CN101076356B

CN101076356B - 分枝杆菌的电穿孔及在分枝杆菌中过表达抗原

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Publication number: CN101076356B
Application number: CN2005800414379A
Authority: CN
Inventors: 孙荣改; 大卫·迈克尔·霍恩; 杰拉尔德·C·萨多夫
Original assignee: Aeras Global TB Vaccine Foundation
Current assignee: Aeras Global TB Vaccine Foundation
Priority date: 2004-12-01
Filing date: 2005-11-29
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2025-11-29
Also published as: US20060121054A1; EP1817061A4; DK1817061T3; MX2007006552A; ES2370885T3; AU2005312062A1; AP2007004021A0; JP2008521435A; ZA200704764B; CN101076356A; JP5461776B2; CA2587507A1; AP2869A; WO2006060332A2; EA012182B1; KR20070111452A; WO2006060332A3; AU2005312062B2; KR101382215B1; US7625572B2

Abstract

本申请提供了用作接种试剂的具有改良的疫苗特性的重组分枝杆菌菌株。选择重组的分枝杆菌菌株的亲本株的有效免疫原性。该分枝杆菌菌株不表现抗生素抗性，并且不显示出针对革兰氏阴性菌的水平转移。

Description

分枝杆菌的电穿孔及在分枝杆菌中过表达抗原

发明背景

发明领域

本发明提供了具有改良的疫苗特性的分枝杆菌菌株，用作针对结核病的接种试剂。分枝杆菌菌株优选自鉴定出具有有效免疫原性的亲本株，其不显示抗生素抗性，并且不显示出对革兰氏阴性细菌的水平转化。本发明还提供了具有用于递送转基因的改良特性的分枝杆菌，其具有用于接种对抗其他疾病和用于癌症治疗的疫苗特性。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，M tb)已感染世界人口的三分之一，每年引起八百万人的活动性疾病并且致使一百六十万至两百二十万人的死亡，其中大多数人生活在发展中国家。结核病(TB)是一种全球范围的流行病，该范围正在增长且当它与HIV的传播交叉时就变得更为致命。TB是AIDS人群的头号杀手。

BCG，目前广泛使用的TB疫苗，是在80年前开发的，且经检测，对肺结核的有效性已经有很大程度的变异率，包括最近在印度进行的大范围实验中的无效情况(Fine et al，Vaccine，16(20)：1923-1928；1998；Anonymous，Indian J Med Res.，Aug；l 10：56-69；1999。虽然如此，在高TB流行率的国家，世界卫生组织目前对所有儿童(除有HIV病/AIDS症状的儿童以外)在出生或首次接触卫生服务时仍推荐BCG。该政策是基于BCG可保护儿童免受孩童形式的严重TB的危害证据(Lanckrietet al.，Int J Epidemiol，24(5)：1042-1049；1995；Rodrigues et ah，JEpidemiol Community Health 45(1)：78-80；1991)。超过幼儿时期，BCG对TB的保护作用是一个有争议的论题，因为有限的数据给出了混杂的结论。然而，在广泛实施婴儿BCG免疫的发展中国家，小儿和成年人TB的高发病率表明，目前施用的BCG在人们处于患TB疾病危险中的那些年没有明显的功效。因此，对于干预和控制TB来说，BCG被认为是一种不完善的公共卫生手段。

大约有70％的暴露于TB生物体，但具有正常免疫系统的人，不会被感染，那些确实被感染的人，只有大约5％在头两年内会发病。多数受到感染的人可抑制感染，这与针对结核分枝杆菌发展强有力的细胞免疫应答有关。当免疫力降低时，另有5％在后来发病。HIV/AIDS患者初次患病以及后发病更常见，再次强调了免疫力在预防和控制感染中的作用。

发明概述

因为大多数人能控制肺结核，因此就有理由期待通过诱导适当种类的长效免疫力，应该能够开发在暴露后阻止初次感染、阻止疾病早期发展、阻止从潜伏期发病以及阻止疾病治疗后复发的有效疫苗。最终，系统疫苗使用与化学干预相结合将最终清除作为人病原体的结核分枝杆菌。

鉴于儿童BCG疫苗接种被认为在预防急性肺结核中发挥关键作用，在没有压倒性证据证明新的肺结核疫苗是一种优越的产品的情况下，很难在试验中取代BCG来评价候选TB疫苗的。问题在于结核分枝杆菌是一种人特异性病原体，动物模型仅仅模拟宿主-病原体相互作用的一部分。因此，新的结核疫苗具有改进效力的明确证据只能获自对照人类现场试验。这种现实引导许多研究者断定对结核疫苗改进的关键步骤将是开发改良的BCG菌株和动物模型，尽管有局限性，显示过表达保护性抗原的重组BCG相对于BCG具有增强的效力。

某些M.tb抗原具有疫苗特性，且当作为疫苗制剂施用于动物时，具有与单独使用BCG所获得的相似的保护作用(Anderson，InfectImmun 62(6)2536-2544；1994)。为了推动这些备选疫苗的发展，已开发出用以增强BCG中这些抗原免疫原性的策略。至此，BCG菌株被开发为过表达经选择的M.tb抗原，且这些重组BCG(rBCG)菌株显示，相对于rBCG菌株衍生自的亲本BCG菌株，诱导更强的保护作用(Horwitz et al，Infect Immun 72(4)：1672-1679；2003)。一项研究中，rBCG菌株，表达抗原85B(在此是指“Ag85B”)，被证实比混合相同抗原的BCG更有效(Horwitz et al，supra，2003)。根据这些发现，这一途径有巨大的潜力。

在一些情况下，过表达抗原的BCG菌株可以用于安全而有效的引发对结核病的感染起到保护作用的免疫应答。

本发明提供了遗传工程化(重组体)分枝杆菌菌株，其具有改良的疫苗特性以用作针对结核病的接种试剂。它们具有多种特征，每种特征都可用于增强这些菌株的免疫原性。本发明的重组体分枝杆菌菌株由根据有效的免疫原性而有目的选择出的亲本株开发而来。换言之，用于进行基因操作(例如，过表达结核抗原)的选作亲本株的分枝杆菌菌株是经过选择的，因为在基因操作之前，其已经显示出在接种的宿主中引发有效的免疫应答的能力。卡介苗菌株Danish 1331就是实例。该菌株被优选改造，例如，过表达目的结核病抗原。优选地，一种在体内有活化的启动子用于遗传重组体分枝杆菌。另外，本发明的重组体分枝杆菌菌株被基因工程化为在一个不使用抗生素抗性基础上就可选择，或以完全不需要选择标记的方式构建，使得其作为人群接种试剂时基本上是安全的。例如，分枝杆菌复制所必需的基因被切除并被置于表达质粒中。另外，本发明的重组体分枝杆菌菌株不进行向革兰氏阴性菌的水平转化，因此不能从宿主生物体“逃出”。这也保证了它们作为疫苗在人群中的安全性。

另一个例子，本发明描述了通过质粒表达的抗原85b作为质粒稳定因子的用途，这避免在它们的维持培养中对抗生素选择的需要。使用高浓度的表达Ag85B加上用PCR正向选择鉴定的其他抗原的最小质粒直接转化分枝杆菌菌株获得了过表达抗原的分枝杆菌，其在缺乏抗生素或营养缺陷选择下具有质粒稳定性。另外，本发明的重组体分枝杆菌菌株是用于结核病疫苗的优良试剂，通过遗传工程化它们也可以表达或过表达与结核病不相关的抗原，并因此也可以用作针对其他疾病的接种试剂。此外，过表达结核病抗原或其他疾病重要抗原的rBCG连同重组蛋白质，及作为免疫加强剂的佐剂，重组病毒载体，或DNA或RNA疫苗一起，可以用于致敏加强方案。

本发明提供了一种转化的细菌或其子代，其中掺入了外源核苷酸序列，可在转化细菌(或子代)中复制并表达，其中的外源核苷酸序列没有与选择标记连接。在一个实施方案中，外源核苷酸序列位于质粒中，在一些实施方案中，质粒编码存活必需的基因，该存活必需的基因已经从被转化细菌的细菌基因组中缺失。在另一实施方案中，质粒包含编码用于逃出内体的基因，例如，pfo。在另一些实施方案中，外源核苷酸序列编码抗原85a，抗原85b，或抗原85a/85b。在另一些实施方案中，质粒包含编码维持和/或稳定质粒的蛋白质的基因。在一些实施方案中，编码蛋白质的基因编码抗原85a，抗原85b，或抗原85a/85b。在一个本发明的实施方案中，细菌是分枝杆菌。在另一个实施方案中，外源核苷酸序列编码细胞凋亡。在另一个实施方案中，质粒包含编码用于细胞凋亡的基因。在本发明的另一个实施方案中，外源核苷酸序列在革兰氏阴性菌中不能复制。在一些实施方案中，转化细菌是营养缺陷型。在另一实施方案中，外源核苷酸序列至少是单向穿梭载体的一部分。

本发明进一步提供了一种转化细菌的方法。该方法包括掺入在细菌中可以复制和表达的外源核苷酸序列的步骤，且外源核苷酸序列不与选择标记连接。在本发明的一个实施方案中，掺入步骤是通过电穿孔法完成的。在另一个实施方案中，外源核苷酸序列在载体中，且电穿孔在以下条件下完成的：质粒DNA与细菌细胞的比例为1μg-5μg质粒DNA比1.25×10⁸个细菌细胞。在本发明的一个实施方案中，比例为大约1.6μg质粒比大约1.25×10⁸个细菌细胞。在本发明的一些实施方案中，外源核苷酸序列不能在革兰氏阴性细菌中复制。在另一些实施方案中，外源核苷酸序列至少是单向穿梭载体的一部分。在另一个实施方案中，外源核酸序列位于质粒中且编码一个存活必需的基因，该基因已从细菌的细菌基因组中缺失。

本发明进一步提供了一种转化的分枝杆菌或其子代，其包含一个编码目的基因的外源核苷酸序列，并且其中存在一个或多个下列条件：a)转化的分枝杆菌包括不能在革兰氏阴性菌中复制的质粒；b)转化的分枝杆菌不存在抗生素抗性；c)转化的分枝杆菌是营养缺陷型的；和d)转化的分枝杆菌包含一个单向穿梭载体。在一个实施方案中，外源核苷酸序列是质粒的一部分。在另一个实施方案中，质粒缺少选择标记。本发明的一个实施方案中，外源核苷酸序列编码一个存活必需的基因，其中存活必需的基因在转化的分枝杆菌的细菌基因组中缺失。在一些实施方案中，存活必需的基因是leuD。转化的分枝杆菌或其子代更进一步包含在体内活化的启动子序列。转化的分枝杆菌或其子代可以是减毒的。转化的分枝杆菌或其子代可以是BCG，其可以是，例如，BCG1331，BCG Pasteur，BCG Tokyo，或BCG Copenhagen。

本发明更进一步提供了一种疫苗，包含转化的分枝杆菌或其子代，该分枝杆菌或其子代包含编码目的基因的外源核苷酸序列，其中存在一个或多个下列条件：a)转化的分枝杆菌包括不能在革兰氏阴性菌中复制的质粒；b)转化的分枝杆菌不表现抗生素抗性；c)转化的分枝杆菌是营养缺陷型的；以及d)转化的分枝杆菌包含一个单向穿梭载体。

附图简述

图1：自杀载体pAF103的图谱。每一个DNA片段的含义如下：L-侧翼和R-侧翼：分别为leuD基因的左侧翼和右侧翼；aph是氨基葡糖苷磷酸转移酶基因(gene bank登录号：X06402)，赋予质粒卡那霉素抗性；OriE是pUC复制起点(gene bank登录号：AY234331)；Ble是基因(Gene bank登录号：L36850)，赋予载体Zeocin抗性；SacB是编码果聚糖蔗糖酶的基因(Gene bank登录号：Y489048)，其使细菌对蔗糖敏感；P_hsp60是热休克蛋白基因的启动子序列(即Rv0440)；MCS是标出的限制性内切酶的多克隆位点。请注意两个PacI位点间的盒，在适当的时候，可以被其他的溶解内体的酶基因替换。

图2：当前不同的疫苗株攻击后，通过肺CFU量测定的保护水平。

图3：非抗生素表达载体的示意图，用于导入重组体分枝杆菌，即rBCG。在rBCG中表达的基因经pacI位点克隆入质粒。电穿孔进入rBCG之前，质粒被指示的限制性内切酶消化移除了oriE和Kan区域，形成一个单向穿梭表达载体。每一个DNA片段的指示如下：P_RV3130是抗原Rv3130c的启动子序列；P_Ag85B是抗原85B(即Rv1886c)的启动子序列；抗原Y是分枝杆菌抗原TB10.4(即Rv0288)；Ag85B是编码抗原85B的DNA序列(即Rv1886c)；Ag85A是编码抗原85A的基因(即Rv3804c)；aph是氨基葡糖苷磷酸转移酶基因(gene bank登录号：X06402)，赋予质粒对卡那霉素的抗性；OriE是pUC的复制起点(Gene Bank登录号：AY234331)；LeuD是编码3-异丙基苹果酸脱水酶的基因(即Rv2987c)；oriM是分枝杆菌中的复制起点(Genbank登录号：M23557)。

图4：等位基因交换的主要步骤的流程图

图5：对所选定的克隆PCR分析表达质粒的存在。PCR如材料和方法部分的描述进行。PCR的产物用1.0％琼脂糖胶进行凝胶电泳分析。泳道1：DNA序列梯(ladder)(Invitrogen)用作1Kb加DNA标准。泳道2：PCR模板的阴性对照；泳道3：对卡介苗菌株Danish1331的RCR；泳道4-7：分别对标号为59，61，69和84的克隆进行的PCR；泳道8：空白加样孔；泳道9：最初的质粒的PCR。

优选实施方案的详述

本发明提供了遗传工程化的(重组体)分枝杆菌菌株，具有改良的疫苗特性，可以用作针对结核病的接种试剂。它们具有多种特征，每一种特征都起到增强菌株免疫原性的作用。本发明的重组体分枝杆菌菌株由经过对有效的免疫原性进行了有目的的选择的亲本株开发而来。换言之，选作亲本株的分枝杆菌菌株经过基因操作(例如，过表达结核病抗原)被选择是因为，基因操作前，其已经表现出引发接种疫苗的宿主的有效的免疫应答的能力。BCG菌株Danish 1331就是一例。该菌株被优选改良，例如，来过表达目的结核病的抗原。优选地，在体内活化的启动子用于基因重组体分枝杆菌。另外，本发明的重组体分枝杆菌菌株经遗传工程化，从而可在不使用抗生素抗性的基础上进行选择，使其在人群中用作接种试剂时是基本上安全的。例如，复制必需的基因被移除并被置于表达质粒中。另外，本发明的重组体分枝杆菌菌株不能水平转移到革兰氏阴性菌中，并因此不能从宿主生物体“逃出”(即，它们是“单向穿梭载体”)。这也确保了它们在人群中作为接种试剂的安全性。另外，虽然本发明的重组体分枝杆菌菌株是用于结核病疫苗的优良试剂，它们还可以被遗传工程化使表达或过表达除与结核病相关的抗原以外的抗原，因此，还可以用作针对其他疾病的疫苗试剂。

I在本发明的优选的实施方案中，分枝杆菌菌株是减毒的菌株，例如BCG。然而，入本领域技术人员很容易认识到的，也可以利用其他减毒的和未减毒的分枝杆菌菌株。其他种类的分枝杆菌的实例包括，但不限于，田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)，分枝杆菌H37Ra，母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)等。

BCG菌株的选择

现有技术认为，BCG不是同种的菌株，而是已经发展为一系列不同的遗传谱系(Oettinger et ah，Tuber Lung Dis.79(4)：243-250；1999)。直到最近，仍不清楚是否是因为这些不同改变了BCG家族成员的免疫原性和效力。然而，正如在此描述的，作为重组体BCG(在此称为rBCG)的衍生来源的特定菌株，现在已经被发现其使rBCG的免疫原性在效力上有显著的区别。下面的实施例1中显示BCG菌株Danish 1331(在此称为“BCG₁₃₃₁”)与BCG_Tice相比是一种优良疫苗。因此，尽管菌株rBCG30中抗原85B的过表达提高了亲本菌株BCG_Tice的免疫原性，由所述亲本菌株BCG_Tice衍生出rBCG30，在BCGtice菌株中过表达抗原85B的rBCG30没有获得BCG₁₃₃₁的效力。因此，某些由在BCG中过表达抗原获得的优势可以通过在疫苗构建过程的开始阶段选择亲本BCG菌株而获得。虽然这一技术方案在事后看来是显而易见的，本领域的技术人员并没有进行这样的补充(Horwitz et al.，Proc Natl Acad SciUSA 97(25)：13853-13858；2000)，表明迄今为止，在开始构建rBCG疫苗之前首先确定卡介苗亲本株是否显示充分效力，既不是公知的，也不被认为是必需的。这样的菌株非常适合过表达BCG和TB抗原或外源抗原。

有效的亲本株BCG可以从下组，但不限于下组中选择：BCG₁₃₃₁，BCG Pasteur，BCG Tokyo和BCG Copenhagen。亲本株BCG以超过下面实施例1中所示的低剂量气雾剂豚鼠攻击模型中的BCG Tice至少0.4×10¹⁰的水平降低活的结核分枝杆菌攻击生物体的水平。

增强BCG的免疫原性

如上文所述，BCG的免疫原性不是不变的。而且，由实施例1我们可以看出，尽管BCG抗原的免疫原性可以通过遗传修饰BCG而增强，如果其中重组体改变的亲本株BCG在豚鼠攻击模型中缺乏效力，这样的修饰是无用的。由该方案推论，进一步增强BCG免疫原性的修饰可以进一步改善由这样的亲本株衍生的重组体菌株的免疫原性。

应用上面详述的方法选择合适的BCG菌株作为rBCG疫苗及疫苗载体衍生来源的亲本株，将遗传修饰引入所述菌株以产生期望的rBCG疫苗和疫苗载体。用于构建个体的rBCG菌株的方法并不是本发明的关键，并且可以选自任何一种本领域技术人员已知的方法或这些方法的任意组合(Horwitz et al，PNAS 97(25)：13853-13858；2000；Hess et al，Proc Natl Acad Sci USA，95：5299-5304；1998)。

进一步，使用在感染后在体内有活性的启动子对rBCG疫苗是有利的。例如，使用组成性活性启动子，如来自抗原85B，抗原85A，Hsp60或Rv1908c(KatG)的启动子可以在免疫后在体内使抗原组成性表达。由此，在感染过程中的每一个阶段引起针对感染的加强的免疫应答。选择潜伏期活性启动子，如来自基因Rv2032，Rv3127，Rv2031c或Rv3030c等的启动子，可以在免疫后在体内当rBCG疫苗进入潜伏期时，使rBCG表达选择的抗原，尤其是潜伏期特异性抗原。

表达载体

非-抗生素选择系统的开发

如上所述，当前，用于在rBCG菌株中过表达保护性抗原的质粒是不能接受的，这是由于它们依赖于抗生素抗性基因来维持，并且这些质粒具有固有可以水平转化广泛种类的微生物宿主的能力，因此，具有使抗生素抗性基因以及抗原表达盒向周围的生物体散播的威胁。为了克服这些重大缺陷，本发明描述了用于将表达载体导入分枝杆菌宿主菌，如rBCG中并对其进行维持的一种新型非抗生素选择系统和一种单向穿梭系统。

质粒非抗生素选择的获得是通过选择性缺失一个复制必需的宿主基因，并随后在表达质粒中通过插入该基因的功能性拷贝而补偿缺失部分。因此，细菌宿主依靠表达质粒才能存活，从而形成在缺少抗生素选择标记的情况下在分枝杆菌宿主中维持质粒的机制。优选的方法需要使基因失活以产生营养缺陷型表型。例如，在M.tb和BCG中，leuD基因(Genome Seq ID# Mb3011C)的失活形成亮氨酸依赖性表型，具有失活的leuD基因的菌株的存活依赖于亮氨酸的补充(Hondalus et al，InfectImmun.68(5)：2888-98.2000)。另外，分枝杆菌△leuD菌株不能在体内复制(Hondalus et al，supra，2000)，因此，M.tb和rBCG △IeuD突变体在体外和体内可以维持leuD⁺质粒。

将营养缺陷型突变引入目的分枝杆菌菌株的具体方法在本发明中并不重要，可以从任何本领域技术人员公知的等位基因交换方法中选择(Parish et al.，Microbiology，145：3497-3503；1999)。类似的，通过在表达载体中引入失活基因(例如leuD⁺)的功能性拷贝获得营养缺陷型突变的补偿。表达载体还需要分枝杆菌的复制起点(例如OriM；Labidiet al.，Plasmid，27(2)：130-140；1992)以能够在目的M.tb和rBCG菌株中复制。包含该质粒的分枝杆菌菌株将依赖编码leuD基因的质粒的表达在从培养基消耗亮氨酸后的存活。

新型单向穿梭载体的开发

上述步骤描述了产生一个在结核分枝杆菌和rBCG中维持表达载体的选择系统的方法。但是，该载体系统必须能在大肠杆菌中复制才能在导入分枝杆菌前对质粒结构进行有效操作。此外，为了扩展可以在质粒构建中使用的潜在重组体大肠杆菌宿主菌株，以此使研究人员使用大肠杆菌宿主促进质粒构建，优选在表达载体中包括抗生素选择标记(例如卡那霉素抗性)和广泛宿主范围的复制起点(例如OriE；Halpern et al.，Proc Natl Acad Sci，USA 76(12)：6137-6141；1979；Mosiget al.，New Biol 1(2)：171-179；1989)。这些元件由单一的限制性核酸内切酶消化位点侧接，使抗生素抗性标记和大肠杆菌复制起点能够在将质粒导入目的分枝杆菌菌株之前被移除。另外，包括可以导入抗原表达盒的单一的限制性核酸内切酶位点(例如PacI)。

一旦在大肠杆菌中完成了这些操作，鉴定并表征目的质粒，分离重组质粒DNA并用限制性内切酶消化，释放出抗生素选择标记和OriE。消化后的质粒DNA用T4 DNA连接酶连接。得到的质粒包含补偿宿主分枝杆菌的营养缺陷型的基因，但不表现抗生素抗性，也不能在革兰氏阴性菌中复制。用标准的电穿孔操作将还含有抗原表达盒的质粒导入目的分枝杆菌营养突变体中。包含质粒的重组菌株通过在缺少生长必需的代谢产物(例如亮氨酸)的培养基中被分离出来。该系统独有的好处是最终的表达质粒不再具有抗生素抗性基因。因此，其不能像目前常用的表达质粒那样将抗生素抗性基因传播到环境中。另外，本发明的表达质粒不再能够在广泛的宿主范围中复制，因为，使其能进行这种复制的遗传元件被缺失了。因此，这样的载体被称为“单向”穿梭载体。

过表达TB抗原

在本发明中，包含在单向穿梭载体的表达盒中然后转入rBCG中的基因可以编码M.tb免疫原。结核分枝杆菌免疫原可以是，例如，一个全长天然蛋白，两个或多个M.tb免疫原的嵌合融合体或其模拟物，或一个或多个来自的结核分枝杆菌的M.tb免疫原的片段。

M.tb抗原在体内，位于在分枝杆菌感染的至少一个阶段活化的启动子的控制下，由单向穿梭载体表达。具体的启动子在本发明中并不重要，可以选白有组成性活性的如下启动子：抗原85B，Hsp60，抗原85A，Rv1908c(KatG)，和/或在潜伏期有活性的启动子，如如下基因的启动子：Rv3130C(Florczyk et al，Infect Immun 71(9)：5332-5343；2003；Voskuil et al，J Exr Med 198(5)：705-713；2003)，Rv2032，Rv3127，和/或Rv2031c。为了提高抗原的表达水平，可以使用产生微细胞的分枝杆菌载体菌株的衍生菌株。产生微细胞的分枝杆菌种中的菌株是通过过表达FtsZ(Genome database# Mb2174c)或定向失活whiB3产生的。对FtsZ表达水平或whiB3失活的改良可以通过本领域技术人员已知的标准遗传方法实现。例如，FtsZ过表达是通过将ftsZ基因导入单向穿梭载体并处于强启动子控制下实现的，该启动子，例如为抗原85B，抗原85A，Hsp60或Rv1908c(KatG)的启动子，具有组成性活性，和/或在潜伏期具有活性的启动子，例如基因Rv2032，Rv3127，Rv2031c，和Rv3130C(Florczyk et al，supra；2003；Voskuil et al，supra，2003)的启动子。whiB3的定向失活是通过下面描述的操作进行等位基因交换而实现的。

能够插入重组体分枝杆菌中的外源抗原的实例

本发明中，由分枝杆菌载体携带的单向穿梭载体中的表达盒可以编码免疫原，其可以是来自病毒，细菌或寄生虫病原体的外源免疫原，或内源免疫原，例如但不限于自身免疫抗原或肿瘤抗原。免疫原可以是，例如，全长天然蛋白质；外源免疫原和内源蛋白质的嵌合融合体或模拟物；或一个或多个免疫原的片段，所述免疫原来源于病毒，细菌和寄生虫病原体。

在此所用的“外源免疫原”是指蛋白质或其片段，其不是在受体动物细胞或组织中正常表达的，例如，但不限于，病毒蛋白质，细菌蛋白质，寄生虫蛋白质，细胞因子，趋化因子，免疫调节因子，或治疗因子。

“内源免疫原”是天然存在于受体动物细胞或组织内的蛋白或其部分，例如，但不限于，内源细胞蛋白质，免疫调节因子，或治疗因子。或者，免疫原可以是由合成基因编码，并且可以是用本领域技术人员已知的构建重组体DNA的方法构建的。

外源免疫原可以是由病毒、细菌或寄生虫病原体在其进入动物宿主、在动物宿主中定殖或复制以前或期间表达的任意分子。rBCG可以表达来源于病毒，细菌或寄生虫病原体的免疫原或其部分。这些病原体能感染人，家畜或野生动物宿主。

病毒抗原由其衍生而来的病毒病原体，包括但不限于，正黏病毒，例如流感病毒(分类ID：59771)；逆转录病毒，例如RSV，HTLV-I(分类ID：39015)，和HTLV-II(分类ID：11909)；疱疹病毒，例如EBV分类ID：10295)；CMV(分类ID：10358)或单纯性疱疹病毒(ATCC#：VR-1487)；慢病毒，例如HIV-I(分类ID：12721)和HTV-2分类ID：11709)；杆状病毒，例如狂犬病；微小RNA病毒(picornoviruses)，例如脊髓灰质炎病毒(分类ID：12080)；痘病毒，例如痘苗病毒(分类ID：10245)；轮状病毒(分类ID：10912)；和细小病毒，例如腺相关病毒1(分类ID：85106)。

病毒抗原的例子如下组所示，包括但不限于，人免疫缺陷病毒抗原Nef(National Institute of Allergy and Infectious Disease HTVRepository Cat.# 183；Genbank登录# AF238278)，Gag，Env(NationalInstitute of Allergy and Infectious Disease HTV Repository Cat.# 2433；Genbank登录# U39362)，Tat(National Institute of Allergy and InfectiousDisease HTV Repository Cat.# 827；Genbank登录# M13137)，Tat突变衍生物，例如Tat-Δ31-45(Agwale et al Proc.Natl.Acad.Sci.in press.JuI 8^th；2002)，Rev(National Institute of Allergy and Infectious DiseaseHIV Repository Cat.# 2088；Genbank登录# L14572)，和Pol(NationalInstitute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository Cat.# 238；Genbank登录# AJ237568)和T和B细胞的gp120表位(Hanke andMcMichael，AIDS Immunol Lett.，66：177；1999；Hanke，et al，Vaccine，17：589；1999；Palker et al，J.Immunol.，142：3612-3619；1989)，，HIV-IEnv和gp120的嵌合衍生物，例如但不限于，gp120和CD4的融合物(Fouts et al，J.Virol.2000，74：11427-11436；2000)；HTV-1 env的截短或修饰衍生物，例如但不限于，gp140(Stamatos et al.J Virol，72：9656-9667；1998)，或HTV-1 Env和/或gp140的衍生物(Binley，et alJ Virol，76：2606-2616；2002；Sanders，et al J Virol，74：5091-5100；2000；Binley，et al.J Virol，74：627-643；2000)，乙型肝炎表面抗原(Genbank登录# AF043578；Wu et al，Proc.Natl.Acad.Sd.，USA，86：4726-4730；1989)；轮状病毒抗原，例如VP4(Genbank登录# AJ293721；Mackow etal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，87：518-522；1990)和VP7(GenBank登录# AY003871；Green et al，J.Virol.，62：1819-1823；1988)，流感病毒抗原，例如血凝素(GenBank登录# AJ404627；Pertmer and Robinson，Virology，257：406；1999)；核蛋白(GenBank登录# AJ289872；Lin et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，97：9654-9658；2000)；单纯性疱疹病毒抗原，例如胸腺嘧啶核苷激酶(Genbank登录# AB047378；Whitley et al，In：New GenerationVaccines，pages 825-854；2004)。

细菌抗原由其衍生而来的细菌病原体，包括但不限于，分枝杆菌(Mycobacterium spp.)，幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)，沙门氏菌(Salmonella spp.)，志贺氏杆菌(Shigella spp.)，大肠杆菌，立克次氏体(Rickettsia spp.)，李斯特菌(Listeria spp.)，肺炎军团杆菌(Legionellapneumoniae)，假单胞菌(Pseudomonas spp.)，弧菌属(Vibrio spp.)，和伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi).

细菌病原体保护性抗原包括肠毒性大肠杆菌菌体抗原，例如，CFA/I菌毛抗原(Yamamoto et al，Infect.Immun.，50：925-928；1985)和不耐热毒素的无毒B-亚基(Klipstein et al，Infect.Immun.，40：888-893；1983)；百日咳杆菌的粘附素(Roberts et al，Vacc，10：43-48；1992)，百日咳杆菌的腺嘌呤环化酶-溶血素(Guiso et al，Micro.Path.，11：423-431；1991)，破伤风梭状芽孢杆菌的破伤风毒素的片段C(Fairweather et al，Infect.Immun.，58：1323-1326；1990)，伯氏疏螺旋体(Borellia burgdorferi)的OspA(Sikand，et al，Pediatrics，108：123-128；2001)；Wallich，et al，Infect Immun，69：2130-2136；2001)，普氏克立次体和地方性斑疹伤寒克立次体的保护性不完全结晶-表面-层蛋白(Carl，et al，Proc Natl AcadSci U S A，87：8237-8241；1990)，单核细胞增多性李斯特菌的listeriolysin(也叫做″LIo″和″HIy″)和/或超氧化物歧化酶(也叫做″SOD″和″p60″)(Hess，J.，et al，Infect.Immun.65：1286-92；1997；Hess，J.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.93：1458-1463；1996；Bouwer，et al，J.Exp.Med.175：1467-71；1992)，幽门螺旋杆菌脲酶(Gomez-Duarte，et al，Vaccine 16，460-71；1998；Corthesy-Theulaz，et al，Infection & Immunity66，581-6；1998)，和炭疽芽孢杆菌的致死毒素的受体-结合结构域和/或防护性抗原(Price，et al，Infect.Immun.69，4509-4515；2001)。

从中衍生出寄生虫抗原的寄生虫病原体，包括但不限于：变形虫(Plasmodium spp.)，例如镰状疟原虫(Plasmodium falciparum)(ATCC#30145)；锥虫(Trypanosome spp.)例如克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)(ATCC# 50797)；贾第虫(Giardia spp.)例如肠贾第虫(Giardiaintestinalis)(ATCC# 30888D)；牛蜱(Boophilus spp.)，巴贝西虫(Babesiaspp.)例如果氏巴贝西虫(Babesia microti)(ATCC# 30221)；内阿米巴属Entamoeba spp.)例如痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)(ATCC#30015)；艾美球虫(Eimeria spp.)例如巨型艾美球虫(Eimeria maxima)(ATCC# 40357)；利氏曼原虫(Leishmania spp.)(分类ID：38568)；血吸虫(Schistosome spp.)，布鲁丝虫(Brugia spp.)，Fascida spp.，恶丝虫(Dirofilaria spp.)，吴策线虫(Wuchereria spp.)，和Onchocerea spp.

寄生虫病原体保护性抗原的例子包括变形虫环子孢子抗原(Sadoffet al，Science，240：336-337；1988)，例如P.bergerii的环子孢子抗原或P.falciparum的环子孢子抗原；变形虫裂殖子表面抗原(Spetzler et al，Int.J.Pept.Prot.Res.，43：351-358；1994)；痢疾阿米巴半乳糖特异性凝集素(Mann et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88：3248-3252；1991)，Leishmatiia spp.的gp63(Russell et al，J.Immunol.，140：1274-1278；1988；Xu and Liew，Immunol.，84：173-176；1995)，硕大利什曼原虫的gp46(Handman et al，Vaccine，18：3011-3017；2000)，马来布鲁格丝虫(Brugia malayi)的副肌球蛋白(Li et al，MoI.Biochem.Parasitol.，49：315-323；1991)，曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)的磷酸丙糖异构酶(Shoemaker et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89：1842-1846；1992)；蛇型毛原线虫(Trichostrongylus colubriformis)的分泌型球样蛋白(Frenkel et al，MoI.Biochem.Parasitol.，50：27-36；1992)；Frasciolahepatica的谷胱甘肽-S-转移酶’s(Hillyer et al，Exp.Parasitol.，75：176-186；1992)，牛血吸虫(Schistosoma bovis)和S.japonicum(Bashiret al，Trop.Geog.Med.，46：255-258；1994)；及牛血吸虫和S.japonicum的KLH(Bashir et al，supra 1994)。

如之前提到的，rBCG疫苗可以编码内源免疫原，其可以是任何细胞蛋白质，免疫调节因子，或治疗因子，或其部分，其可以在受体细胞中表达，包括但不限于，肿瘤，移植或自身免疫免疫原，或肿瘤，移植和自身免疫免疫原的片段和衍生物。因此，在本发明中，rBCG可以编码肿瘤，移植或自身免疫免疫原，或其部分和其衍生物。或者，rBCG可以编码合成基因(如上文描述的)，其编码肿瘤特异性，移植或自身免疫抗原或其部分。

肿瘤特异性抗原的实例包括前列腺特异性抗原(Gattuso et al，Human Pathol.，26：123-126；1995)，TAG-72和CEA(Guadagni et al，Int.J.Biol.Markers，9：53-60；1994)，MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie et al，J.Immunothera.，14：104-109；1993)。最近，有研究显示，在小鼠中用表达肿瘤抗原的非恶性细胞接种提供疫苗效应，也可以帮助动物形成对显示相同抗原的恶性肿瘤细胞进行清除的免疫应答(Koeppen etal，Anal.N.Y.Acad.Sci.，690：244-255；1993)。

移植抗原的实例包括T细胞上的CD3分子(Alegre et al，Digest.Dis.Sci.，40：58-64；1995)。用抗CD3受体的抗体进行治疗，表现出对循环T细胞的快速清除以及逆转细胞介导的移植排斥(Alegre et al.，supra，1995)。

自身免疫抗原的实例包括IAS β链(Topham et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：8005-8009；1994)。用来自IAS β链的18个氨基酸的肽接种小鼠，表明对于具有试验性自身免疫脑脊髓炎的小鼠提供保护和治疗作用(Topham et al，supra，1994)。

表达佐剂的rBCG的开发

rBCG可以构建为编码免疫原和佐剂，且可以用于增强宿主对rBCG的应答。或者，rBCG可以构建为编码佐剂，它与其他rBCG混合以增强宿主对配对的rBCG编码的免疫原的应答。

由rBCG编码的具体佐剂对本发明来说不是关键的，可以是霍乱毒素的A亚基(即CtxA；GenBank登录号X00171，AF175708，D30053，D30052)或其部分和/或其突变衍生物(例如，Ctx的A亚基的A1结构域(i.e.CtxA1；GenBank登录号K02679)，来自任何经典的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)(例如霍乱弧菌菌株395，ATCC# 39541)或El Tor霍乱弧菌(例如霍乱弧菌株2125，ATCC# 39050)菌株。或者，细菌二磷酸腺苷-核糖基化外毒素家组成员的任何细菌毒素(Krueger and Barbier，Clin.Microbiol.Rev.，8：34；1995)可以用于替代CtxA，例如肠毒性大肠杆菌的(GenBank登录# M35581)不耐热毒素A亚基(在此称为EItA)，百日咳毒素S1亚基(例如ptxS1，GenBank登录#AJ007364，AJ007363，AJ006159，AJ006157等)；进一步的其它佐剂可以为百日咳杆菌(ATCC#8467)，支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)(ATCC# 7773)或副百日咳博代菌(Bordetella parapertussis)(ATCC# 15237)的腺嘌呤环化酶-溶血素之一，例如百日咳杆菌(GenBank登录号X14199)，副百日咳博代菌(GenBank登录号 AJ249835)或支气管败血性博德特菌(Bordetella bronchiseptica)(GenBank登录号 Z37112)的cyaA基因。

表达免疫调节因子的rBCG的开发

rBCG可以被构建为编码免疫原和细胞因子，用于增强宿主对rBCG的应答。或者，rBCG可以被构建为只编码所述的细胞因子，与其他rBCG混合以增强宿主对配对rBCG编码的免疫原的应答。

由rBCG编码的具体细胞因子对本发明来说不是关键的，可以包括，但不限于，白介素-4(此处称为″IL-4″；Genbank登录号AF352783(鼠IL-4)或NM_000589(人IL-4))，IL-5(Genbank登录号NM_010558(鼠IL-5)或NM_000879(人IL-5))，IL-6(Genbank登录号M20572(鼠IL-6)或M29150(人IL-6))，IL-I0(Genbank登录号NM_010548(鼠IL-10)或AF418271(人IL-I0))，IL-12_p40(Genbank登录号NM_008352(鼠IL-12 p40)或AY008847(人IL-12 p40))，IL-12_p70(Genbank 登录号NM_008351/NM_008352(鼠IL-12 p35/40)或AF093065/AY008847(人IL-12 p35/40))，TGFβ(Genbank登录号 NM_11577(鼠TGFβ1)或M60316(人TGFβ1))，和TNFα Genbank登录号X02611(鼠TNFα)或M26331(人TNFα)).

细胞凋亡是细胞程序性死亡，其诱导和结果明显不同于细胞坏死。包含外源抗原的细胞凋亡是已知的针对该抗原的细胞免疫的刺激。包含抗原的细胞的凋亡引起细胞免疫的过程有时被称为交叉致敏(Heath，W.R.，G.T.BeIz，G.M.Behrens，C.M.Smith，S.P.Forehan，I.A.，Parish，G.M.Davey，N.S.Wilson，F.R.Carbone，and J.A.Villandangos.2004.Cross-presentaion，dentritic cell subsets，and the generation of immunity tocellular antigens.Immunol Rev 199：9；Gallucci，S.，M.Lolkema，and P.Matzinger.1999.Natural adjuvants：Endogenous activators of dendriticcells.Nature Biotechnology.5：1249；Albert，M.L，B.Sauter，and N.Bhadrdwaj.1998.Dendtritic cells acquire antigen from apoptotic cells andinduce class I-restricted CTLs.Nature 392：86)。引起抗原特异性细胞介导的免疫增强的细胞凋亡有若干机制。caspase8介导的凋亡引起抗原特异性细胞免疫保护作用。由rBCG产生的caspase8和rBCG表达的外源抗原背景下的rBCG在真核细胞胞质中分泌caspase8，由rBCG过表达的针对BCG和其他结核病的抗原及针对BCG自身的抗原可以引起高水平的抗原特异性细胞免疫。死亡受体-5(DR-5)，也叫做TRAIL-R2(TRAIL受体2)或TNFR-SF-10B(肿瘤坏死因子超家族成员10B)也介导caspase 8介导的细胞凋亡(Sheridan，J.P.，S.A.Marsters，R.M.Pitti，A.Gruney，M.Skutbatch，D.Baldwin，L Ramakrishnan，CL.Gray，K.Baker，W.I.Wood，A.D.Goddard，P.Godowski，and A.Ashkenazi.1997.Control of Trail induced apoptosis by a family of signaling anddecoy receptors.Science 277：818)。呼肠病毒诱导的细胞凋亡由TRAIL-DR5介导，引起后续的对病毒的清除(Clarke，P.，S.M.Meintzer，S.Gibson，C.Widmann，T.P.Garrington，G.L.Johnson，and K.L，.Tyler.2000.Reovirus-induced apoptosis is mediated by TRAIL.J.Virol74：8135)。由重组BCG表达的DR-5可以提供有效辅助作用，其可以诱导针对rBCG所表达抗原的抗原特异性细胞免疫。也可诱导表达抗原的细胞以通过Fas连接而进行细胞凋亡，Fas连接是用于诱导抗原特异性细胞免疫反应的强刺激。(Chattergoon，M.A.，JJ.Kim，J.S.Yang，T.M.Robbinson，D.J.Lee，T.Dentchev，D.M.Wilson，V.Ayyavoo，andD.B.Weiner.2000.Targeted antigen delivery to antigen-presenting cellsincluding dendritic cells by engineered Fas-mediated apoptosis.NatBiotechnology 18：974)。

表达Fas或Fas胞质结构域/CD4外结构域融合蛋白的重组BCG能够诱导细胞凋亡和抗原特异性细胞免疫应答。

通过rBCG对细胞免疫的增强产生的如前所述凋亡的增强子不只限于BCG抗原或特异性编码由rBCG过表达的抗原，还包括前面提到的能够被rBCG侵入的真核细胞中的任何抗原。例如，如果该rBCG被递送到要诱导凋亡的肿瘤细胞，那么针对重要的肿瘤抗原的细胞免疫将被肿瘤和/或转移灶的消除，减少或阻止而被诱导。这种抗肿瘤效应将是当BCG局部给药至例如膀胱癌时，BCG产生的广泛抗肿瘤效应的补充。

本发明更进一步的实施方案中，通过产生特异的凋亡介质而增强的rBCG，递送入肿瘤或其他细胞中，在其中这种rBCG也产生外源抗原，针对该外源抗原将建立强烈的细胞免疫应答，该rBCG将诱导针对含有这些外源抗原的细胞的强烈的细胞免疫应答。这些细胞应答会引起免疫介导的肿瘤细胞的破坏，进一步交叉致敏和诱导针对肿瘤或其他重要抗原的细胞免疫和后续的对肿瘤和/或转移灶的清除，减少或阻止。该外源抗原的一个例子为不同于宿主细胞的HLA的HLA抗原，针对该抗原会建立强烈的异源性细胞应答。

rBCG的凋亡诱导特性通过表达特异的凋亡介质被增强，其还表达特异性肿瘤抗原，该rBCG可以诱导针对这些肿瘤抗原的强抗原特异性细胞应答，包括破坏这些抗原的某些耐受性，引起肿瘤和/或转移灶的消除，减少或阻止，而不需要直接将rBCG递送到肿瘤中。

DNA损伤后的凋亡或caspase9诱导对某些抗原的耐受性(Hugues，S.，E.Mougneau，W.Ferlin，D.Jeske，P.Hofman，D.Homann，L.Beaudoin，D.Schrike，M.Von Herrath，A.Lehuen，and N.Glaichenenhaus.2002 Tolerance to islet antigens and prevention from diabetes induced bylimited apoptosis of pancreatic beta cells.Immunity 16：169)。耐受性的诱导在控制或预防自身免疫疾病中很重要，所述自身免疫疾病例如但不限于糖尿病，类风湿性关节炎，克隆病，炎性肠病和多发性硬化。在细胞中由rBCG产生caspase9或其他凋亡介导的耐受性诱导蛋白会产生有限的细胞凋亡，该细胞调亡将在这些细胞中诱导针对这些自身免疫的抗原靶的耐受性，从而治疗或预防自身免疫疾病，所述细胞例如但不限于，胰脏B细胞，结肠和神经细胞。对参与自身免疫反应的具体抗原的鉴定将允许通过rBCG产生这些抗原和caspase9或其他能够诱导细胞凋亡介导的耐受的分子而诱导针对这些自身免疫靶抗原的耐受性。该rBCG可以治疗和/或预防这些自身免疫疾病。

以下描述了用于将功能表达盒导入在真核细胞或组织中产生能够表达免疫调控因子的rBCG所进行的重组DNA和RNA的操作。

以下实施例被认为是本发明的多方面的示例，并且并不意味着对本发明的实施进行限制。本领域普通技术人员可以理解那些可选的材料、条件和操作可以变化并且在不超出本领域普通本申请说明书教导的一般范围的条件下保持在本领域技术人员能够认知的范围内。

实施例

方法

分枝杆菌菌株的培养

所选的BCG菌株在液体培养基中例如Middlebrook 7H9或Saulton合成培养基中，优选37℃进行培养。菌株可以通过静置或振荡培养进行维持。另外，BCG的生长率可以通过添加油酸(0.06％ v/v；Research Diagnostics Cat.No.01257)和去污剂，例如四丁酚醛(0.05％v/v；Research Diagnostics Cat.No.70400)来提高。BCG培养物的纯度可以通过将在磷酸缓冲盐水(此处称作PBS)中连续稀释的BCG培养物(例如从整-10^″8以10-倍梯度)以100微升的等份均匀涂布在含有25-30ml固体培养基，例如Middlebrook 7H10的3.5英寸的平板上进行评估。另外，培养物的纯度可以进一步用商业上可获得的试剂盒例如thiglycolate培养基(Science Lab，catalogue #1891)和大豆-casin培养基(BD，catalogue # 211768)来评估。

BCG种子罐在--80℃以0.1-2×10⁷cfu/ml的密度贮藏。通常，在液体培养物光密度(600nm)为0.2-4.0时，在相对无菌条件下进行收集；将培养物放入合适大小的离心管内且生物体在8000×g下离心5-10分钟。去上清，生物体在含有10-30％(v/v)甘油的Middlebrook 7H9的贮藏溶液中以0.1-2×10⁷cfu/ml密度重悬。该悬液在无菌的1.5ml硼硅盐冰冻管中以1ml等份量进行分配并置于-80℃。

普通分子生物学技术

限制性内切酶(在此为“REs”)；New England Biolabs Beverly，MA)；T4 DNA连接酶(New England Biolabs Beverly，MA)和Taq聚合酶(Life Technologies，Gaithersburg，MD)根据厂商操作手册使用；质粒DNA根据厂商操作手册(Qiagen，Santa Clarita，CA)通过使用小规模(Qiagen Miniprep^R kit，Santa Clarita，CA)或大规模(Qiagen Maxiprep^R kit，Santa Clarita，CA)质粒DNA纯化试剂盒进行制备；无核酸酶、分子生物学等级的milliQ水，Tris-HCl(pH7.5)，EDTA pH8.0，1M MgCl₂，100％(v/v)乙醇，超纯琼脂糖，和琼脂糖凝胶电泳缓冲液购自LifeTechnologies，Gaithersburg，MD。RE消化，PCRs，DNA连接反应和琼脂糖电泳都依照公知的操作执行(Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.1，2，3；1989；Straus，et al，Proc Natl Acad Sci USA.Mar；87(5)1889-93；1990)。为了验证在下节中描述的各个重组质粒的DNA序列进行的DNA测序是通过常规自动DNA测序技术实现的，使用的是Applied Biosystems自动测序仪，型号373A。

PCR引物购自供货商，例如Sigma(St.Louis，MO)，并使用AppliedBiosystems DNA合成器(型号373A)合成。PCR引物在150-250μM浓度下使用，PCR反应的退火温度用Clone manager software version4.1(Scientific and Educational Software Inc.，Durham NC)确定。PCR在Strategene Robocycler，型号400880(Strategene，La Jolla，CA)中进行。PCR扩增引物用Clone Managersoftware version 4.1(Scientific andEducational Software Inc.，Durham NC)设计。该软件能够设计PCR引物并鉴别被操作的特异性DNA片段相匹配的RE位点。PCR在热循环装置，例如Strategene Robocycler，型号400880(Strategene)中进行，PCRs中引物退火，延伸和变性时间根据标准操作(Straus et ah，supra，1990)设定。RE消化和PCRs随后通过使用标准操作(Straus et al.，supra，1990；and Sambrook et al.，supra，1989)的琼脂糖凝胶电泳分析。当克隆显示出正确的RE模式和/或PCR模式时确定其为阳性克隆。通过这一操作鉴定的质粒，更进一步使用如上文所述的标准DNA测序操作进行评价。

大肠杆菌菌株，例如DH5α和Sable2^R，由LifeTechnologies(Gaithersburg，MD)购，买并作为下面实施例中描述的重组质粒的起始宿主。重组质粒通过使用高压电脉冲装置，例如GenePulser(BioRad Laboratories，Hercules，CA)如所述的(Straus et ah，supra，1990)，设为100-200Ω，15-25μF和1.0-2.5kV的电穿孔导入大肠杆菌菌株。最佳的电穿孔条件通过确定导致每DNA meg/细菌的最大的转化率的设定进行鉴定。

按照产商的指导，菌株在胰胨豆胨琼脂(Difco，Detroit，MI)或胰胨豆胨培养液(Difco，Detroit，MI)中生长。除非另外陈述，所有细菌在37℃，5％ CO₂(v/v)轻微振荡的条件下生长。适当的时候，在培养基中补入抗生素(Sigma，St.Louis，MO)。菌株在-80℃下，悬浮在含有30％(v/v)甘油(Sigma，St.Louis，MO)的(Difco)中，每毫升大约10⁹个菌落形成单位。

BCG中的等位基因交换

现有技术教导了将改变的等位基因导入分枝杆菌菌株的方法，并且本领域技术人员能够理解并实施该方法(Parish et al.，Microbiology146：1969-1975；2000)。产生等位基因交换质粒的新方法需要使用合成的DNA。用这种方式的优点在于质粒产物具有高度明确的规律，可以适应政府的规定，而过去使用的方法，尽管有效，缺乏实验室培养记录的证明，因此不太可能适应。要使产品得到美国和欧洲权威机构用于人体的许可，对所述规定的满足是必要的。

在分枝杆菌中等位基因交换的自杀载体是能在大肠杆菌菌株中复制但不能在分枝杆菌，例如M.tb和BCG中复制的质粒。这种用在本发明的等位基因交换操作中的具体自杀载体并不重要，并可以从学术(Parish et ah，supra；2000)和商业来源中选择。等位基因交换用的自杀质粒优选设计如图1所示。该质粒包含如下DNA片段：使质粒在大肠杆菌中复制的oriE序列(GenBank登录#L09137)，在大肠杆菌和分枝杆菌中进行选择的卡那霉素抗性序列(GenBank登录# AAM97345)，和另外的抗生素选择标记(例如zeocin抗性基因(GenBank登录# AAU06610)，其可以位于分枝杆菌启动子的控制下。第二抗生素选择标记不是必须的但被包括以便能够进行双重选择而对在等位基因交换过程中自发的卡那霉素抗性分离物的向外生长进行阻止(Garbe et al.，Microbiology140：133-138；1994)。

该自杀载体的构建可以用在此所述的标准DNA重组技术完成。然而，目前的调控标准带来了如下的恐惧：会引入从接触含有BSE-感染物质的牛产品的产物而获得的朊病毒颗粒。为了避免将不明原因的物质(例如DNA序列)引入目标菌株，因此，优选的，自杀载体中的所有DNA通过商业来源进行合成制备(例如Picoscript，Inc.)。因此，构建自杀载体的优选方法是用DNA软件构建汇集DNA序列的设计(例如Clone Manager)，由任一提供此项服务的供应商(例如Picoscript Inc.)基于一次一付费来合成DNA。用该方法生产自杀载体pAF100(未显示)，然后为了本申请进行进一步修饰(pAF103；在图1中概述并进一步描述在表1中)。

表1.自杀载体

名称	主链	用于等位基因交换的具体等位基因
			pAF103	pAF100	leuD基因的1kb侧翼区

该自杀载体的优点在于，例如含有两个抗生素选择标记，以此减少对表现一种抗生素抗性的自发突变的选择，该突变每代中的发生概率为大约1/10⁸发生。对两种抗生素的自发抗性及其少见，每代的发生概率大约只有1/10⁶。因此，在用于实施等位基因交换操作的培养基中的双抗性菌株的发生几率小于1/10⁶。

为了在等位基因交换过程中阴性选择，将赋予蔗糖敏感表型的sacB基因(Genome Seq ID # NT01BS4354)加入到经过最终DNA重组步骤并完成了等位基因交换的菌株的富集培养物中。

制剂和接种策略

疫苗制剂策略是基于测定整个生产过程的最大存活率和稳定性的研究进行构建的。其包括，在使用多种常用分枝杆菌培养基，包括加入甘油，糖，氨基酸，和去污剂或盐的情况下的培养过程中，测定最大的生物体存活率(由活到死)。之后，通过离心或正切流向过滤和在冷冻或冻干过程中能够保护细胞的稳定介质中重悬来收获培养的细胞。常用的稳定剂包括谷氨酸钠，或氨基酸或氨基酸衍生物，甘油，糖或常用的盐。最终的制剂将提供具有充分的存活生物体以进行皮内，经皮注射，灌注或口腔递送的递送，并具有足够的维持稳定性以及运输和使用的足够的贮藏期。

TB疫苗的临床前评估

一般的安全试验

六只一组的BALB/c小鼠用2×10⁶ CFU的目的rBCG菌株和类似的亲本菌株进行腹膜内感染。感染后14天内对动物的一般健康状况和体重情况进行监控。接受BCG和rBCG菌株的动物在观察期保持健康，没有体重减轻或明显病征。

新性rBCG菌株在具有免疫能力的小鼠中的毒性

15只具有免疫能力的BALB/c小鼠组分别经静脉感染2×10⁶的rBCG和BCG亲本菌株。感染后一天，每组中处死三只小鼠，并分析脾，肺和肝中的CFU，以确保每只动物具有相同的感染剂量。在感染后4，8，12，16周，每组处死三只小鼠，获得脾、肝和肺的CFU，评估rBCG菌株在体内的生长，将其与亲本BCG菌株比较。预计rBCG菌株可以表现出与亲本BCG相似的毒性。

免疫功能不全的小鼠中的严格安全试验

具有SCID(重症联合免疫缺陷)的免疫功能不全小鼠10只一组，分别静脉内感染2×10⁶ cfu rBCG和亲本BCG菌株。感染后一天，每组中处死三只小鼠，并分析脾，肺和肝中的CFU，以确认接种剂量。监控每组中剩下的7只小鼠的一般健康状况和体重。在整个观察过程中，跟踪这些小鼠的存活，rBCG-感染的小鼠的存活不比亲本菌株感染的动物差就是成功的结果。

豚鼠安全试验

还在豚鼠模型中与在人体中具有良好构建的安全性的亲本BCG疫苗进行比较评估rBCG菌株的安全性，以。首先，检测疫苗在一般健康状况下的动物中的效果，包括体重增加。豚鼠经肌内注射10⁷(10O×接种剂量)cfu重组的和亲本菌株进行免疫，监控动物的一般健康状况和体重6周。对在6周前死亡的动物进行死后检查。所有的动物在感染后6周末的时候处死并进行总体病理学检查。在第6周的尸体剖检中没有体重减轻，没有异常行为且所有器官都正常。对rBCG-Pfo疫苗没有观察到有害健康的影响且与亲本菌株接种的动物相比动物的体重以正常速率增加时，表示是成功的试验。

同时，监控动物器官中的细菌水平。对用亲本或重组疫苗免疫的豚鼠在感染后不同的时间间隔内实施安乐死，然后分析肺，脾和局部(腹股沟)淋巴结的BCG或rBCG的cfu。

毒性试验

为了评估rBCG菌株的毒性，每组12只豚鼠经皮内注射分别接种，1倍剂量，高于单一剂量四倍，或低于用于人的rBCG菌株剂量四倍的剂量，BCG亲本株或生理盐水。接种后三天，处死六只动物获得疫苗在这些动物中的急性作用的信息。接种28天后，处死剩下的六只动物以评估在动物中的慢性作用。在这两个时间点，获得每只动物的体重，检查总体病理学和注射部位的外观。对血进行血化学检查，并进行内脏和注射部位的组织病理学检查。

测定保护作用的研究

鼠的保护研究

C57Bl/6小鼠(雌性，5-6周龄)13只为一组，用10⁶ CFU的rBCG、亲本BCG或盐水经皮下注射免疫。另一组小鼠作为健康对照。免疫接种8周后，用M.tb Erdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)通过由含有总共10⁷CFU攻击菌株的10ml单细胞悬液产生的气雾剂攻击小鼠，如前所述，该剂量递送100个活的细菌至每只动物的肺。监控实验动物和未攻击动物的存活情况。攻击后，还要监控动物的体重减轻和一般健康情况。攻击后一天，处死每组中的三只小鼠，检查肺部的cfu以证实攻击剂量并处死每组中的一只进行脾和肺的组织病理学检查。攻击五周后，每组中的9只小鼠被处死，对动物进行组织病理学和微生物学分析。对来自6只小鼠的肺和脾组织评估cfu计数(具有选择补充物的平板用于将疫苗菌株与攻击菌株区分开)。如果用H37Rv-卡那霉素抗性菌株攻击，Kan或TCH用于将攻击菌株与疫苗菌株区分开。如果用M.tb Erdman菌株攻击，TCH用于将疫苗菌株和攻击菌株区分开(BCG敏感，而M.tb是自然抗性的)。

皮肤迟发性超敏反应(DTH)的诱导

无特异病原体(SPF)豚鼠可经皮内注射10³rBCG或BCG亲本菌株进行免疫。免疫接种9周后，将动物背部刮毛，皮内注射10μgPPD的100μl磷酸缓冲盐水溶液。24小时后，测量硬结直径。rBCG菌将诱导与亲本BCG菌株诱导相等或更严重的DTH。

豚鼠攻击研究

为了确定rBCG疫苗针对M.tb攻击的效力，以12只豚鼠(年轻成年SPF Hartley，250-300克，雄性)为一组进行免疫，每组用rBCG，亲本BCG株或盐水免疫。疫苗与对照以皮下注射10⁶cfu给药。免疫接种10周后，rBCG-，BCG-和假免疫的动物通过M.tb气雾剂攻击，气雾剂由含有总共10⁷CFU的M.tb的10ml单细胞悬液产生；如前所述，该操作递送～100个活细菌至每只动物肺中(Brodin et al，J Infect Dis.190(1)，2004)。攻击后，监控动物，连同未接种的健康组，未攻击的动物的存活。攻击后，监控动物的体重减轻和一般健康情况。在攻击10周后，处死每组中6只动物，剩下的每组6只动物在攻击70周后处死作为长期评估。在两个时间点，进行动物的组织病理学和微生物学分析。肺和脾组织进行组织病理学评估和cfu计数(具有选择性补充物的平板用于将疫苗菌株与攻击的菌株区分开)。如果使用H37Rv-卡那霉素抗性菌株攻击，Kan或TCH用于将攻击菌株与疫苗菌株区分开。如果使用M.tb Erdman菌株攻击，TCH(BCG敏感，而M.tb是自然抗性的)用于将疫苗菌株和攻击菌株区分开。当假免疫的动物在攻击后最快死亡时，而rBCG免疫的动物比BCG亲本菌株免疫的动物存活更长，则表示成功。

灵长类安全性和攻击的研究

最近，猕猴已被用于评估针对M.tb的疫苗。人与非人灵长类的进化关系以及在这些物种中结核病的类似临床和病理表现使非人灵长类模型对结核病和疫苗效力的实验研究具有吸引力。

通过发生肺空泡特征该模型表现出能够应用于人结核病。感染和疾病后进行X光并测定体重减轻及多种血液测试，包括红细胞沉降率(ESR)，外周血单核细胞(PBMC)增殖和细胞因子产生，细胞毒T淋巴细胞(CTL)活性和抗体应答。感染后，猕猴发生具有特征性损伤的肺部病征，并且取决于攻击剂量，在感染后4至6周内发生急性呼吸道感染引起的死亡。较低的感染剂量引起慢性感染而不患病，更像在人类体内。

研究设计

该研究将直接比较BCG亲本菌株与重组BCG的多种剂量，两者是单次给药或者伴随有使用含有在rBCG构建体中过表达序列的疫苗的随后的两次加强免疫。后者可以作为基于合适佐剂的重组蛋白、DNA或者Ad35构建体而递送。

第一项研究在不加强免疫的情况下评估亲本BCG对比rBCG构建体的保护效果。该研究包括如下设计的3组(每组10只动物)：包括BCG，rBCG和生理盐水各自一组。用在rBCG构建体中过表达的抗原和标准PPD和作为对照的生理盐水对每组中两只动物进行皮肤测试。与BCG组相比在rBCG组中阳性且大量的硬结表示体内疫苗成活且引发免疫应答。每组中剩下的8只动物用低剂量的M.tb Erdman菌株进行气雾剂攻击，并通过攻击16周后细菌负荷的减少或结束时的存活率测定保护作用。

接着而来的BCG致敏方案与上面的基本相同，除了动物首先用BCG，rBCG和生理盐水接种，随后用过表达的抗原两次加强免疫。

非人灵长类动物模型中的免疫原性和保护作用的研究将针对用以研究rBCG构建体效果研究的短尾猴结核病的免疫生物学和免疫病理学。动物为从少年到青年成体，在开始实验之前，经全面调控使得在笼养状态下平均体重为2至3kg。接种前的研究由基线血液检测组成，包括常规的血液研究和红细胞沉降率及淋巴细胞增殖分析。用PPD皮试以确保对结核菌素敏感性的缺乏以及获得胸部X-线检查作为感染前的部分分布。免疫阶段总共持续21周，包括在0周用BCG或rBCG致敏接种并在12和16周加强抗原。抗原-特异性免疫通过测定淋巴细胞刺激实验中增殖率和干扰素γ(IFNγ)的分泌进行评估。淋巴细胞产生IFNγ的频率通过酶连免疫吸附实验(ELISPOT)或荧光-活化的细胞分拣仪(FACS)测定。最后，血样在相对于致敏接种的0，4，8，12，16和20周时提取。

最后免疫后4至6周，在同一天用相同制剂通过气管内吸入3ml(1,000cfu)结核分枝杆菌Erdman攻击动物。评估感染过程的体重减轻，发热，升高的ESR，DTH至PPD，PPD刺激的PBMC的体外增殖反应和rBCG中过表达的抗原，之后测定IFN-g的产生水平。进行胸部X-射线检查以检测与肺结核病一致的异常，并且最后，在攻击12-16周后进行尸体剖检。

TB载体和疫苗的临床评价

安全性和毒性研究：由规章指南强制的临床前安全性和毒性研究依照之前描述的临床前毒理学和安全性研究进行。这些研究之后进行对人的安全性研究。这些研究最初在健康的Quantiferon阴性成年人中进行，然后对年龄降低至儿童和新生儿。

免疫原性研究：在小鼠和灵长类中的免疫原性的研究可以利用但不限于评估细胞免疫学的标准方法，例如在短期和长期抗原或肽刺激下的INFγ，ELISPOT和/或流式细胞计量。类似的方法用于评估人体反应。四聚物研究用于评估在人体接种后的CD4和CD8反应。

致敏-加强策略的优化：rBCG也可作为针对TB或其他疾病的标准的单一疫苗，为此将其工程化为表达相关的转基因。在此使用的，“转基因”是一种DNA片段，其功能上连接于分枝杆菌的启动子且表达目的蛋白。在此描述的rBCG作为TB的疫苗或表达防御其他疾病的转基因，和重组蛋白与佐剂或病毒或细菌携带抗原混合，对于致敏免疫系统非常好。在动物临床前研究和人体研究中，BCG致敏随后进行重组蛋白/佐剂或载体加强免疫优化治疗方案和剂量。因为BCG致敏的效力，这些致敏加强策略是诱导人体免疫的最有效手段，尤其在本发明中体现的，后续有由重组蛋白或载体集中和增强加强免疫系统的加强反应。

在动物中接触后治疗性疫苗的研究

C57BL/6小鼠用于建立潜伏性感染；在只有由低剂量感染诱导的可忽略的M.tb特异免疫时，以及在当M.tb特异性免疫消退而记忆T细胞占优势时的另一时间点，治疗性疫苗施于小鼠。疫苗的治疗性优点在最后一次递送疫苗后2和5个月时，通过计算个体小鼠肺和脾的cfu计数而进行评估。Cfu计数通过对小鼠的组的标准统计方法进行分析，结果用于说明治疗性接种是否显著地减少了小鼠中潜伏M.tb感染；需要时，类似的方法用于评估其他动物的反应。

BCG载体临床评价：rBCG疫苗的口服施用

本发明目标动物的rBCG的口服免疫可以用先前描述的方法完成(Miller et al，Can Med Assoc J 121(1)：45-54；1979)。给药口服的rBCG的量依赖于受试者的种类、治疗的疾病或病症的改变而改变。一般的，使用的剂量大约为10³到10¹¹活菌，优选大约10⁵到10⁹活菌。

rBCG一般与药学上可接受的载体或稀释剂一起给药。所使用的具体药学上可接受的载体或稀释剂不是本发明的关键。稀释剂的例子包括磷酸缓冲生理盐水，缓冲胃中胃酸的缓冲液，例如含蔗糖的柠檬酸盐缓冲液(pH7.0)，碳酸氢盐缓冲液(pH7.0)(Levine et al，J.Clin.Invest，79：888-902；1987；and Black et al，J.Infect.Dis.，155：1260-1265；1987)，或含有抗坏血酸，乳糖，和任选的的阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲液(pH7.0)(Levine et al，Lancet，II：467-470；1988)。载体的例子包括蛋白，例如在脱脂牛奶发现的，糖，例如蔗糖，或聚乙烯吡咯烷酮。这些载体通常以大约0.1-90％(w/v)，优选1-10％(w/v)的浓度范围使用。

实施例

实施例1.亲本BCG菌株在豚鼠中的效力：rBCG30对豚鼠保护作用的研究

所研究的一个实施例用现有的rBCG30疫苗进行，进行大量豚鼠研究的目的在于比较两批rBCG30的防护效果，包括亲本BCG Tice菌株本身和另一种商业上可获得的并在世界范围内的人群中使用的BCG疫苗(SSI-1331菌株)。两批rBCG30可以在实验室条件下(rBCG30-UCLA)也可以在GMP条件下加工(rBCG30-KIT)用于人类。

豚鼠(10只动物一组)以每种BCG疫苗单一剂量10³cfu经皮下途径免疫接种。阴性对照组(生理盐水免疫接种)也包括在研究中。接种疫苗8周后，用有毒性的Erdman菌株经气雾剂途径攻击，通过对Middlebrook空气传播感染装置的喷雾器小室的调整而递送大约10-15个细菌至肺部。攻击10周后处死动物。尸体剖检中，从动物中取出肺和脾，通过在营养素Middlebrook 7H11上涂布一系列10倍稀释的肺叶和脾组织匀浆而确定有活细菌的数目。在37℃，5％(v/v)CO₂下培养21天后，对形成的菌落计数。数据以回收的细菌的平均值的log10表示。

结果(图2)表示，与阴性生理盐水对照比较，所有的疫苗都针对Mtb攻击具有保护性，疫苗间的区别趋向分化为两组：

1)rBCG30(UCLA)，和BCG Danish 1331更具有保护性；以及

2)BCG(亲本Tice菌株)和rBCG30(KIT)保护性较低。

因此，可以合理推断虽然rBCG30(UCLA)在实验室条件下产生，但并非GMP等级，其显出比亲本Tice菌株更好的诱导防护作用，最好的情况是，防护效果只可与商业上可获得的BCG SSI相比。因此，对BCG Danish 1331的改善应该以产生新型rBCG疫苗为目标。

实施例2.构建宿主以作为缺乏抗生素抗性标记的表达载体的携带者

敲除BCG Danish 1331菌株中的leuD基因的质粒的构建：leuD基因的左右1kb侧翼区通过DNA合成(DNA 2.0，CA)装配在一起形成2kbDNA片段，在两个末端有PacI位点。

使用PacI限制性内切酶消化及之后的连接将该DNA片段克隆入上述的等位基因交换质粒，产生leuD敲除质粒。

等位基因交换灭活leuD基因：leuD基因的灭活是在除50μg/ml亮氨酸被补充到leuD基因敲除的菌株的培养基中之外如所描述的进行。其过程的主要步骤的流程图在图4中给出。

LeuD敲除的验证

表型测试：获得的菌株对其依赖亮氨酸补充的生长进行测试。具体而言，细菌在含有10％ OADC和0.05％(v/v)四丁酚醛添加物的7H9培养基中培养，其中存在或缺乏50ug/ml亮氨酸，且细菌的生长通过测量OD₆₀₀值监控。

基因组分区域序列分析：构建的菌株的基因DNA如前面的描述进行制备。与目标基因左右1kb侧翼互补的引物对用于PCR扩增而获得大约2kb染色体片段。对该PCR产物进行测序以确定在区域中leuD基因缺失。

实施例3.在rBCG菌株中过表达的M.tb抗原

DNA操作：M.tb抗原TB 10.4(Rv0288)，Ag85B(Rv1886c)，和Ag85A(Rv3804c)使用来自Ag85B plus Rv3130(Florczyk et ah，supra，2003)的启动子以多顺反子的形式按所描述的顺序表达。编码具有KEDL序列的多肽的DNA序列置于每种抗原的末端作为内质网贮留信号以改善每一种抗原的抗原呈递。另外，放置5’-环状结构和3’-转录终止序列以确保转录的多顺反子mRNA的稳定性。最后，限制性酶PacI序列用在两个末端的侧翼以便易于将表达盒克隆到表达载体中。表达盒中的全部DNA通过基因合成制备(Picoscript Inc，TX)。表达盒利用PacI位点克隆入表达载体。在大肠杆菌中扩增后，用NdeI消化质粒除去oriE和卡那霉素抗性基因，然后连接产生单向穿梭系统，然后用标准电穿孔操作(Parish et al，Microbiology，145：3497-3503；1999)将该系统导入分枝杆菌leuD营养缺陷型突变体中。图3示意性描述了非-抗生素表达载体。

用非-抗生素选择系统表达M.tb抗原：用作非-抗生素选择系统的亮氨酸自养的BCG Danish 1331，在补充10％ OAD(油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶)，0.05％(v/v)四丁酚醛和50μg/m亮氨酸的7H9培养基中培养。电穿孔后，包含抗原表达质粒的重组菌株通过在无亮氨酸的7H10平板(BD Difco)中平皿培养分离。细菌的存活依赖于质粒的leuD基因的抗原表达，反之，其功能作为维持细胞中质粒的机制。所产生的单个克隆被分离并在如上面所述的7H9培养基中培养，除了没有亮氨酸添加物。

表达的确认：每种抗原的表达通过Western印迹分析检测。具体而言，收集培养物的上清并如前面的描述进行处理(Harth et al，InfectImmun 65(6)：2321-2328；1997)。然后，表达的抗原在SDS-PAGE凝胶上分离并与85A，85B和10.4抗原的抗体杂交。每种抗原的表达水平通过每种特异条带与由表达质粒阴性宿主菌产生的条带的亮度对比的定量测量进行评估。

实施例4.在没有抗生素选择的分枝杆菌中表达选定的抗原

材料和方法：

用于电穿孔的质粒和分枝杆菌的制备：分离重组质粒DNA并用限制性内切酶NdeI(New England Biolabs)消化释放出抗生素选择标记(例如卡那霉素抗性)和大肠杆菌复制起点(OriE)。然后，根据产品说明书，消化的质粒片段用T4D NA连接酶(New England Biolabs)环化。产生的含有分枝杆菌复制起点和所选抗原、但无抗生素抗性基因且不能在革兰氏阴性细菌中复制的质粒，被导入所选的分枝杆菌。为制备用于电穿孔的分枝杆菌，BCG Danish 1331细菌在37℃，在含有10％OADC添加物的7H9培养基(BD Biosciences)中培养至指数增长期。四丁酚醛(0.05％ v/v，Research Diagnostics Cat.No.70400)用于分散细菌。然后细胞在10％甘油加0.05％四丁酚醛中冲洗三次，在电穿孔前除去培养基。每次电穿孔，1.6μg质粒用于每1.25×10⁸细菌细胞。电穿孔在2.2kV，电容25μF，电阻1.0kΩ的条件下进行。电穿孔后，细胞十倍系列稀释，立即置于Middlebrook 7H10琼脂(BD Biosciences)板上并在37℃下培养。

含有表达质粒的菌落的PCR筛选：

重组体菌株首先通过使用正向引物GTTAAGCGACTCGGCTATCG(SEQ ID NO：1)和反向引物ATGCCACCACAAGCACTACA(SEQ ID NO：2)扩增表达质粒中的oriM区的PCR进行筛选。PCR参数如下：步骤1：95℃ 4分钟，一次循环；步骤2：95℃ 1分钟，60℃ 1分钟，然后72℃ 1分钟，总共30次循环；步骤3：72℃ 10分钟一次循环。步骤4：4℃贮存。所产生的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析以验证细胞中的质粒的存在。

结果

进行设计用于扩增质粒复制区(OriM)的PCR用于筛选含有过表达质粒的所产生的菌落。因为该区在细菌染色体中不存在，细胞中该区的存在是一种质粒已经导入细胞的有力指示。在筛选的rBCG克隆中，一些克隆产生的PCR产物，在大小上与质粒阳性对照反应相似，如用凝胶电泳分析的。相反，亲本BCG细菌不产生任何PCR产物，如图5中所示。该实验提供了质粒已经成功导入分枝杆菌且含有质粒的菌落已经在不使用抗生素选择下分离的初步证据。

讨论

常规的用在重组分枝杆菌菌株中的质粒含有复制区和选择标记(通常的抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性，或补偿代谢缺陷的基因，例如，leuD或asd(Galan et al.，Gene，94：29；1990)作为质粒必需元件用于重组DNA实验。代表性的，抗生素用于挑选含有重组质粒的克隆。然而，其形成了在抗生素抗性遗传修饰的生物体有意的在实验室限制之外使用的情况下造成的抗生素抗性基因的意外传播的风险。

在上面的研究中，我们将能够表达抗原且不含有oriE区也不含有抗生素选择标记的重组质粒导入到细菌中，并成功的未经挑选就分离出含有质粒的克隆。尽管目前的实验将oriE作为质粒的复制起点，将其他的质粒复制区作为替换是可以想到的，例如pMF1(Bachrach et al.，Microbiol.，146：297；2000)的复制区。该系统特有的好处在于重组质粒不再具有抗生素抗性基因。因此，其不能意外地如商业用的表达质粒可能出现的情况将抗生素抗性传播到环境中。另外，本发明的单向穿梭载体表达质粒不再能够在广谱宿主中复制，因为能够进行这样复制的遗传元件被缺失了。该限制添加了对重组质粒的第二层次的限制，从而显著降低了将遗传改良生物体(GMO)释放到环境中的相关风险。

尽管当前的结果显示不经选择就可将重组质粒导入减毒的分枝杆菌菌株是可能的，其他因子可能在分枝杆菌中的无-选择标记质粒的稳定性上起到作用。因此，复制区包含促进质粒复制和介导在同胞细胞中质粒分离的基因，从而促成不经过选择就能鉴定出含有质粒的菌落的能力。

能够不经选择就分离出含有质粒的菌落的可能因素为，在当前方式中使用较高的质粒与细胞比例。较高的质粒与细胞比例的使用增加了细胞接受质粒的机率，减少不含质粒的细胞数。在该研究中，质粒与细胞的比例比常规使用选择系统的方法中的代表性使用的比例高大约10倍。理论上，更高的质粒与细胞比例可能导致更多的含有质粒的菌落，直到达到质粒饱和度，其可能抑制质粒DNA被电穿孔细胞的摄入。在本发明优选的具体实施方案中，质粒与细菌的比例在大约0.5μg至大约10μg质粒DNA比大约1.25×10⁸个细菌细胞的范围内，优选的在大约1μg至5μg质粒DNA比大约1.25×10⁸个细菌细胞的范围内。

另外，被质粒pAF105过表达的TB抗原在质粒稳定中起重要作用。该质粒过表达两种蛋白质，抗原85复合物(Ag85A(Rv3804c)和Ag85B(Rv1886c))，两者都具有mycolyltranferase活性，其是海藻糖二霉菌酸酯生物合成必需的，海藻糖二霉菌酸酯是维持细胞壁完整的必需的主要结构。因此，如果非-选择质粒能给含有该质粒的细胞带来生长优点，过表达这些抗原中至少一种可以促进稳定性，因此使不经选择就能鉴定含有质粒的克隆。

Claims

1.引入了外源核苷酸序列的转化的细菌或其子代，所述转化的细菌为rBCG1331或rBCG30，外源核苷酸序列在其中复制并被表达，其中所述的外源核苷酸序列不与选择标记连接，其中所述的外源核苷酸序列存在于质粒上，以及其中所述的质粒编码存活必需的基因leuD，并且所述存活必需的基因leuD从所述转化的细菌的细菌基因组中删除。

2.权利要求1的转化的细菌或其子代，其中所述的转化的细菌是营养缺陷型。

3.权利要求1的转化的细菌或其子代，其中所述核苷酸序列是单向穿梭载体的至少一部分。

4.转化细菌的方法，所述转化细菌为rBCG1331或rBCG30，包括引入外源核苷酸序列的步骤，该外源核苷酸序列在所述细菌中复制并被表达，其中所述的外源核苷酸序列不与选择标记连接，其中所述的外源核苷酸序列存在于质粒上，以及其中所述的质粒编码存活必需的基因leuD，并且所述存活必需的基因leuD从所述转化的细菌的细菌基因组中删除。

5.权利要求4的方法，其中所述的引入步骤通过电穿孔进行。

6.权利要求4的方法，其中所述的外源核苷酸序列是单向穿梭载体的至少一部分。

7.疫苗，其包含转化的细菌或其子代，所述转化细菌为rBCG1331或rBCG30，包括引入外源核苷酸序列的步骤，该外源核苷酸序列在所述细菌中复制并被表达，其中所述的外源核苷酸序列不与选择标记连接，其中所述的外源核苷酸序列存在于质粒上，以及其中所述的质粒编码存活必需的基因leuD，并且所述存活必需的基因leuD从所述转化的细菌的细菌基因组中删除。