CN111635891A

CN111635891A - 一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用

Info

Publication number: CN111635891A
Application number: CN202010580858.5A
Authority: CN
Inventors: 商营利; 孔正杰
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN111635891B

Abstract

本发明提供一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其构建的重组病毒与应用。本方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该方法构建的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株在UL13基因部位发生特异性缺失突变。所得伪狂犬病毒基因缺失弱毒株诱导的I型IFN基因表达量显著提高，能产生更强的天然免疫反应，而病毒自身的复制无显著差异。因此，UL13基因缺失突变能显著降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，具有重要的潜在应用价值。

Description

一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用。

背景技术

伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者，伪狂犬病毒感染可引起母猪流产、死胎，公猪不育，仔猪神经紊乱及死亡和育肥猪呼吸道疾病等。变异毒株的出现使得成年猪也表现出与仔猪相似的严重症状，给该病的防控增加了新的难题。预防猪伪狂犬病最行之有效的办法是接种疫苗，但经典的Bartha-K61弱毒疫苗免疫所产生的抗体对目前流行毒株的中和能力弱，已经不能提供高效的保护。针对当前猪伪狂犬病的流行现状，有必要对经典疫苗株Bartha-K61或变异毒株进行改造，研制免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗，有效的预防和控制猪伪狂犬病。

宿主天然免疫系统是抵抗感染的第一道防线。为了适应宿主细胞，甲型疱疹病毒如伪狂犬病毒等进化出了多种策略拮抗宿主抗病毒免疫反应，这些免疫逃逸策略对于甲型疱疹病毒在宿主体内建立持续感染具有重要意义。例如，研究显示伪狂犬病毒强毒株感染能够显著抑制干扰素(Interferon，IFN)诱导的STAT1的活化及其下游ISGs的表达，表明伪狂犬病毒能够抑制宿主IFN介导的抗病毒免疫反应。另外，研究发现伪狂犬病毒脱氧尿苷磷酸酶UL50和间质蛋白US3均能抑制IFN-STAT信号通路活化。综上所述，伪狂犬病毒能够通过多种病毒蛋白抑制宿主抗病毒天然免疫反应。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，通过构建免疫效力更强、安全性更好的新型基因缺失疫苗株，来实现对猪伪狂犬病的有效预防和控制。

伪狂犬病毒UL13基因编码一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在病毒的成熟、组装及复制过程中发挥重要作用。我们首次发现，间质蛋白UL13是伪狂犬病毒导致宿主免疫抑制的关键蛋白，能够显著抑制宿主IFN以及下游ISGs的表达，从而抑制宿主天然免疫和促进病毒的免疫逃逸。因此，构建伪狂犬病毒UL13基因缺失株是开发新型伪狂犬病毒基因缺失疫苗的一种有效手段。

本发明提供了一种构建重组伪狂犬病毒的方法，包括降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。

上述方法中，所述UL13蛋白为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

A2)与A1)具有98％以上同一性且来源于伪狂犬病毒的同源蛋白质。

所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。所述98％以上的同一性可为至少98％、99％或100％的同一性。

上述方法中，所得重组伪狂犬病毒诱导的宿主I型IFN表达量高于所述目的伪狂犬病毒，且复制能力与所述目的伪狂犬病毒没有显著差异。

上述方法中，所述降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，是通过抑制目的伪狂犬病毒中所述UL13基因的表达或敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因实现的。

上述方法中，所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。

所述CRISPR/Cas9基因编辑技术以UL13的编码基因中符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段为靶序列；N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸；进一步地，所述靶序列是脱氧核糖核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQID No.3两个序列。

所述CRISPR/Cas9基因编辑技术包括包含sgRNA的载体，所述sgRNA的序列是核苷酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的两个单链DNA。

上述方法中，所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒Bartha-K61株。

由上述的方法构建的重组伪狂犬病毒也属于本发明的保护范围。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，所述物质为降低伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低伪狂犬病毒中所述UL13基因的物质。

上述应用中，所述物质为以下B1)-B5)中的任一种：

B1)核苷酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的两个单链DNA；

B2)编码所述sgRNA的核酸分子；

B3)含有B2)所述核酸分子的表达盒；

B4)含有B2)所述核酸分子的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。

所述重组载体的重组微生物为重组伪狂犬病毒。

所述重组伪狂犬病毒可为上述方法构建的重组伪狂犬病毒。

本发明还提供下述任一种应用：

P1、上述的方法、上述的重组伪狂犬病毒或上述的应用在制备伪狂犬病毒疫苗中的应用或在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用；

P2、上述的物质在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用。

所述调控伪狂犬病毒免疫抑制可为提高伪狂犬病毒感染后宿主I型IFN基因的表达量。

本发明所述重组伪狂犬病毒理解为不仅包含第一代到第二代重组病毒，也包括其子代。

本方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株，该方法构建的伪狂犬病毒基因缺失弱毒株在UL13基因部位发生特异性缺失突变。所得伪狂犬病毒基因缺失弱毒株感染宿主细胞后诱导的I型IFN及下游ISG基因表达显著提高，而病毒自身的复制无显著差异。因此，UL13基因缺失突变能显著降低伪狂犬病毒导致的免疫抑制，具有重要的潜在应用价值。

附图说明

图1为实施例1中转化pX459M-gRNA1后菌落的4PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1为菌落单克隆1号样品，2为菌落单克隆2号样品。

图2为实施例1中转化pEZ-gRNA2后菌落的PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1为菌落单克隆①号样品，2为菌落单克隆②号样品。

图3为实施例1中转化重组载体pX459M-gRNA1/2后菌落的PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1为菌落单克隆I号样品，2为菌落单克隆II号样品。

图4为实施例1中UL13基因缺失突变单克隆病毒噬斑PCR鉴定结果；图中M为DNA分子量标准(DL2000 DNA marker)，1为噬斑单克隆1号病毒DNA，2为噬斑单克隆2号病毒DNA，P.C为阳性对照(野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株DNA)，N.C为阴性对照(去离子水)。

图5为实施例1中UL13基因缺失突变单克隆病毒的DNA序列及氨基酸序列测序结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，PRV-△UL13为UL13基因缺失突变伪狂犬病毒Bartha-K61株。

图6为实施例2中UL13基因缺失对IFN表达的影响结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，PRV-△UL13为UL13基因缺失伪狂犬病毒Bartha-K61株。所示数据表示为平均值±标准差(Mean±SD),*表示P≤0.05,**表示P≤0.01(Student’s t test)。

图7为实施例2中UL13基因缺失对伪狂犬病毒复制影响的结果；图中PRV-WT为野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株，PRV-△UL13为UL13基因缺失突变伪狂犬病毒Bartha-K61株。

图8为机理实验中UL13对IFN以及下游ISG54表达影响的结果；图中Vec为空载体对照组，UL13为过表达UL13试验组。所示数据表示为平均值±标准差(Mean±SD),*表示P≤0.05(Student’s t test)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。

1分子生物学试剂

Bbs I酶(NEB#R3539)为NEB产品。

Lipofectamine 2000(11668019)为ThermoFisher公司产品。

2载体与细胞株、病毒株

pX459M载体(Addgene#62988)为Addgene载体库产品。

pEZ-GuideXH载体(淼灵#P4206)为淼灵载体平台产品。

JM109大肠杆菌(9052)为大连宝生物公司产品。

小鼠成纤维细胞(MEF)

HEK-293T细胞

BHK-21细胞

PK-15

均为ATCC产品。

伪狂犬病毒Bartha-K61株为青岛易邦生物工程有限公司产品产品。

3溶液和培养基

下述实施例中所用的溶液和培养基的配制方法如下：

含氨苄抗性的LB培养基的配制方法为(以200mL为例)：固体LB培养基(200mL):酵母提取物1g，胰蛋白2g，氯化钠2g，3g琼脂粉，溶解于200mL去离子水中，120℃高压灭菌20min，在培养基将至50℃时，在超净台中加入200μL氨苄抗生素(100mg/mL)，混匀后倒入培养皿中，凝固后4℃保存。

含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的配制方法为(以500mL为例)：将50mL的FBS和5mL青链霉素双抗(5000U/mL)加入到450mLDMEM培养基中，充分混匀。

Opti-MEM培养基(31985088)为Gibco产品，青链霉素(5000U/mL)(15070063)和DMEM培养基(11995065)为Gibco产品，FBS(1752054)为Biological Industries产品。

实施例1、构建UL13基因缺失的伪狂犬病毒株(即UL13基因缺失突变的重组伪狂犬病毒)

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对伪狂犬病毒Bartha-K61株的UL13基因进行特异性缺失。具体操作如下：

1、UL13基因敲除载体的构建与鉴定

1.1伪狂犬病毒Bartha-K61株UL13蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。伪狂犬病毒Bartha-K61株UL13基因的基因序列参考Genbank中Bartha-K61(Suidherpesvirus 1 stain Bartha)的基因序列(Genbank Accession No.JF797217.1，02-NOV-2011)。

为敲除伪狂犬病毒UL13基因，选取了位于UL13基因序列中两段符合5’-N₂₀-NGG-3’或5’-CCN-N₂₀-3’序列排列规则的片段为靶序列，N表示A、G、C和T中的任一种，N₂₀表示20个连续的脱氧核糖核苷酸。两段靶序列分别记为靶序列1和靶序列2。根据http://crispr.mit.edu/网站，针对可能的靶序列1和靶序列2设计gRNA序列。

本实施例中靶序列1的序列为5’-GAGCACGCTGCCGTACGATCCGG-3’(SEQ ID No.2)，针对靶序列1的gRNA命名为gRNA1，gRNA1的序列为：5’-GAGCACGCTGCCGTACGATC-3’(SEQ IDNo.4)。靶序列2的序列为：5’-GGCGATCGACCTGTGCGCGCTGG-3’(SEQ ID No.3)，针对靶序列2的gRNA命名为gRNA2，gRNA2的序列为：5’-GGCGATCGACCTGTGCGCGC-3’(SEQ ID No.5)。

1.2引物的磷酸化与退火

针对上述UL13基因的gRNA基因，设计DNA引物F和R(针对gRNA1的引物具体称为F1和R1，针对gRNA2的引物具体称为F2和R2)，并合成。

F1：5’-CACC-GAGCACGCTGCCGTACGATC-3’(下划线指示的序列为Bbs I粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R1反向互补的序列)；

R1：5’-AAAC-GATCGTACGGCAGCGTGCTC-3’(下划线指示的序列为Bbs I粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F1反向互补的序列)。

F2：5’-CACC-GGCGATCGACCTGTGCGCGC-3’(下划线指示的序列为Bbs I粘性末端序列，双下划线指示的序列为与R2反向互补的序列)；

R2：5’-AAAC-GCGCGCACAGGTCGATCGCC-3’(下划线指示的序列为Bbs I 粘性末端序列，双下划线指示的序列为与F2反向互补的序列)。

合成的F和R通过退火获得双链互补序列，引物退火反应体系：前向引物F(100μM)1μL、反向引物R(100μM)1μL、10×T₄ligase buffer 1μL、T4 DNA连接酶(T₄ligase)1μL、H₂O 6μL，总体积为10μL。反应在PCR仪中进行，37℃,30min，95℃,5min，PCR梯度降温到25℃，速度为每秒降低0.1℃，得到退火引物。放置在冰上或者保存在-20℃冰箱备用。得到F1和R1退火形成的双链互补DNA，以下简称F1-R1；F2和R2退火形成的双链互补DNA，以下简称F2-R2。

1.3重组载体的构建

1)pX459M-gRNA1的构建和鉴定

将纯化的pX459M载体以Bbs I酶消化，反应体系为：pX459M载体6-10μg；Bbs I酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化pX459M载体骨架。然后将F1-R1分别与切胶纯化的pX459M载体骨架进行连接，反应体系如下：F1-R1 2μL，pX459M载体骨架100ng，10×T4 ligase buffer 1μL，T4 DNA连接酶(T4ligase)1μL，加超纯水补足至10μL，置于16℃恒温金属连接仪中过夜连接。连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆1号和菌落单克隆2号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组载体用于PCR鉴定。重组载体用gRNA1的前向引物F1和CAG-R(5’-GTACTGGGCACAATGCCAG-3’)作为鉴定上、下游引物，PCR产物大小为490bp。反应体系和PCR条件：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq 0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定结果见图1。鉴定好的阳性克隆应测序确认，pX459M插入gRNA1的克隆用CAG-R引物测序，测序正确的重组载体命名为pX459M-gRNA1。pX459M-gRNA1是在pX459M的Bbs I识别位点插入gRNA1序列，保持pX459M的其它核苷酸不变得到的gRNA1基因表达载体。

2)pEZ-gRNA2的构建和鉴定

将纯化pEZ-GuideXH载体以Bbs I酶消化，反应体系为：pEZ-GuideXH载体6-10μg；Bbs I酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将酶切后载体产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化载体骨架。然后将F2-R2与切胶纯化的pEZ-GuideXH载体骨架进行连接，反应体系如下：F2-R2 2μL，pEZ-GuideXH载体骨架100ng，10×T4 ligase buffer 1μL，T4 DNA连接酶(T4 ligase)1μL，加超纯水补足至10μL，置于16℃恒温金属连接仪中过夜连接。连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆①号和菌落单克隆②号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组载体用于PCR鉴定。重组载体用gRNA2的前向引物F2和M13F(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)作为鉴定引物，PCR产物大小为200bp。反应体系和PCR条件：模板DNA 1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定结果见图2。鉴定好的阳性克隆应测序确认，pEZ-GuideXH插入gRNA2的克隆用M13F引物测序，测序正确的重组载体命名为pEZ-gRNA2。pEZ-gRNA2是在pEZ-GuideXH的Bbs I识别位点插入gRNA2序列，保持pEZ-GuideXH的其它核苷酸不变得到的gRNA2基因表达载体。

3)重组载体pX459M-gRNA1/2的构建：

将1.3构建好的重组载体pX459M-gRNA1用Xho I和Hind III双酶切。反应体系为：pX459M-gRNA1 6-10μg；Xho I酶2μL；Hind III酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳。选取3300bp大小的条带回收，得到pX459M-gRNA1片段。

将1.3构建好的重组载体pEZ-gRNA2用Xho I和Hind III双酶切。反应体系为：pEZ-gRNA2 6-10μg；Xho I酶2μL；Hind III酶2μL；10×buffer 5μL；H₂O补足至50μL。37℃反应2h后，将产物进行琼脂糖凝胶电泳。选取360bp条带回收，得到pEZ-gRNA2片段。

将pX459M-gRNA1片段和pEZ-gRNA2片段进行过夜连接，连接后转化JM109大肠杆菌感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行阳性菌筛选。37℃培养12h后，用灭菌枪头挑取2个单菌落(菌落单克隆I号和菌落单克隆II号)至含氨苄抗性的LB培养基中37℃、220rpm过夜培养，提取重组载体用于PCR鉴定。以gRNA1前向引物F1作为上游引物，gRNA2反向引物R2作为下游引物，按照下列反应体系和条件进行PCR扩增：模板DNA1μL，上、下游引物各0.5μL，10×buffer 2.5μL，2.5mM dNTP 2μL，rTaq 0.125μL，加超纯水至总体积25μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3，阳性载体PCR产物大小为480bp。结果显示重组载体构建成功。将重组载体进一步测序验证，将测序验证正确的重组载体命名为pX459M-gRNA1/2。pX459M-gRNA1/2是将pX459M-gRNA1的Xho I识别位点和Hind III识别位点之间的小片段替换为含gRNA2基因片段(用Xho I和Hind III双酶切pEZ-gRNA2得到的含gRNA2序列的片段)，保持pX459M-gRNA1的其它核苷酸不变得到的gRNA1基因gRNA2基因共表达载体。

2、UL13基因缺失突变伪狂犬病毒的构建

将重组载体pX459M-gRNA1/2转染HEK-293T细胞，转染体系如表1所示。

表1 Lip2000转染HEK-293T细胞的反应体系(12孔板)

序号	试剂(每孔)	加入量
			A1	Opti-MEM培养基	50μL
A2	Lipofectamine 2000	2μL
			B1	Opti-MEM培养基	50μL
B2	pX459M-gRNA1/2	1μg

操作方法：首先将表1中A1和A2试剂混合均匀得到A组液体，再将B1和B2试剂混匀得到B组液体，然后将A组液体和B组液体均匀混合在一起，室温静置15分钟。将反应产物均匀加入含10％FBS的DMEM培养基培养的HEK-293T细胞上，于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，感染疫苗株伪狂犬病毒Bartha-K61株，病毒的接种量为MOI＝1，24h后收取病毒液，-80℃保存。

3、UL13基因缺失突变伪狂犬病毒的筛选

将收取的病毒液用BHK-21细胞进行噬斑纯化，挑取单克隆病毒。

具体操作方法为：将BHK-21细胞铺于细胞板(六孔板)，细胞汇聚成单层方可进行实验。将收取的病毒液用纯DMEM进行倍比稀释(通常使用10^-2至10^-5稀释度)。弃掉细胞板中原有的营养液，用纯DMEM洗涤细胞表面2-3次，加入稀释好的病毒(100μL/孔)。将细胞板不同角度倾斜混匀后，放置于37℃温箱进行孵育1h，在此期间每隔15min要将细胞板取出倾斜混匀，以保证病毒分布均匀。孵育完后，弃掉病毒液，将5％2×DMEM及融化的低熔点琼脂1:1混合均匀后，加入细胞板孔中。将细胞板放入4℃冰箱5min，使琼脂完全凝固，凝固后将细胞板放入37℃温箱倒置培养数天(通常4-5天)。细胞板中加入结晶紫染色液，覆盖住细胞孔，将细胞板置于37℃温箱，放置2-3小时，用水流将细胞板孔中的琼脂冲掉，可以看到清晰可见的蚀斑。挑取2个噬斑(噬斑单克隆1号和噬斑单克隆2号)，提取病毒DNA，获得噬斑单克隆1号病毒DNA、噬斑单克隆2号病毒DNA，进行PCR鉴定。

分别以提取的噬斑单克隆1号病毒DNA和噬斑单克隆2号病毒DNA为模板，以野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株DNA为阳性对照，以去离子水为阴性对照。UL13全长引物(引物序列UL13 F:5’-ATGGCTGCTGGAGGA-3’；UL13 R:5’-TCAGGCAGCGAGTTC-3’)进行PCR扩增：模板DNA 2μL；上、下游引物各1μL；2×GC buffer 25μL，2.5mM dNTP 4μL；rTaq 0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1m50s，共30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为590bp，切胶回收，将回收产物进行DNA测序，确定UL13基因的敲除效果。电泳结果见图4，缺失突变病毒UL13基因测序结果及氨基酸序列结果见图5，显示基因缺失病毒的UL13基因与正常病毒相比缺少了609bp，导致其编码的氨基酸序列发生改变，表明成功获得了UL13基因缺失突变的单克隆伪狂犬病毒Bartha-K61株，将该毒株命名为UL13基因缺失突变的重组伪狂犬病毒。

实施例2、UL13基因缺失对宿主天然免疫反应和对伪狂犬病毒复制的影响

1、UL13基因缺失对IFN的影响

小鼠成纤维细胞(Mouse Embryonic Fibroblasts，MEF)以3.5×10⁵个细胞/孔铺于12板中，于37℃、5％CO₂的培养箱中过夜培养，将实施例1的UL13基因敲除的重组伪狂犬病毒和伪狂犬病毒Bartha-K61株(野生型)分别以MOI＝1感染MEF细胞，于感染后0h、12h、24h收取RNA样品，反转录为cDNA，利用组成性表达的GAPDH基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。荧光定量PCR检测I型IFN基因的表达情况。其中，PCR检测I型IFN基因的上下游引物序列分别为：

mIFN-F：5’-ATGAGTGGTGGTTGCAGGC-3’；

mIFN-R：5’-TGACCTTTCAAATGCAGTAGATTC-3’。

内参GAPDH基因的上下游引物序列分别为：

mGAPDH-F:5’-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3’；

mGAPDH-R:5’-AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3’。

荧光定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq 5μL、上下游引物各0.3μL、模板2μL、超纯水补足体系至10μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃5min；95℃20s，55℃20s，70℃30s，40个循环。结果见图6，以伪狂犬病毒Bartha-K61株(野生型，图中标为PRV-WT)感染0h的I型IFN基因表达水平为1，与野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株(图中标为PRV-WT)相比，UL13基因缺失突变的重组伪狂犬病毒(图中标为PRV-△UL13)能显著诱导I型IFN基因的表达。

2、UL13基因缺失突变对伪狂犬病毒复制的影响

以提取的伪狂犬病毒DNA为模板，以gD基因引物(gDF：5’-CACGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’；gDR：5’-GTCCACGCCCCGCCTGAAGCT-3’)进行PCR扩增：模板DNA2μL；上、下游引物各1μL；2×PrimeSTAR GC buffer 25μL，2.5mM dNTP 4μL；PrimeSTAR0.25μL；加超纯水至总体积50μL。反应条件：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR片段长度为217bp，切胶回收，测定产物DNA浓度，根据DNA浓度和核酸拷贝数计算公式得出核酸拷贝数，dsDNA：(6.02x10²³次拷贝数/摩尔)×(浓度g/ml)/(MW g/mol)＝copies/ml。将回收产物作为标准品，进行倍比稀释，以稀释后的标准品作为模板，gD基因上下游引物进行荧光定量PCR扩增。系统自动得出标准曲线y＝-4.844x+52.141，R²＝0.994，其中y值为CT值，x值为拷贝数log10的指数。

猪肾细胞(PK-15)以1.5×10⁵个细胞/孔铺于12板中，于37℃、5％CO₂的培养箱中过夜培养，将实施例1的UL13基因缺失突变的重组伪狂犬病毒和野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株分别以MOI＝0.1感染PK-15细胞，于感染后0h、12h、24h、36h、48h收取细胞样品,提取样品总DNA，荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的复制情况。将荧光定量PCR检测伪狂犬病毒的CT值带入标准曲线中，计算得到病毒拷贝数。结果见图7，与野生型伪狂犬病毒Bartha-K61株(图中标为PRV-WT)相比，UL13基因缺失对病毒(图中标为PRV-△UL13)复制无显著影响。

机理实验

为了验证UL13对IFN表达的影响，将表达UL13的猪肾细胞(PK-15)和表达空载体的对照细胞以1.5×10⁵个细胞/孔铺于12板中，于37℃、5％CO₂的培养箱中过夜培养。将B-DNA(1μg/mL)转染至两组细胞中，于转染后0h、6h、12h收取RNA样品，反转录为cDNA，利用GAPDH基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。荧光定量PCR检测I型IFN(引物序列分别为：pIFN-F：5’-TGCATCCTCCAAATCGCTCT-3’；pIFN-R：5’-ATTGAGGAGTCCCAGGCAAC-3’)及下游ISG54基因(引物序列分别为：pISG54-F:5’-GCACAGCAATCATGAGTGAGAC-3’；pISG54-R:5’-CTGGCCCCTGCAGTCTTTTA-3’)的表达情况。荧光定量PCR反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq5μL、上下游引物各0.3μL、模板2μL、超纯水补足体系至10μL。荧光定量PCR反应条件为：95℃5min；95℃20s，55℃20s，70℃30s，40个循环。结果见图8，以对照组细胞转染0h的I型IFN基因表达水平为1，与过表达UL 13的细胞相比，UL13基因能够显著抑制B-DNA诱导的宿主IFN以及下游ISG54的表达。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种构建伪狂犬病毒基因缺失弱毒株的方法及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus)

<400> 1

Met Ala Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Ser Arg Val Ala Leu Ala

1 5 10 15

Arg Pro Pro Ile His Arg Gly Thr Ser Ala Pro Gly Gly Ala Ile Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Gly Asp Gly Asp Gly Asp Glu Ala Ser Arg Leu Leu Gly

35 40 45

Arg Ala Gln Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Leu Ile Pro Arg Pro Asp Gly

50 55 60

Asp Leu Ala Val Pro Asp Asp Leu Gln Tyr Ala Thr Leu Asp Leu Thr

65 70 75 80

Gly Asp Pro Val Ala Val Gly Ala Gly Ser Tyr Gly Ser Val Leu Val

85 90 95

Tyr Gly Ser Val Ala Val Lys Thr Leu Arg Ala Gly Phe Gly His Glu

100 105 110

Ala Val Met Thr Leu Leu Ala Ala Glu Glu Ala Arg Ser Ala Gly Val

115 120 125

Arg Gly Val Val Arg Leu Met Gly Leu Ser Ala Pro Leu Arg Gln Leu

130 135 140

Met Phe Pro Ala Tyr Glu Met Asp Met Asp Ala Tyr Arg Arg Ser Leu

145 150 155 160

Thr Ala Arg Pro Gly His Val Val His Ala Leu Gly Arg Val Phe Thr

165 170 175

Glu Leu Gly Arg Ala Leu Val Phe Leu Asn Gly Arg Gly Leu Ser His

180 185 190

Leu Asp Val Lys Gly Gly Asn Ile Phe Val Arg Thr Cys Gly Asn Met

195 200 205

Val Val Thr Ala Val Ile Gly Asp Phe Ser Leu Met Ala Leu Asn Ser

210 215 220

Arg Ser Ala Leu Ala Asp Pro Arg Phe Arg Leu Ala Arg Arg Lys Ala

225 230 235 240

Leu Lys Ile Thr Ser Leu Ala Arg Ser Pro Pro Thr Gly Val Leu Leu

245 250 255

Gly His Ala Arg Asp Arg Pro Thr Arg Val Leu Met Asp Phe Ile Asn

260 265 270

Gly Arg Pro Pro Pro Pro Gly Pro Leu Pro Tyr Glu Val Gly Leu Ala

275 280 285

Ile Asp Leu Cys Ala Leu Gly His Val Leu Leu Asp Val Ala Leu Gly

290 295 300

Leu Arg Pro Gln Arg Gly Gln Ala Leu Thr Arg Glu Tyr Ala Val Glu

305 310 315 320

Val Leu Ala Arg Arg Cys Val Leu Phe Ala Ala Leu Leu Pro Pro Gly

325 330 335

Ser Gly Pro Ser Ala Glu Ala Leu Ala Gly Asp Ile Leu Glu Glu Glu

340 345 350

Leu Ala Ala Gly Phe Arg Glu Gly Val Ala Ser Ser Arg Pro Gly Asn

355 360 365

Gln Pro Pro Arg Thr Val Ala Pro Leu Leu Glu Leu Val Ala Arg Phe

370 375 380

Cys Gly Glu Asp Gly Gly Ala Arg Phe Ala Glu Leu Ala Ala

385 390 395

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagcacgctg ccgtacgatc cgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcgatcgac ctgtgcgcgc tgg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcacgctg ccgtacgatc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcgatcgac ctgtgcgcgc 20

Claims

1.一种构建重组伪狂犬病毒的方法，其特征在于：包括降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，得到构建的重组伪狂犬病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述UL13蛋白为如下A1)或A2)的蛋白质：

A1)其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所得重组伪狂犬病毒诱导的宿主I型IFN基因表达量高于所述目的伪狂犬病毒。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低目的伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低目的伪狂犬病毒中UL13基因的表达量，是通过抑制目的伪狂犬病毒中所述UL13基因的表达或敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因实现的。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述敲除所述目的伪狂犬病毒中所述UL13基因是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现的。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9基因编辑技术包括包含sgRNA的载体，所述sgRNA的序列是核苷酸序列分别为SEQ ID No.4和SEQ ID No.5的两个单链DNA。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述目的伪狂犬病毒为伪狂犬病毒Bartha-K61株。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法构建的重组伪狂犬病毒。

9.物质在构建重组伪狂犬病毒中的应用，其特征在于：所述物质为降低伪狂犬病毒中UL13蛋白活性、降低伪狂犬病毒中UL13蛋白含量或/和降低伪狂犬病毒中所述UL13基因的物质。

10.下述任一种应用：

P1、权利要求1-7中任一项所述的方法、权利要求8所述的重组伪狂犬病毒或权利要求9所述的应用在制备伪狂犬病毒疫苗中的应用或在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用；

P2、权利要求9中所述的物质在制备调控伪狂犬病毒免疫抑制产品中的应用。