原或肿瘤抗原。这种免疫原可能在外源免疫原和内生蛋白或拟态、断片或断片中含有源自病毒、细菌和寄生虫病原体免疫原之间的全长天然蛋白、嵌合体融合子。

如这里所用，“外源免疫原”意味着蛋白或其中的片断，其通常不在受体动物细胞或组织中表达，例如，但不限于病毒蛋白、细菌蛋白、寄生虫蛋白、细胞素、趋化激素、免疫调节剂、或治疗剂。

“内生免疫原”意味着存在于受体动物细胞或组织中的蛋白或蛋白片断，例如，但不限于内生细胞蛋白、免疫调节剂、或治疗剂。可选地或额外地，该免疫原可能由一种合成基因编码，并且可能使用为本领域技术人员所知的传统重组DNA方法被构建。

外源免疫原在动物寄主中侵入、克隆或复制前或期间，可以是任何病毒、细菌或寄生虫病原体分子；分枝杆菌载体可能表达源自病毒、细菌或寄生虫病原体的免疫原或其中的部分片断。这些病原体会感染人类、家畜或野生动物。

病毒抗原被衍生、包埋的病毒病原体包含但不限于正粘病毒，例如流感病毒(分类ID：59771)；逆转录病毒，例如RSV、HTLV-1(分类ID：39015)、以及HTLV-II (分类ID：11909)，疱疹病毒，例如EBV(分类ID：10295)；CMV(分类ID：10358)或单纯疱疹病毒(ATCC#：VR-1487)；慢病毒属，例如，HIV-1(分类ID：12721)和HIV-2(分类ID：11709)；棒状病毒，例如狂犬病；微小核糖核酸病毒，例如脊髓灰质炎病毒(分类ID：12080)；痘病毒，例如牛痘(分类ID：10245)；轮状病毒(分类ID：10912)；以及细小病毒，例如腺伴随病毒1(分类ID：85106)。

病毒抗原可在以下群体中被发现，包含但不限于人类免疫缺陷病毒抗原Nef(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIVRepository Cat.# 183；Genbank登录号AF238278))、Gag、Env(NationalInstitute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository Cat.# 2433；Genbank登录号U39362)、Tat(National Institute of Allergy andInfectious Disease HIV Repository Cat.# 827；Genbank登录号M13137)、Tat的突变衍生物，例如Tat-Δ31-45(Agwale et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.In press.Jul 8^th；2002)、Rev(National Institute ofAllergy and Infectious Disease HIV Repository Cat.# 2088；Genbank登录号L14572)、以及Pol(National Institute of Allergy and InfectiousDisease HIV Repository Cat.# 238；Genbank登录号AJ237568)及gp120的T和B细胞的抗原决定部位(Hanke and McMichael，AIDSImmunol Lett.，66：177；1999)；(Hanke，et al.，Vaccine，17：589；1999)；(Palker et al.，J.Immunol.，142：3612-3619；1989)、HIV-1Env and gp120的嵌合体衍生物，例如但不限于gp120和CD4之间的融合(Fouts et al.，J.Virol.，74：11427-11436；2000)；切去顶端和修饰的HIV-1env衍生物，例如但不限于gp140(Stamatos et al.，J Virol，72：9656-9667；1998)或HIV-1Env和/或其中的gp140衍生物(Binley，et al.，J Virol，76：2606-2616_；2002)；(Sanders，et al.，J Virol，74：5091-5100；2000)；(Binley，et al.，J Virol，74：627-643_；2000)、肝炎B表面抗原(Genbank登录号AF043578)；(Wu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86：4726-4730；1989)；轮状病毒抗原，例如VP4(Genbank登录号AJ293721；Mackow et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87：518-522；1990)和VP7(Genbank登录号AY003871；)(Green et al.，J.Virol.，62：1819-1823；1988)，流感病毒抗原，例如红血球凝集素或(Genbank登录号AJ404627、)；(Pertmer and Robinson，Virology，257：406；1999)；核蛋白质(Genbank登录号AJ289872)；(Lin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：9654-9658；2000)、单纯疱疹病毒抗原，例如胸苷激酶(Genbank登录号AB047378)；(Whitley et al.，New Generation Vaccines，825-854；2004)。

衍生细菌抗原的细菌病原体包含但不限于，分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、(Helicobacter pylori)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、(Shigella spp.)、大肠杆菌(E.coli)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、李斯特菌属(Listeria spp.)、军团杆菌属(Legionella pneumoniae)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、以及伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)。

细菌病原体的保护性抗原的实施例包括产肠毒素大肠杆菌的菌体抗原，例如CFA/I菌毛抗原(Yamamoto et al.，Infect.Immun.，50：925-928；1985)和热不稳定毒素的无毒B亚基(Klipstein et al.，Infect.Immun.，40：888-893；1983)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的百日咳外膜蛋白(Roberts et al.，Vacc.，10：43-48；1992)、百日咳博德特氏菌的腺苷酸化环化酶-溶血素(Guiso et al.，Micro.Path.，11：423-431；1991)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)破伤风毒素的C片断(Fairweather et al.，Infect.Immun.，58：1323-1326；1990)、伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)的OspA(Sikand，et al.，Pediatrics，108：123-128；2001)；(Wallich，et al.，Infect Immun，69：2130-2136；2001)、普氏立克次体(Rickettsiaprowazekii)和斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)的保护性类结晶-表面-层蛋白(Carl，et al.，Proc Natl Acad Sci USA，87：8237-8241；1990)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的李斯特菌细胞溶解素(也以“Llo”和“Hly”闻名)和/或超氧化物歧化酶(也以“SOD”和“p60”闻名)(Hess，et al.，Infect.Immun.65：1286-92；1997；(Hess，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.93：1458-1463；1996)；(Bouwer，et al.，J.Exp.Med.175：1467-71；1992)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的脲酶(Gomez-Duarte，et al.，Vaccine 16，460-71；1998)；Corthesy-Theulaz，et al.，Infection & Immunity 66，581-6；1998)、以及致死毒素的受体结合域和/或炭疽杆菌(Bacillus anthrax)的保护性抗原(Price，et al.，Infect.Immun.69，4509-4515；2001)。

衍生寄生虫抗原的寄生虫病原体包括但不限于疟原虫属(Plasmodium spp.)，例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)(ATCC#：30145)；锥虫属(Trypanosome spp.)，例如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(ATCC#：50797)；梨形虫属(Giardia spp.)，例如肠吉亚尔氏鞭毛虫(Giardia intestinalis)(ATCC#：30888D)；牛蜱属(Boophilus spp.)，巴贝虫属(Babesia spp.)，例如田鼠巴贝虫(Babesia microti)(ATCC#：30221)；阿米巴属(Entamoeba spp.)，例如痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)(ATCC#：30015)；爱美尔球虫属(Eimeria spp.)，例如巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)(ATCC#40357)；利什曼原虫属(Leishmania spp.)(分类ID：38568)；裂体吸虫属(Schistosome spp.)，鲁丝虫属(Brugia spp.)，(Fascidaspp.)，犬心丝虫属(Dirofilaria spp.)，吴策线虫属(Wuchereria spp.)，以及(Onchocerea spp.)。

寄生虫病原体保护性抗原的实施例包括疟原虫属的环子孢子抗原(Sadoff et al.，Science 240：336-337；1988)，例如P.bergerii的环子孢子抗原或恶性疟原虫的环子孢子抗原；疟原虫属的裂殖子表面抗原(Spetzler et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，43：351-358；1994)痢疾阿米巴的半乳糖专一性外源凝集素(Mann et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：3248-3252；1991)、利什曼虫属的gp63(Russell et al.，J.Immunol.，140：1274-1278；1988)；(Xu and Liew，Immunol.，84：173-176；1995)、利什曼虫主要的gp46(Handman et al.，Vaccine，18：3011-3017；2000))、马来丝虫(Brugia malayi)的副肌球蛋白(Li et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，49：315-323；1991)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma mansoni)的丙糖-磷酸盐异构酶(Shoemaker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：1842-1846；1992)；蛇形毛圆线虫(Trichostrongylus colubriformis)的分泌型类球蛋白蛋白(Frenkel et al.，Mol.Biochem.Parasitol.，50：27-36；1992)；Frasciola hepatica的谷胱苷肽-S-转移酶(Hillyer etal.，Exp.Parasitol.，75：176-186；1992)、牛裂体吸虫和日本血吸虫(Bashir et al.，Trop.Geog.Med.，46：255-258；1994)；以及牛血吸虫(Schistosoma bovis)和日本血吸虫(S.japonicum)的KLH(Bashiret al.，supra，1994)。

如早期所提及，分枝杆菌载体可能携带编码内生免疫源的PNS，这有可能是任意细胞的蛋白质、免疫调节剂、或治疗剂、或在受体细胞中表达的部分，包含但不限于肿瘤、移植物、以及自体免疫的免疫原，或肿瘤、移植物和自体免疫原的断片和衍生物。因此，在本发明中，分枝杆菌载体可能携带编码肿瘤、移植物或自体免疫原、或其中的断片和衍生物等的PNS。可选地，分枝杆菌载体可能携带合成的PNS(同以上描述)，编码肿瘤专一性物质、移植物、或自体免疫原或其中的部分。

肿瘤专一性抗原的实施例包括前列腺专一性抗原(Gattuso et al.，Human Pathol.，26：123-126；1995)、TAG-72和CEA(Guadagni et al.，Int.J.Biol.Markers，9：53-60；1994)、MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie et al.，J.Immunothera.，14：104-109；1993)。近年来，小鼠实验已表明，表达肿瘤抗原的具有非恶性细胞的免疫可提供一种有效的疫苗，同时也辅助动物增强免疫应答，清除显示同样抗原的恶性瘤细胞(Koeppen et al.，Anal.N.Y.Acad.Sci.，690：244-255；1993)。

移植抗原的实施例包括T细胞上的CD3分子(Alegre et al.，Digest.Dis.Sci.，40：58-64；1995)。用一种抗体对CD3进行处理，结果表明其可迅速清除环状T细胞，而且细胞反过来可介导移植受体(Alegre et al.，supra，1995)。

自体免疫抗原的实施例包括IASβ链(Topham et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：8005-8009；1994)。用来自IASβ链的18氨基酸肽为小鼠接种疫苗，结果表明其对有自体免疫脑脊髓炎的实验小鼠有保护和治疗作用(Topham et al.，supra，1994)。

表达辅剂的分枝杆菌载体

构建携带编码免疫原和辅剂的PNS的分枝杆菌载体是可行的，而且能增强寄主对载体和PNS编码的免疫原的应答。可选地，构建携带编码辅剂的PNS的分枝杆菌载体是可行的，其是一种混合物，与其它携带至少编码一个免疫原的PNS的分枝杆菌混合在一起，提高寄主对已述的由伴侣分枝杆菌载体编码的免疫原的应答。

这种由插入到已述分枝杆菌载体上的PNS编码的特殊辅剂不是本发明的关键点，可能是霍乱毒素的A亚基(例如，CtxA；Genbank登录号X00171，AF175708，D30053，D30052)，或其中的片断和/或突变衍生物(例如，Ctx A亚基的A1于(例如CtxA1；Genbank登录号K02679))，任何典型的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(例如霍乱弧菌菌株395，ATCC#39541)或E1Tor霍乱弧菌(例如霍乱弧菌菌株2125，ATCC#39050)菌株。可选地，任何腺苷-磷酸二盐-核糖基化内毒素家族成员中的细菌毒素(Krueger and Barbier，Clin.Microbiol.Rev.，8：34；1995)，可被用来替代CtxA，例如，产肠毒素大肠埃希氏菌热不稳定毒素的A亚基(这儿指作EltA)(Genbank登录号M35581)、百日咳毒素S1亚基(例如ptxS1，Genbank登录号AJ007364，AJ007363，AJ006159，AJ006157，etc.)；作为进一步的可选，辅剂可能是百日咳博德特氏菌(ATCC#8467)、ordetella bronchiseptica (ATCC#7773)或副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)(ATCC#15237)的腺苷酸化环化酶-溶血素之一，例如，百日咳博德特氏菌的cyaA基因(Genbank登录号X14199)、副百日咳博德特氏菌的cyaA基因(Genbank登录号AJ249835)或支气管炎博德特菌(B.bronchiseptica)的cyaA基因(Genbank登录号Z37112)。

表达免疫调节剂的分枝杆菌载体

还有一个方法使得对携带至少一个编码免疫原和细胞因子的分枝杆菌载体的使用是必需的，可用于增强寄主对编码免疫原分枝杆菌载体的PNS的应答。可选地，构建一个携带仅编码已述细胞因子的PNS的分枝杆菌载体是有可能的，这可通过与至少一个其它携带编码免疫原的PNS的分枝杆菌混合来使用，从而增强寄主对编码伴侣分枝杆菌载体表达的免疫原的PNS的应答。

这种由分枝杆菌载体编码的特殊细胞因子不是本发明的关键点，包括但不限于白细胞介素-4(这儿指为“IL-4”；Genebank登录号AF352783(鼠科IL-4)或NM_000589(人类IL-4))、IL-5(Genebank登录号NM_010558(鼠科IL-5))或NM_000879(人类IL-5))、IL-6(Genebank登录号M20572(鼠科IL-6)或M29150(人类IL-6))、IL-10(Genebank登录号NM_010548(鼠科IL-10)或AF418271(人类IL-10))、I1-12_p40(Genebank登录号NM_008352(鼠科IL-12p40)或AY008847(人类IL-12p40))、IL-12_p70(Genebank登录号NM_008351/NM_008352(鼠科IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人类IL-12p35/40))、TGFβ(Genebank登录号NM_011577(鼠科TGFβ1)或M60316(人类TGFβ1))、以及TNFα(Genebank登录号X02611(Murine TNFα)或M26331(人类TNFα))。

用于将编码Pfo基因的基因导入BCG基因组的特殊方法不是本发明的一个关键特征，而且可能选自为本领域技术人员所熟知的方法(Parish et al.，Microbiology，145：3497-3503；1999)。一个优选的方法将Pfo基因靶向ureC位点，从而导致后面基因的失活并为修饰菌株的筛选创造一个标记(Qadri et al.，J Clinic Micro.20(6)，1198-1199；1984)。为了达到目的，一种合成的等位基因交换质粒，例如以下所选实施例中多描述的质粒，可经过修饰而引导(harbor)侧翼ureC基因(基因组数据库号：Mb1881)末端5个和3个阅读框的1kb序列。然后，PfoA基因(基因组数据库号：CPE0163)被插到Ag85B启动子控制下的侧翼序列。为了分泌PfoA蛋白，可用Ag85B的前导肽序列来置换天然的PfoA信号序列，确保其从重组BCG菌株中有效地分泌。

将等位基因交换质粒导入目标BCG菌株的方法不是本发明的关键特征，可通过对分枝杆菌使用标准的电穿孔方法来完成。同样地，这种影响等位基因交换和将Pfo等位基因导入ureC位点的特殊方法不是本发明的关键特征，可从为本领域技术人员所熟知的方法中挑选。一个自杀载体，例如附图1所描述，可提供一种优选的方法，因为这种质粒含有两个抗生素筛选标记，可缩小对自发的抗生素抗性突变体的筛选。在等位基因交换期间，PfoA基因片断置换ureC基因，结果形成左右侧翼序列的同源性重组，从而导致稳定的染色体整合和PfoA的表达。这种方法的优点在于不需要抗生素来维持终产物，在终菌株中也不会出现无抗生素抗性的基因型或表现型。这是为人类所使用产品的优选实施例(它们是“无抗”)。UreC阴性表现型将标记经过等位基因交换的菌株并用Pfo置换ureC，这可理解为阳性表现型可能也有一定的应用。

在本发明中，pfoA在BCG中的定位不限于ureC。其它位置包括但不限于pfoA整合进质粒，以及染色体的attB位点。本发明的那些技术人员将会明确其它pfoA在染色体中整合和表达的潜在位点。

本发明也提供疫苗制剂，用于引发抗结核的免疫应答。这种疫苗制剂至少包括一个rBCG菌株和一个药理上合适的携带体。用于疫苗的这种合成物的制剂为本领域的那些技术人员所熟知。这种复合物的制剂以液态或悬浮状为代表，然而，诸如药片、药粒、粉末或类似物等固态物也有望得到。可能也会制备使用前可溶解进或悬浮进液体的固态物。该制剂也可能被乳化。活性成分可能会与赋形剂一起被混合，这种赋形剂是药学上可接受的并能与活性成分兼容。合适的赋形剂是，例如，水、盐、葡萄糖、棉子糖、甘油及其类似物、或其中的化合物。此外，该合成物可能含有少量的辅剂，例如湿剂或乳剂、pH缓冲剂及其类似物。此外，该合成物可能含有其它辅剂。

如果想合成一种口服物，那么就要加入各种增稠剂、风味剂、稀释剂、乳化剂、分散剂或结合剂及其类似物。本发明的合成物可能含有任意这样的辅剂，以便提供适于应用的合成物形式。rBCG在这种形成物中的最终量可能不同。然而，通常在形成物中的量约为1-99％。本发明的疫苗制剂也可能含有辅剂，合适的实施例包括但不限于Seppic、Quil A、Alhydrogel等。此外，本发明的疫苗制剂可能含有一个rBCG的单一型，可选地，超过一个rBCG的类型可能也被用于疫苗。

本发明也提供对结核产生免疫应答的方法和对哺乳动物接种抗结核疫苗的方法。对于产生免疫应答，我们是指本发明疫苗制剂的应用可引起专一性抗体(滴定范围在1-1×10⁶，优选范围在1-1×10³，更优选范围大约在1×10³-1×10⁶，最优选范围大于1×10⁶)和/或细胞增殖的合并，这可通过，例如，³H胸苷合并被测量。该方法涉及使用由本发明中rBCG菌株组成的合成物，其在药理上对哺乳动物具有可接受的携带体。本发明的疫苗制剂可能以那些为本领域技术人员所熟知的任何适合的方式被使用，包括但不限于注射、口服、intranasally、食用含有rBCG的食品等。在优选实施例中，应用的方式是皮下或肌肉注射。

以下实施例被认作本发明各方面的示例，同时并不限于本发明的实践方面。本发明的那些普通技术人员将感到欣慰的是，如果不背离本发明说明书中的常规范围的话，那么可选的材料、方法和程序可能会不同并仍然保留在普通技工的技术中。

实施例

存在于结核杆菌里的MHC I型-限制性CD8⁺T细胞免疫保护的重要作用已得到了证实(Flynn et al.，supra，1992)。为了努力改善CD8 T细胞应答，已构建了一株重组BCG菌株，来表达单核细胞增生李斯特菌的李斯特菌细胞溶解素。然而，这个重组BCG(rBCG)不能显示逃出内体的增强能力，因此不能引起细胞应答诱导的提高，例如，MHC I型-限制性CD8⁺T细胞应答。检测发现，有不到1％的该菌株逃出了内体。这是不足为奇的，因为李斯特菌细胞溶解素的活性对pH非常敏感，因此在内体内的pH下，酶可能不显示活性。尽管有这种缺陷，这个重组菌株的保护性和安全性均得到了显著改善。在此发现的基础上，我们已通过将衍生于产气荚膜梭菌的PfoA_G137Q导入BCG染色体中，构建了一株新的rBCG菌株。PfoA_G137Q具有一个氨基酸位点的变化，其137位的G变为Q。这种单个氨基酸的改变导致了哺乳动物细胞中野生型PfoA的毒性丧失，然而酶仍然保持其内体溶素功能。该成品菌株通过小鼠实验显示是安全的并具有免疫原。

材料和方法：常规的

对于以下部分所描述的每个实验，限制性内切酶(这儿指“REs”；New England Biolabs Beverly，MA)、T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs Beverly，MA)和Tag多聚酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)根据制造商的方法来使用；质粒DNA根据制造商的方法(Qiagen，Santa Clarita，CA)应用小规模(Qiagen Miniprep^R kit，Santa Clarita，CA)或大规模(Qiagen Maxiprep^R kit，Santa Clarita，CA)质粒DNA纯化盒来制备；无核酸酶、分子生物学级milli-Q水，Tris-HCl(pH 7.5)，EDTA pH8.0，1M MgCl₂，100％(v/v)乙醇和超纯琼脂糖和琼脂糖凝胶电泳缓冲液等购买于Life Technologies，Gaithersburg，MD。RE消化、PCRs、DNA连接反应及琼脂糖凝胶电泳等根据众所周知的程序来进行(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.1，2，3；1989)；(Straus，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.Mar；87(5)：1889-93；1990)。为了证实以下部分所描述的每个重组质粒的DNA序列，可进行核苷酸测序，测序可通过常规的自动化DNA测序技术来完成，所使用的测序仪是应用生物系统的自动化测序仪，型号为373A(Applied Biosystems automatedsequencer，model 373A)。

PCR引物购自商业化的卖主，例如Sigma(St.Louis，MO)，或使用应用生物系统的DNA合成仪(型号373A)来合成。PCR引物的使用浓度为150-250μM，PCR反应的退火温度使用

软件4.1版(Scientific and Educational Software Inc.，Durham，NC)来决定。PCRs在Strategene Robocycler，型号400880(Strategene，La Jolla，CA)上来操作。用于扩增的PCR引物使用

软件4.1版(Scientific andEducational Software Inc.，Durham，NC)来设计。这个软件能设计PCR引物，也能鉴别与所使的专一性DNA片断匹配的RE位点。PCRs在热循环装置上来操作，例如Strategene Robocycler，型号400880(Strategene)，PCRs中引物退火、延伸和变性的时间根据标准程序来设定(Straus et al，supra 1990)。RE消化和PCRs接着通过使用标准程序的琼脂糖凝胶电泳来分析(Straus et al，supra 1990；and Sambrook et al.，supra 1989)。一个阳性克隆被定义为一个具有适当的RE样品和/或PCR样品。如上所述，通过这个方法鉴定的质粒可进一步使用标准的DNA测序方法来评价。

大肠杆菌菌株，例如DH5和Sable2^R，购买自Life Technologies(Bethesda，MD)并用作重组质粒的起始寄主。重组质粒通过电穿孔导入大肠杆菌，电穿孔使用的是一种高压电脉冲装置，例如Gene Pulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)，设置在100-200Ω，，5-25μF和1.0-2.5kV，这点已描述过(Straus et al，supra 1990)。电穿孔的最佳条件通过每个细菌每mcg DNA的最大转化率来确定。

细菌菌株代表性地生长于胰蛋白酶的大豆琼脂上(Difco，Detroit，MI)或胰蛋白酶的大豆肉汤里，这可根据制造商的指导来做。除非另有说明，所有细菌生长在37℃，5％(v/v)CO₂，温和振荡的条件下。在适当的条件下，要在培养基中补充抗生素(Sigma，St.Louis，MO)。细菌菌株有代表性地以每毫升大约10⁹个菌落形成单位(这儿指“cfu”)悬浮于含有30％(v/v)甘油的中，-80℃储存。

BCG中的等位基因交换。先前技术讲了将改变了的等位基因导入分枝杆菌菌株的方法，而且本发明的那些技术人员能够解释和执行该方法(Parish et al.，Microbiology，146：1969-1975；2000)。一个新的产生等位基因交换质粒的方法使得合成DNA的使用成为必需。本方法的优点在于这种质粒产品具有很高的定义史(defined history)并符合联邦监管的要求，以前使用的方法尽管有效，但缺乏文献记载的实验室培养记录，因此不可能符合联邦监管的要求。如果一个适用于人类的产品要得到美国和欧洲监管部门的许可，就必须符合这些要求。

作为分枝杆菌中等位基因交换的一个自杀载体，是能够在大肠杆菌菌株中复制而不能在分枝杆菌属，例如结核分枝杆菌和BCG中复制的质粒。本发明中用于等位基因交换程序的专一性自杀载体是不重要的，能从学术和商业资源中得到筛选(Parish et al.，supra，2000)。等位基因交换的一个自杀质粒的优选设计如附图1所示。该质粒由以下DNA片断组成：质粒在大肠杆菌中复制的一个oriE序列(Genebank登录号L09137)，在大肠杆菌和分枝杆菌中筛选的一个卡那霉素抗性基因(Genebank登录号AAM97345)，以及一个额外的抗生素筛选标记，例如抗性基因(Genebank登录号AAU06610)，其受一个分枝杆菌启动子的控制(例如，hsp60启动子)。第二个抗生素筛选标记是不重要的但可能会被包含，形成双筛选，在等位基因交换过程中阻止自发卡那霉素抗性分离物的产生。

这种自杀载体的构建可使用标准重组DNA技术来完成。然而，当前的监管标准(例如联邦监管)已从对已曝光产品中含有朊病毒颗粒到受疯牛病(BSE)感染的牛制品中提高了警觉。

为了避免将物质(例如DNA序列)引入来源未知的目标菌株，所以通过商业资源(例如Picoscript，Inc.)来合成存在于自杀载体里的所有DNAs是更可取的。因此，构建自杀载体的一个优选方法是应用DNA软件(例如Clone Manager)来组装一套DNA序列的方案，然后通过任何供应商所提供的服务(例如Picoscript Inc.)来免费合成该DNA。该程序用来设计和获得用于以下部分实施例的自杀载体。

以上所述自杀载体(附图1)的构形具有优势，因为这个质粒含有两个抗生素筛选标记，这会降低对一个抗生素显示抗性的自发突变体的筛选，其每代约以1/10⁸的几率产生。对两个抗生素有自发抗性的非常少，仅以每代约1/10¹⁶的几率产生。因此，双抗菌株出现在培养物中的概率小于1/10⁶，该培养物用来完成等位基因交换程序。

要在等位基因交换过程中进行阴性筛选，可用一个具有蔗糖敏感表现型的sacB基因(Genebank登录号NT01BS4354)来浓缩菌株培养物，该菌株已经过了最终的DNA重组并完成了等位基因交换。

分枝杆菌的培养。在液体培养基中培养已选的BCG菌株，例如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基，适宜在37℃下培养。该菌株可静止或振荡培养。此外，可通过加入油酸(0.06％v/v；ResearchDiagnostics Cat.No.01257)和清洁剂，例如Tyloxapol(0.05％v/v；Research Diagnostics Cat.No.70400)，来提高BCG的生长率。BCG培养物的纯化：用磷酸盐缓冲液(这儿指PBS)连续稀释(例如10倍稀释法，0-10^-8)BCG，然后取100ml的BCG稀释物，均匀铺在含有25-30ml固体培养基的3.5英寸平板上，例如Middlebrook 7H10。此外，该培养物的纯化可进一步应用商业上可获得的培养基来评定，例如巯基乙酸盐培养基(Science Lab，catalogue number 1891)和大豆-酪素培养基(BD，catalogue number 211768)。

BCG种批以0.1-2×10⁷cfu/ml的密度保存在-80℃。典型地，液体培养物在0.2-4.0的光密度(600nm)下获得，以无菌空白作为对照；培养物置于适当大小的离心管中，8,000g离心5-10min。废弃上清，生物体以0.1-2×10⁷cfu/ml悬浮在含有10-30％(v/v)甘油的Middlebrook7H9储存液中。将悬浮物分装在1.5ml无菌的硅酸硼冷冻小瓶中，然后置于-80℃。

实施例1.能逃出内体的rBCG-PfoA菌株的构建

能逃出内体的rBCG-PfoA菌株的构建可通过ureC基因侧翼区的等位基因交换来实现。结果，PfoA基因片断置换ureC基因，允许稳定染色体的PfoA表达。详细描述如下。

构建等位基因交换质粒

等位基因交换质粒由下列DNA片断组成：一个在大肠杆菌中复制的oriE序列，一个在大肠杆菌和分枝杆菌两者中筛选的卡那霉素抗性基因，以及一个额外的抗生素筛选标记((zeocin抗性基因)，其由Hsp60启动子表达。第二个标记可用于制作双筛选，从而在此过程中阻止对卡那霉素的自发抗性。对于等位基因交换过程中的阴性筛选，可使用一个蔗糖敏感性基因。最终，侧翼目标BCG丹麦1331菌株ureC基因左右1kb的序列将PfoA基因夹在之间。该基因在Ag85B启动子控制下表达。前导肽序列用于置换最初的PfoA分泌信号肽序列。最终，所有这些组分由Picoscript Inc(Houston，TX)合成和装配。最终生成的质粒是一个分枝杆菌自杀载体，获得该质粒的图如附图1所示。最终生成的质粒结构如附图5所示被确认。

将等位基因交换质粒导入牛分枝杆菌BCG丹麦1331菌株

等位基因交换的过程由附图4流程图来说明，其概括了该程序的主要步骤。那些步骤由以下来详细描述。

BCG丹麦1331培养在7H9培养基中，该培养基含有10％的OADC(油酸-白蛋白-葡萄糖-触酶)(BD Gibco)和0.05％(v/v)的Tyloxapol(research and diagnostic lab)补充物。当培养进入对数期时，收集细菌并按以前说述的方法(Sun et al.，2004)为电穿孔做准备。使用标准的方法将5μg等位基因交换质粒导入新鲜制备的电感受态细胞。

通过标准电穿孔分枝杆菌的方法，将以上构建的等位基因交换质粒导入牛分枝杆菌BCG丹麦1331菌株。电穿孔后，细胞在7H9培养基中过夜培养，该培养基含有10％的OADC和0.05％(v/v)的Tyloxapol补充物。然后细胞被铺在含有50μg/ml卡那霉素和zeocin的7H10平板上。挑选最终生成的克隆并培养在含有10％(v/v)蔗糖的7H9培养基中。将获得的培养物铺在7H10平板上进行克隆，获得单个菌落，其可由PfoA基因置换ureC得到识别。附图4所示的流程图概括了这个方法的主要步骤，表1描述了自杀载体、pAF 102，其在附图1中也有描述。

表1.用于本发明的自杀载体

名称	骨架	等位基因交换的专一性等位基因
名称	骨架	等位基因交换的专一性等位基因	pAF102	pAF 100	侧翼ureC基因1kb的PfoA基因

实施例1表明，分枝杆菌BCG菌株通常被工程化，表达一个可选的溶内体蛋白，其在中性pH是有活性的，允许分枝杆菌逃出细胞胞质中的内体。

实施例2.rBCG-PfoA菌株的确认

实施例2的材料和方法.

分枝杆菌的培养：对于以下实验，BCG菌株在含有10％OADC补充物的Middlebrook 7H9培养基(BD biosciences)中，37℃下培养。使用Tyloxapol(0.05％v/v，Research Diagnostics Cat.No.70400)来分散细菌。实验中比较不同菌株之间的生长，在接种后的不同时间测定光密度(600nm)。对于卡那霉素敏感性的测试，可按以上所述制备培养物并测定其生长，除了卡那霉素加入的终浓度为50μg/ml。当使用固体培养基培养该细菌时，适当时可使用Middlebrook 7H10琼脂(BDbiosciences)，卡那霉素加入的终浓度为50μg/ml，蔗糖加入的终浓度为3％。

脲酶活性的测定：根据制造商的指导，在缺乏脲酶活性的条件下，使用脲酶测试盒(BD Difico)初次筛选实施例1所描述的来自蔗糖平板的终产克隆。简要地，挑取一环细菌再次悬浮在制造商所提供的测定缓冲液中，缓冲液装在透明试管中。BCG丹麦1331菌株用作脲酶阳性对照。单独的缓冲液用作阴性对照。室温下培养反应混合物30min，结果可根据制造商的指导来判定。

携带ΔureC:pfoA的rBCG菌株的遗传型分析.使用正向引物[acggctaccgtctggacat](SEQ ID NO：4)和反向引物[cgatggcttcttcgatgc](SEQ ID NO：5)来进行PCRs，扩增Pfo专一性插入等位基因的DNA序列和侧翼ureC基因的BCG基因组的DNA序列。PCR参数如下：步骤1：95℃4min，1个循环；步骤2：95℃1min，60℃1min，72℃1min，共30个循环；步骤3：72℃10min，1个循环；步骤4：4℃储存。PCR终产物通过琼脂糖凝胶电泳来分析，通过自动化双脱氧核苷酸测序技术来测序，并证实全长PfoA基因置换ureC基因的出现(例如ureC::PfoA)。

AFV102在巨噬细胞中的生长：通过决定分枝杆菌在已感染巨噬细胞里的菌落形成单位(CFUs)，rBCG菌株AFV102的原位生长可在J774A.1类巨噬细胞里得到测定。J774A.1细胞感染后的3小时，通过测定胞内CFU来决定分枝杆菌吞噬作用的效率。随后如先前所述(Sun etal.，2004)，通过裂解细胞来释放胞内细菌，用5倍的PBS清洗后，计数CFU。

由AFV102表达的Pfo溶血活性的分析：为了评价PfoA的分泌作用，让菌株生长到以上所述的对数中期。然后收集培养物上清和细菌。AFV102细菌沉淀物再次用100μl含有0.1％BSA的PBS(pH 7.0)悬浮在96孔V底平板中。为了测定PfoA蛋白是否分泌到培养物上清中，离心液体培养物，所得上清用于测定。为了测定表达的PfoA的溶血活性与其pH无关，样品用如上所述的方法来制备，除了用不同pH值的PBS缓冲液作为反应缓冲液。每孔中加入100μl 1％的清洗过的绵羊红细胞。轻轻混合反应物，于37℃下振荡培养1h。BCG丹麦1331菌株作为溶血的阴性对照。连续稀释已知溶血活性单位的α-溶血素(Sigma)作为溶血的阳性对照。培养结束后，于500g下离心15min，来自V底板的上清被转移到平底96孔板的相同位置，并测定光密度(450nm处的吸光度减去540nm处的吸光度)。通过测量红细胞裂解后颜色改变的光密度，定量PfoA分子的溶血活性。颜色的亮度与红细胞裂解量成比例，其然后与溶血素的量成比例。然后样本值可通过已知标准从标准曲线上读出。溶血单位定义为50％免疫红细胞裂解后的样本稀释度。

AFV102对巨噬细胞的细胞毒性：应用“Cell Titer 96Aqueous OneSolution Cell Proliferation Assay”试剂盒(Promega，cat#：G3580)，根据制造商的说明，通过测量从感染细胞中释放触的乳酸脱氢酶(LDH)，来确定重组菌株对J774A.1巨噬细胞(ATCC No.A TIB-67)的细胞毒性。简要地，AFV102细菌以10倍的级数感染细胞。在感染后的不同时间，以细胞中释放出的LDH量测量上清，然后与BCG丹麦1331菌株比较。以非感染的正常细胞为阴性对照。以感染细胞中释放出的LDH量与阴性对照细胞(100％的细胞存活)的对照为基础，计算存活细胞的比例。

实施例2的结果.

AFV102的构建：在AFV102的构建过程中，可选的局部二倍体细菌培养在含有Middlebrook 7H10的蔗糖平板上，最终通过PfoA表达盒来让等位基因交换基因置换ureC基因，该细菌可经过其同源性DNA片断与敲除质粒上的DNA片断进行等位基因交换，在其染色体上引导全部敲除质粒。在蔗糖平板上产生的菌落中，发现一个菌落Pfo-105-5(重新命名为AFV102)对脲酶是阴性的，推断ureC基因已通过PfoA表达盒被置换了。这个细菌菌落进一步通过ΔureC::ΩpfoA基因型的PCR来进行基因型分析。PCR反应的终产物通过1.2％的琼脂糖凝胶电泳来分析，结果如附图6所示。从结果可看出，用细菌作为模板的PCR可产生所期望大小的PCR产物，其大于双亲本BCG丹麦1331菌株的大小。ΔureC::ΩpfoA基因型的DNA条带的预期大小为2180bps，然而双亲本BCG丹麦1331菌株的大小为1967bps。克隆105-5的PCR产物进一步通过凝胶被纯化，也通过Johns Hopkins University(Baltimore，MD)的商业化测序设备被测序。测序结果显示，该菌落具有期望的ΔureC::ΩpfoA基因型。此外，PCR可靶向扩增卡那霉素基因和从AFV102菌株上得不到的sacB基因，得到任意PCR产物(数据未显示)。这些发现推断，AFV102已经过了最终的等位基因交换步骤并具有期望的ΔureC::ΩpfoA基因型。

AFV102的生长特性和卡那霉素敏感性测试：在脲酶活性测定和基因型结果的基础上，克隆105-5(重命名为AFV102)显示出了期望的基因型和ΔureC::ΩpfoA基因型。然后，通过其与双亲本BCG1331菌株的比较，进一步测定AFV102在7H9生长培养基上的生长能力。结果如附图7显示。可看出，AFV102在7H9生长培养基上具有与双亲本菌株非常相似的增殖曲线。此外，在卡那霉素存在的情况下，AFV102的生长降低程度与双亲本BCG丹麦1331菌株的相似，由此推断，如期望一样，其对卡那霉素具有相似的敏感性。

AFV102的细胞毒性：已报道，PfoA蛋白的单个氨基酸的改变(密码子从编码Gly的gga突变为编码Gln的cag)可导致对哺乳动物细胞毒性的丧失。然而该蛋白仍保留介导细菌逃出液泡的能力(Portnoy supra，1996)。从AFV102中表达的蛋白毒性通过用AFV102细菌感染J7741A细胞来评定。感染后在不同的时间点与未感染的正常细胞进行比较，AFV102不会引起任何比当前使用的BCG丹麦1331疫苗菌更重要的细胞死亡(附图8)。

在肺泡巨噬细胞细胞系中的存活：为了调查该构建物是否能在巨噬细胞中存活，使用对数中期培养物来感染J774A.1肺泡巨噬细胞。细胞以1∶1的感染复数(MOI)被感染。感染后，通过在不同时间间隔对细菌进行平板计数，来监控分枝杆菌的胞内存活。这点可能会在附图9中看到，AFV102构建物显示出与双亲本菌株相似的持久基因型，意味着这个构建物在J774A.1细胞中的胞内存活没有缺陷。

通过AFV102分泌PfoA蛋白：由含有AFV102构建物的细菌分泌PfoA蛋白可通过与BCG丹麦1331菌株相比能提高溶血活性的细菌培养物上清的测量来测定。在相同的光密度下获得AFV102和BCG丹麦1331菌株的培养物上清，并比较二者裂解红血细胞的能力。结果显示在附图10中。与以前的报道一致，由于细菌在生长期间释放代谢物，BCG培养物上清显示出一个基线水平的溶血活性，可能导致红细胞裂解(Grode et al.，Journal of Clinical Investigation，115：2472-2479；2005)。与BCG丹麦1331菌株相比，AFV102培养物上清具有更高水平的溶血活性，与分泌进培养物上清的PfoA分子一致。此外，PfoA的非pH依赖性的溶血活性进一步在pH 5.5和7.0下被测定和比较，结果显示在附图10中。可看出，来自AFV102的上清在pH 5.5和7.0下具有相似的溶血活性，这就意味着，如期望的一样，PfoA的溶血活性是pH非依赖性的。

实施例2表明，该构建菌株具有预期的生物活性，以及该菌株所产生的Pfo是分泌型的并具有pH非依赖性活性。

实施例3.rBCG-PfoA内体逃出和动物免疫原性测试

结核分枝杆菌发病机理的一个主要范例是噬菌化脓的捕捉。Armstrong和Hart(1971)已确定，结核分枝杆菌的吞噬体不能与铁蛋白标签溶酶体混合，称作吞噬体-溶酶体融合子的抑制。

牛分枝杆菌疫苗菌(BCG)也发现存在于吞噬体的间室中，隐匿在终端内吞细胞器官中(Clemens and Horwitz，1995；Hasan et al.，1997；Via et al.，1997)。发现，分枝杆菌吞噬体具有的铁传递蛋白受体(TfR)在密度上与那些存在于质膜上的TfR相似。铁传递蛋白受体被快速(t¹/₂in minutes)从内体中移出，并回传到质膜；然而，在分枝杆菌吞噬体内，这个过程被中断了，而且吞噬体将包含铁传递蛋白受体。就是这个现象允许我们来将含有分枝杆菌的吞噬体形象化。用抗体将吞噬体标记到铁传递蛋白上。同时，分枝杆菌用荧光染料染色，一旦细菌进入吞噬体，该染料可对其进行视角监控。结果表明，感染细胞后，rBCG-Pfo构建物能够逃出内体。

内体逃出测试的材料和方法：细菌和细胞：BCG丹麦1331和rBCG-ΔureC::ΩpfoA_G137Q(AFV102)生长在含有10％(v/v)OADC和0.05％(v/v)Tyloxapol补充物的7H9培养基上(生长培养基)，OD₆₀₀大约在0.8-1.0。感染前，根据厂商指导，用Alexa Fluor 568 succinimidylester(Molecular Probes，Eugene，OR)标记细菌细胞，置于PBS中，室温下放置1-1.5小时。这个染料会在位于细菌表面上蛋白的一级胺上形成非常稳定的氨键。简要来讲，10ml细菌培养物被颗粒化并重新悬浮在25ml含有0.625μg/ml Alexa Fluor 568的PBS中，室温下培养1-1.5小时，来标记细菌。然后用PBS(pH 7.2)清洗标记的细菌细胞3次，并重新悬浮在7H9生长培养基中，在冰箱中过夜储存。如前所述(Sun etal，2004)，J774A.1细胞培养在DMEM培养基中，使用6孔培养板，该培养板表明有人类显微连接蛋白包被的涂层。细胞铺在培养板上的密度是3×10⁶个细胞/孔，在37℃、5％CO₂和潮湿的条件下培养2天。感染期间，标记细菌被颗粒化并重新悬浮在DMEM+10％FBS培养基中，并且直接以每个细胞10的感染复数(MOI)添加到J774A.1细胞。20min、8h、24h后，细胞在室温下用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.2)清洗。然后细胞用2％多聚甲醛在PBS(pH 7.2)中、室温下固定20min。固定的细胞然后用0.1％Triton X-100在PBS(pH 7.2)中、室温下渗透10min，接着用PBS(pH 7.2)洗2次。用3％牛血清白蛋白(BSA)、5％正常山羊血清(NGS)和0.5％叠氮钠在PBS(pH7.2)中、室温下至少终止2h或4℃过夜。去除终止缓冲液，然后将抗小鼠的铁传递蛋白受体-FITC(US Biological，Swampscott，MA)以1∶50的稀释倍数加入到PBS(pH 7.2)中，该PBS含有1％BSA、3％NGS和0.5％叠氮钠，接着在室温下至少培养1h。然后用PBS清洗2-3次，并且用vectsheild mounting培养基层铺在玻片上。使用Nikon TE2000反向显微镜，以1500的放大倍数分析，该显微镜上配备有Retiga EXI Mono，12 bitcooled，IR滤波数字式成像机。

结果：在显微镜下检查时，发现感染后15min，BCG和rBCG-PfoA细菌均被寄主细胞内在化(internalized)，然而，感染后8h，发现与BCG细菌相比，rBCG-PfoA细菌在内体的外面，大部分BCG细菌位于寄主吞噬体内。这些结果在附图11A-D中用图解进行了说明，其说明了细菌侵染巨噬细胞(附图11A)、BCG在内体中的持续(附图11B)、早期内体内的AFV102(附图11C)、以及由于重组PfoA的分泌，AFV102细菌从内体中逃出进细胞胞质中(附如11D)。细菌计数表明，感染后8小时，138个AFV102细菌中有100个逃出了内体(72％)，然而100个BCG细菌中仅有29个逃出了内体(26％)。感染后24小时内检查细菌，产生相似的结果。这个发现表明，PfoA的表达可增强AVF102从吞噬体中释放出来。

应用一种不同的体系，对这个结果进行了进一步的验证，该体系在一个和以上相似的实验环境和程序下，用pH敏感性染料标记内体和溶酶体(Lysotracker-Red，Molecular probes，catalog number L-7528)。细菌在568的波长发射下观察，而吞噬体在488的波长发射下观察。该结果与以上发现一致。

实施例3表明，重组菌株AVF102能够逃出内体，而BCG菌株逃出内体的效率甚微。因此，菌株AVF102比BCG更有可能引起组织相容性-I型免疫应答，而且将在疫苗应用上非常有用。

实施例3的参考文献.

Armstrong J，Hart PD.1971.Response of cultured macrophages toMycobacterium tuberculosis，with observations on fusion of lysosomeswith phagosomes.JExp Med.134：713-40.

Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophilaphagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.InfectImmun.68(9)：5154-66.

Hasan Z，Schlax C，Kuhn L，Lefkovits I，Young D，Thole J，Pieters J.1997.Isolation and characterization of the mycobacterial phagosome：segregation from the endosomal/lysosomal pathway.Mol Microbiol25(2)：427

Via LE，Deretic D，Ulmer RJ，Hibler NS，Huber LA，Deretic V.Arrest of mycobacterial phagosome maturation is caused by a block invesicle fusion between stages controlled by rab5and rab7.J Biol Chem.1997.272(20)：13326-31.

Sun R，Converse PJ，Ko C，Tyagi S，Morrison NE，Bishai WR.2004.Mycobacterium tuberculosis ECF sigma factor sigC is required forlethality in mice and for the conditional expression of a defined gene set.Mol Microbiol.52(1)：25-38

实施例4.疫苗接种方法和配方.

疫苗配方以决定其在整个生产过程中的最大生存能力和稳定性研究为基础。这包括培养期间微生物的最大生存能力(活到死)的确定，分枝杆菌的培养可使用各种常规培养基，包括甘油、糖、氨基酸、以及清洁剂或盐等添加剂。培养后，通过离心或切向流过滤获得细胞，并将之重新悬浮在一种稳定性培养基中，该培养基在冷冻或冷冻干燥期间可保护细胞。通常使用的稳定剂包括谷氨酸盐、氨基酸或氨基酸的衍生物、甘油、糖或常用盐。终配方将提供由皮内输送、皮下注射、灌注或口服的完全存活的微生物，为运输和使用保持充足的货价期。

TB疫苗的潜伏期评价

常规安全试验以2×10⁶CFU的rBCG有益菌株和同功的双亲本菌株对6组BALB/c小鼠进行腹膜内感染。侵染后14天对这些动物进行常规的健康和体重检查。获得BCG和rBCG菌株的动物依然健康，而且体重下降，在观察期间没有明显的病症。

新的菌株在免疫活性鼠中的毒性.以2×10⁶rBCG和双亲本菌株对15组BALB/c小鼠分别进行腹膜内感染。浸染后的第1天，将每组中的3只小鼠致死，分析脾、肺或肾中的CFUs，确保每只动物具有相同的感染剂量。在浸染后的第4，8，12和16周，将每组中的3只小鼠致死，获得其脾脏、肺或肾中的CFUs，与双亲本BCG菌株比较，确定rBCG菌株的体内生长。

免疫低弱老鼠的严谨安全测试.以2×10⁶rBCG和双亲本菌株感染10组具有SCID(严重联合免疫缺陷)表现型的免疫低弱小鼠。侵染后的第1天，将每组中的3只小鼠致死，评价其脾、肾和肺中的cfu来确定接种剂量。监控每组中剩余7只小鼠的一般健康和体重。追踪这些存活的小鼠并在整个观察期间比较存活的rBCG感染小鼠与存活的双亲本菌株感染的动物。

豚鼠安全试验.与已确定对人类具有很好安全性的双亲本BCG疫苗进行比较，rBCG菌株的安全性也在豚鼠模型中进行了评定。首先，检查该疫苗对动物普通健康状况的作用，包括增重。以10⁷(100倍的疫苗剂量)的重组和双亲本菌株对豚鼠进行肌内免疫，连续6周对这些动物的常规健康和体重进行监控。对6周前死亡的动物进行事后分析检查。所有动物在感染后6周的末期被致死。在该试验的证实下，没有发现减重和非异常行为，而且所有器官在6周尸体解剖中显示正常，而且/或者发现对rBCG-PfoA疫苗没有不良健康作用，以及接种rBCG-PfoA疫苗的动物与接种双亲本菌株的动物相比，以正常的速率获得了体重。

同时监控了动物器官中的细菌水平。用双亲本或重组疫苗免疫的豚鼠在接种后的不同间隔施无痛致死术，之后化验肺、脾和局部(腹股沟)淋巴结中的BCG或rBCG的CFU。

毒性试验.为了评价rBCG菌株的毒性，用1个剂量、高于单剂量4倍或低于单剂量4倍的使用于人类的rBCG菌株、BCG双亲本菌株或盐水对豚鼠(每组12只)进行皮内疫苗接种。接种后的第3天，将6只动物致死来评定疫苗对这些动物的急性效应。接种后的第28天，将剩余的6只动物致死来评价慢性效应。在两者的时间点，获得每只动物的体重，并检查肉眼病理和注射部位的外观。

鼠科保护性研究.13组C57B1/6小鼠(雌性，5-6周岁)以10⁶CFU的rBCG、双亲本BCG或盐水进行皮下免疫。另组小鼠作为健康对照。免疫后的第8周，小鼠用结核分枝杆菌株(或H37Rv卡那霉素抗性株)进行激发，所用的是一种产自共含有10⁷CFU激发株的10ml单细胞悬浮液的气溶胶(aerosol)，如前所述，一个剂量可传递大约100个活菌到每个动物的肺部(Brodin et al，J Infect Dis.，190(1)：115-122；2004)。监控接种动物伴随未激发动物的存活。随着激发，发现这些动物的体重健康状况下降。激发后的第1天，将3只小鼠致死获得肺部CFU来确定激发剂量，致死1只动物进行脾脏和肺脏组织病理学研究。激发后的第5周，将每组中的9只动物致死，并进行组织病理学和微生物学分析。对6只小鼠肺脏和脾脏组织进行CFU计数分析(使用选择性平板来将疫苗株从激发株中区分开来)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性株激发，那么可用卡那霉素或TCH(噻酚-2-羧基酰基肼)来将疫苗株从激发株中区分开来(BCG是易感的，而结核分枝杆菌是天然抗性的)。

皮肤迟发性超敏反应的诱导(DTH).以10³rBCG或BCG双亲本菌株对无特殊病源体(SPF)进行皮层免疫。免疫后的第9周，削刮这些动物的后背并用100μl含有10μg PPD(蛋白纯化衍生物)的磷酸盐缓冲液进行皮内注射。24小时后测量硬结外径(DTH)。rBCG株诱导的DTH等于或大于双亲本BCG株诱导的。

豚鼠激发研究.为了确定rBCG疫苗抗结核分枝杆菌激发的功效，对12组豚鼠(年轻成年SPF Hartley，250-300g，雄性)进行免疫，每个用rBCG、双亲本BCG株或盐水进行免疫。以10⁶cfu进行皮内疫苗接种。用含有结核分枝杆菌的气溶胶在免疫后的第10周，对rBCG-、BCG-和假免疫的动物进行激发，该气溶胶是由含有共10⁷cfu结核分枝杆菌的10ml单细胞悬浮物产生的；如前所述，这个过程将大约100个活菌传递到每只动物的肺部(Brodin et al.，2004)。激发后，伴随未接种、未激发的健康组动物监控这些激发动物的存活、丧失的体重和一般健康。激发后的第10周，将每组动物中的6只致死，每组中的其余6只在激发后的第70周进行长期评价。在二者的时间点，对这些动物进行组织病理学和微生物学分析。通过组织病理学和CFU计数来评价肺组织和脾组织(使用选择性平板来将疫苗株从激发株中区分开来)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性株激发，那么可用卡那霉素或TCH(噻酚-2-羧基酰基肼)来将激发株从疫苗株中区分开来。如果使用结核分枝杆菌Erdman株来激发，那么可用TCH来将疫苗株从激发株中区分开来(BCG是易感的，而结核分枝杆菌是天然抗性的)。对一成功的激发研究来说，激发后假免疫动物大多很快死亡，而且rBCG免疫动物存活时间要长于BCG双亲本株免疫的动物。

灵长类动物的安全和激发研究.最近，非人灵长类已用于评价抗结核分枝杆菌的疫苗。这种在人类和非人灵长类之间的进化关系以及这些种群之间相似的临床和结核病理表现已使得非人灵长类模型在结核病和疫苗功效上的实验研究引人注目。

这个模型，以肺空洞(lung cavitation)的发展为特性，显得适用于人类结核病。感染过程和疾病的追踪手段有X射线、减重，以及各种血液学试验，包括沉降反应(ESR)、周围血液单核细胞(PBMC)和细胞因子、T淋巴细胞细胞毒(CTL)活性，以及抗体反应。随着感染的进行，猕猴肺部表现出特征性病变，而且，根据激发剂量的差异，感染后4-6个月，会出现急性呼吸道感染引起的死亡。更低感染剂量会导致无疾病的慢性感染，与人类很相似。

该研究直接比较各种剂量的BCG双亲本菌株对重组菌株，或单独比较或由两个带有疫苗的继发性激发剂跟踪，该疫苗由rBCG构建物过表达的序列组成。后者以任意几种已知的方式被传递，包括但不限于：以基于合适辅剂的重组蛋白方式、以DNA方式或以Ad35构建物方式。

初次研究在无激发剂的情况下评价双亲本BCG对rBCG构建物的保护性功效。该研究由3组动物组成，每组有10只动物：一组每个包含BCG、rBCG和盐水。每组中有2只动物用rBCG构建物中过表达的抗原进行皮试，同时以标准的PPD和盐水为对照。与BCG比较，rBCG组中的一个阳性和较大的硬结是体内疫苗吸收和引起免疫应答的指示。每组中其它8只动物被用低剂量结核分枝杆菌Erdman株进行了气溶胶激发，并且通过在激发后16周降低细菌载荷或用末端点的存活率进行保护性测定。

随后的BCG主要方案在本质上与以上相同，除了动物首先用BCG、rBCG和盐水进行疫苗接种，随后用两个带有过表达抗原的激发剂。

在非人灵长类模型中的免疫原性和保护性研究可调查结核病在猕猴中对rBCG构建物在免疫生物学和免疫病理学方面的功效研究。这些动物是关养状态下青年动物中的幼小动物，平均体重2-3kg，实验前经过了全面的条件适应。预接种研究包括基线血液测试和沉降反应速率以及淋巴细胞繁殖分析，基线血液测试包括常规的血液学研究。用PPD进行皮试，确保对结核菌素敏感性的缺乏，并获得胸腔X射线，作为部分预感染剖面。免疫期共持续21周，覆盖在0周时用BCG或rBCG进行的初次疫苗接种，以及在12和16周的抗原激发。抗原特异性免疫通过测定繁殖和在淋巴细胞刺激试验里分泌的γ干扰素(IFN γ)来评定。淋巴细胞产生干扰素的频率由酶联免疫试验(ELISPOT)和荧光激活细胞分析仪(FACS)来确定。最后，相对于初次免疫，在0，4，8，12，16和20周采取血样。

最后免疫后的4-6周，在同一天，通过在动物的气管内放置3ml(1,000cfu)结核分枝杆菌Erdman株以及相同的制剂来激发动物。感染过程的评价有体重下降、发烧、沉降反应速率(ESR)上升、DTH到PPD、用PPD刺激的PBMC体外增值反应以及rBCG中过表达的抗原伴随IFN-g的测量水平。对胸部进行X射线来检测伴随肺部结核病的异常，最终，在激发后的12-16周进行尸体剖检。

TB载体和疫苗的临床评价

安全性和毒性研究：根据以上所述的潜伏期和毒性研究，联邦监管要求进行潜伏期和毒性研究。这些研究后，也要进行人类安全性研究。这些研究首先在全血干扰素(Quantiferon)阴性的健康成年人身上进行，随后将年龄降低，进入儿童和婴儿的测试。

免疫原性研究：小鼠和灵长类中的免疫原性研究利用但不限于评价细胞免疫的标准方法，例如INFγ、ELISPOT、用短期和长期抗原或肽刺激的流式细胞仪，等等。对人类的应答使用相似的方法。对人类接种疫苗后的CD4和CD8应答的评价，要进行四聚体研究。

优化致敏-加强(致敏-加强)疗法：rBCG可很好地用作抗TB或其它疾病的良好疫苗，因此，它已被工程化来表达相关抗原。这儿提到的rBCG可作为TB疫苗或表达抗原来抵抗其它疾病，也可很好地执行用重组蛋白免疫的加强免疫前的初次免疫，重组蛋白混合有辅剂，或病毒或细菌载入的抗原。在动物临床前研究和人类研究中，BCG初次免疫后要重组蛋白/辅剂或载体的再次免疫，可就服用方法和剂量进行优化。这些致敏-加强疗法对于诱导人类免疫是最有效的方法，因为BCG致敏的效力体现在本发明中，随后通过重组蛋白或载体集中和加强免疫系统的加速响应。

暴露后的疫苗疗法在动物中的研究：C57BL/6小鼠但不限于该动物将用于建立潜伏性感染；将对该小鼠在仅有可忽略的结核分枝杆菌专一性免疫诱导的时间点进行疫苗治疗，并由记忆T细胞沉淀和控制。然后，将会通过对单个小鼠肺脏和脾脏的cfu进行计数，在最终疫苗治疗后的2和5个月，对小鼠进行疫苗疗效评定。Cfu计数将会通过标准的统计方法在鼠组中被分析，其结果将用于判断疫苗疗法是否可有效地降低潜伏的结核分枝杆菌对小鼠的感染。必要时，可用相似的方法来评价其它动物的应答。

BCG载体的临床评价：rBCG疫苗的口服法.使用先前所述的方法可获得带有本发明rBCG的目标动物的口服疫苗(Miller et al.，Can MedAssoc J.121(1)：45-54；1979)。本发明中rBCG的口服剂量将根据患者种类、疾病和治疗条件而有差异。通常使用的剂量约10³-10¹¹个活力微生物，优选约10⁵-10⁹个活力微生物。

rBCG的使用通常要结合药学上可接受的载体或稀释剂。药学上可接受的特殊载体或稀释剂不是本发明的重点。稀释剂的例子包括磷酸盐缓冲液，对抵抗胃酸具有缓冲作用的缓冲液，例如含有蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0)，单独的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)(Levine et al.，J.Clin.Invest.，79：888-902；1987；and Black et al.，J.Infect.Dis.，155：1260-1265；1987)，或含有抗坏血酸、乳糖和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)(Levine et al.，supra，1989；Lancet，II：467-470；1988)。载体的例子包括蛋白质，例如在脱脂乳中发现的这种蛋白质，糖类，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。有代表性的这种载体以大约0.1-90％(w/v)的浓度被使用，优选浓度范围在1-10％(w/v)。

实施例5.在严重联合免疫缺陷老鼠中的安全性

如早期所提及，Llo在BCG中的表达证实了在促进内体逃出上相对无效，可能因为在BCG存在的修饰内体微环境的中性pH下，Llo的活性低(Hess，et al.，Proc Natl Acad Sci 95：5299；1998；Grode et al.，J.Clin.Invest，J Clin Invest.115(9)：2472；2005)。但是，Llo的表达明显地对内体进行了充分的修饰，从而降低BCG-Llo+在SCID小鼠中的毒性(Grode et al.，2005)。该发现提出，重定位BCG对寄主细胞的胞质具有潜在的免疫原性和独特的活TB疫苗安全性的双重促进作用。因此，该研究的目的是来确定在SCID小鼠中表达PfoA_G137Q的内体-逃出株AFV102的安全性。

为此，双亲本菌株BCG蛋白1331((BCG₁₃₃₁)和表达PfoA_G137Q的BCG₁₃₃衍生物、菌株在2L的长颈瓶中振荡(150个振荡/min)培养至对数期(540nm处的光密度为6.5-7.5)。通过离心获得细菌，-80℃储存，1.5×10⁹cfu/ml，储存体系为盐水+0.05％(v/v)tyloxapol+10％(v/v)甘油。

通过在冰上解冻以上大瓶中的物质来制备接种物，并用无内毒素(＜0.05EU/ml)的生理盐水(0.85％w/v NaCl)做系列稀释。用这些稀释物对6组SCID小鼠进行皮下接种，接种剂量分别如表2所示，悬浮在0.1ml的体积中。

表2.SCID小鼠安全性设计研究

组	疫苗	剂量
组	疫苗	剂量	1	PBS
2	BCG₁₃₃₁	3×10⁴	1	PBS
2	BCG₁₃₃₁	3×10⁴	3	BCG₁₃₃₁	3× 10⁵
4	BCG₁₃₃₁	3×10⁶	3	BCG₁₃₃₁	3× 10⁵
4	BCG₁₃₃₁	3×10⁶	5	BCG₁₃₃₁	3×10⁷
6	AFV102	3×10⁵	5	BCG₁₃₃₁	3×10⁷
6	AFV102	3×10⁵	7	AFV102	3×10⁶
8	AFV102	3×10⁷	7	AFV102	3×10⁶
8	AFV102	3×10⁷	9	AFV102	3×10⁸

接种后，监控小鼠在感染后100多天周期中的存活。该研究的结果表明，接种AFV102的小鼠存活时间要长于接种相似剂量BCG₁₃₃₁的小鼠。

最近，使用异种加强免疫疫苗来支持BCG导致的免疫已引起了人们的关注。因此，BCG初级免疫实验动物和人类产生强的细胞免疫应答，随后有异种加强免疫，其由编码结核分枝杆菌抗原85A(这儿指“Ag85A”；也以Rv3804c而闻名；Vordemeier et al.，Immunol.112(3)：461；2004；McShane et al.，Nature Med.10(11)：1240；2004)的安卡拉疫苗(MVA)组成；对照中，空白个体对MVA-Ag85A载体产生相对弱的应答((McShane et al.，2004)。此外，已有独立的研究表明，用BCG进行初级免疫和MVA-Ag85A((Williams et al.，Infect Immun.73(6)：3814；2005)或Mtb72f亚单位疫苗(Brandt et al.，Infect.Immun.72(11)：6622；2004)进行加强免疫的实验动物产生对结核分枝杆菌抗性的水平要大于那些单独用BCG进行疫苗接种的。尽管这些研究不能详细说明关联保护(correlates of protection)，但明确的是异种致敏-加强免疫接种疫苗的方法可提供一种有效的手段来促进对结核分枝杆菌的抵御。

因此，其目的和下列实施例是为了评价在致敏-加强免疫疫苗接种后的内体-逃出菌株AFV102。实施例中该实验的目的是来优化致敏-加强免疫疫苗接种的时间间隔，其中，内体-逃出株AFV102用作初级免疫，复制缺陷型腺病毒血清型35疫苗载体(Vogels et al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003；Barouch et al.，J.Immunol.172(10)：6290；2004)用作加强型免疫，该载体在细胞巨化病毒早期启动子(Vogels et al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003)的控制下，引导编码融合蛋白的由结核分枝杆菌基因Rv3804c-Rv1886-Rv0288组成的表达盒。该激发剂通过鼻内给药，因为通过这种服药方式，腺病毒对TB抗原的表达比通过常规的肠道服药方式更有效(Wang et al.，J.Immunol.173(10)：6357；2004)。

因此，10组SPF雄性Hartley豚鼠(250-300g)如图3所示被免疫，以便评价14，18和21周的致敏-加强免疫的间隔。

表3.豚鼠服药方式研究设计

组	致敏I(1天)	致敏II(3周)	致敏III(7周)	加强(21周)
组	致敏I(1天)	致敏II(3周)	致敏III(7周)	加强(21周)	1	盐水(id)	-	-	-
2	AFV102(id)	-	-	Ad35-TBS(in)	1	盐水(id)	-	-	-
2	AFV102(id)	-	-	Ad35-TBS(in)	3	-	AFV102(id)	-	Ad35-TBS(in)
4	-	-	AFV102(id)	Ad35-TBS(in)	3	-	AFV102(id)	-	Ad35-TBS(in)
4	-	-	AFV102(id)	Ad35-TBS(in)	5	-	-	-	Ad35-TBS(in)

注意：Ad35-TBS表示复制缺陷型腺病毒血清型35疫苗载体(Vogels et al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003；Barouche et al.，J.Immunol.172(10)：6290；2004)，其在细胞巨化病毒早期启动子(Vogelset al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003)的控制下，引导编码融合蛋白的由结核分枝杆菌基因Rv3804c-Rv1886-Rv0288组成的表达盒。

初级免疫以0.1ml 10％甘油中含10⁶cfu剂量进行皮内免疫。初级免疫后的第14周，豚鼠给予由Ad35-TBS组成的激发剂，并以悬浮在10mlPBS中的10⁹空斑形成单位(i.e.Vogels et al.，2003；Barouch et al.2004)的剂量进行皮内免疫。

加强免疫后的第14周，用含有分枝杆菌Erdman株的气溶胶激发动物，气溶胶产自共含有10⁷cfu结核分枝杆菌的10ml单细胞悬浮液；如先前说述(Brodin et al.，2004)，这个过程将大约100个活菌传递到每个动物的肺部。激发后的第5周，杀死每组中的动物，获得肺脏和脾脏来进行组织学和微生物学分析。在后者的实施例中，对豚鼠肺和脾组织进行了cfu计数。因为结核分枝杆菌Erdman株用于激发，所以在培养基中加入TCH来将对TCH敏感疫苗株从激发株中区分开来。

该研究的结果可鉴定rBCG初级免疫和Ad35-TBS加强免疫之间的最佳间隔。

实施例6.免疫激发

为了测定候补TB疫苗株AFV102抗结核分枝杆菌激发的效力，如表4所示的8组？(年轻的成年SPF Hartley豚鼠)豚鼠(250-300g)被进行了免疫。

表4：豚鼠激发研究设计

组	致敏(1天)	加强(n^*周)	攻击(加强+14周)
组	致敏(1天)	加强(n^*周)	攻击(加强+14周)	1	盐水(id)	-	100cfu Erdman
2	BCG丹麦1331(id)	-	100cfu Erdman	1	盐水(id)	-	100cfu Erdman
2	BCG丹麦1331(id)	-	100cfu Erdman	3	盐水(id`)	Ad35-TBS(in)	100cfu Erdman
4	AFV102(id)	AFV102(id)	100cfu Erdman	3	盐水(id`)	Ad35-TBS(in)	100cfu Erdman
4	AFV102(id)	AFV102(id)	100cfu Erdman	5	AFV102(id)	Ad35-TBS(in)	100cfu Erdman

注意：

1.n^*表示初级免疫和加强免疫之间的间隔将是前述实施例中所界定的值。

2.Ad35-TBS表示复制缺陷型腺病毒血清型35疫苗载体(Vogelset al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003；Barouche et al.，J.Immunol.172(10)：6290；2004)，其在细胞巨化病毒早期启动子(Vogels et al.，J Virol.77(15)：8263-71；2003)的控制下，引导编码融合蛋白的由结核分枝杆菌基因Rv3804c-Rv1886-Rv0288组成的表达盒。

4和5组的初级免疫以含10⁶cfu剂量的0.1ml 10％的甘油进行皮内免疫。1和3组的对照小鼠仅以0.1ml 10％的甘油进行皮内免疫。2组的对照小鼠给予含有10⁶cfu的BCG丹麦1331的0.1ml10％的甘油。

初级免疫后的第14周，对豚鼠进行加强免疫。在第5组中，加强免疫由AFV102组成，并以含10⁶cfu剂量的0.1ml 10％的甘油进行皮内免疫。4和6组的加强免疫由Ad35-TBS组成，并以悬浮在10μl PBS中的10⁹空斑形成单位(i.e.Vogels et al.，2003；Barouch et al.2004)的剂量进行皮内免疫

在最终免疫后的第14周，动物用含有结核分枝杆菌的气溶胶进行激发，气溶胶产自共含10⁷cfu结核分枝杆菌的10ml单细胞悬浮液；如前所述(Brodin et al.，2004)，这个过程将大约100个活菌传递到每个动物的肺部。随后进行激发，监控这些动物伴随健康组为接种疫苗、为激发动物的存活情况。也监控这些动物的体重下降和一般健康状况。

该研究的结果表明，激发后假免疫的动物迅速死亡，皮内接种BCG疫苗但没有加强免疫的动物显示的死亡处于一种中间平均状态，以及用AFV102进行免疫并用Ad35-TBS进行加强免疫的动物存活的时间最长

实施例7.细胞凋亡

细胞凋亡是程序性细胞死亡，就其感应性和结果来说，与坏死性的细胞死亡大大不同。含有外源抗原的细胞凋亡是抗这种抗原的一种强有力的已知的细胞免疫刺激。这个抗原包被细胞的凋亡诱导有效细胞免疫的过程导致的细胞免疫某些时候被称作交叉启动(cross-priming)^1，2，3。诱导凋亡从而导致增强型抗原特异性细胞介导的免疫有几种机制。Caspase 8介导的凋亡导致抗原特异性细胞的免疫保护⁴。重组BCG逃出内体，进入细胞胞质，产生Caspase 8，这是一种诱导程序性细胞死亡的强大的额外方法，与此相关，重组BCG表达外源抗原，抵抗BCG，而且其它由重组BCG过表达的结核病抗原也会抵抗BCG本身的抗原，导致高水平的抗原特异性细胞免疫。以TRAIL-R2(TRAIL受体2)闻名或TNFR-SF-10B(肿瘤坏死因子-超家族成员10B)的死亡受体-5((DR-5)也介导caspase 8，从而介导细胞凋亡⁴。呼肠弧病毒诱导的凋亡由TRAIL-DR5介导，导致随后的病毒清除⁵。由重组BCG表达的DR-5逃出内体，将对抗rBCG表达的抗原的抗原特异性细胞免疫的诱导提供一种有力的辅助作用。细胞表达的抗原也会被诱导，经受穿过Fas连接的凋亡，这对抗原特异性细胞免疫应答的诱导是一种很强的刺激⁶。重组BCG逃出内体，表达Fas或Fas胞质域/CD4胞外域融合蛋白，这将会诱导凋亡和抗原特异性细胞免疫应答。

这种由rBCG内体逃出株增强的细胞免疫或由rBCG内体逃出株产生以上所述的额外加强性的凋亡不限于BCG抗原或为rBCG过表达专门编码的抗原，而是包括任意上述的rBCG能够入侵的真核细胞中的抗原。例如，如果这样的一个rBCG被输送到诱导凋亡的肿瘤细胞，那么抗重要肿瘤抗原的细胞免疫将被诱导，导致肿瘤和/或转移性病灶的消除、减少或预防。当考虑到局部性症状时，例如膀胱癌，这个抗肿瘤作用将排除由BCG产生的一般性抗肿瘤作用。

在本发明的另一实施例中，具有逃出内体功能的rBCG或由凋亡介导的专一性产物加强的具有逃出内体功能的rBCG传递进肿瘤或其它细胞，在其中，这个rBCG也会产生外源抗原，其中将要产生的强细胞免疫应答将会诱导强细胞应答的产物抵抗那些肿瘤细胞或其它含有这些抗原的真核细胞。这些细胞应答将导致免疫介导的肿瘤细胞破灭，进而进行交叉启动并诱导抗肿瘤或其它重要抗原的细胞免疫，随后消除、减少或预防肿瘤和/或转移性病灶。这种外源抗原的一个实施例是与寄主细胞HLA不同的HLA抗原，在其抵抗下，将出现一种很强的异种细胞应答。

具有逃出内体功能的rBCG或由输送专一性肿瘤抗原的凋亡专一性介导物通过表达而加强的具有逃出内体功能的rBCG，将诱导抗这些肿瘤抗原的强抗原特异性细胞应答，包括打破对这些抗原的耐受性，导致肿瘤和/或转移性病灶的消除、减少或预防，而且不需要直接将rBCG输送进肿瘤细胞本身。

细胞凋亡后，DNA受到破坏或caspase 9诱导对一定抗原的耐受性。耐受性的诱导在控制或预防自身免疫性疾病上是重要的，例如但不限于糖尿病、类风湿性关节炎、克隆氏病、肠炎和多发性硬化。通过rBCG逃出内体进入细胞，例如但不限于β胰腺细胞、结肠直肠和神经细胞，从而产生caspase 9或其它凋亡介导的耐受性诱导蛋白，这将产生有限的凋亡，从而诱导对在那些细胞中进行自身免疫的抗原靶的耐受性，因此处理或预防自身免疫病的状况。鉴定包含在自身免疫反应里的专一性抗原，将允许诱导对这些自身免疫靶抗原的耐受性，这可通过逃出内体的rBCG产物来实现，该产物是这些抗原和caspase 9或能够诱导凋亡介导的耐受性的其它分子。这样的rBCG将处理和/或预防这些自身免疫病。

实施例7的参考文献.

1.Heath，W.R.，G.T.Belz，G.M.Behrens，C.M.Smith，S.P.Forehan，I.A.，Parish，G.M.Davey，N.S.Wilson，F.R.Carbone，and J.A.Villandangos.2004.Cross-presentaion，dentritic cell subsets，and thegeneration of immunity to cellular antigens.Immunol Rev 199：9.

2.Gallucci，S.，M.Lolkema，and P.Matzinger.1999.Naturaladjuvants：Endogenous activators of dendritic cells.Nature Biotechnology.5：1249.

3.Albert，M.L.，B.Sauter，and N.Bhadrdwaj.1998.Dendtriticcells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restrictedCTLs.Nature 392：86

4.Sheridan，J.P.，S.A.Marsters，R.M.Pitti，A.Gruney，M.Skutbatch，D.Baldwin，L.Ramakrishnan，C.L.Gray，K.Baker，W.I.Wood，A.D.Goddard，P.Godowski，and A.Ashkenazi.1997.Control of Trailinduced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors.Science277：818.

5.Clarke，P.，S.M.Meintzer，S.Gibson，C.Widmann，T.P.Garrington，G.L.Johnson，and K.L.Tyler.2000.Reovirus-inducedapoptosis is mediated b y TRAIL.J.Virol 74：8135.

6.Chattergoon，M.A.，J.J.Kim，J.S.Yang，T.M.Robbinson，D.J.Lee，T.Dentchev，D.M.Wilson，V.Ayyavoo，and D.B.Weiner.2000.Targeted antigen delivery to antigen-presenting cells including dendriticcells by engineered Fas-mediated apoptosis.Nat Biotechnology 18：974.

7.Hugues，S.，E.Mougneau，W.Ferlin，D.Jeske，P.Hofman，D.Homann，L.Beaudoin，D.Schrike，M.Von Herrath，A.Lehuen，and N.Glaichenenhaus.2002.Tolerance to islet antigens and prevention fromdiabetes induced by limited apoptosis of pancreatic beta cells.Immunity16：169.

实施例8.能够逃出内体的rBCG株中的疫苗抗原的过表达

为了过表达rBCG株AFV102里的TB抗原，需将与编码Rv3804c(也以Ag85A闻名)、Rv1886(也以Ag85B闻名)和Rv0288(也以TB10.4闻名)的序列具有功能性相关的编码Rv3031启动子的序列插入pAF100的PacI位点。由此产生的质粒，pAF105(附图12)，随后用限制性内切酶NdeI消化，移去大肠杆菌复制子和卡那霉素抗性基因，再用T4连接酶连接成环。将该DNA(1-2g)通过电穿孔导入rBCG株AFV102。该细菌在含有25-30ml固体培养基(Middlebrook 7H10)的8.75cm平板上培养。随后通过PCR预筛选来检测引导抗原表达质粒的菌落，一个选择性rBCG菌落，其既是阳性的，也含有TB抗原表达盒，被指定为AFV102，并通过500ml的液体培养基(Middlebrook7H9)，37℃下，振荡，扩大培养。一旦培养物进入对数晚期，在该500ml的培养物中加入终浓度为10％(v/v)的甘油，并以5ml的量分装该种子，-80℃储存。

将BCG和rBCG培养物用磷酸盐缓冲液(PBS)进行系列稀释(例如，10倍步骤，0-10^-8)，然后取100ml均匀涂在含有含有25-30ml固体培养基(Middlebrook 7H10)的8.75cm平板上，进行纯化。使用质粒DNA的PCR和限制性内切酶分析来确定所需基因型存在于每个rBCG的分离物中。此外，可通过自动化脱氧核苷酸测序技术对PCR产生的DNA片断进行测序，来确定出现的全长基因。

为了评价分泌PfoA的AFV102和引导TB抗原表达质粒的AFV112，如上所述，两种菌株均可生长到对数中期。收集这些培养物的上清并通过0.2mm的滤膜过滤，这点如前所述(Hess et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：5299-304；1998)。然后如上所述，评价培养物过滤液中蛋白的溶血活性。结果表明，AFV102和AFV112显示了相似的溶血活性，AFV112依然保留ureC::pfoA_G137Q等位基因并表达一种功能性的PfoA蛋白。

最后，培养物上清中的蛋白可在10-15％SDS-PAGE胶上被分开，从而来评价TB抗原的表达。结果显示了Rv3804c和Rv1886的增强性表达。因为不希望Rv0288在培养物上清中过表达，所以通过观察可推断，这个10kDa蛋白的过表达物是过表达的，其在像Rv3804c和Rv1886的相同的mRNA上表达。

总体来讲，该实施例证明，rBCG株表达PfoA和过表达TB抗原均是可能的。这样的菌株具有用作二代TB疫苗的潜力。

当详细描述了该发明，以及对特殊实施例附有参考文献后，那么显然，对该技术的普通技术人员之一来讲，可在不违背其主题和范围的情况下，在其中做出各种改变和修饰。

Claims

1.分枝杆菌，经遗传工程化来包括可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白，所述蛋白在pH6-8时有活性。

2.权利要求1的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白的是产气荚膜梭菌细胞溶素或其功能性变体。

3.权利要求1的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白由产气荚膜梭菌细胞溶素或其突变体的特异性基因序列编码。

5.权利要求4的分枝杆菌，其中所述的基因序列选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。

6.权利要求1的分枝杆菌，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来表达细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子。

7.权利要求6的分枝杆菌，其中所述的细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子选自caspase 8，死亡受体-5，Fas和Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白。

8.权利要求1的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达目的基因。

9.权利要求1的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达：

细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子；以及

目的基因。

10.分枝杆菌，经遗传工程化来包括可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白，其在由所述分枝杆菌感染的细胞内体所呈现的pH下有活性。

11.权利要求10的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白是产气荚膜梭菌细胞溶素或其功能性变体。

12.权利要求10的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白的氨基酸序列由SEQ ID NO.2所示。

13.权利要求10的分枝杆菌，其中所述可表达并可分泌的功能性溶内体蛋白由产气荚膜梭菌细胞溶素或其突变体的特异性基因序列编码。

14.权利要求13的分枝杆菌，其中所述基因序列选自SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3。

15.权利要求10的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌是BCG。

16.权利要求10的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌经遗传工程化来表达细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子。

17.权利要求16的分枝杆菌，其中所述的细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子选自caspase 8，死亡受体-5，Fas和Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白。

18.权利要求10的分枝杆菌，所述分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达目的基因。

19.权利要求10的分枝杆菌，其中所述分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达：

细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子；以及

目的基因。

20.能使分枝杆菌从内体中逃出的方法，包括如下步骤：

对所述分枝杆菌进行遗传工程化来包括，表达和分泌功能性溶内体蛋白。

21.权利要求20的方法，其中所述的功能性溶内体蛋白是产气荚膜梭菌细胞溶素O或其突变体。

22.权利要求21的方法，其中所述的功能性溶内体蛋白是由SEQID NO：3编码的突变体产气荚膜梭菌细胞溶素O。

23.权利要求20的方法，其中所述的分枝杆菌是减毒的分枝杆菌。

24.权利要求23的方法，其中所述的减毒分枝杆菌是BCG。

25.权利要求20的方法，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来表达细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子。

26.权利要求25的方法，其中所述的细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子选自caspase 8，死亡受体-5，Fas和Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白。

27.权利要求20的方法，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达目的基因。

28.权利要求20的方法，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达

细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子；以及目的基因。

29.疫苗制剂，含有：

经遗传工程化来表达和分泌功能性溶内体蛋白的分枝杆菌，其中所述的功能性溶内体蛋白在中性pH时有活性。

30.权利要求29的疫苗制剂，其中所述的功能性溶内体蛋白是产气荚膜梭菌细胞溶素O。

31.权利要求30的疫苗制剂，其中所述的功能性溶内体蛋白是由SEQ ID NO：3编码的突变体产气荚膜梭菌细胞溶素O。

32.权利要求29的疫苗制剂，其中由所述分枝杆菌表达的所述功能性溶内体蛋白的表达使所述的重组分枝杆菌从内体中逃出。

33.权利要求29的疫苗制剂，其中所述的分枝杆菌是减毒的分枝杆菌。

34.权利要求33的疫苗制剂，其中所述减毒的分枝杆菌是BCG。

35.权利要求29的疫苗制剂，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来表达细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子。

36.权利要求35的疫苗制剂，其中所述的细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子选自caspase 8，死亡受体-5，Fas和Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白。

37.权利要求29的疫苗制剂，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来功能性表达目的基因。

38.权利要求29的疫苗制剂，其中所述的分枝杆菌经遗传工程化来功能性地表达：

细胞凋亡蛋白或细胞凋亡的功能性增强子；以及

目的基因。