CN114438106B - Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用 - Google Patents

Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用，涉及生物医药技术领域。本发明首次发现，Rv2779c基因的敲除突变极大降低了结核分枝杆菌在药物(如利福平或链霉素)压力下的持留生长，同时降低了结核分枝杆菌在感染小鼠体内的存活率。因此，可将Rv2779c基因作为作用靶点用于筛选或制备抗结核分枝杆菌(尤其是抗耐药性结核分枝杆菌)的药物，Rv2779c基因可作为潜在的抗结核药物新靶点。

Description

Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用。
背景技术
结核病是一种非常古老的传染病，也是目前依然危害人类健康的重大传染性疾病之一。尽管在上个世纪四、五十年代，链霉素等抗生素的发现为结核病的治疗提供了有效手段，但近年来随着耐药结核病的发生，耐药结核病形式日趋严重，抗结核新药靶点的开发是防治耐药结核病的可靠保证。
目前对于结核病抗药靶点开发主要集中在核糖体代谢或能量代谢的相关基因，但对于单基因的药物靶点可能更容易发生耐药。转录调控因子可以操纵细菌基因组中多个基因的转录表达，认为其更具有抗结核新药靶点开发的潜在价值。
Rv2779c基因是可能的结核分枝杆菌的亮氨酸应答调节蛋白/天冬酰胺合成酶C家族转录调控因子(亦被称为饥饿筵席调节蛋白)的编码基因，该家族蛋白或广泛(Lrp)或特异性(AsnC)地参与了多种细胞代谢过程的调控，诸如：氨基酸代谢、菌毛的合成、DNA修复和重组。既往研究发现Rv2779c在营养不良的结核分枝杆菌模型中，该基因的转录水平可提高三至四倍，被认为在病原体的潜伏/持留感染阶段发挥重要作用。然而，目前，对于该基因敲除或者失活后产生的影响并没有具体的相关报道。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用。本发明首次发现，Rv2779c基因的敲除突变极大降低了结核分枝杆菌在药物(如利福平)压力下的持留生长，同时降低了结核分枝杆菌在感染小鼠体内的存活率。研究表明Rv2779c基因可作为潜在的抗结核药物新靶点。
本发明提供的具体技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用。
在一个具体的实施方案中，所述应用包括以Rv2779c基因及其表达产物为作用靶点制备或筛选抗结核分枝杆菌(优选抗耐药性结核分枝杆菌，例如抗利福平或链霉素耐药性结核分枝杆菌)的药物。在本发明中，表达产物通常指基因表达过程中形成的RNA或蛋白质。
在本发明中，所述药物包括抑制Rv2779c基因表达的试剂和/或抑制Rv2779c基因表达产物的试剂。所述药物还包括药学上可接受的载体，该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香中的一种或多种。所述药物可应用于哺乳动物，所述哺乳动物包括大鼠、小鼠或人。
在一个实施方案中，所述应用包括通过基因工程方法敲除或者敲减Rv2779c基因；优选地，所述基因工程方法包括同源重组方法。所述同源重组方法为同源双交换、T-DNA插入、CRISPR/Cas9技术、TALEN技术、Red/ET重组技术中任一种。
在一个具体的实施方案中，所述同源重组方法包括：
(a)针对结核分枝杆菌的Rv2779c基因上下游及内侧的左右翼同源重组臂扩增引物对以H37Rv的基因组DNA为模板，扩增同源重组臂；
(b)将重组臂构建到AE159穿梭质粒中，利用温度敏感性噬菌体介导的将同源重组质粒导入H37Rv中；
(c)使用重组元件中潮霉素抗性标记进行阳性重组克隆的筛选，获得Rv2779c基因的缺失突变体菌株Lrp-KO；所Rv2779c基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
当同源重组质粒进入H37Rv中后，利用同源重组原理，将基因组中待敲除基因片段置换出来，同时质粒上的潮霉素抗性基因等重组元件也整合到基因组中。可使用重组元件中潮霉素抗性标记进行阳性重组克隆的筛选，获得Rv2779c基因的缺失突变体菌株。
在另一个方面，本发明提供了Rv2779c基因的抑制剂在制备抗结核分枝杆菌(优选抗耐药性结核分枝杆菌)的产品中的应用。
在一个实施方案中，所述抑制剂包括抑制Rv2779c基因表达的试剂和/或使Rv2779c蛋白活性降低或失活的试剂。
在一个实施方案中，所述抑制剂可以包括但不限于核酸抑制物、蛋白抑制剂、蛋白水解酶、蛋白结合分子、其能够在蛋白或基因水平上下调Rv2779c基因或其编码的蛋白的表达或活性。例如，所述抑制剂可以包括sgRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽、抗体等中的至少一种。
所述抑制剂通过有效抑制或沉默Rv2779c基因的表达，从而能够有效降低结核分枝杆菌在药物(如利福平或链霉素)压力下的持留生长，同时降低结核分枝杆菌在感染小鼠体内的存活率。Rv2779c基因的抑制或沉默将降低结核分枝杆菌抵抗药物压力的能力。
在一个实施方案中，本发明提供了Rv2779c基因的抑制剂在降低结核分枝杆菌在药物压力条件下持留生长方面的应用，所述药物包括利福平。本发明实验证实Rv2779c基因(Lrp基因)敲除极大的降低了结核分枝杆菌在利福平药物压力下的持留生长，因此，Rv2779c基因的抑制剂可用于制备降低结核分枝杆菌在药物压力条件下持留生长能力的产品。
在一个实施方案中，本发明提供了抑制或沉默结核分枝杆菌基因组上的Rv2779c基因表达的物质或试剂在降低结核分枝杆菌毒力/致病力中的应用。具体为Rv2779c基因的抑制剂在降低结核分枝杆菌感染小鼠的体内的存活率中的应用。Rv2779c基因失活可而抑制结核分枝杆菌的体内存活，且由于在哺乳动物没有Rv2779c基因的同源基因，该类抑制剂或药物可以特异性对分枝杆菌发挥抑制作用而不影响宿主细胞的活力。Rv2779c基因的抑制剂可用于制备降低结核分枝杆菌感染小鼠的体内的存活率的产品。本发明中的应用为非疾病诊断和治疗的应用。
在一个实施方案中，以Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用，可将Rv2779c基因敲除获得Rv2779c基因敲除突变株，被敲除序列为如SEQ ID No.1所示的Rv2779c基因序列的部分或全部，该基因失活。所述Rv2779c敲除突变株与野生型株相比，在含高浓度利福平的液体中的存活明显更低，基因敲除突变株感染组在结核分枝杆菌感染小鼠体内的载菌量明显低于野生株感染组。
在一个实施方案中，所述Rv2779c基因敲除突变株用于制备结核分枝杆菌减毒疫苗。在一个可选方案中，也可以通过基因敲除技术获得使所述Rv2779c基因的表达水平降低的突变株。
基于本发明，也可将Rv2779c基因作为靶点用于制备结核分枝杆菌对药物耐受性的检测试剂，通过对Rv2779c基因表达水平的检测，辅助判断结核分枝杆菌对药物(如利福平或链霉素)耐受性(在药物压力条件下的生长能力)。例如，通过RT-PCR检测、实时定量PCR检测、免疫检测、与Rv2779c蛋白特异性结合的抗体的检测、通过原位杂交检测、基因芯片检测等。也可建立一种结核分枝杆菌耐药性(如利福平或链霉素)的快速筛查法，该方法用于非疾病诊断与治疗领域。
有益效果：
本发明表明以Rv2779c基因作为靶点研究抑制剂或药物可以有效的抑制结核分枝杆菌持留，从而抑制结核分枝杆菌的体内存活，且由于在哺乳动物没有Rv2779c基因的同源基因，该类抑制剂或药物可以特异性对分枝杆菌发挥抑制作用而不影响宿主细胞的活力。
本发明提出了Rv2779c基因可用于作为制备或筛选抗结核分枝杆菌(优选抗耐药性结核分枝杆菌，例如抗利福平耐药性结核分枝杆菌)的药物的潜在靶点，为结核病的精准化医疗提供基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的Rv2779c基因敲除突变体的PCR鉴定；
图2为本发明实施例提供的Rv2779c基因(Lrp基因)影响结核分枝杆菌在高浓度利福平或链霉素药物压力下的生长；
图3为本发明实施例提供的Rv2779c基因敲除突变株感染小鼠的脏器细菌载量。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
Rv2779c基因的CDS序列(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)如以下SEQ IDNo.1所示。
SEQ ID No.1：
atgataattctttttcgaggccatatgcgtgataattcaacggaacacaagactcgccgggctgcctcgtcgaaggatgttcgacccgctgaacttgatgaggtggaccgcagaatcctgagcttgctgcatggcgatgccagaatgcccaacaacgcgttagcggacactgtcgggatagcgccgtcgacgtgtcacggccgggttcggcggttggtggacctcggcgtgatccgggggttctacaccgacatcgacccggtcgcggtgggtttgccgttgcaggcgatgatctcggtcaacttgcagtcgtccgctcgcgggaaaatccgcagcttcatccagcagatccgccgcaaacggcaggtgatggatgtctactttctggccggcgccgacgatttcatcttgcacgtcgccgctcgcgacaccgaggacctgcgttcgttcgtggtcgaaaacctcaatgccgacgccgacgtcgcaggtacccagacgtccctgatcttcgagcatctgcgcggggcggcgcccatctag。
Rv2779c基因编码的氨基酸序列如以下SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2：
MIILFRGHMRDNSTEHKTRRAASSKDVRPAELDEVDRRILSLLHGDARMPNNALADTVGIAPSTCHGRVRRLVDLGVIRGFYTDIDPVAVGLPLQAMISVNLQSSARGKIRSFIQQIRRKRQVMDVYFLAGADDFILHVAARDTEDLRSFVVENLNADADVAGTQTSLIFEHLRGAAPI。
1.H37RvΔRv2779c(Lrp-KO)突变株的构建及鉴定：
1.1构建含同源重组臂的p0004s-ΔRv2779c质粒
以Mtb H37Rv菌株的粗提DNA为模板，根据待敲除基因Rv2779c上游(左臂)和下游(右臂)序列片段，设计引物对LF-LL/LF-LR(左臂上游引物/左臂下游引物)和LF-RL/LF-RR(右臂上游引物/右臂下游引物)其中左臂下游引物和右臂的上游引物均为Rv2779c基因内部序列，引物列表见表1。
表1.Rv2779c基因敲除同源臂扩增的上下游引物
采用上述引物对，分别扩增Rv2779c左臂(577bp)、右臂(563bp)DNA序列。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行验证。
使用质粒提取试剂盒提取p0004质粒，用Van91I限制性内切酶分别酶切回收的左臂、右臂DNA片段及p0004s质粒。使用T4 DNA连接酶连接获得的左臂、右臂及p0004s质粒酶切片段，将连接产物转化至E.coli Trans5α感受态细胞，将转化后菌液涂布于含潮霉素的LB平板。筛选阳性克隆，获得测序正确的p0004s-ΔRv2779c质粒。
1.2构建phAE159-ΔRv2779c噬菌粒
分别提取phAE159质粒和p0004s-ΔRv2779c质粒，并使用限制性内切酶PacI酶切质粒并回收目的片段。用T4连接酶连接两个线性化片段，连接产物转化E.coli HB101感受态细胞，涂布含潮霉素抗性的LB平板。挑取阳性克隆于含潮霉素抗性的液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜。试剂盒提取噬菌粒，并使用PacI酶切，电泳验证获得构建成功的phAE159-ΔRv2779c噬菌粒。
1.3感染噬菌体的制备
取5～10μL的phAE159-ΔRv2779c噬菌粒加至200μL mc2 155感受态细胞混匀，使用伯乐的电转仪电击转化，电击参数如下：电压2.5kV，电阻1000Ω，电容25μF。电击后，加入1mL无抗7H9培养基，37℃复苏培养4-5h。将复苏后的菌液与4mL顶层琼脂混匀，均匀铺于7H10平板上，30℃倒置培养2～3d。从平板上挑取若干个含有噬菌体的空斑，加入200μL MP缓冲液，4℃孵育过夜。取上述噬菌液与mc2155菌液按一定比例混合，再与4mL顶层琼脂混匀并铺板。30℃培养3d后，在含有裙带状噬菌斑的平板上加入MP缓冲液，室温水平摇床缓摇孵育4～6h，使用0.22μm无菌过滤器过滤上清以获得高滴度噬菌体。
1.4噬菌体感染Mtb H37Rv
将培养至对数生长期的H37Rv预先用MP缓冲液洗2遍，按细菌：噬菌体＝1:10比例加入高滴度噬菌体，37℃孵育过夜。离心后弃上清，加入适量新鲜7H9培养基复苏过夜，离心收集菌体沉淀，涂布于含75μL/mL潮霉素的7H10+OADC平板，37℃培养4～5周。挑取单克隆接种于含75μg/mL潮霉素的7H9+OADC液体培养基中，培养3～4周，提取基因组DNA，进行三片段PCR扩增法验证敲除是否成功(左、右臂的上下游引物对和基因内部引物对，引物序列见表2)。
表2.Rv2779c基因敲除菌株鉴定的PCR扩增引物对
2.lrp/lrp-KO回补株构建
以Mtb H37Rv菌株的粗提DNA为模板，根据Rv2779c的序列设计引物对Lrp-S1/Lrp-AS1，引物序列见表3，PCR扩增获得上下游含EcoRI和HindIII/>双酶切位点的Rv2779c基因片段，将Rv2779c基因克隆到pMV361载体(Kan+)上，挑取抗性筛选阳性克隆进行PCR测序鉴定，对测序鉴定正确的重组菌进行质粒提取，将pMV361-lrp质粒电转至H37RvΔRv2779c(Lrp-KO)突变株的感受态细胞中，获得lrp/lrp-KO回补株。
表3.Rv2779c基因扩增的上下游引物
3.高浓度药物压力条件下的持留菌生长实验
H37Rv野生株、lrp-KO突变株和lrp/lrp-KO回补株培养至对数生长期(OD600＝0.6～1.0之间)，收集菌液并用含10％OADC的7H9完全培养基调整各组菌液浓度至1×108CFU/mL，加入利福平药物储液(1mg/mL)或链霉素药物储液(10mg/ml)，使得菌液中利福平终浓度为2μg/mL和10μg/mL，链霉素终浓度为20μg/mL和100μg/mL。在培养0天、7天和14天取菌液进行CFU计数。
4.动物感染实验
收集对数生长期的各组菌液，使用1×PBS洗2遍，用1×PBS重悬并调整菌液浓度为1×107CFU/mL，取100μL菌液以尾静脉注射的方式感染6～8周龄BalB/c小鼠，在感染后2周和12周，每组分别取3～4只小鼠进行解剖实验，取肺脏和脾脏研磨，取组织研磨液进行CFU计数。
实验结果
1.Rv2779c基因敲除的结核分枝杆菌突变体的构建及鉴定
利用同源重组的原理，设计针对Rv2779c(Lrp)基因上下游及内侧的左右翼同源重组臂扩增引物对，以H37Rv的基因组DNA为模板，扩增同源重组臂，并将重组臂构建到AE159穿梭质粒中，利用温度敏感性噬菌体介导的将同源重组质粒导入H37Rv中，使用重组元件中潮霉素抗性标记进行阳性重组克隆的筛选，获得PCR鉴定正确的Lrp-KO突变株(图1)。
图1为Rv2779c基因敲除突变体的PCR鉴定；其中A图为Rv2779c同源重组失活突变体构建示意图；B图为左右臂及基因内部的PCR产物电泳结果；M为Trans2K DNA Marker。
2.Rv2779c基因失活降低了结核分枝杆菌在高浓度药物压力条件下持留生长的能力：
利用药物持留模型分析Rv2779c(Lrp)基因对结核分枝杆菌持留能力的影响，比较野生株，突变株和回补株在含高浓度利福平或链霉素的液体培养基中的存活(图2)，在培养14天时，突变株的存活率明显低于野生株，而回补株在高浓度药物压力下的生长与野生株Rv无显著差异，表明Lrp基因与结核分枝杆菌在高浓度药物压力下的持留存活有关。
图2为Lrp基因影响结核分枝杆菌在高浓度利福平压力下的生长。比较了野生株、突变株和回补株在含有终浓度为2.0μg/mL(A)和10.0μg/mL(B)利福平的液体培养基，以及含20.0μg/mL(C)和100.0μg/mL(D)链霉素的液体培养基中的存活情况。
3.Lrp基因敲除降低结核分枝杆菌感染小鼠的致病力：
为进一步分析Rv2779c(Lrp)对结核分枝杆菌致病力的影响，我们进行了小鼠感染实验。收集野生株、突变株和回补株菌液，采用尾静脉注射的方法感染BalB/c小鼠，在感染2w，12w解剖小鼠，分离肺脏和脾脏，测定脏器荷菌量(图3)。图3为Rv2779c基因敲除突变株感染小鼠的脏器细菌载量；其中A图为感染2w和12w的肺脏荷菌量(CFU/Organ)；B图为感染2w和12w的脾脏荷菌量(CFU/Organ)。
从小鼠感染实验数据来看，Lrp基因敲除突变株感染组在2w肺脏载菌量上明显低于野生株感染组，且在12w时，敲除突变株感染组的肺脏和脾脏细菌载量均明显低于野生株感染组，回补株可以基本恢复上述表型。上述结果均表明Lrp基因影响结核分枝杆菌感染小鼠的致病力，可能成为抗结核分枝杆菌抑制剂或药物设计的靶点，该基因的敲除突变株也具备抗结核减毒疫苗研制的基本条件。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 首都医科大学附属北京胸科医院；北京市结核病胸部肿瘤研究所
<120> Rv2779c基因及其表达产物作为抗结核分枝杆菌靶点的应用
<130> PA21034837
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 540
<212> DNA
<213> Rv2779c CDS
<400> 1
atgataattc tttttcgagg ccatatgcgt gataattcaa cggaacacaa gactcgccgg 60
gctgcctcgt cgaaggatgt tcgacccgct gaacttgatg aggtggaccg cagaatcctg 120
agcttgctgc atggcgatgc cagaatgccc aacaacgcgt tagcggacac tgtcgggata 180
gcgccgtcga cgtgtcacgg ccgggttcgg cggttggtgg acctcggcgt gatccggggg 240
ttctacaccg acatcgaccc ggtcgcggtg ggtttgccgt tgcaggcgat gatctcggtc 300
aacttgcagt cgtccgctcg cgggaaaatc cgcagcttca tccagcagat ccgccgcaaa 360
cggcaggtga tggatgtcta ctttctggcc ggcgccgacg atttcatctt gcacgtcgcc 420
gctcgcgaca ccgaggacct gcgttcgttc gtggtcgaaa acctcaatgc cgacgccgac 480
gtcgcaggta cccagacgtc cctgatcttc gagcatctgc gcggggcggc gcccatctag 540
<210> 2
<211> 179
<212> PRT
<213> Rv2779c 氨基酸序列
<400> 2
Met Ile Ile Leu Phe Arg Gly His Met Arg Asp Asn Ser Thr Glu His
1 5 10 15
Lys Thr Arg Arg Ala Ala Ser Ser Lys Asp Val Arg Pro Ala Glu Leu
20 25 30
Asp Glu Val Asp Arg Arg Ile Leu Ser Leu Leu His Gly Asp Ala Arg
35 40 45
Met Pro Asn Asn Ala Leu Ala Asp Thr Val Gly Ile Ala Pro Ser Thr
50 55 60
Cys His Gly Arg Val Arg Arg Leu Val Asp Leu Gly Val Ile Arg Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Thr Asp Ile Asp Pro Val Ala Val Gly Leu Pro Leu Gln Ala
85 90 95
Met Ile Ser Val Asn Leu Gln Ser Ser Ala Arg Gly Lys Ile Arg Ser
100 105 110
Phe Ile Gln Gln Ile Arg Arg Lys Arg Gln Val Met Asp Val Tyr Phe
115 120 125
Leu Ala Gly Ala Asp Asp Phe Ile Leu His Val Ala Ala Arg Asp Thr
130 135 140
Glu Asp Leu Arg Ser Phe Val Val Glu Asn Leu Asn Ala Asp Ala Asp
145 150 155 160
Val Ala Gly Thr Gln Thr Ser Leu Ile Phe Glu His Leu Arg Gly Ala
165 170 175
Ala Pro Ile
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccataaattg ggttcgcatc aggtggtaag c 31
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccatttcttg ggcgagtctt gtgttccgtt g 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccatagattg gtccctgatc ttcgagcatc 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccatcttttg gtgtcccgcc agcactttc 29
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccacgacggg ttagttcc 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ccctagagtc ctgtccgaaa ta 22
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
acttcgaggt gttcgaggag a 21
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gggatcggcg tcggtaa 17
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gttagcggac actgtcggga ta 22
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcgtcggcat tgaggtttt 19
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaattcatga taattctttt tcgaggcc 28
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aagcttctag atgggcgccg c 21

Claims (3)

1.Rv2779c基因作为药物筛选的靶点在筛选抗结核分枝杆菌药物中的应用，其特征在于，所述Rv2779c基因的序列如SEQ ID No.1所示；
所述抗结核分枝杆菌的药物为抑制Rv2779c基因表达、降低抗结核分枝杆菌在药物压力下持留生长从而抑制结核分枝杆菌的药物。
2.敲除结核分枝杆菌中Rv2779c基因在减少结核分枝杆菌在药物压力条件下持留生长时间中的应用，其特征在于，所述药物为利福平或链霉素；
所述Rv2779c基因的序列如SEQ ID No.1所示；
所述应用为非疾病的诊断和治疗。
3.敲除结核分枝杆菌中Rv2779c基因获得敲除突变株在制备结核分枝杆菌减毒疫苗中的应用，其特征在于，所述Rv2779c基因的序列如SEQ ID No.1所示。
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