KR102453996B1 - Escrt1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포 및 이의 용도 - Google Patents

Escrt1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포와 이의 용도 등에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ESCRT1을 구성하는 VPS37의 유전자 발현이 감소 또는 억제된 수지상세포와 이의 용도 등에 관한 것이다. 본 발명의 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있고, 비강 내로 투여되어 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물로 이용될 수 있으며, 비염 및 천식의 증상 완화를 위한 의약 및 의약외품에 이용될 수 있다.

Description

ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포 및 이의 용도 {Dendritic cells with reduced or inhibited formation of the ESCRT1 and uses thereof}
본 발명은 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포와 이의 용도 등에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 ESCRT1을 구성하는 VPS37의 유전자 발현이 감소 또는 억제된 수지상세포와 이의 용도 등에 관한 것이다.
수지상세포(Dendritic Cell; DC)는 강력한 항원제시세포(APC; Antigen Presenting Cell)로서 1차적인 세포성 면역반응을 유발하고 조절한다. 수지상세포는 최종 분화세포로 체내 전체 면역세포의 1% 이하로 존재하나 단핵구나 대식세포에 비해 훨씬 강력하게 임파구의 활성을 유도한다.
수지상세포는 자극물에 대하여 면역체계가 작동하여 염증반응을 유도할 것인가 또는 관용(tolerance)으로 받아드릴 것인가를 초기에 결정하며, 이후 미경험 T 림프구(naive T cells)가 어떤 T 림프구로 분화할 것인가를 결정하는데 핵심적인 역할을 한다.
기존에 면역억제(Immuno-suppressive) 수지상세포를 만드는 방법은, ex vivo/in vitro에서, cytokine, pharmacological agent, 및 anti-inflammatory biological에 노출시키는 방법을 사용한다. 예를 들어, IL-10을 처리하여 배양시키면 MHCII가 발현되어도 다른 co-stimulatory 분자들이 발현되지 않은 면역억제(Immuno-suppressive) 수지상세포로 만들 수 있다. 그러나, 기존의 면역억제 수지상세포는 오히려 면역반응을 유도하는 세포로 변형될 가능성이 있고, 종양을 유도하는 등의 안전성의 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 유전자 조작을 통해 변형가능성이 없거나 낮은 면역억제 수지상세포 제작을 위해 예의연구한 결과 ESCRT1을 타겟으로 하여 유전자 조작된 수지상세포를 제작하였고, ESCRT1 중에서도 VPS37A 또는 VPS37B 유전자가 넉아웃된 수지상세포에서 면역억제 활성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2019-0041005
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포, 이의 제조방법, 이의 면역억제 및 면역억제를 통한 천식과 비염의 예방 또는 치료 용도, 및 비염 증상 완화 용도를 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 수지상세포에서 ESCRT1의 형성 감소 또는 억제는 VPS37 유전자의 발현 감소 또는 억제를 통해 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 VPS37 유전자는 VPS37A 및/또는 VPS37B일수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 VPS37의 발현 감소 또는 억제는 유전공학적으로 수지상세포의 VPS37 유전자에 돌연변이를 유도하여 유전자를 넉아웃(knock out)시키거나 발현을 감소시키는 것을 의미할 수 있고, 단백질 수준의 발현 감소를 유도하여 달성되는 것일 수 있다. 단백질 수준에서 발현 감소를 유도하는 경우 RNA 간섭(RNA interference: RNAi) 기술을 이용할 수 있으며, 구체적으로 VPS37A 및/또는 VPS37B mRNA에 상보적인 서열을 포함하는 microRNA, siRNA, 또는 shRNA를 이용하여 VPS37A 또는 VPS37B의 발현을 넉다운(knock down)시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 VPS37의 발현 감소는 수지상세포의 VPS37A 및/또는 VPS37B 유전자에 돌연변이에 의한 것일 수 있으며, 상기 돌연변이는 유전자 가위 기술을 이용하여 유도되는 것일 수 있고, 상기 유전자 가위 기술은 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 수지상세포는 Th2 세포의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있으며, Th2 세포의 활성은 항원에 대한 Th2 세포의 반응 감소를 의미하는 것으로서 Th2 세포의 염증관련 사이토카인의 분비를 포함하고, 상기 염증관련 사이토카인은 특히 인터루킨 4 (interleukin 4: IL-4), IL5, 및/또는 IL 13일 수 있다.
또한, 본 발명은 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 포함하는 면역억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 조성물은 비강 내로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 조성물은 비강 및/또는 폐에서 Th2 세포의 활성을 억제 또는 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 면역억제는 과면역 또는 비정상적 면역에 의한 면역질환의 개선, 예방 또는 치료일 수 있고, 상기 면역질환은 이식편 숙주반응 질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐쇄성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 약학적 조성물은 알레르기성 호흡기 질환의예방 또는 치료 용도에 이용될 수 있으며, 상기 알레르기성 호흡기 질환은 비염 또는 천식일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포는 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 포함하는 비염 증상 완화용 약학적 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 비강 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 비염 증상은 비강 내 점액 과다 분비 및/또는 재채기일 수 있다.
또한, 본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 위해 설계된 VPS7A 및/또는 VPS37B의 발현 감소 또는 억제용 gRNA(guide RNA)를 제공하며, 상기 gRNA를 암호화하는 벡터를 수지상세포에 도입하는 단계를 포함하는 VPS7A 및/또는 VPS37B 유전자가 넉아웃된 수지상세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 개체는 면역억제가 필요한 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있고, 상기 인간은 이식 수술을 앞둔 환자이거나, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐쇄성 호흡기 질환, 알레르기성 천식, 천식, 기관지염, 엘라르기성 비염, 및 자가면역성 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 갖는 환자일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 수지상세포는 상기 개체로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 방법은 (1) 개체의 혈액샘플에서 단구를 획득하는 단계; (2) 상기 단구가 미성숙 수지상세포가 되었을 때 VPS7A 및/또는 VPS37B의 발현 감소 또는 억제용 gRNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 VPS7A 및/또는 VPS37B 유전자 발현이 감소 또는 억제된 수지상세포를 제조하는 단계; 및 (3) 상기 유전자 발현이 감소 또는 억제된 수지상세포를 상기 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 수지상세포에서 VPS37A 및/또는 VPS37B 단백질 발현의 감소 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하는 면역억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 면역억제 약물의 제조를 위한 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 면역억제는 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료 용도를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포는 VPS37A 및/또는 VPS37B의 발현 감소 또는 억제된 수지상세포일 수 있다.
본 발명은 수지상세포의 ESCRT1을 선천적 면역 반응 억제를 위한 타겟 유전자로 제공하는 것으로서, 본 발명의 ESCRT1의 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포는 염증성 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있고, 비강 내로 투여되어 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물로 이용될 수 있으며, 비염 및 천식의 증상 완화를 위한 의약 및 의약외품에 이용될 수 있다.
도 1은 수지상세포의 항원 표지 과정의 모식도이다.
도 2a는 알레르기 환자와 정상인의 혈액 내 수지상세포 단백질 발현 패턴을 비교한 결과이다.
도 2b는 정상인과 비교하여 알레르기 환자의 수지상세포에서 VPS37B의 발현만이 유의미하게 높게 유지됨을 확인한 도면이다.
도 3은 수지상세포에 면역원(Der p1)을 처리하는 경우 VPS37B의 발현이 증가하고, 항원 표지 억제제인 monensin 또는 filipin을 처리하는 경우 VPS37B의 발현이 면역원 처리 전의 수준으로 복구됨을 확인한 도면이다.
도 4는 유전자 가위 기술을 이용하여 각각 VPS37A 또는 VPS37B 넉아웃 수지상세포를 웨스턴 블롯을 통해 검증한 도면이다.
도 5는 in vitro에서 VPS37A 넉아웃 수지상세포보다 VPS38B 넉아웃 수지상세포가 Th2 세포의 IL-13 분비를 감소시킴을 확인한 도면이다.
도 6a는 in vivo 실험 개략도 이다.
도 6b는 알레르기 비염 유도 마우스에서 VPS38B 넉아웃 수지상세포의 비강 투여 시 비염 증상(rubbing, sneezing)이 완화됨을 확인한 도면이다.
도 6c는 알레르기 비염 유도 마우스에서 VPS38B 넉아웃 수지상세포의 비강 투여 시 전신적 알레르기 증상은 변화 없음을 확인한 도면이다.
도 6d는 알레르기 비염 유도 마우스에서 VPS38B 넉아웃 수지상세포의 투여 시 폐에서 염증성 사이토카인(IL-5 및 IL-13)의 발현이 현저하게 감소됨을 확인한 도면이다.
본 발명자들은 기존의 알레르기성 질환의 치료를 위한 면역요법(면역원 투여하여 내성 유발하는 방법)과 면역조절 치료법(기 발생한 Th2 면역 반응을 감소시키는 방법)의 부작용과 치료 중단에 따른 재발을 원천적으로 방지할 수 있는 알레르기성 질환 치료 방법에 대해 예의 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 기존의 알레르기 반응의 하위 기전 조절을 통한 치료 접근 방식에서 벗어나 알레르기 반응의 상위 기전, 즉 면역원의 항원 표지 단계에서의 조절을 통해 알레르기성 질환의 치료 가능성을 확인하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 정상인과 알레르기성 비염 환자의 수지상세포에서 항원 표지 프로세스에 관여하는 단백질 발현의 패턴을 비교하여 비염 환자의 수지상세포에서 SNX9과 VSP37B의 발현이 증가되어 있음을 확인하고, SNX9과 VSP37B의 발현을 웨스턴 블랏으로 validation한 결과 VPS37B의 발현 증가만이 알레르기성 비염과의 유의한 관계가 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
VPS37B (vacuolar protein sorting 37 subunit B)는 ESCRT 1(endosomal sorting complex require for transport 1)을 구성하는 단백질로서, VPS37B의 발현 조절을 통해 ESCRT1과 알레르기성 질환과의 관계를 확인하고자 CRISPR-Cas9 시스템을 통해 ESCRT1을 구성하는 또 다른 단백질인 VPS37A 및/또는 VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out)된 3 종 수지상세포를 제작하여, ESCRT1의 형성 감소에 따른 알레르기성 질환의 치료 효과를 확인하고자 하였다(실시예 2 참조).
본 발명자들은 VPS37A 넉아웃 수지상세포(VPS37A KO) 또는 VPS37B 넉아웃 수지상세포(VPS37B KO)를 CD4+T cell과 공동배양(co-culture)하여 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 발현 수준을 확인한 결과, VPS37A KO 수지상세포 및 VPS37B KO 수지상세포 배양 배지 모두에서 감소된 IL-13 분비를 확인하였으며, VPS37A 넉아웃 수지상세포 배양 배지보다 VPS37B 넉아웃 수지상세포 배양 배지에서 현저하게 낮은 수준의 IL-4 및 IL-5을 확인하였다. 이로부터 VPS37A 및/또는 VPS37B의 발현 감소에 따른 ESCRT1의 형성 감소가 수지상세포의 Th2에 의한 면역반응을 효과적으로 감소시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 특히 VPS37B의 발현 감소가 상기 면역반응 감소에 보다 우수함을 알 수 있었다(실시예 3 참조).
이어서, 본 발명자들은 in vivo에서 ESCRT1의 형성 감소이 감소된 수지상세포의 면역억제 효과를 확인하기 위하여, 알레르기 비염이 유발된 마우스에 VPS37A KO 수지상세포와 VPS37B KO 수지상세포를 각각 비강 투여하고 비염의 증상과 폐 점막에서 염증관련 사이토카인의 발현 수준을 확인하였다. 그 결과, VPS37A KO 수지상세포 또는 VPS37B KO 수지상세포의 투여는 비염 증상 완화 효과가 있음을 알 수 있었으며, 특히 VPS37B 넉아웃 수지상세포가 투여된 개체에서 비염 증상이 현저하게 완화됨을 확인할 수 있었으며, 면역원에 의한 증가된 염증관련 사이토카인의 감소 효과는 VPS37A KO 수지상세포 보다 VPS37B KO 수지상세포 현저하게 우수함을 확인할 수 있었다. 한편, 상기 수지상세포의 투여에 따라 IL-4, IL-5, 및 IL-13의 발현이 감소되는 것과 달리 IFN-γ의 발현 수준에는 큰 차이가 확인되지 아니하였다(실시예 4 참조).
상기로 결과로부터, 본 발명자들은 면역원에 의한 선천적 면역반응 억제를 위한 타겟으로서 ESCRT1의 형성 조절이 효과적임을 알 수 있었으며, 특히 선천적 면역반응 중에서도 Th2 면역 반응 억제에 보다 효과적임을 알 수 있었다. 또한, ESCRT1 complex 중에서도 VPS37B의 발현 조절을 통해 선천적 면역반응을 보다 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다. 이에 본 발명은 수지상세포에서 ESCRT1의 형성 감소 또는 억제를 통해 면역반응 억제방법을 제공할 수 있으며, 상기 ESCRT1의 형성 감소 또는 억제는 VPS37 유전자의 발현을 감소 또는 억제시킴으로서 달성될 수 있고, 바람직하게는 VPS37B 유전자 또는 VPS37A와 VPS37B 유전자를 동시에 전사 억제 또는 유전자 deletion을 통해 상기 유전자(들)의 발현을 감소 또는 억제 시킴으로서 달성될 수 있다.
본 발명에서 면역억제를 위한 수지상세포의 ESCRT1의 형성 감소 또는 억제는 ESCRT1을 구성하는 단백질의 발현을 감소 또는 억제하는 것에 의해 달성될 수 있고, 구체적으로 VPS37의 하나 이상의 subunit 발현 감소 또는 억제일 수 있으며, 상기 VPS37의 하나 이상의 subunit 발현 감소 또는 억제는 유전자 수준의 발현 감소 또는 억제일 수 있고 단백질 수준의 발현 감소 또는 억제일 수 있다.
본 발명에서 VPS37의 하나 이상의 subunit의 단백질 수준의 발현 감소는 RNA 간섭 기술을 이용하는 것일 수 있으며, 유전자 수준의 발현 감소는 유전자 가위 기술, 특히 CRISPR 유전자 가위를 이용하는 것일 수 있으나, 수지상세포 내에서 ESCRT1를 형성하는 VPS37 단백질의 수준(level)을 감소시키는 방법이라면 제한되지 아니한다.
'유전자 가위 기술'은 유전체에서 원하는 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 기술을 의미한다. 인간 및 동식물 세포의 유전체를 교정하는 데 사용되는 유전자 교정(genome editing) 기술로 유전체에서 특정 염기 서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 시스템을 말한다.
현재까지 개발된 유전자 가위로는 1세대 징크핑거 뉴클레이즈(ZFNs · Zinc Finger Nucleases), 2세대 탈렌 (TALENs · Transcription Activator-Like Effector Nucleases), 3세대 크리스퍼(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated, CRISPR/Cas9)가 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술을 이용하여 VSP37A 및/또는 VPS37B 유전자의 넉아웃을 유도하였다.
가장 최근 기술인 크리스퍼 유전자 가위는 인간이나 동식물의 세포에서 특정 유전자가 있는 DNA를 잘라내는 효소로 박테리아의 면역시스템에서 유래하였다. 크리스퍼 유전자 가위는, 교정하려는 DNA를 찾아내는 가이드 RNA와 DNA를 잘라내는 Cas9 단백질로 구성된다. 크리스퍼(CRISPR/Cas9) 기술을 이용하면 유전자를 잘라내고 새로 바꾸는 데 최장 수년씩 걸리던 것이 며칠로 줄어들며, 동시에 여러 군데의 유전자를 손볼 수도 있다. 또한, DNA 특정 서열만을 타게팅하여 작동하기 때문에 정확도가 높으며 가이드 RNA 커스터마이징을 자유자재로 할 수 있어 디자인 유연성이 뛰어나다. 더욱이, 하나의 가이드 RNA와 하나의 단백질로 심플하게 구성되어 있어 활용성이 좋으며 대량생산에 용이한 장점이 있다.
본 발명은 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 포함하는 면역억제 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 면역원에 의한 과민한 선천성 면역반응에 의한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 과민한 선천성 면역반응에 의한 질환은 통상 알레르기 질환으로 불리우는 것으로서 상기 알레르기 질환에는 알레르기성 비염 및 천식 등이 포함된다.
따라서, 본 발명은 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기성 호흡기 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “개체”란 포유류라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 인간 또는 가축일 수 있다.
본 발명에서 예방이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 면역원에의한 선천성 면역반응을 지연시키거나, 그 면역반응에 의한 질병의 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 치료란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 상기 선천성 면역반응에 따른 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 약학적 조성물(pharmaceutical composition)은 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포 외에 공지의 염증억제 물질을 1종 이상 더 포함할 수 있으며, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제, 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "담체(carrier)"란 비이클(vehicle)이라고도 불리우며, 세포 또는 조직 내로의 단백질 또는 펩타이드의 부가를 용이하게 하는 화합물을 의미하는 것으로서, 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기물의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.
본 발명에서 "희석제(diluent)"란 대상 단백질 또는 펩타이드의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 단백질 또는 펩타이드를 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 여기에 사용된 아젤라산을 함유하는 화합물들은 인간 환자에게 그 자체로서, 또는 결합 요법에서와 같이 다른 성분들과 함께 또는 적당한 담체나 부형제와 함께 혼합된 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 ESCRT1 형성이 감소 또는 억제된 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 본 발명의 면역억제용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으고, 알레르기성 호흡기 질환을 목적으로 투여하는 경우 비강투여할 수 있다.
투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 형태로 약 0.001mg 내지 1000mg이 투여될 수 있다. 본 발명의 면역억제용 조성물은 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
[실시예]
실시예 1. 후보 유전자의 탐색
수지상세포 내로 들어온 allergen들은 early endosome과 antigen processing compartment를 거쳐 processing된 후 수지상세포 표면에 MHC class II와 함께 제시된 후 T cell의 TCR과 결합하여 T cell의 분화를 유도한다. 이 과정 중 early endosome에는 allergen processing 관련 물질들이 있는데, 이들은 물질 이송을 위한 ESCRT을 형성한다. 수지상세포의 항원표지 과정(antigen processing)에 있어서 과면역 또는 비정상적인 면역 반응에 관여하는 인자를 확인하기 위하여 정상인과 알레르기 비염 환자에서 수지상세포를 분리하여 RNA sequencing을 통해 antigen processing과 관련있는 gene을 조사하여 알레르기 비염 환자의 수지상세포에서 VPS37B와 SNX9이 유의미한 증가를 확인할 수 있었다. 상기 RNA sequencing 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
Pathways Gene Symbol
early endosome to Golgi transport Rab6a
endocytic recycling Arf6, Ehd1, Ehd4, Rab35,
endosomal transport Als2, Ap5m1, Ehd1, Picalm, Rab35, Snx9, Snx27, Vps36
endosome to lysosome transport via multivesicular body sorting pathway Ubxn6, Snx27,
endosome transport via multivesicular body sorting pathway Chmp1b, Laptm4b, Rilp, Vps37a, Vps37b
late endosome to Golgi transport Gcc2
late endosome to vacuole transport via multivesicular body sorting pathway Tmem50a
positive regulation of endocytic recycling Ehd1, Sorl1
protein transport to vacuole involved in ubiquitin-dependent protein catabolic process via the multivesicular body sorting pathway Vps36
recycling endosome to Golgi transport Gcc2
regulation of retrograde transport, endosome to Golgi Lrrk2
retrograde transport, endosome to Golgi Ap1s1, Bet1l, Cln5, Evi5, Gcc2, Heatr5a, Pikfyve, Rab6a, Rgp1, Stx16, Tmem87b
retrograde transport, endosome to plasma membrane Vps39
synaptic vesicle to endosome fusion Vamp4
이어서, Snx9과 VSP37B의 발현 증가가 면역질환과의 연관성을 재확인하기 위하여 수지상세포에서 VPS37B 와 SNX9에 대한 단백질 발현을 western blot으로 validation한 결과 알레르기 비염 환자의 수지상세포에서 VPS37B만 유의미하게 증가함을 확인할 수 있었다(도 2b).
실시예 2. VPS37A 또는 VPS37B 넉아웃 수지상세포의 제조
이어서, 상기 실시예 1에서 알레르기 비염과의 관계를 확인한 VPS37B의 조절이 특히 알레르기성 질환의 통제에 효과적인지 확인하기 위하여, CRISPR-Cas9 시스템을 통해 VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out: KO)된 수지상세포를 제작하였다. 또한, VPS37B는 ESCRT1을 구성하는 VPS37의 subunit으로서, VPS37의 발현 감소로 ESCRT1의 불완전 복합체 또는 복합체 형성을 감소시키는 것과 알레르기성 질환 통제와의 관계를 확인하기 위하여, VPS37B 이외에 VPS37A 유전자를 넉아웃 시킨 수지상세포와 VPS37A 및 VPS37B 모두 넉아웃 시킨 수지상세포(double knock-down DC)도 함께 제조하였다. 제작된 각 세포는 웨스턴 블랏을 통해 검증하였다(도 4).
상기 VPS37A KO 및 VPS37B KO을 위해 사용한 gRNA의 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
No. VPS37A (NM_152415)
서열번호 1 crRNA#1 agttccggagggactcgatc
서열번호 2 crRNA#2 ctcctgtttgcttcttgtgg
서열번호 3 crRNA#3 gccggcaggggacccagccg
서열번호 4 crRNA#4 agcggctgatcgagtcactc
VPS37B (NM_024667.2)
서열번호 5 crRNA#1 GGAGCGAAGCCCGGTTCGCC
서열번호 6 crRNA#2 GTGCTTTCAACGTGTCCAGC
실시예 3. In vitro 상에서 VPS37B 넉아웃 수지상세포의 면역억제 활성 확인
이어서, 상기 실시예 2에서 제작된 VPS37B KO 수지상세포와 VPS37A KO 수지상세포를 각각 T 세포와 공동배양한 후 T 세포의 Th2 반응을 확인하였다. Th2 반응은 세포 배양배지에서 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 분비량을 확인하는 것으로 수행되었다. 그 결과. VPS37B KO 수지상세포와 VPS37A KO 수지상세포 배양배지 모두에서 IL-4, IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 감소를 확인할 수 있었으며, VPS37A 넉아웃 수지상세포 배양 배지보다 VPS37B 넉아웃 수지상세포와 양 유전자가 모두 넉아웃된 수지상세포의 배양 배지에서 현저하게 낮은 수준의 IL-4 및 IL-5을 확인하였고, 특히 IL-13과 IFN-γ의 수준에서 양 유전자가 모두 넉아웃 시킴으로서 면역 억제 활성이 각별함을 확인하였다(도 5).
실시예 4. in vivo 상에서 VPS37B 넉아웃 수지상세포의 면역억제 활성 확인
이어서, 상기 실시예 3에서 VPS37A 또는 VPS37B 넉아웃 수지상세포의 in vitro 상에서 면역억제 활성을 확인하고, 상기 수지상세포가 in vivo에서도 동일한 활성을 나타낼 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 알레르기 비염이 유도된 마우스의 비강에 VPS37A 또는 VPS37B가 넉아웃된 수지상세포를 투여하고 비염의 증상 완화 정도를 관찰하였다(도 6a).
그 결과, VPS37 유전자가 넉아웃된 수지상세포가 투여된 개체에서 비염 증상의 완화를 확인할 수 있었으며, 특히 VPS37B 넉아웃 수지상세포가 투여된 개체에서 비염 증상이 현저하게 완화됨을 확인할 수 있었다(도 6b). 나아가 면역원에 의한 증가된 염증관련 IL-4, IL-5, 및 IL-13이 VPS37B 넉아웃 수지상세포가 투여로 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다(도 6c 내지 6e).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (13)

  1. VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out)된 수지상세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 VPS37B 유전자의 넉아웃은 유전자 가위 기술을 이용하여 유도되는 것을 특징으로 하는, 수지상세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유전자 가위 기술은 크리스퍼/카스9(CRISPR/Cas9) 유전자 가위 기술인 것을 특징으로 하는 수지상세포.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 수지상세포는 Th2 세포의 인터루킨(Interleukin)의 분비 감소를 유도하는 것을 특징으로 하는, 수지상세포.
  5. VPS37B의 gRNA(guide RNA) 및 Cas9(CRISPR　associated protein 9)을 암호화하는　유전자를 포함하는 재조합 벡터를 수지상세포에 도입하는 단계를 포함하는 VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out)된 수지상세포의 제조방법.
  6. VPS37A 및/또는 VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out)된 수지상세포를 유효성분으로 포함하는, 면역억제용 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서,
    상기 면역억제는 과면역 또는 비정상적 면역에 의한 면역질환의 개선, 예방 또는 치료이고,
    상기 면역질환은 이식편 숙주반응 질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐쇄성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 면역질환인, 면역억제용 약학적 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 조성물은 비강 투여용인 것을 특징으로 하는, 면역억제용 약학적 조성물.
  10. VPS37A 및/또는 VPS37B 유전자가 넉아웃(knock out)된 수지상세포를 포함하고, 비강으로 투여되는 비염 증상 완화용 약학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    상기 비염 증상은 비강 내 점액 과다 발생 및 재채기인 것을 특징으로 하는, 알레르기성 비염 증상 완화용 약학적 조성물.
  13. (1) 인간이 아닌 개체의 혈액샘플에서 단구를 획득하는 단계;
    (2) 상기 단구가 미성숙 수지상세포가 되었을 때 VPS7A 및/또는 VPS37B의 넉아웃(knock out)용 gRNA를 암호화하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 VPS7A 및/또는 VPS37B 유전자가 넉아웃된 수지상세포를 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 유전자가 넉아웃된 수지상세포를 상기 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 면역억제 방법.
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