EA012434B1 - Рекомбинантные штаммы bcg, обладающие повышенной способностью к высвобождению из эндосомы - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к штаммам Mycobacterium, обладающим повышенной способностью вырабатывать CD8-T-клеточный иммунный ответ, рестриктированный главным комплексом гистосовместимости класса I. Были генетически сконструированы штаммы Mycobacterium, экспрессирующие эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН (например, перфринголизин О), что приводит к высвобождению указанной Mycobacterium из эндосом в цитоплазму клетки. Настоящее изобретение также относится к вакцинным препаратам, содержащим указанные штаммы Mycobacterium.

Description

Настоящее изобретение относится к штаммам МусоЬас1егшт, обладающим повышенной способностью вырабатывать иммунный ответ. В экспериментах ίη νίνο была продемонстрирована, например, выработка СИ8⁺-Т-клеточного иммунного ответа, рестриктированного главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I. В частности, настоящее изобретение относится к штаммам МусоЬас1егшт, экспрессирующим белок перфринголизин О (ΡίοΆ), который способствует высвобождению МусоЬас1егшт из эндосом, а также к вакцинным препаратам, содержащим указанные штаммы МусоЬас1егшт.

Предшествующий уровень техники

Бактерией МусоЬас1егшт 1иЬегси1оз1з (М. 1Ь) инфицирована одна треть населения всего мира, и эти инфекции вызывают активную форму заболевания у 8 млн человек, из которых каждый год умирает 1,62,2 млн человек, причем большинство из них проживает в развивающихся странах. Туберкулез (ТБ) представляет собой эпидемическое заболевание глобального масштаба, причем заболеваемость туберкулезом и смертность от этого заболевания все возрастает, поскольку его распространенность становится сравнимой с распространенностью ВИЧ-инфекций. ТБ является главной причиной смертности больных СПИДом.

Бацилла Кальмета-Герена (ВСС), представляющая собой аттенуированный штамм МусоЬас1егшт Ьо\'1з и широко используемая в настоящее время вакцина против ТБ, была разработана 80 лет назад, и, как показали испытания, уровень ее эффективности против туберкулеза легких широко варьируется, причем эта вакцина оказалась неэффективной в большинстве испытаний в условиях практической работы, проводимых в последнее время в Индии (Рте е1 а1., Уассше, 16(20): 1923-1928; 1998; Апопутоиз, Ιη6ίηη 1 Меб Кез., Аид; 110: 56-69; 1999). Тем не менее, в настоящее время Всемирная Организация Здравоохранения рекомендует ВСС-вакцинацию всех детей при рождении или при первом посещении патронажной службы (за исключением детей с симптомами ВИЧ-инфекции/СПИД) в странах с высоким риском заболеваемости туберкулезом. Такая тактика основана на полученных данных, свидетельствующих о том, что ВСС обеспечивает защиту от тяжелых форм детского ТБ (Ьапскпе! е1 а1., Ιηΐ 1 Ер1бетю1, 24(5): 1042-1049; 1995; Кобпдиез е1 а1., 1 Ер1бетю1 Соттипйу НеаИй 45(1): 78-80; 1991). Иммунизация противотуберкулезной вакциной ВСС детей далеко не раннего возраста является предметом обсуждения, поскольку в настоящее время имеется лишь ограниченное число данных, дающих противоречивые результаты. Однако высокая заболеваемость туберкулезом у детей и взрослых в развивающихся странах, где широко практикуется ВСС-иммунизация, указывает на то, что применяемая в настоящее время вакцина ВСС не очень эффективна, и уже в течение многих лет люди, проживающие в этих странах, подвержены высокому риску заболевания ТБ. Поэтому очевидно, что ВСС не обеспечивает адекватную защиту человека от заболевания ТБ и не является средством борьбы против заражения ТБ.

Приблизительно 70% людей, контактирующих с микроорганизмами, вызывающими ТБ, и имеющих нормальную иммунную систему, не подвергаются инфицированию, и лишь у 5% из всех инфицированных индивидуумов развивается заболевание в первые два года. У большинства инфицированных индивидуумов наблюдается подавление инфекции, ассоциированное с продуцированием стойкого клеточного иммунного ответа против антигенов М. ТЬ, а у еще 5% индивидуумов наблюдаются рецидивы этого заболевания при снижении иммунитета. Как первичное заболевание, так и рецидивы этого заболевания наблюдаются, главным образом, у людей, страдающих ВИЧ-инфекциями/СПИД, что еще раз подтверждает важную роль, которую играет иммунитет в предупреждении и устранении инфекции.

Поскольку организм большинства людей способен бороться с ТБ, т.е. все основания надеяться, что индуцирование стойкого иммунитета определенного типа позволит разработать эффективные вакцины, предупреждающие возникновение первичной инфекции после контакта с микроорганизмами, вызывающими эту инфекцию, и раннее прогрессирование заболевания, а также предупреждающие реактивацию при латентном состоянии и возникновение рецидивов после лечения. И наконец, может быть использована комбинации системного введения вакцины и проведения химиотерапии, которые, в конечном счете, будут способствовать уничтожению микроорганизма М. 1Ь. являющегося патогеном для человека.

Исходя из того факта, что вакцинация ВСС в детстве играет решающую роль для предупреждения развития острой формы ТБ, очевидно, что замена ВСС на новую вакцину против ТБ в испытаниях, проводимых для оценки кандидатов на вакцину против ТБ, не может быть осуществлена без получения огромного количества данных, свидетельствующих о том, что такая новая вакцина является в высокой степени эффективным продуктом. Однако проблема заключается в том, что М. 1Ь является, главным образом, возбудителем инфекций у человека, и животные-модели лишь частично имитируют взаимодействие хозяина с патогеном. Таким образом, окончательные данные, подтверждающие повышенную эффективность новой вакцины ТБ, могут быть получены только в контролируемых испытаниях в условиях практической работы с участием человека. Исходя из этих соображений, многие исследователи пришли к выводу, что ключевой стадией в создании улучшенной вакцины против ТБ является усиление иммуногенности ВСС.

Одним из примеров такой стратегии является повышение способности ВСС индуцировать или активировать Т-клетки для усиления иммунного ответа. Решающая роль СЭ8⁺-Т-клеток, рестриктирован

- 1 012434 ных главным комплексом гистосовместимости класса I, в выработке иммунитета к М. !Ь была продемонстрирована неспособностью мышей, дефицитных по в2-микроглобулину ф2т), к выработке иммунитета против экспериментальной инфекции М. !Ь (Е1уии е! а1., ΡΝΆ8 и8Л. 89(24): 12013-12017; 1992). Решающая роль СЭ8⁺-Т-клеток, рестриктированных комплексом гистосовместимости класса I, была убедительно продемонстрирована неспособностью мышей, дефицитных по в2-микроглобулину (в2т), к выработке иммунитета против экспериментальной инфекции М. !иЬегси1ок1к (Р1упи е! а1., см. выше, 1992). Поскольку эти мутантные мыши не содержат комплекса гистосовместимости класса I, то не могут вырабатываться функциональные СЭ8'-Т-клетки. В отличие от мышей, инфицированных М. !иЬегси1ок1к, β2ιηдефицитные мыши являются толерантными к некоторым инфекционным дозам вакцинного штамма ВСС (Р1упи е! а1., см. выше, 1992; Ьабе1 С.Н., е! а1., Еиг 1 1ттипо1, 25: 377-384; 1995). Кроме того, ВССвакцинация в2т-дефицитных мышей приводит лишь к увеличению продолжительности их жизни после инфицирования М. !иЬегси1ок1к, тогда как ВСС-иммунизованные мыши С57ВЬ/6 являются резистентными к М. !иЬегси1ок1к (Е1упп е! а1., см. выше, 1992).

Такую дифференциальную СЭ8'-Т-клеточную зависимость между М. !иЬегси1ок1к и ВСС можно объяснить следующим образом: антигены М. !иЬегси1ок1к являются более доступными для цитоплазмы, чем антигены ВСС, что обеспечивает более выраженную презентацию молекул комплексом гистосовместимости класса I (Некк апб КаиТтапп, ЕЕМ8 М1сгоЬю1. 1ттипо1 7: 95-103; 1993). Поэтому более эффективный СЭ8-Т-клеточный ответ генерируется М. !иЬегси1ок1к. Эта точка зрения была недавно подтверждена повышенным уровнем презентации нерелевантного антигена, овальбумина, комплексом гистосовместимости класса I при одновременном инфицировании антигенпрезентирующих клеток (АРС) штаммом М. !иЬегси1ок1к, не являющимся ВСС (Маххассаго е! а1., Ргос. N6. Асаб. δα. И8А, Ос!. 15: 93(21): 11786-91; 1996).

Таким образом, антигены М. !Ь поступают в цитоплазму клетки-хозяина быстрее, чем антигены ВСС, что приводит к повышению уровня презентации комплекса гистосовместимости класса I (Некк е! а1., см. выше, 1993) и к усилению СЭ8'-Т-клеточного ответа на М. !Ь. Кроме того, М. !Ь стимулирует антигенспецифические СЭ4⁺-Т-хелперные клетки, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса II, а также цитотоксические СЭ8⁺-Т-клетки, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса I, у мышей и у человека (КаиТтапп, Аппи Неу Iттипо1 11: 129-163; 1993). В более широком смысле это означает, что М. !Ь-инфицированные клетки могут распознаваться цитотоксическими СЭ8'Т-клетками, рестриктированными комплексом гистосовместимости класса I. Учитывая тот факт, что 70% иммунокомпетентных индивидуумов, контактирующих с микроорганизмами М. !Ь, не подвергаются инфицированию, следует отметить, что иммунитет, индуцируемый М. !Ь-инфекцией, в подавляющем большинстве случаев является достаточно эффективным в выработке иммунитета против этого микроорганизма. Поэтому очевидно, что эффективность имеющегося вакцинного штамма ВСС против ТБ может быть увеличена путем повышения способности ВСС индуцировать иммунный ответ посредством продуцирования цитотоксических СЭ8⁺-Т-клеток, рестриктированных комплексом гистосовместимости класса I (КаиТтапп, Еипбатеп!а1 Iттипо1оду, 1997).

Как правило, антигены, экспрессируемые патогенами, которые являются связанными с фагосомой, презентируются, главным образом, молекулами комплекса гистосовместимости класса II на СЭ4'-Тклетках, но они плохо распознаются СЭ8⁺-Т-клетками, которые обычно распознают антигены, презентируемые в ассоциации с молекулами комплекса гистосовместимости класса I (КаиТтапп, см. выше, 1997). В противоположность этому, внутриклеточные бактерии, такие как Ык1епа топосу!одепек (например, АТСС № 13932), которые высвобождаются из фагосомы и реплицируются в цитоплазме клеток-хозяев, являются эффективными в отношении пути презентации антигена комплекса гистосовместимости класса I и выработке СЭ8'-Т-клеточных ответов (Вегсйе е! а1., 1 ^типок 138: 2266-2276; 1987). Такая способность бактерии Ык1епа топосу!одепек высвобождаться из эндосомы недавно была сообщена аттенуированной 8а1топе11а, которая обычно находится в фагосоме, путем введения последовательностей, кодирующих листериолизин (Е1о); при этом было показано, что полученные штаммы способны высвобождаться из эндосомы и являются более эффективными в индуцировании СЭ8⁺-Т-клеточных ответов (В1е1еск1 е! а1., №-Ш.1ге (Ьопбоп), 354: 175-176; 1990; Сеп!ксйеу е! а1., Мес! [ттип 63(10): 4202-4205; 1995; Некк е! а1., Нок! Некропке !о Iпί^асе11и1а^ РаШодепк, 75-90; 1997). Позже сообщалось, что этот подход применим и к ВСС; а поэтому для повышения способности ВСС индуцировать иммунные ответы, рестриктированные комплексом гистосовместимости класса I, были сконструированы штаммы гВСС, секретирующие Ь1о (Некк е! а1., ΡNА8 И8А, 95(9): 5299-5304; 1998). Хотя полученные ранее данные свидетельствуют о том, что штамм гВСС-Ь1о⁺ более эффективен в продуцировании СЭ8'-Т-клеток, однако было установлено, что этот штамм не способен высвобождаться из эндосомы. Таким образом, недостаток такого подхода состоит в том, что гемолитическая функция Ь1о, необходимая для высвобождения из эндосомы, является полностью активной при рН 5,5 и почти не обладает активностью при рН 7,0. Поскольку в микобактериях рН эндосомы поддерживается приблизительно при 7,0, то логично предположить, что Ь1о в штаммах гВСС-Ь1о, как уже давно сообщалось, не является функциональным, поскольку окружение, в котором он экспрессируется, является субоптимальным для достижения соответствующей величи

- 2 012434 ны гемолитической активности (СеоГГгоу с1 а1., 1пГесГ 1ттип 55(7): 1641-1646; 1987). Поэтому при данном подходе эффект усиления иммунитета не может быть реализован до тех пор, пока не будет разработана стратегия, обеспечивающая функционирование Ь1о в ВСС-модифицированных эндосомах.

Таким образом, в предшествующих работах вообще отсутствуют какие-либо подтверждения того, что гВСС обладает повышенной способностью к высвобождению из эндосомы, а значит и того, что он может способствовать индуцированию, например, цитотоксических СЭ8'-Т-клеточных ответов, рестриктированных комплексом гистосовместимости класса I.

Описание сущности изобретения

В своем репрезентативном аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантным штаммам ВСС (гВСС), которые обладают повышенной способностью вырабатывать СЭ8⁺-Т-клеточный иммунный ответ, рестриктированный главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I. Эти новые штаммы гВСС были генетически сконструированы так, чтобы они экспрессировали функциональный эндосомолитический белок, который является биологически активным при значениях рН, близких к нейтральным (например, при рН примерно 6-8 или примерно 6,5-7,5). Поэтому эндосомолитический белок является активным в МусоЬас1спа-содержащих эндосомах, которые обычно имеют внутренний рН, близкий к нейтральному. Активность эндосомолитического белка, продуцируемого штаммом гВСС, приводит к разрушению эндосомы, что позволяет штамму гВСС высвобождаться из эндосомы и поступать в цитоплазму клетки. Таким образом, гВСС является доступным для цитоплазмы и вырабатывает сильный Тклеточный ответ, а в частности сильный МНС-1-рестриктированный цитотоксический СЭ8⁺-Т-клеточный ответ. В одном из вариантов изобретения эндосомолитическим белком, вводимым в гВСС методами генной инженерии, является перфринголизин О (РГоА), происходящий из ОоЧпйннп регГлидеик.

Настоящее изобретение также относится к МусоЬасГейит, которая была генетически сконструирована так, чтобы она экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН. В некоторых вариантах изобретения указанным функциональным эндосомолитическим порообразующим белком является РГоА или мутантный РГоА, кодируемый 8ЕЦ Ш N0: 3 (обозначаемый далее Р£оА_С137р). Экспрессия указанного функционального эндосомолитического белка микобактерией приводит к высвобождению гВСС из эндосом. Генетически сконструированная таким образом МусоЬасГейит может представлять собой аттенуированную микобактерию, такую как ВСС. Настоящее изобретение также относится к МусоЬасГейит, генетически сконструированной для экспрессии и секреции РГоА; и к МусоЬасГейит, генетически сконструированной для экспрессии и секреции Р£оА_С!37р, кодируемого 8ЕЦ Ш N0: 3.

Настоящее изобретение также относится к способу индуцирования высвобождения производного МусоЬасГейит из эндосом. Указанный способ включает стадию генетического конструирования МусоЬасГегшт так, чтобы она содержала, экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, такой как РГоА или РГоЛ_С|₃-₄₎. кодируемый 8ЕЦ Ш N0: 3. В некоторых вариантах изобретения указанной МусоЬасГейит является аттенуированная МусоЬасГейит, такая как ВСС.

Настоящее изобретение также относится к вакцинному препарату, содержащему МусоЬасГейит, которая была генетически сконструирована так, чтобы она экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН. Указанным функциональным эндосомолитическим белком может быть, например, РГоА или РГоА_С1₃₇р, кодируемый 8ЕЦ Ш N0: 3. Экспрессия указанного функционального эндосомолитического фермента микобактерией позволяет этой рекомбинантной МусоЬасГейит высвобождаться из эндосом. В некоторых вариантах изобретения указанной МусоЬасГейит является аттенуированная МусоЬасГейит, такая как ВСС.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1. Карта вектора-самоубийцы рАР102. Каждый из сегментоЕ ДНК имеет следующие обозначения: Ь-Г1апк и В-Г1апк означают левый и правый фланги гена игеС соответственно; рГоА означает ген, кодирующий мутантную форму перфринголизина О (СепЬапк, инвентарный номер ВА000016) с одной аминокислотной заменой в положении 137С(О); ЬР_РАб85В означает ДНК-последовательность, кодирующую пептид лидерной последовательности антигена 85В (т.е. К.у1886с); Р_Ад85А означает промоторную последовательность гена антигена 85А (т.е. Ру3804с); ар11 означает ген аминогликозидфосфотрансферазы (СепЬапк, инвентарный номер Х06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину; 0пЕ означает ориджин репликации рИС (СепЬапк, инвентарный номер АУ234331); В1е означает ген (СепЬапк, инвентарный номер Ь36850), который сообщает данной плазмиде резистентность к зеоцину; 8асВ означает ген (СепЬапк, инвентарный номер Υ489048), кодирующий левансахаразу, которая сообщает бактерии восприимчивость к сахарозе; Р_1кр60 означает промоторную последовательность гена белка теплового шока (т.е. Ру0440); МС8 означает сайты множественного клонирования для указанных рестриктирующих ферментов. При этом следует отметить, что кластер, расположенный между двумя Рас1сайтами, может быть заменен, если это необходимо, другими генами эндосомолитических ферментов.

Фиг. 2А и В. А - генная последовательность РГоА, происходящая из ПокГййшт регГпидеик (8ЕЦ Ш N0: 1); В - последовательность белка РГоА, происходящая из С1о8Гййшт регГпидеик (8ЕЦ Ш N0: 2).

Фиг. 3. Генная последовательность предпочтительного мутанта РГоА_С137р (8ЕЦ Ш N0: 3).

Фиг. 4. Блок-схема основных стадий аллельного обмена.

- 3 012434

Фиг. 5. Рестрикционная карта плазмиды рАЕ102 для аллельного обмена. Дорожка 1: 1 т.п.н. + ДНКледдер. Дорожка 2: плазмида рАЕ102, гидролизованная рестриктирующим ферментом ЕсоК1. Дорожка 3: плазмида рАЕ102, используемая в качестве негидролизованного контроля. Дорожка 4: плазмидный вектор рАЕ100, не содержащий вставки РЕО-кластера и гидролизованный рестриктирующим ферментом ЕсоК1. Дорожка 5: плазмидный вектор рЛЕ100, не содержащий вставки ΡΕΘ-кластера и используемый в качестве негидролизованного контроля. На этой фигуре плазмида рАЕ100 линеаризована рестриктирующим ферментом ЕеоК! с продуцированием, как и предполагалось, одной полосы размером 4,4 т.п.н. Плазмида рАЕ102, гидролизованная рестриктирующим ферментом ЕсоК1, давала, как и предполагалось, две полосы размером 2,3 т.п.н. и 6,0 т.п.н. соответственно.

Фиг. 6. ПЦР-анализ отобранных колоний с генотипом ДшеС::рГоА. ПЦР осуществляли, как описано в разделе Материалы и методы. ПЦР-продукт анализировали с помощью гель-электрофореза в 1,2% агарозном геле. Используемый ДНК-леддер представляет собой 1 т.п.н. плюс ДНК-стандарт и был закуплен у фирмы 1иуйгодеи. Дорожки 1-6: ПЦР для колоний № 105-1 - 105-6 соответственно. Дорожка 7 и дорожка 8: ПЦР для колоний № 142-7 и 142-10 соответственно. Дорожка 9: ПЦР для штамма ВСС Дания 1331.

Фиг. 7. Рост бактерии АЕУ102 и ее чувствительность к канамицину. Меродиплоидные конструкции, полученные из бактерий АЕУ102, ВСС Дания 1331 и РГоА (РГо105 ΜΙ), инокулировали в культуральную среду 7Н9 и рост каждого штамма сравнивали между собой путем измерения оптической плотности при 600 нм в различные периоды времени. Для проведения теста на чувствительность к канамицину, в среду добавляли антибиотик до конечной концентрации 50 мкг/мл, и рост бактерий оценивали, как описано выше. Сокращения в надписях на фигуре означают: С1г1 -контрольная среда, не инокулированная бактериями; +Кап или -Кап: присутствие или отсутствие канамицина в данной среде.

Фиг. 8. Тест на цитотоксичность для АЕУ102 в клетках 1774А.1. Эти клетки инфицировали либо АЕУ102, либо штаммом ВСС Дания 1.331. Через указанное время после инфицирования жизнеспособность клеток определяли, как описано в разделе Материалы и методы путем сравнения с неинфицированным контролем.

Фиг. 9. Тест на выживаемость бактерии АЕУ102 в макрофагах. Клеточные монослои 1774А.1 инфицировали АЕУ102 или штаммом ВСС Дания 1331, и через указанное время после инфицирования, внутриклеточные бактерии подсчитывали как описано в разделе Материалы и методы.

Фиг. 10. Тест на способность АЕУ102 секретировать белок РГо с гемолитической активностью, не зависимой от рН. Культуру АЕУ102 получали, как описано ранее, и супернатант анализировали на его способность лизировать эритроциты при рН 7,0 и 5,5. Гемолизиновую активность определяли, как описано в разделе Материалы и методы.

Фиг. 11Ά-Ό. Схематическое представление результатов примера 3. А, бактерия (зачерненные овалы) проникает в макрофаг (серый овал), находящийся в клетке (шестиугольник), что способствует образованию ранних эндосом; В, ВСС останавливает созревание эндосом и ВСС сохраняется внутри ранней эндосомы; С, РГоА-экспрессирующие бактерии АЕУ102, после их проникновения, сначала находятся в ранних эндосомах, однако затем они начинают секретировать РГоА и покидают эндосому; Ό, РГоАэкспрессирующие бактерии АЕУ102 могут высвобождаться из эндосомы или могут находиться в клетке в свободном виде.

Фиг. 12. Карта вектора рАЕ105, сверхэкспрессирующего антиген. Каждый из сегментов ДНК имеет следующие обозначения: Р_КУз1з₀ означает промоторную последовательность антигена Ву3130с; Р_Аб85В означает промоторную последовательность антигена К.у1886с. Гены в экспрессионном кластере имеют следующие обозначения: Κν0288; Ву1886с и Ву3804с; арй означает ген аминогликозидфосфотрансферазы (СепЬапк, инвентарный номер Х06402), который сообщает плазмиде резистентность к канамицину; ОпЕ означает ориджин репликации рИС (СепЬапк, инвентарный номер АУ234331); 1еиБ означает ген, кодирующий 3-изопропилмалатдегидратазу (т.е. Кл^г2987с); ОпМ означает ориджин репликации в МусоЬаФепиш (СепеЬапк, инвентарный номер М23557).

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к штамму гВСС, способному высвобождаться из эндосом и поступать в цитоплазму инфицированной клетки-хозяина. В результате этого в указанных клетках вырабатывается сильный СБ8⁺-Т-клеточный ответ на гВСС.

гВСС был генетически сконструирован так, чтобы он содержал функциональный эндосомолизин, который экспрессируется и секретируется штаммом гВСС и который опосредует высвобождение этого штамма гВСС из эндосомы. Используемый здесь термин эндосомолизин означает белок, который способен разрушать эндосомную мембрану на уровне, достаточном для высвобождения бактериальной клетки из эндосомы в цитозоль. Используемый здесь термин эндосомолитический относится к белку, обладающему такой разрушающей активностью. Используемый здесь термин эндосомолизис означает процесс разрушения эндосомной мембраны, достаточный для высвобождения бактериальной клетки из эндосомы в цитозоль. Эндосомолитический белок является активным в среде с рН, близким к нейтральному, например, в эндосомах клеток, инфицированных микобактериями, и, таким образом, опосредует высвобождение бактерий в цитоплазму.

- 4 012434

В одном из вариантов изобретения функциональный эндосомолитический белок, который вводят в штаммы гВС’С согласно изобретению, представляет собой ΡίοΑ Скбйтйшш рсгГппдспк или его функциональный вариант. ΡίοΑ представляет собой цитолизин, секретируемый ΟΊοκΙπάίιιιη регГгшдепз и кодируемый геном ρίοΑ (СспсЬапк. инвентарный номер СРЕ0163).

Последовательность этого гена и его белка представлены на фиг. 2А и В, соответственно. ΡίοΑ опосредует высвобождение бактерий из фагосом в ΟΊοκΙπάίιιιη и в В. киЫШк, если он там экспрессируется (ΡοΠπον с1 а1., 1пГсс1 1шшип. 1и1; 60(7): 2710-7; 1992). В отличие от Πο, ΡίοΑ является активным при рН 5,0 и при рН 7,0, а поэтому он сохраняет свою активность в цитозоле и вызывает повреждение инфицированных клеток-хозяев ^Пму с1 а1., см. выше, 1992). Таким образом, если в Ь. тοηοсуίοдеηе8 вместо Μο экспрессируется ΡίοΑ, то это позволяет данному штамму высвобождаться из фагосом (ίοποκ и Ροτίгюу, 1пГсс1 1шшип. Эес; 62(12): 5608-13; 1994). Однако экспрессия этого белка также приводит к повреждению клеток-хозяев. Πο обладает свойствами, аналогичными свойствам ΡίοΑ, за исключением того, что Πο является оптимально активным при рН 5,5 и обнаруживает незначительную активность при рН 7,0. Таким образом, Μο будет опосредовать высвобождение из эндосомы после того, как рН эндосомы снизится до 5,5, но он не будет воздействовать на клетку-хозяина, поскольку Μο не является активным при рН цитозоля, который близок к нейтральному.

ΡοΠπο\· и др. также продемонстрировали, что если ΡίοΑ экспрессируется в Ь. тοηοсуίοдеηеκ в мутантной форме с одной аминокислотной заменой, то такая мутантная форма ΡίοΑ больше не является токсичной для клеток-хозяев, но все же обладает способностью опосредовать высвобождение бактерии из вакуоли и стимулировать ее внутриклеточный рост (ΡοΠπο\· с1 а1., см. выше, 1992). Конкретный штамм ΌΡ-12791, имеющий мутацию, а именно, замену О1п137 на О1п137 в Ρίο (т.е. ΡίοΑ^^), способен высвобождаться из фагосомы по механизму, аналогичному механизму высвобождения бактерии дикого типа, но он не оказывает токсического действия на клетки-хозяева. Кроме того, ΡΓοΑ,ιβ-χ является активным при рН 5,6 и рН 7,4 и имеет меньшее время полужизни в цитозоле. Генная последовательность ΡίοΑ_Οι₃₇ρ представлена на фиг. 3 (8ЕО ΙΌ N0: 3).

Экспрессия ΡίοΑ способствует высвобождению бактерии из эндосом, поскольку порообразующая активность ΡίοΑ приводит к повреждению мембраны эукариотической клетки. ΡίοΑ образует поры в холестеринсодержащих мембранах посредством спонтанного встраивания его доменов в бислой. Это происходит посредством связывания с холестерином, который действует как рецептор. После связывания токсин образует пограничную мономер-мономерную область (которая необходима для сборки олигомера), затем подвергается олигомеризации и распределяется по мембране при изменении его структуры, которое зависит от связывания с мембраной. Образование мембраносвязанных олигомеров приводит к повреждению мембраны и, в конечном счете, к лизису клетки (Вашасйапйгап с1 а1., №1Шге 81гис1иге апй Мцкс^аг Вюкду, 11(8), 697-705 (1995)). ΡΓοΛ₄|₃,-₇₎ обладает способностью опосредовать лизис вакуоли аналогичным способом.

Предпочтительный ΡίοΑ_Ο137ρ обладает ограниченной активностью в цитоплазме инфицированной клетки-хозяина, что обусловлено его чувствительностью к протеазам хозяина.

В одном из вариантов изобретения указанный функциональный эндосомолитический фермент, который экспрессируется штаммом гВСО, представляет собой ΡίοΑ, происходящий или выделенный из С. регГгшдепз. Однако для специалиста в данной области очевидно, что в настоящем изобретении могут быть использованы и другие эндосомолитические белки, которые являются активными при нейтральном рН или при рН, близком к нейтральному. Примерами таких эндосомолитических белков являются, но не ограничиваются ими, пневмолизин (продуцируемый δίτορίοοοοΐΐπδ рηеитοη^ае), стрептолизин О (продуцируемый δίτορίοοοοοπδ ρуοдеηе8), церолизин (продуцируемый Васйиз сегеиз), α-гемолизин (продуцируемый 8ίаρйу1οсοсси8 аигеиз) и т.п. и их функциональные варианты.

Используемые здесь термины функциональный эндосомолитический белок или функциональная форма белка (или генного продукта гена, который является функционально экспрессируемым) означает, что форма белка, продуцируемого бактерией гВСО, имеет характерную величину активности, присущей нативному или природному белку (дикого типа), присутствующему, как известно, в нативном организме. Величина активности функциональной формы данного белка, продуцируемого штаммом гВСО, составляет, в основном, по меньшей мере примерно 50% от обычной активности белка дикого типа, как показал анализ, проводимый в стандартных условиях, известных специалистам. Величина активности белка может быть определена путем измерения любого физически наблюдаемого параметра, такого как уровень связывания с лигандом, или продуцирования эффекта, такого как высвобождение гВСО из эндосом. При этом предпочтительно, чтобы величина активности составляла по меньшей мере примерно 50, 60, 70, 80, 90, 100% или более от стандартной величины активности белка дикого типа, как определено в анализе, проводимом в стандартных условиях, известных специалистам.

Под термином функциональный вариант белка авторы настоящего изобретения подразумевают полипептид, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере примерно на 70% гомологична аминокислотной последовательности эталонного белка дикого типа, и который сохраняет величину функциональной активности (как описано выше) белка дикого типа. Аминокислотную последовательность эталонного белка дикого типа обычно используют в качестве исходного материала для осуще

- 5 012434 ствления мутаций и альтераций, проводимых методами генной инженерии.

Предпочтительно функциональным вариантом является полипептид, аминокислотная последовательность которого примерно на 75, 80, 85, 90, 95% или более идентична эталонной аминокислотной последовательности. Такими функциональными вариантами являются, но не ограничиваются ими, полипептидные последовательности, в которых может быть сделана одна или несколько консервативных аминокислотных замен. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны специалистам, и такими заменами являются, например, замена одной положительно заряженной аминокислоты другой такой же аминокислотой, одной отрицательно заряженной аминокислоты другой такой же аминокислотой, одной гидрофобной аминокислоты другой такой же аминокислотой, и т.п. Варианты полипептидов могут иметь одну или несколько таких замен при условии, что полученный вариант полипептида сохраняет величину функциональной активности, определенную в настоящем изобретении. Термин функциональные варианты также охватывает и другие модификации, которые могут быть внесены в первичную последовательность представляющего интерес полипептида. Примерами таких модификаций являются, но не ограничиваются ими, делеции и добавления аминокислот или замены аминокислот (например, химические модификации, такие как сульфирование, дезамидирование, фосфорилирование, гидроксилирование и т.п.). Такие модификации могут быть осуществлены в эталонной аминокислотной последовательности методами генной инженерии, либо они могут быть осуществлены путем посттрансляционных модификаций белка, либо теми и другими методами. Кроме того, функциональные варианты фермента могут образовываться в результате таких природных мутаций, которые обычно происходят между аналогичными белками, обладающих одинаковой или подобной активностью и выделенных из различных штаммов одного вида или различных видов, или из различных отдельных организмов одного и того же вида. Белки, происходящие от таких природных вариантов, также могут служить в качестве эталонного белка, а аминокислотная последовательность такого природного варианта может служить в качестве эталонной последовательности. В любом случае, все указанные функциональные варианты эталонного белка сохраняют величину активности белка, как описано в настоящем изобретении.

Описанные здесь гомологичные и идентичные последовательности не включают гетерологичные аминокислотные последовательности, которые происходят от других источников, не являющихся эталонными последовательностями, и которые присоединены к полипептидной последовательности белка, используемого в различных других целях, или включены в эту полипептидную последовательность. Примерами таких гетерологичных последовательностей являются, но не ограничиваются ими, последовательности, облегчающие выделение полипептидов (например, гистидиновые метки), последовательности, облегчающие секрецию или локализацию полипептида в клетке (например, различные лидерные или нацеливающие последовательности), и последовательности, кодирующие сайты гликозилирования (последовательности гликозилирования), и т.п.

В любом случае, указанный функциональный вариант до определенной степени сохраняет величину активности белка, вариантом которого он является, т. е. величина активности этого функционального варианта составляет по меньшей мере примерно 50%, а предпочтительно примерно на 60, 70, 80, 90, 100% или более от величины активности белка, вариантом которого он является, как может быть определено в анализе, проводимом в стандартных условиях, известных специалистам.

Кроме того, настоящее изобретение также включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белки и функциональные варианты белков, используемых в настоящем изобретении. Последовательностями нуклеиновой кислоты могут быть дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды или их любые модифицированные формы, и такие последовательности могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Последовательностями нуклеиновой кислоты согласно изобретению являются любые последовательности, перечисленные в настоящем описании, а также любые их варианты. Так, например, варианты нуклеиновых кислот не могут быть идентичны перечисленным последовательностям, но они могут кодировать идентичную аминокислотную последовательность вследствие избыточности генетического кода. Альтернативно, в последовательности согласно изобретению могут быть внесены некоторые модификации (например, замены, делеции или добавления), которые приводят к изменениям в кодируемой аминокислотной последовательности, при условии, что такая кодируемая аминокислотная последовательность является функциональным вариантом эталонной аминокислотной последовательности, описанной выше. Примерами таких модификаций являются, но не ограничиваются ими, замены, которые приводят к консервативным аминокислотным заменам в ферменте, и замены, которые приводят к неконсервативным аминокислотным заменам, или делеции или добавления в аминокислотных последовательностях. Такие модификации могут быть сделаны в любых целях, например, для введения посттрансляционных модификаций ферментов; для повышения или снижения растворимости; для предотвращения образования или введения стерических затруднений в транслированном полипептиде и т.п. В общих чертах, варианты последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению по меньшей мере примерно на 50%, а предпочтительно примерно на 60, 70, 80, 90, 95 или 100% гомологичны эталонным последовательностям, как было определено в соответствии с процедурами сравнения, хорошо известными специалистам. Такие варианты могут быть охарактеризованы по их способности связываться с последовательностями, используемыми в настоящем изобретении, в условиях высокой жесткости. Анализы на

- 6 012434 связывание в условиях высокой жесткости хорошо известны специалистам и могут быть легко адаптированы для анализа возможных вариантов последовательностей согласно изобретению.

Описанные здесь гомологичные последовательности не включают последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные аминокислотные последовательности, которые происходят из других источников, не являющихся эталонными аминокислотными последовательностями, и которые присоединены к полипептидной последовательности белка, используемого в различных других целях, либо включены в эту полипептидную последовательность. Так, например, такие последовательности нуклеиновой кислоты могут кодировать гетерологичные аминокислотные последовательности, включая, но не ограничиваясь ими, последовательности, облегчающие выделение полипептидов (например, гистидиновые метки), последовательности, облегчающие секрецию или локализацию полипептида в клетке (например, различные лидерные или нацеливающие последовательности), и последовательности, кодирующие сайты гликозилирования (последовательности гликозилирования), и т.п.

Другие варианты последовательностей нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которые входят в объем настоящего изобретения, представляют собой последовательности, которые были модифицированы для удобства осуществления или усовершенствования методов генетического конструирования последовательностей нуклеиновой кислоты или экспрессии кодируемых ими аминокислотных последовательностей. В общих чертах, такие модификации не влияют на последовательность полипептида, которая, в конечном счете, транслируется из последовательности нуклеиновой кислоты, или полипептида, который пока еще удовлетворяет вышеуказанным критериям для вышеуказанного функционального варианта. Примерами модификаций такого типа являются, но не ограничиваются ими, включение подходящих сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз в последовательность нуклеиновой кислоты для облегчения модификации этой последовательности (например, для встраивания последовательности в вектор); инсерция, делеция или другая модификация в последовательности или в последовательностях, участвующих в экспрессии аминокислотной последовательности (например, включение любого из различных промоторных и/или энхансерных последовательностей, стоп-сигналов, суперпромоторов, индуцибельных промоторов и различных других последовательностей, которые модифицируют экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты); и включение последовательностей, облегчающих взаимодействие вектора с нуклеиновой кислотой организма-хозяина; и т.п.

Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут быть химически модифицированы или могут включать нетрадиционные основания, введенные в различных целях, хорошо известных специалистам, например, для обеспечения стабильности нуклеиновой кислоты или для придания ей нужной стерической конформации.

Под термином активный при нейтральном рН и активный при рН примерно 7,0 авторы настоящего изобретения подразумевают, что данный фермент является активным при рН в пределах примерно от 6,0 до 8,0, а предпочтительно в пределах примерно от 6,5 до 7,5.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантной бактерии МусоЬас1епа. В предпочтительном варианте изобретения МусоЬас1епа представляют собой аттенуированные бактерии, например ВСО. Однако специалистам в данной области известно, что в настоящем изобретении могут быть также использованы и другие аттенуированные и неаттенуированные МусоЬас!епа. Примерами МусоЬас!ейа других типов являются, но не ограничиваются ими, штамм М. !иЬегси1о818 СЭС 1551 (см., например, ОпГПШ е! а1., Ат. 1. Веерй. Сгй. Саге Мей. Аид; 152(2): 808; 1995), штамм М. !иЬегси1о818 Беинга (Боойпдеп е! а1., 1995), штамм М. !иЬегси1о818 Н37Ка (АТСС № 25177), штамм М. !иЬегси1о818 Н37Кч (АТСС № 25618), М. Ьоу18 (АТСС № 19211 и 27291), М. Гойийит (АТСС № 15073), М. етедтаИе (АТСС № 12051 и 12549), М. т!гасе11и1аге (АТСС № 35772 и 13209), М. Капелей (АТСС № 21982 и 35775) М. ачшт (АТСС № 19421 и 25291), М. даШпагит (АТСС № 19711), М. чассае (АТСС № 15483 и 23024), М. 1ергае (АТСС №), М. талпагит (АТСС № 11566 и 11567) и М. писгоЮ (АТСС № 11152).

Примерами аттенуированных штаммов МусоЬас!ейит являются, но не ограничиваются ими, штамм М. ШЬегси1о818, который является ауксотрофным по пантотенату (БатЬаийатиййу, Ыа!. Мей. 2002 8(10): 1171; 2002), мутантный штамм М. !иЬегси1о818 гроУ (СоШпз е! а1., Ргос. №111. Асай. Бс1. ИБА. 92(17): 8036; 1995), штамм М. !иЬегси1о818, который является ауксотрофным по лейцину (Нопйа1из е! а1., 1пГес!. 1ттип. 68(5): 2888; 2000), штамм ВСО Дания (АТСС № 35733), штамм ВСО Япония (АТСС № 35737), штамм ВСО Чикаго (АТСС № 27289), штамм ВСО Копенгаген (АТСС № 27290), штамм ВСО Пастер (АТСС № 35734), штамм ВСО Глазго (АТСС № 35741), штамм ВСО Коннахт (АТСС № 35745), штамм ВСО Монреаль (АТСС № 35746).

В другом варианте изобретения аттенуированные штаммы МусоЬас1епит модифицируют для усиления апоптоза, причем указанные штаммы индуцируют сильные клеточные иммунные ответы.

Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Фактически, механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к индуцированию сильного клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием (Неа!й е! а1., 1ттипо1 Кеч 199; 2004; Оа11исс1 е! а1., №1иге Вю!есйпо1оду. 5: 1249; 1999; А1Ьей е! а1., Ыа!иге 392: 86; 1998). Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, который приводит к усилению антигенспеци

- 7 012434 фического клеточно-опосредуемого иммунитета. Апоптоз, опосредуемый каспазой 8, приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточного иммунитета (8Непбап е! а1., 8с1еиее 277: 818; 1997).

Поэтому в другом своем варианте настоящее изобретение относится к аттенуированным штаммам МусоЬас1епит. которые обладают улучшенными проапоптотическими свойствами, такими как, но не ограничивающимися ими, кесА1-секреция 8обА, не содержащего лидерного пептида, происходящего от 8а1тоие11а епЮпбШк (бепЬапк, инвентарный номер 1068147), ЕксйепсЫа со11 (бепЬапк, инвентарный номер 1250070) или 81пде11а Пехпеп (бепЬапк, инвентарный номер 1079977) или, альтернативно, продуцирование белка 8обА, который в природе является несекретируемым белком, такой как 8обА, происходящий из Ь1к!епа топосу!одепек ЕбЭ-е (беиЬаик, инвентарный номер 986791). Такие аттенуированные штаммы МусоЬас!етшт не продуцируют внеклеточный 8об, а поэтому они не подавляют иммунные ответы у хозяина, но при этом экспрессируют внутриклеточный 8об, что способствует выживанию указанной МусоЬас!етшт (Еб^атбк е! а1., Ат. 1. Яекрй. Стй. Саге Меб. 164(12): 2213-9; 2001). Альтернативно, аттенуированные штаммы МусоЬас!етшт, обладающие улучшенными проапоптотическими свойствами, несут инактивированный ген Ру3238с.

Альтернативно, экспрессия 8орЕ 8а1тоие11а (беиЬаик, инвентарный номер ААЭ54239, ААВ51429 или ААС02071) или каспазы-8 (беиЬаик, инвентарный номер ААЭ24962 или ААН06737) в цитоплазме клеток-хозяев аттенуированной МусоЬас!етшт согласно изобретению является эффективным средством индуцирования запрограммированной клеточной гибели в присутствии антигенов, экспрессируемых указанной аттенуированной МусоЬас!етшт, продуцирующей высокие уровни антигенспецифического клеточного иммунного ответа.

Рецептор-5 гибели клеток (ΌΚ.-5), также известный как ΤΡΛΙΕ-Ρ2 (рецептор 2 ТКА1Ь) или ΤΝΕΕ8Р-10В (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10В), также индуцирует апоптоз, опосредуемый каспазой 8 (8йепбаи е! а1., 1997). Индуцируемый реовирусом апоптоз опосредуется ТКА1Е-ЭК5 и приводит к последующему выведению вируса (С1агке, 1. Упо1 74: 8135, 2000). Экспрессия ΌΚ.-5, такого как человеческий ΌΚ.-5 (беиЬаик, инвентарный номер ВАА33723), гомолог ΌΚ.-5 герпесвируса-6 (ННУ-6) (беиЬаик, инвентарный номер САА58423) и т.п. аттенуированным штаммом МусоЬас!етшт согласно изобретению обеспечивает сильное стимулирующее действие, направленное на индуцирование антигенспецифического клеточного иммунного ответа против М. 1Ь-антигенов.

Кроме того, антигенпрезентирующие клетки-хозяева (такие как макрофаги и дендритные клетки) могут быть также индуцированы в целях стимуляции апоптоза посредством присоединения Рак, который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов (Сйайетдооп е! а1., №11. Вю!есйпо1. 18: 974; 2000). Таким образом, аттенуированный штамм МусоЬас!етшт, экспрессирующий гибридный белок, включающий Рак или цитоплазматический домен Рак/эктодомен СЭ4, будет индуцировать апоптоз и усиленные антигенспецифические клеточные иммунные ответы.

В целом, аттенуированные штаммы МусоЬас!етшт, которые стимулируют индуцирование апоптоза, являются эффективным средством индуцирования клеточных ответов, приводящих к иммуноопосредуемой деструкции М. 1Ь-инфицированных клеток с последующей элиминацией, снижением уровня или предупреждением М. 1Ь-инфекции.

В еще одном варианте изобретения двухкомпонентная вакцина против ТБ может включать аттенуированные штаммы МусоЬас!етшт, которые сверхэкспрессируют по меньшей мере один антиген МусоЬас!етшт, включая, но не ограничиваясь ими, Εν0125, Εν0203, Εν0287, Εν0288, Εν0603, Εν1196, Εν1223, К.у1271с, Ру1733с, Εν1738, Εν 1804с, Εν1886, Ку2031с, Εν2032, Εν2253, Εν2290, Ку2389с, Ру2626с, Ру2627с, Ρν2779ο Εν2873, Εν2875, Ру3017с, Εν3407, Ру3804с, Εν3810 или Εν3841. Альтернативно, сверхэкспрессируемые антигены МусоЬас!етшт могут присутствовать в форме гибридного белка, состоящего из одного или нескольких указанных гибридных белков МусоЬас!етшт, таких как М(Ь72Г (Вгапб! е! а1., 1пГес!. 1ттип., 72: 6622-6632; 2004; 8ке1ку е! а1., 1. 1ттипо1., 172: 7618-7628; 2004), НуЬпб-1 (О1кеп е! а1., 1пГес!, 1ттип., 72: 6148-6150; 2004; Ьапдеттапк е! а1., Уассше, 23: 2740-2750; 2005), Нуνас-4 (Э1е1пс11 е! а1., 1. 1ттипо1., 174: 6332-6339; 2005) и т.п.

Настоящее изобретение может быть использовано в целях разработки вакцин против патогенных видов МусоЬас!етшт и в целях разработки вакцинных векторов для доставки антигена. Вектор МусоЬас!етшт определен в настоящем описании как любой штамм МусоЬас!етшт, сконструированный в целях экспрессии по меньшей мере одной нуклеотидной последовательности-пассажира (обозначаемой далее ΡΝ8), состоящей из ДНК или РНК и кодирующей любую комбинацию антигенов, иммунорегуляторных факторов или адъювантов, описанных ниже. ΡΝ8 может быть встроена в хромосому или она может быть использована как часть экспрессионного вектора с применением композиций и методов, хорошо известных специалистам (1асоЬк е! а1., №Ш.1ге 327: 532-535; 1987; Ват1ейа е! а1., Рек МютоЬю1. 141: 931939; 1990; Ка^айата е! а1., С1ш 1ттипо1. 105: 326-331; 2002; Ь1т е! а1., А1Э8 Рек. Нит. Кейоуйикек. 13: 1573-1581;1997; СНи)оН е! а1., Уассше, 20: 797-804; 2001; Ма!кито!о е! а1., Уассше, 14: 54-60; 1996; Наеке1еег е! а1., Мо1. Вюсйет. Рагакйо1., 57: 117-126; 1993).

В соответствии с настоящим изобретением вектор МусоЬас!етшт может содержать ΡΝ8, кодирующий иммуноген, которым может быть либо чужеродный иммуноген, происходящий от вирусных, бакте

- 8 012434 риальных и паразитарных патогенов, либо эндогенный иммуноген, такой как, но не ограничивающийся им, аутоиммунный антиген или опухолевый антиген. Такими иммуногенами могут быть, например, полноразмерный нативный белок, химерные гибриды, состоящие из чужеродного иммуногена и эндогенного белка или миметика, или фрагмент или фрагменты иммуногена, происходящего от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов.

Используемый здесь термин чужеродный иммуноген означает белок или его фрагмент, которые обычно не экспрессируются в клетках или в тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, вирусные белки, бактериальные белки, паразитарные белки, цитокины, хемокины, иммунорегуляторные агенты или терапевтические средства.

Термин эндогенный иммуноген означает белок или его часть, обычно присутствующие в клетках или тканях животного-реципиента, такие как, но не ограничивающиеся ими, эндогенный клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство. Альтернативно или дополнительно, такой иммуноген может кодироваться синтетическим геном и может быть сконструирован стандартными методами рекомбинантных ДНК, известными специалистам.

Чужеродным иммуногеном может быть любая молекула, которая экспрессируется любым вирусным, бактериальным или паразитарным патогеном, до или в процессе его инвазии или колонизации организма животного-хозяина или репликации в этом организме; при этом вектор МусоЬас!егшш может экспрессировать иммуногены или их части, происходящие от вирусных, бактериальных и паразитарных патогенов. Такие патогены могут быть инфекционными для человека, домашних животных или диких животных.

Вирусными патогенами, от которых происходят вирусные антигены, являются, но не ограничиваются ими, ортомиксовирусы, такие как вирус гриппа (Тахопоту ГО: 59771); ретровирусы, такие как К8У, НТЬУ-1 (Таxопоту ГО: 39015) и НТЬУ-ΙΙ (Таxопоту ГО: 11909); герпесвирусы, такие как ЕВУ (Тахопоту ГО: 10295); СМУ (Тахопоту ГО: 10358) или вирус простого герпеса (АТСС № УК-1487); лентивирусы, такие как ВИЧ-1 (Тахопоту ГО: 12721) и ВИЧ-2 (Тахопоту ГО: 11709); рабдовирусы, такие как вирус бешенства; пикорновирусы, такие как полиовирус (Тахо по ту ГО: 12080); поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы (Тахопоту ГО: 10245); ротавирус (Тахопоту ГО: 10912); и парвовирусы, такие как аденоассоциированный вирус 1 (Тахопоту ГО: 85106).

Примерами вирусных антигенов могут служить антигены группы, включающей, но не ограничивающейся ими, антигены вируса иммунодефицита человека №Г (№Шопа1 1пх!1!и!е о! АНсгду апб 1пГес!юих 01хеахе Н1У Керохйогу Са1. № 183; СепЬапк, инвентарный номер АТ238278), Сад, Епу (№Шопа1 1пх!1!и!е оГ А11егду апб 1пГес!юих 01хеахе Н1У Керохйогу Са1. № 2433; СепЬапк, инвентарный номер И39362), Та! (Ыа!юпа1 1пхй!и!е оГ А11егду апб 1пГесйоих 01хеахе Н1У Керохйогу Са!. № 827; СепЬапк, инвентарный номер М13137), мутантные производные Та!, такие как Та!-Д31-45 (Адтеа1е е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8ск ш ргехх. 1и1 8'¹'; 2002), Кеу (Ыа!юпа1 1пх!1!и!е оГ А11егду апб 1пГес!юих 01хеахе Н1У Керохйогу Са!. № 2088; СепЬапк, инвентарный номер Б14572) и Ро1 (Ыа!юпа1 1пх!1!и!е оГ А11егду апб 1пГес!1оих ОБеахе Н1У КерохС !огу Са!. № 238; СепЬапк, инвентарный номер А1237568), и Т- и В-клеточные эпитопы др120 (Напке апб МсМюйае1, АГО8 1шшипо1 Ье!!., 66: 177; 1999; Напке, е! а1., Уассше, 17: 589; 1999; Ра1кег е! а1., 1. 1шшипо1., 142: 3612-3619; 1989), химерные производные Епу и др120 ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, гибриды белков др120 и СЭ4 (Рои!х е! а1., 1. У1го1. 2000, 74: 11427-11436; 2000); усеченные или модифицированные производные епу ВИЧ-1, такие как, но не ограничивающиеся ими, др140 (8!аша!ох е! а1. 1. У1го1., 72: 9656-9667; 1998), или производные Епу и/или др140 ВИЧ-1 (Вш1еу, е! а1. 1. У1го1., 76: 2606-2616; 2002; 8апбегх, е! а1. 1. Уио1., 74: 5091-5100; 2000; Вш1еу, е! а1. 1. Упо1., 74: 627-643; 2000), поверхностный антиген вируса гепатита В (СепЬапк, инвентарный номер АР043578; XVи е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск, И8А, 86: 4726-4730; 1989); ротавирусные антигены, такие как УР4 (СепЬапк, инвентарный номер А1293721; Маскоте е! а1., Ргос. Νι!1. Асаб. 8ск, И8А, 87: 518-522; 1990) и УР7 (СепВапк, инвентарный номер АУ003871; Сгееп е! а1., 1. У1го1., 62: 1819-1823; 1988), антигены вируса гриппа, такие как гемаглютинин (СепВапк, инвентарный номер А1404 627; Рег!тег и КоЬшхоп, Уио1оду, 257: 406; 1999); нуклеопротеин (СепВапк, инвентарный номер А128 9872; Ып е! а1., Ргос. №1!1. Асаб. 8ск, 97: 9654-9658; 2000), антигены вируса простого герпеса, такие как тимидинкиназа (СепЬапк, инвентарный номер АВ047378; ΧνΐιΗΕν е! а1., №те Сепегайоп Уассшех, 825-854; 2004).

Бактериальными патогенами, от которых происходят бактериальные антигены, являются, но не ограничиваются ими, МусоЬас!егшш хрр., Не11соЬас!ег ру1оп. 8а1топе11а хрр., 8Шде11а хрр., Е. сой. К1ске!!х1а хрр., Ых!епа хрр., ЬедюпеПа рпеитошае, Рхеиботопах хрр., УШгю хрр. и ВогеШа ЬигдбогГеп.

Примерами протективных антигенов бактериальных патогенов являются соматические антигены энтеротоксигенных бактерий Е. сой, такие как антиген фимбрий СРА/Ι (Уатато!о е! а1., 1пГес!. 1шшип., 50: 925-928; 1985) и нетоксическая В-субъединица термолабильного токсина (К11рх!еш е! а1., 1пГес!. 1штип., 40: 888-893; 1983); пертактин Вогбе!е11а рег!ихх1х (КоЬег!х е! а1., Уасс, 10: 43-48; 1992), аденилатциклаза-гемолизин В. рег!ихх1х (Сшхо е! а1., Мюго. РаШ., 11: 423-431; 1991), фрагмент С столбнячного токсина С1ох!пбшш !е!аш (РаитееаШег е! а1., 1пГес!. 1шшип., 58: 1323-1326; 1990), ОхрА ВогеШа ЬигдбогГей (81капб, е! а1., Реб1а!псх, 108: 123-128; 2001; \VаΗ^с11. е! а1., 1пГес!. 1шшип., 69: 2130-2136; 2001), протективные паракристаллические поверхностные белки К1ске!!х1а рготеахекй и К1ске!!х1а !урШ (Саг1, е! а1.,

- 9 012434

Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, 87: 8237-8241; 1990), листериолизин (также известный, как Ь1о и Н1у) и/или супероксид-дисмутаза (также известная, как 8ΘΌ и р60) Ык1ег1а топосуЮдспсх (Некк, 1., е1 а1., 1пГес1. 1ттип. 65: 1286-92; 1997; Некк, 1., е1 а1., Ргос. №аб. Асаб. 8с1. 93: 1458-1463; 1996; Вои\\'ег. е1 а1., 1. Ехр. Меб. 175: 1467-71; 1992), уреаза Не11соЬас1ег ру1оп (боте/ЮиаПе, е1 а1., Уассше 16, 460-71; 1998; Сопйеку-Тйеи1а7, е1 а1., 1пГес11оп & 1ттипйу 66, 581-6; 1998) и связывающийся с рецептором домен летального токсина и/или протективный антиген ВасШик ап1йгах (Рисе, е1 а1., 1пГес1. 1ттип. 69, 4509-4515; 2001).

Паразитарными патогенами, от которых происходят паразитарные антигены, являются, но не ограничиваются ими, Р1а§тобшт крр., такие как Р1а§тобшт ГаЮрагит (АТСС № 30145); Тгурапокота крр., такие как Тгурапокота сги/ί (АТСС № 50797); С1агб1а крр., такие как С1агб1а йИекРпайк (АТСС № 30888Ό); Воорйбик крр., ВаЬеща крр., такие как ВаЬеыа пйсгоб (АТСС № 30221); Еп1атоеЬа крр., такие как Еп1атоеЬа й1к1о1убса (АТСС № 30015); Еппепа крр., такие как Еппепа тах1та (АТСС № 40357); Ье^йташа крр. (Тахопоту Ш: 38568); 8сЙ1к1окошс крр., Вгид1а крр., Еакшба крр., ОноГйапа крр., ^исйегепа крр. и Опсйосегеа крр.

Примерами протективных антигенов паразитарных патогенов являются антигены круглого спорозоита Р1а8тобшт крр. (8абоГГ е1 а1., 8с1епсе, 240: 336-337; 1988), такие как антиген круглого спорозоита Р. Ьегдеги или антиген круглого спорозоита Р. Га1с1рагит; поверхностный антиген мерозоита Рйактобшт крр. (8ре1х1ег е1 а1., 1п1. 1. Рер1. Рго1. Кек., 43: 351-358; 1994); галактозоспецифический лектин Еп1атоеЬа Ык1о1уйса (Мапп е1 а1., Ргос. №аб. Асаб. 8сЕ, И8А, 88: 3248-3252; 1991), др63 БеЫппаша крр. (Кикке11 е1 а1., 1. 1ттипо1., 140: 1274-1278; 1988; Хи апб Ыете, 1ттипо1., 84: 173-176; 1995), др46 БеЫппаша та)ог (Напбтап е1 а1., Уассше, 18: 3011-3017; 2000), парамиозин Вгид1а та1ау1 (Ь1 е1 а1., Мо1. Вюсйет. Рагак11о1., 49: 315-323; 1991), триозофосфатизомераза 8сЫк1окота тапкош (8йоетакег е1 а1., Ргос. №аб. Асаб. 8сЕ, И8А, 89: 1842-1846; 1992); секретируемый глобин-подобный белок Тг1сйок1гопду1ик со1иЬпГогт1к (Егепке1 е1 а1., Мо1. Вюсйет. РагакйоЕ, 50: 27-36; 1992); глутатион-8-трансфераза Егаксю1а йерайса (НШуег е1 а1., Ехр. РагакйоЕ, 75: 176-186; 1992), 8сЫк1окота Ьоу1к и 8. )арошсшп (ВакЫг е1 а1., Тгор. Сеод. Меб., 46: 255-258; 1994); и КЬН 8сЫк1окота Ьоу1к и 8. )арошсшп (ВакЫг е1 а1., см. выше, 1994).

Как было упомянуто выше, вектор МусоЬас1егшш может содержать Р№8, кодирующий эндогенный иммуноген, которым может быть любой клеточный белок, иммунорегуляторный агент или терапевтическое средство, или их части, которые могут экспрессироваться в клетке реципиента, включая, но не ограничиваясь ими, опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов и аутоиммунные иммуногены или их фрагменты и производные. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением вектор МусоЬаМегшт может содержать Р№8, кодирующий опухолевые иммуногены, иммуногены трансплантатов или аутоиммунные иммуногены или их части или производные. Альтернативно, вектор МусоЬас1епит может содержать синтетический Р№8 (описанный выше), кодирующий опухолеспецифические антигены, антигены трансплантатов или аутоиммунные антигены или их части.

Примерами опухолеспецифических антигенов являются специфический для предстательной железы антиген (Сайико е1 а1., Нитап Ра1йо1., 26: 123-126; 1995), ТАС-72 и СЕА (Сиабадп е1 а1., 1п1. 1. Вю1. Магкегк, 9: 53-60; 1994), МАСЕ-1 и тирозиназа (Соийе е1 а1., 1. Iш^пипоΐйе^а., 14: 104-109; 1993). Недавно было обнаружено, что у мышей, которые были иммунизованы незлокачественными клетками, экспрессирующими опухолевый антиген, наблюдается вакцинный эффект, а также вырабатывается иммунный ответ, способствующий выведению злокачественных опухолевых клеток, несущих тот же самый антиген (Коерреп е1 а1., Апа1. Ν.Υ. Асаб. 8сЕ, 690: 244-255; 1993).

Примером антигенов трансплантатов является молекула СЭ3 на Т-клетках (А1едге е1 а1., Эфек!. Э1к. 8с1., 40: 58-64; 1995). Было показано, что обработка антителом против рецептора СЭ3 способствует быстрому выведению циркулирующих Т-клеток и предотвращению клеточно-опосредуемого отторжения трансплантата (А1едге е1 а1., см. выше, 1995).

Примером аутоиммунных антигенов является β-цепь 1А8 (Торйат е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8сЕ, И8А, 91: 8005-8009; 1994). Было продемонстрировано, что вакцинация мышей пептидом β-цепи 1А8, состоящим из 18 аминокислот, вызывает у мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом выработку иммунитета к указанному заболеванию и подавление такого заболевания (Торйат е1 а1., см. выше, 1994).

Векторы Му^Ьа^егшт, экспрессирующие адъювант.

Могут быть сконструированы векторы Мусо^йсйиш, содержащие Р№8, кодирующий иммуноген и адъювант, и такие векторы могут быть использованы для выработки усиленного иммунного ответа у хозяина на указанный вектор и Р№8-кодируемый иммуноген. Альтернативно, для усиления ответов у хозяина на иммуногены, кодируемые партнером вектора Му^Ьа^егшт, могут быть сконструированы векторы Му^Ьа^егшт, содержащие Р№8, кодирующий адъювант, которые вводят в комбинации с другими векторами МусоЪас1еиит, содержащими Р№8, кодирующий по меньшей мере один иммуноген.

Выбор какого-либо конкретного адъюванта, кодируемого Р№8 в указанном векторе МусоЬасΐейиш, не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими адъювантами могут быть субъединица А холерного токсина (т.е. С1хА; СепВапк, инвентарный номер Х00171, АЕ175708, Ό30053,

- 10 012434

Ό30052) или ее части и/или мутантные производные (например, домен А1 субъединицы А С!х (т.е. С!хА1; СепБапк, инвентарный номер К02679)), происходящие от любого классического штамма У1Ьтю с1ю1сгас (например, штамма V. с1ю1егае 395, АТСС № 39541) или штамма Е1 Тог V. с1ю1егае (например, штамма V. с1о1егае 2125, АТСС № 39050). Альтернативно, вместо С'ТхА может быть использован любой бактериальный токсин, который является членом семейства бактериальных аденозиндифосфатрибозилирующих экзотоксинов (Кгиедег апй ВатЫет, С1ш. МютоЬю1. Вет.. 8: 34; 1995), например субъединица А термолабильного токсина (называемого далее Е1!А) энтеротоксигенной бактерии ЕксйепсЫа сой (СепВапк, инвентарный номер М35581), субъединица 81 коклюшного токсина (например, р!х81, СепВапк, инвентарный номер А1007364, А1007363, А1006159, А1006157 и т.п.); а в качестве другой альтернативы таким адъювантом может быть один из аденилатциклазогемолизинов бактерий Вотйе!е11а рейиккк (АТСС № 8467), Вотйе!е11а ЬтопсЫкерйса (АТСС № 7773) или Вотйе!е11а ратарейи8818 (АТСС № 15237), например гены суаА В. рейи8818 (СепВапк, инвентарный номер Х14199), В. ратарейи8818 (СепВапк, инвентарный номер А1249835) или В. ЬтопсШерйса (СепВапк, инвентарный номер Ζ37112).

Вектор МусоЬас!етшш, экспрессирующий иммунорегуляторный агент.

В еще одном способе может быть использован вектор МусоЬас!етшш, содержащий по меньшей мере один ΡΝ8, кодирующий иммуноген и цитокин, и такой вектор может быть использован для выработки усиленных ответов хозяина на указанный вектор МусоЬас!етшш, экспрессирующий Р№-кодируемый иммуноген. Альтернативно, может быть сконструирован вектор МусоЬас!етшш, содержащий ΡΝ8, кодирующий указанный отдельно взятый цитокин, и эти векторы могут быть использованы в комбинации по меньшей мере с одним другим вектором МусоЬас!етшш, содержащим ΡΝ8, кодирующий иммуноген, для усиления ответа хозяина на Р№-кодируемые иммуногены, экспрессируемые партнером вектора МусоЬас!етшш.

Выбор какого-либо конкретного цитокина, кодируемого вектором МусоЬас!етшш, не имеет решающего значения для осуществления изобретения, и такими цитокинами являются, но не ограничиваются ими, интерлейкин-4 (называемый далее 1Ь-4; СепЬапк, инвентарный номер АР352783 (мышиный 1Ь-4) или N^000589 (человеческий 1Ь-4)), 1Ь-5 (СепЬапк, инвентарный номер N^010558 (мышиный 1Ь-5) или N^000879 (человеческий 1Ь-5)), 1Ь-6 (СепЬапк, инвентарный номер М20572 (мышиный 1Ь-6) или М29150 (человеческий 1Ь-6)), 1Ь-10 (СепЬапк, инвентарный номер N^010548 (мышиный 1Ь-10) или АЕ418271 (человеческий 1Ь-10)), 1Ь-12_р40 (СепЬапк, инвентарный номер NМ_008352 (мышиный 1Ь-12 р40) или АУ008847 (человеческий 1Ь-12 р40)), 1Е-12_р70 (СепЬапк, инвентарный номер

МИ_008351/МИ_008352 (мышиный 1Ь-12 р35/40) или АЕ093065/АУ008847 (человеческий 1Ь-12 р35/40)), ТСЕЗ (СепЬапк, инвентарный номер N^011577 (мышиный ТСЕЗ1) или М60316 (человеческий ТСЕЗ1)) и Т№а (СепЬапк, инвентарный номер Х02611 (мышиный Т№а) или М26331 (человеческий Т№а)).

Выбор какого-либо конкретного метода, применяемого для встраивания гена, кодирующего РГо, в геном ВСС, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такие методы могут быть выбраны из методов, хорошо известных специалистам (Райф е! а1., МютоЬю1оду, 145: 34973503; 1999). Предпочтительный метод позволяет вводить ген РГо в локус игеС, что приводит к инактивации последнего гена и к получению маркера для отбора модифицированных штаммов (Цайп е! а1., 1 С11шс Мюто. 20(6), 1198-1199; 1984). Для этого синтетическая плазмида для аллельного обмена, такая как плазмида, описанная ниже в разделе примеры, может быть модифицирована так, чтобы она содержала 1-т.п.н. последовательности, фланкирующие 5'- и 3'-концы гена игеС (Сепоте Ба1аЬа5е № МЬ1881). Затем ген РГоА (Сепоте БаЮЬахе № СРЕ0163) встраивают между указанными фланкирующими последовательностями под контролем промотора Ад85В. Для секреции белка РГоА, вместо сигнальной последовательности нативного РГоА используют последовательность лидерного пептида Ад85В, которая обеспечивает эффективную секрецию из рекомбинантных штаммов ВСС.

Выбор метода, посредством которого плазмиды для аллельного обмена могут быть введены в нужные штаммы ВСС, не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой метод может быть осуществлен в соответствии со стандартными протоколами электропорации МусоЬас1епит.

Аналогичным образом, выбор конкретного метода осуществления аллельного обмена и введения аллеля РГо в локус игеС не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой метод может быть выбран из методов, хорошо известных специалистам. Использование векторасамоубийцы, представленного на фиг. 1, является предпочтительным методом, поскольку такая плазмида содержит два маркера для отбора на резистентность к антибиотикам, что позволяет минимизировать отбор спонтанно образующихся мутантов, резистентных к антибиотикам. В процессе аллельного обмена ген игеС заменяется на генный сегмент РГоА в результате гомологичной рекомбинации левой и правой фланкирующих последовательностей, что приводит к стабильной хромосомной интеграции и экспрессии РГоА. Преимущество такого подхода заключается в том, что для сохранения конечного продукта не требуется использования антибиотиков, и в конечном штамме отсутствует генотип или фенотип резистентности к антибиотику. Такие продукты являются предпочтительными для введения человеку (эти продукты далее будут называться продуктами, не содержащими гена резистентности к антибиоти

- 11 012434 ку). ИгеС-негативный фенотип будет служить показателем того, что данные штаммы были подвергнуты аллельному обмену, при котором ген игеС был заменен геном Ρίο, при этом очевидно, что в некоторых вариантах применения изобретения в качестве маркера может также служить ИгеС-позитивный фенотип.

В настоящем изобретении локализация ρίοΑ в ВСС не ограничивается локусом игеС. Другими возможными вариантами таких локусов являются, но не ограничиваются ими, ρίοΑ, интегрированный в плазмиду, и айВ-сайт на хромосоме. Для специалиста в данной области очевидно, что ρίοΑ может быть интегрирован и экспрессирован и в других возможных сайтах на хромосоме.

Настоящее изобретение также относится к вакцинным препаратам, которые могут быть использованы для выработки иммунного ответа против туберкулеза. Такие вакцинные препараты включают по меньшей мере один штамм гВСС, описанный в настоящем изобретении, и фармакологически приемлемый носитель. Получение таких композиций, используемых в качестве вакцины, хорошо известно специалистам. Обычно такие композиции получают в виде жидких растворов или суспензий, однако они могут быть также получены и в виде твердых форм, таких как таблетки, драже, порошки и т.п. Могут быть также получены твердые формы, которые, перед их введением, могут быть растворены или суспендированы в жидкости. Такой препарат может быть также эмульгирован. Активные ингредиенты могут быть смешаны с эксципиентами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активными ингредиентами. Подходящими эксципиентами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, раффиноза, глицерин, этанол и т.п., или их комбинации. Кроме того, данная композиция может содержать небольшие количества вспомогательных ингредиентов, таких как смачивающие или эмульгирующие вещества, забуферивающие агенты для коррекции рН и т.п. Кроме того, такая композиция может также содержать и другие адъюванты.

Если данную композицию желательно вводить перорально, то в такую композицию могут быть добавлены различные загустители, флаворанты, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки, связующие вещества и т.п. Композиция согласно изобретению может содержать любой из указанных дополнительных ингредиентов при условии, что данная композиция будет иметь форму, пригодную для введения. Конечное количество бактерий гВСС в данных композициях может варьироваться. Однако в основном, это количество будет составлять примерно 1-99%. Вакцинные препараты согласно изобретению могут также включать адъюванты, подходящими примерами которых являются, но не ограничиваются ими, 8ерр1с, Οιιίΐ Α, Л111убгоде1 и т.п. Кроме того, вакцинные препараты согласно изобретению могут содержать гВСС одного типа. Альтернативно, данная вакцина может включать гВСС более одного типа.

Настоящее изобретение также относится к способам выработки иммунного ответа против туберкулеза и к способам вакцинации млекопитающих против туберкулеза. Под термином выработка иммунного ответа авторы настоящего изобретения подразумевают, что введение вакцинного препарата согласно изобретению, которое приводит к синтезу специфических антител (с титром в пределах от 1 до 1х 10⁶, предпочтительно 1х10³, более предпочтительно в пределах примерно от 1х10³ до 1х10⁶, а еще более предпочтительно до более 1х10⁶) и/или к пролиферации клеток, измеренной, например, по включению ³Н-тимидина. Указанные методы включают введение млекопитающему композиции, содержащей штамм гВСС согласно изобретению в фармакологически приемлемом носителе. Вакцинный препарат согласно изобретению может быть введен любыми подходящими способами, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, инъекции, пероральное введение, интраназальное введение, прием пищевого продукта, содержащего гВСС, и т.п. В предпочтительном варианте изобретения таким способом введения является подкожное или внутримышечное введение.

Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничение осуществления изобретения. При этом следует отметить, что в настоящем изобретении могут быть использованы различные альтернативные материалы, условия и процедуры, которые являются очевидными для специалиста в данной области, но которые не должны выходить за рамки общего объема изобретения, представленного в его описании.

Примеры

Ранее была продемонстрирована решающая роль, которую играют СЭ8⁺-Т-клетки, рестриктированные МНС класса I, в вырабатывании иммунитета против туберкулеза (Иуии е! а1., см. выше, 1992). Для улучшения СЭ8-Т-клеточного ответа был сконструирован рекомбинантный штамм ВСС, который экспрессирует листериолизин ЫЧепа топосуЮдепех. Однако этот рекомбинантный штамм ВСС (гВСС) не обладал повышенной способностью к высвобождению из эндосомы, а поэтому он не обладал повышенной способностью к индуцированию, например, цитотоксического СЭ8'-Т-клеточного ответа, рестриктированного МНС класса I. Результаты анализа показали, что этот штамм способен к высвобождению из эндосомы на уровне менее 1%. Это не удивительно, если учесть, что активность листериолизина в высокой степени чувствительна к рН, а поэтому этот фермент фактически не активен при рН эндосомы. Несмотря на этот недостаток, протективные свойства и безопасность указанного рекомбинантного штамма значительно улучшились. Исходя из этих наблюдений, авторами настоящего изобретения был сконструирован новый штамм гВСС путем введения ΡίοΑα^, происходящего от С1о81пбшт рейлидеик, в

- 12 012434 хромосому ВСС. РГоА_С137р имеет одну аминокислотную замену С на О в положении 137. Эта одна аминокислотная замена приводит к потере токсичности РйоА в клетках млекопитающих, но при этом указанный фермент сохраняет свою эндосомолитическую функцию. На мышиных моделях было показано, что полученный штамм является безопасным и иммуногенным.

Материалы и общие методы.

В каждом эксперименте, описанном в нижеследующих разделах, рестриктирующие эндонуклеазы (обозначаемые здесь КЕк); (Чете Еид1аий Вю1аЬк Веуег1у, ΜΑ), ДНК-лигаза Т4 (Чете Еид1аий Вю1аЬк, Веуег1у, ΜΑ) и полимераза Тац (Ь1£е ТесЬио1од1ек, СайЬегкЬигд, ΜΌ) были использованы в соответствии с протоколами производителей. Плазмидную ДНК получали с использованием наборов для лабораторной очистки (Ц1адеи М1шргер^К кй 8аи!а С1агйа, СА) или для крупномасштабной очистки (Ц1адеи Мах1ргер^К кй, 8аи!а С1ап!а, СА) плазмидных ДНК в соответствии с протоколами производителей (Ц1адеи, 8аи!а С1ап!а, СА). Воду т1Ш-Ц, не содержащую нуклеазы и очищенную до чистоты, требуемой для проведения молекулярно-биологических экспериментов; трис-НС1 (рН 7,5), ЭДТА, рН 8,0, 1 М МдС1₂, 100% (об./об.) этанол, сверхчистую агарозу и буфер для электрофореза в агарозном геле закупали у фирмы Ы£е ТесЬио1од1ек, СайЬегкЬигд, ΜΌ. Гидролиз рестриктирующими ферментами, ПЦР, реакции лигирования ДНК и электрофорез в агарозном геле проводили в соответствии с хорошо известными процедурами (8атЬгоок, е! а1., ΜοΕα.ι1;·ΐΓ С1ошид: А ЬаЬога!огу Μаииа1. 1, 2, 3; 1989; 8йаик, е! а1., Ргос. Чай. Асай. 8с1. И8А. Μ;·ιγ; 87(5) 1889-93; 1990). Секвенирование нуклеотидов для подтверждения последовательности ДНК каждой рекомбинантной плазмиды, описанной в нижеследующих разделах, проводили в соответствии со стандартными автоматизированными методами секвенирования ДНК с использованием автоматического секвенатора Аррйей Вюкуйетк, модели 373А.

ПЦР-праймеры закупали у коммерческих фирм-поставщиков, таких как 8Цта (8ΐ. Ьошк, ΜΟ), или синтезировали с использованием ДНК-синтезатора АррЬей Вюкуйетк (модель 373А). ПЦР-праймеры использовали при концентрации 150-250 мкМ, а температуру отжига для ПЦР-реакций определяли с помощью компьютерной программы С1оие таиадег койтеаге уегкюи 4.1 (8аеиййс аий Ейисайоиа1 8ойтеаге 1ис., Эигкат ЧС). ПЦР проводили в автоматизированном термоциклере 8!га!едеие КоЬосус1ег, модель 400880 (8!га!едеие, Ьа 1о11а, СА). ПЦР-праймеры для амплификации конструировали с помощью компьютерной программы С1оие Μаηаде^® койтеаге уегкюи 4.1 (8с1еиййс аий Ейиса!юиа1 8ойтеаге 1ис., Эигкат ЧС). Эта программа позволяет конструировать ПЦР-праймеры и идентифицировать рестрикционные сайты, совместимые со специфическими ДНК-фрагментами, подвергаемыми модификации. ПЦР проводили в термоциклере, таком как автоматизированный термоциклер 8йа!едеие КоЬосус1ег, модель 400880 (8йа!едеие), а время отжига, удлинения и денатурации праймеров в ПЦР устанавливали в соответствии с протоколами стандартных процедур (8йаик е! а1., см. выше, 1990). Затем гидролиз рестриктирующими ферментами и ПЦР анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле стандартными методами (8йаик е! а1., см. выше, 1990; и 8атЬгоок е! а1., см. выше, 1989). Положительный клон определяли как клон, который обнаруживал соответствующую рестрикционную карту и/или картину ПЦР. Плазмиды, идентифицированные указанным способом, могут быть дополнительно оценены в соответствии со стандартными процедурами секвенирования ДНК, описанными выше.

Штаммы ЕксЬейсЫа сой, такие как ΌΗ5α и 8аЬ1е2^К, закупали у фирмы Ьйе Тес1то1од1ек (СайЬегкЬигд, ΜΌ), и эти штаммы служили в качестве исходного хозяина для рекомбинантных плазмид. Рекомбинантные плазмиды вводили в штаммы Е. сой путем электропорации с применением электроимпульс ного устройства высокого напряжения, такого как Сеие Ри1кег (Вюйай ЬаЬога!ог1ек, Негси1ек, СА), с установленными параметрами 100-200 Ом, 15-25 мкФ и 1,0-2,5 кВ, как описано в литературе (8йаик е! а1., см. выше, 1990). Оптимальные условия электропорации идентифицировали путем определения параметров, которые дают максимальную скорость трансформации на мкг ДНК/бактерию.

Бактериальные штаммы культивировали на трипсинизированном соевом агаре (Эйсо, Пейой, ΜΙ) или в трипсинизированном соевом бульоне (Эйсо, Пейой, ΜΙ), которые приготавливали в соответствии с инструкциями производителя. Если это не оговорено особо, то все бактерии культивировали при 37°С в 5% СО₂ (об./об.) при легком помешивании. Если необходимо, то в указанные среды добавляли антибиотики (81дта, 8ΐ. Ьошк, ΜΟ). Бактериальные штаммы хранили при -80°С и суспендировали в среде Эйсо, содержащей 30% (об./об.) глицерина (81дта, 8ΐ. Ьошк, ΜΟ), при плотности примерно 10⁹ колониеобразующих единиц (далее обозначаемых к.о.е.) на 1 мл.

Аллельный обмен в ВСС.

Ранее были описаны методы введения модифицированных аллелей в штаммы ΜусοЬасΐе^^ит, и эти методы могут быть адаптированы и применены специалистами в данной области (РапкЬ е! а1., Μ^с^οЬ^ο1оду 146: 1969-1975; 2000). Новый метод генерирования плазмиды для аллельного обмена предусматривает использование синтезированной ДНК. Преимущество такого метода заключается в том, что о данном плазмидном продукте, полученным таким методом, может быть дана полная информация, а поэтому на его применение должно быть получено разрешение регуляторных органов, тогда как применяемые ранее методы, хотя и являются эффективными, очень плохо задокументированы с точки зрения протоколов проведения лабораторного культивирования, а поэтому на осуществление этих методов может быть не

- 13 012434 получено разрешения. Если данный продукт используется для введения человеку, то в соответствии с существующими нормами, на его применение должно быть получено разрешение регуляторных органов США и Европейских стран.

Вектором-самоубийцей для аллельного обмена в МусоЬас!егшт является плазмида, которая способна реплицироваться в штаммах Е. со11, но не способна реплицироваться в штаммах МусоЬас!егшт зрр., таких как М. !Ь и ВСС. Выбор того или иного конкретного вектора-самоубийцы для его использования в процедурах аллельного обмена не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения, и такой вектор может быть выбран из векторов, полученных в научно-исследовательских лабораториях (Рапзй е! а1., см. выше, 2000) или являющихся коммерчески доступными. Предпочтительная конструкция плазмиды-самоубийцы для аллельного обмена представлена на фиг. 1. Эта плазмида состоит из нижеследующих ДНК-сегментов: последовательности опЕ для репликации данной плазмиды в Е. сой (СепВапк, инвентарный номер Ь09137); последовательности гена резистентности к канамицину для отбора в Е. со11 и в МусоЬас!егшт (СепВапк, инвентарный номер ААМ97345); и вспомогательного маркера для отбора на резистентность к антибиотику, например, гена резистентности к зеоцину (СепВапк, инвентарный номер ААИ06610), который находится под контролем промотора МусоЬас!егшт (например, промотора 11зр60). Указанный второй маркер для отбора на резистентность к антибиотику не является обязательным, и он был включен для осуществления двойного отбора в целях предотвращения чрезмерного роста резистентных к канамицину изолятов, спонтанно образующихся в процессе аллельного обмена.

Конструирование таких векторов-самоубийц может быть осуществлено стандартными методами рекомбинантных ДНК, описанных в настоящем изобретении. Однако современные стандарты, разработанные регуляторными органами, требуют обратить внимание на угрозу попадания прионовых частиц, образующихся в продуктах, обработанных коровьими продуктами, содержащими В8Е-инфицированный материал. Поэтому во избежание попадания этих материалов (например, последовательностей ДНК) в нужный штамм неизвестного происхождения, предпочтительно, чтобы все ДНК в векторе-самоубийце были синтезированы с использованием коммерческих источников (например, Ркозспр!, 1пс.). В соответствии с этим, предпочтительным методом конструирования векторов-самоубийц является разработка протокола получения последовательностей ДНК с помощью компьютерной программы для конструирования ДНК (например, С1опе Мападег), с последующим синтезом ДНК коммерческой фирмойпоставщиком (например, Ркозспр! 1пс.), предоставляющей такие услуги за соответствующую плату. Этот метод был использован для конструирования и продуцирования вектора-самоубийцы, используемого в экспериментах, описанных в разделе Примеры.

Конфигурация вектора-самоубийцы, описанного выше (фиг. 1), имеет те преимущества, что он содержит два маркера для отбора на резистентность к антибиотикам, что позволяет минимизировать отбор спонтанных мутантов, обнаруживающих резистентность к одному антибиотику, и присутствующих в отношении примерно 1/10⁸ на генерацию. Спонтанная резистентность к двум антибиотикам встречается крайне редко и наблюдается только примерно в 1 случае на 10¹⁶-генерацию. Таким образом, вероятность появления штаммов, обладающих такой двойной резистентностью, в культурах, используемых для проведения процедуры аллельного обмена, составляет менее 1/10⁶.

Для негативного отбора в процессе аллельного обмена был включен ген засВ (геномная последовательность 8ЕЭ ΙΌ № ЫТ01В84354), который сообщает фенотип чувствительности к сахарозе, в целях обогащения культуры штаммами, которые были подвергнуты конечной стадии рекомбинации ДНК и в которых была завершена процедура аллельного обмена.

Культивирование штаммов МусоЬас!егшт.

Выбранные штаммы ВСС культивировали в жидкой среде, такой как среда М1бб1еЬгоок 7Н9 или синтетическая среда 8аи1!оп, предпочтительно при 37°С. Эти штаммы могут храниться в виде стационарной или перемешиваемой культуры. Кроме того, скорость роста ВСС может быть увеличена путем добавления олеиновой кислоты (0,06% об./об.; Кезеагсй Э|адпозЦсз Са! № 01257) и детергентов, таких как тилоксапол (0,05% об./об.; Кезеагсй Э|адпозЦсз Са! № 70400). Чистота культур ВСС может быть оценена путем равномерного посева 100 мкл аликвот культуры ВСС, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (Ыеа!) - 10^-8) в забуференном фосфатом физиологического растворе (далее обозначаемом РВ8), на 3,5-дюймовых чашках, содержащих 25-30 мл твердой среды, такой как среда М1бб1еЬгоок 7Н10. Кроме того, чистота указанной культуры может быть дополнительно оценена с использованием коммерчески доступных наборов, таких как наборы, содержащие тиогликолят натрия (8с1епсе ЬаЬ, номер по каталогу 1891) и соевую среду с казеином (ВЭ, номер по каталогу 211768).

Посевные лоты ВСС хранили при -80°С при плотности 0,1-2х10⁷ к.о.е./мл. Жидкие культуры обычно собирали при оптической плотности (600 нм), составляющей 0,2-4,0 по отношению к стерильному контролю; и эти культуры высевали в центрифужные пробирки соответствующего размера, а затем микроорганизмы подвергали центрифугированию при 8000хд в течение 5-10 мин. Супернатант отбрасывали, и микроорганизмы ресуспендировали в растворе для хранения, состоящем из среды М1бб1еЬгоок 7Н9, содержащей 10-30% (об./об.) глицерина при плотности 0,1-2х10⁷ к.о.е./мл. Эти суспензии в аликвотах по

- 14 012434 мл распределяли по стерильным 1,5-миллилитровым боросиликатным сосудам для глубокого замораживания, а затем хранили при -80°С.

Пример 1. Конструирование штаммов гВСО-ΡίοΑ, способных высвобождаться из эндосомы.

Конструирование штаммов гВСО-ΡίοΑ, способных высвобождаться из эндосомы, осуществляли посредством аллельного обмена областей, фланкирующих ген игеС. В результате этого ген игеС был заменен на генный сегмент ΡίοΑ, что приводило к стабильной экспрессии гена ΡίοΑ в хромосоме. Эта процедура подробно описана ниже.

Конструирование плазмиды для аллельного обмена. Плазмида для аллельного обмена состояла из следующих ДНК-сегментов: последовательности ογϊΕ для репликации данной плазмиды в Е. сой; последовательности гена резистентности к канамицину для отбора в Е. сой и в МусоЪас1епит; и вспомогательного маркера для отбора на резистентность к антибиотику (например, гена резистентности к зеоцину), который экспрессируется под контролем промотора Нзрб0. Указанный второй маркер используется для осуществления двойного отбора в целях предотвращения исключения резистентных к канамицину штаммов, спонтанно образующихся в данном процессе. Для негативного отбора в процессе аллельного обмена был использован ген, чувствительный к сахарозе. И наконец, между левой и правой 1-т.п.н. последовательностями, фланкирующими ген игеС в нужном штамме ВСО Дания 1331, был включен ген ΡίοΑ. Ген ΡίοΑ экспрессировался под контролем промотора Ад85В. Для секреции ΡίοΑ вместо его природной секреторной последовательности была использована последовательность лидерного пептида Αд85В. И наконец, синтез и сборка всех этих компонентов были осуществлены Ρώο^πρί 1пс (Ηοπδίοπ, ТХ). Полученная плазмида представляет собой бактериальный вектор- самоубийцу, и карта, полученная для этой плазмиды, представлена на фиг. 1. Полученная плазмидная конструкции имеет подтвержденную структуру, показанную на фиг. 5.

Введение плазмиды для аллельного обмена в штамм ВСО Дания 1331 Μχ'ί'οΙχκΈπιιιη Εονίδ. Процесс аллельного обмена схематически продемонстрирован на фиг. 4, где указаны главные стадии этой процедуры. Подробное описание этих стадий приводится ниже.

Штамм ВСО Дания 1331 культивировали в среде 7Н9, в которую были добавлены 10% ΟΑ^С (олеиновая кислота-альбумин-декстрозо-каталаза) (ВЭ ОТсю) и 0,05% (об./об.) тилоксапола (Научноисследовательская и диагностическая лаборатория). При достижении культурой логарифмической стадии роста, бактерии собирали и приготавливали для введения путем электропорации, как описано в литературе (8ип еί а1., 2004). В свежеприготовленные электрокомпетентные клетки вводили 5 мкг плазмиды для аллельного обмена в соответствии со стандартной методикой.

Плазмиду для аллельного обмена, сконструированную, как описано выше, вводили в штамм М. Εονΐδ ВСО Дания 1331 в соответствии со стандартным протоколом электропорации, разработанным для введения микобактерий. После электропорации клетки культивировали в течение ночи на среде 7Н9, в которую были добавлены 10% (об./об.) ΟΑ^С и 0,05% (об./об.) тилоксапола. Затем эти клетки высевали на чашки со средой 7Н10, содержащей 50 мкг/мл канамицина и зеоцина. Полученные колонии собирали и культивировали в среде 7Н9, содержащей 10% (об./об.) сахарозы. Затем полученную культуру высевали на чашки со средой 7Н10 для клонирования и получали отдельные колонии, которые были идентифицированы на присутствие гена ΡίοΑ вместо гена игеС. На диаграмме, представленной на фиг. 4, описаны главные стадии этой процедуры, а в табл. 1 описан вектор- самоубийца, ρΑΕ 102, который также изображен на фиг. 1.

Таблица 1 Вектор- самоубийца, используемый в настоящем изобретении

Название	Остов	Специфический аллель для аллельного обмена
рАГ102	рАГЮО	ген ΡίοΑ, фланкированный 1-т.п.н. областями гена игеС

В примере 1 показано, что штамм ВСО МусюкасТепит является генетически сконструированным так, что он экспрессирует выбранный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН и позволяет данной микобактерии высвобождаться из эндосомы в цитоплазму клетки.

Пример 2. Тестирование штамма гВСО-ΡίοΑ.

Материалы и методы для примера 2.

Культивирование Му^ка^елит. Для проведения последующих экспериментов, штаммы ВСО культивировали при 37°С в среде М^άά1еΕ^οοк 7Н9 (ВЭ Еюзшепсез), в которую были добавлены 10% ΘΑΌΟ Для диспергирования бактерий использовали тилоксапол (0,05% об./об., КезеагсЕ ОшрюЩс^ Сак № 70400). В экспериментах, проводимых для сравнения различных штаммов, оптическую плотность (б00 нм) измеряли в различное время после инокуляции. Для оценки на чувствительность к канамицину штаммы культивировали и рост культур оценивали, как описано выше, за исключением того, что канамицин добавляли до конечной концентрации 50 мкг/мл. Если для культивирования бактерий использовали твердую среду, то в этих целях применяли агар М^άά1еΕ^οοк 7Н10 (ВЭ Еюзшепсез). При необходимости, канамицин добавляли до конечной концентрации 50 мкг/мл, а сахарозу добавляли до конечной кон

- 15 012434 центрации 3%.

Тест на уреазную активность. Колонии, полученные на чашках с сахарозой, как описано выше в примере 1, сначала скринировали на отсутствие уреазной активности с использованием тест-набора на уреазную активность (ВБ БШсо) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, петлю с бактериальной культурой ресуспендировали в коммерчески доступном тест-буфере в прозрачных пробирках. В качестве уреазного позитивного контроля использовали штамм ВСС Дания 1331. В качестве негативного контроля использовали лишь один буфер. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин, и полученный результат оценивали в соответствии с инструкциями производителя.

Генотипический анализ штаммов гВСС, несущих ДигеС: рГоА. Для амплификации ДНКпоследовательности для РГо-специфической инсерции аллеля и геномных ДНК-последовательностей ВСС, фланкирующих ген игеС, осуществляли ПЦР с использованием прямого праймера [асддс!ассд!с!ддаса!] (8ЕО 1Б N0: 4) и обратного праймера [сда!ддсйсйсда!дс] (8Е0 1Б N0: 5). ПЦР осуществляли в следующем режиме: стадия 1: при 95°С, 4 мин, один цикл; стадия 2: при 95°С, 1 мин, при 60°С, 1 мин, а затем при 72°С, 1 мин, всего 30 циклов; стадия 3: при 72°С, 10 мин, один цикл; стадия 4: хранение при 4°С. Полученные ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, секвенировали на автоматическом секвенаторе с применением дидезокси-метода секвенирования, и подтверждали присутствие полноразмерного гена РГоА вместо гена игеС (т.е. ДигеС::РГоА).

Рост АЕУ102 на микрофагах. Рост штамма АЕУ102 гВСС ш кйи оценивали в макрофаг-подобных клетках 1774А.1 путем измерения микобактериальных колониеобразующих единиц (к.о.е.) в инфицированных макрофагах. Эффективность фагоцитоза микобактерий определяли путем оценки числа внутриклеточных к.о.е. через три часа после инфицирования клеток 1774А.1. Последующую продолжительность жизни бактерий определяли путем лизиса клеток с высвобождением внутриклеточных бактерий для подсчета числа к.о.е. после их пятикратного промывания РВ8, как описано в литературе (8ип е! а1., 2004).

Анализ на гемолитическую активность РГо, экспрессированного в АЕУ102. Для оценки секреции РГоА из АЕУ102 этот штамм культивировали до середины фазы логарифмического роста, как описано выше. Затем собирали супернатанты культуры. Бактериальный осадок АЕУ102 ресуспендировали в 100 мкл РВ8 (рН 7,0), содержащего 0,1% В8А, в 96-луночном планшете с У-образным дном. Для того чтобы определить, секретируется ли белок РГоА в супернатант культуры, жидкую культуру центрифугировали, и супернатант подвергали тестированию. Для оценки экспрессированного РГоА на его рНнезависимую гемолитическую активность, получали образцы, как описано выше, за исключением того, что в качестве реакционного буфера использовали буфер РВ8 с различными значениями рН. При этом в каждую лунку также добавляли 100 мкл 1% промытых овечьих эритроцитов. Реакционную смесь слегка размешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч при перемешивании. В качестве негативного гемолитического контроля использовали бактерии штамм ВСС Дания 1331. В качестве позитивного гемолитического контроля использовали серийные разведения α-гемолизина (81дта) с известной гемолитической активностью. По окончании инкубирования реакционную смесь собирали путем центрифугирования при 500/д в течение 15 мин, после чего супернатант из планшета с У-образным дном переносили в эквивалентные лунки в плоскодонный 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность (оптическая плотность при 450 нм минус оптическая плотность при 540 нм). Гемолитическую активность количественно оценивали по изменению окраски после лизиса эритроцитов путем измерения оптической плотности. Интенсивность окраски соответствует уровню лизиса эритроцитов, который, в свою очередь, соответствует количеству гемолизина. Затем соответствующие величины для образцов вычисляли по стандартной кривой, построенной с использованием известных стандартов. Единицы гемолитической активности определяли как разведение образца, при котором наблюдается лизис 50% всех овечьих эритроцитов.

Цитотоксичность АЕУ102 по отношению к макрофагам. Цитотоксичность рекомбинантного штамма на макрофагах 1774А.1 (АТСС № А Т1В-67) определяли путем измерения уровня лактатдегидрогеназы (ЕБН), высвобождаемой из инфицированных клеток, с использованием набора Се11 Т11ег 96 Ациеоик Опе 8о1иЦоп Се11 РгойЕегайоп Аккау (Рготеда, номер по каталогу С3580) в соответствии с инструкциями производителя. Короче говоря, клетки инфицировали бактерией АЕУ102 при множественности заражения 10. Через различные промежутки времени после инфицирования супернатант оценивали на количество ЬБН, высвобождающееся из клеток, которое затем сравнивали с количеством ЕБН, высвобождающимся из штамма ВСС Дания 1331. В качестве негативного контроля использовали нормальные неинфицированные клетки. Процент жизнеспособных клеток подсчитывали, исходя из количества ЬБН, высвобожденного из инфицированных клеток, по отношению к количеству ЬБН, высвобождаемому из клеток негативного контроля (100% жизнеспособность клеток).

Результаты эксперимента, описанного в примере 2.

Конструирование АЕУ102. В процессе конструирования АЕУ102, отобранные меродиплоидные бактерии, которые в своей хромосоме содержали полноразмерную дефектную плазмиду, полученную

- 16 012434 посредством замены аллеля в ее гомологичном ДНК-сегменте на аллель, присутствующий на дефектной плазмиде, культивировали на чашках со средой М1бб1еЬгоок 7Н10, содержащей сахарозу, для осуществления конечной аллельной замены гена игеС экспрессионным кластером РГоА. Было обнаружено, что из всех колоний, продуцированных на чашках с сахарозой, одна колония РГо-105-5 (названная АРУ102) была негативной по уреазе, что позволяет предположить, что ген игеС был заменен экспрессионным кластером РГоА. Затем эту бактериальную колонию подвергали генотипическому анализу с помощью ПЦР на генотип ДитеС::ОрГоА. Полученную ПЦР-реакционную смесь анализировали путем электрофореза на 1,2% агарозном геле, и результаты этого анализа представлены на фиг. 6. Как можно видеть, при ПЦР, проводимой с использованием этой бактерии в качестве матрицы, продуцировался ПЦР-продукт предполагаемого размера, который превышал размер продукта, полученного с использованием родительского штамма ВСС Дания 1331. Ожидаемый размер ДНК-полосы для генотипа ДитеС::ОрГоА составлял 2180 п.н., тогда как родительский штамм имел размер 1967 п.н. ПЦР-продукт для колоний 105-5 был дополнительно очищен и секвенирован в коммерческой лаборатории при Университете Джона Хопкинса (Ва1бшоте, МО). Результат секвенирования показал, что эта колония имеет ожидаемый генотип ДитеС::ОрГоА. Кроме того, при проведении ПЦР для амплификации гена резистентности к канамицину и гена касВ, происходящего от штамма АРУ102, не продуцировался какой-либо ПЦР-продукт (данные не приводятся). Эти данные дают основание предположить, что АРУ102 был подвергнут конечной стадии аллельного обмена и имеет нужный генотип ДитеС::ОрГоА.

Тест для характеризации роста и чувствительности к канамицину для АРУ102. Исходя из результатов теста на уреазную активность и генотипирования, был сделан вывод, что клон 105-5 (названный АЕУ102) имел ожидаемый фенотип и желательный генотип ДитеС::ОрГоА. Затем штамм АРУ102 был дополнительно проанализирован на его способность к росту на среде 7Н9 по сравнению с ростом родительского штамма ВСС Дания 1331. Результат этого анализа представлен на фиг. 7. Как можно видеть на этой фигуре, конструкция АРУ102 имеет кривую пролиферации на культуральной среде 7Н9, аналогичную кривой роста, полученной для родительского штамма. Кроме того, в присутствии канамицина рост АРУ102 замедлялся до уровня, сравнимого с уровнем роста родительского штамма ВСС Дания 1331, что дает основание предположить, что, как и ожидалось, АРУ102 обладает чувствительностью к канамицину, аналогичной чувствительности родительского штамма.

Цитотоксичность АРУ102. Сообщалось, что одна аминокислотная замена в белке РГоА (мутация в кодоне 137 с заменой дда, кодирующего С1у, на сад, кодирующего С1п) приводит к потере его токсичности для клеток млекопитающих. При этом указанный белок сохраняет способность опосредовать высвобождение бактерии из вакуоли (Робпоу, см. выше, 1996). Токсичность белка, экспрессированного в АЕУ102, оценивали путем инфицирования клеток 17741А бактерией АЕУ102. При сравнении с неинфицированными нормальными контрольными клетками в различные промежутки времени после инфицирования было обнаружено, что АРУ102 не вызывает более высокого уровня гибели клеток, чем уровень гибели клеток, вызываемый штаммом ВСС Дания 1331, широко используемым в качестве вакцины (фиг. 8).

Выживание клеточной линии в альвеолярных макрофагах. Для того чтобы определить, является ли данная конструкция жизнеспособной в макрофагах, для инфицирования альвеолярных макрофагов 1774А.1 были использованы бактериальные культуры, достигшие середины логарифмической фазы роста. Эти клетки инфицировали при множественности заражения (МО1) 1: 1. Мониторинг выживания МусоЬас1епиш в указанных клетках проводили путем подсчета бактерий на чашках через различные промежутки времени после инфицирования. Как можно видеть на фиг. 9, конструкция АРУ102 обнаруживала устойчивый фенотип, аналогичный фенотипу родительского штамма, что позволяет предположить об отсутствии какого-либо нарушения в способности этой конструкции выживать в клетках 1774А.1.

Секреция белка РГоА конструкцией АЕУ102. Секрецию белка РГоА бактерией, содержащей конструкцию АЕУ102, оценивали путем анализа супернатанта бактериальной культуры на усиление гемолитической активности по сравнению с активностью штамма ВСС Дания 1331. Супернатанты культур для АРУ102 и штамма ВСС Дания 1331 собирали при той же оптической плотности и сравнивали на их способность лизировать эритроциты. Полученные результаты представлены на фиг. 10. В соответствии с предыдущими результатами супернатант ВСС-культуры обнаруживал фоновый уровень гемолитической активности, индуцированной в результате высвобождения бактериальных метаболитов в процессе роста, которые могут приводить к лизису эритроцитов (Сгобе е! а1., 1оитпа1 оГ С11шса1 ШуеШдаНоп, 115: 24722479; 2005). В противоположность этому, супернатант культуры АЕУ102 обнаруживал значительно более высокий уровень гемолитической активности, сравнимый с активностью штамма ВСС Дания 1331 и соответствующий секреции молекул РГоА в супернатант культуры. Кроме того, был проведен анализ на рН-независимую гемолитическую активность РГоА при рН 5,5 и 7,0, и полученные результаты представлены на фиг. 10. Как можно видеть на этой фигуре, супернатант от АРУ102 обнаруживал аналогичную гемолитическую активность при рН 5,5 и 7,0, что позволяет предположить, что гемолитическая активность секретированного белка РГоА, как и ожидалось, не зависит от рН.

В примере 2 показано, что сконструированный штамм обладает предсказанной биологической ак

- 17 012434 тивностью, и что РГо, продуцируемый этим штаммом, обладает способностью секретироваться, и его активность не зависит от рН.

Пример 3. Высвобождение гВСО-РГоА из эндосомы и тест на иммуногенность у животных.

Главная парадигма патогенеза МусоЬас!егшт !иЬегси1о818 заключается в прекращении созревания фагосом. Агтйгопд и Наг! (1971) показали, что фагосомы М. !иЬегси1о818 не смешиваются с меченными ферритином лизосомами, что объясняется ингибированием образования гибридов фагосомы-лизосомы. Было также обнаружено, что вакцинный штамм М. Ьо\35 (ВСО) присутствует только в фагосомном компартменте, изолированном от конечных эндоцитарных органелл (С1етеп§ апй Нонуй/, 1995; Наеап е! а1., 1997; У1а е! а1., 1997). С1етеп§ и Но\\'Цх (1995) обнаружили, что микобактериальные фагосомы приобретают устойчивую окраску в присутствии трансферринового рецептора (ТГК) при плотности, аналогичной его плотности на плазматической мембране. Обычно рецептор трансферрина быстро высвобождается (!=1/2 минуты) из эндосом и переносится обратно в плазматическую мембрану; однако, в микобактериальных фагосомах, этот процесс прекращается, и трансферриновый рецептор остается в фагосомах. Этот феномен позволяет визуализировать фагосомы, содержащие микобактерии. Фагосомы были помечены антителами против трансферринового рецептора. В то же самое время микобактерии были окрашены флуоресцентным красителем, который позволяет проводить визуальный мониторинг поведения бактерий после их проникновения в фагосому. Полученные результаты показали, что конструкция гВСО-РГо способна высвобождаться из эндосомы после инфицирования клеток.

Материалы и методы для проведения теста на высвобождение из эндосомы.

Бактерии и клетки. Штамм ВСО Дания 1331 и гВСС-АигеС::ОрГоА_О|₃-.-_<, (АВУ102) культивировали в среде 7Н9, в которую были добавлены 10% (об./об.) ОАЭС и 0,05% (об./об.) тилоксапола (среда для культивирования) до ОЭ₆₀₀ примерно 0,8-1,0. Перед инфицированием бактериальные клетки метили сукцинимидиловым эфиром А1еха Е1иог 568 (Мо1еси1аг РгоЬее, Еидепе, ОК) в РВБ при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч в соответствии с инструкциями производителя. Этот краситель образует очень стабильные амидные связи с первичными аминами, имеющимися в белках на поверхности бактерий. Вкратце, 10 мл бактериальной культуры осаждали и ресуспендировали в 25 мл 0,625 мкг/мл А1еха Е1иог 568 в РВБ (рН 7,2) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1-1,5 ч для мечения бактерий. Затем меченые бактериальные клетки три раза промывали РВБ и ресуспендировали в культуральной среде 7Н9, а затем хранили в течение ночи в холодильнике. Клетки 1774А.1 культивировали в среде ЭМЕМ, как описано в литературе (Бип е! а1., 2004), в 6-луночных планшетах для культивирования клеток на покровных стеклах, покрытых человеческим фибронектином. Клетки высевали при плотности 3х10⁶ клеток/лунку и культивировали в течение 2 дней в инкубаторе при 37°С в атмосфере повышенной влажности с 5% СО2. В процессе инфицирования меченые бактерии осаждали и ресуспендировали в среде ЭМЕМ+10% ЕВБ и непосредственно добавляли в клетки 1774А.1 при множественности заражения (МО1) 10 на каждую клетку. Через 20 мин, 8 ч и 24 ч клетки промывали при комнатной температуре (к.т.) забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВБ, рН 7,2). Затем клетки фиксировали в течение 20 мин при комнатной температуре 2% параформальдегидом в РВБ (рН 7,2). После этого фиксированные клетки делали более проницаемыми путем обработки 0,1% Тгйоп Х-100 в РВБ (рН 7,2) в течение 10 мин при комнатной температуре, а затем два раза промывали РВБ (рН 7,2). Блокирование проводили по меньшей мере в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4°С путем обработки 3% альбумином бычьей сыворотки (ВБА), 5% нормальной козьей сывороткой (ЫОБ) и 0,5% азидом натрия в РВБ (рН 7,2). Затем блокирующий буфер удаляли и добавляли ФИТЦ-конъюгированное крысиное антитело против мышиного трансферринового рецептора (ИБ Вю1одюа1, Б^атресо!!, МА) при разведении 1:50 в РВБ (рН 7,2), содержащем 1% ВБА, 3% ЫОБ и 0,5% азида натрия с последующим инкубированием при комнатной температуре по меньшей мере в течение 1 ч. Затем клетки 2-3 раза промывали РВБ, помещали на покровные стекла и заливали заливочной средой Вектшельда. Анализ проводили при увеличении 1500 на инвертированном микроскопе №коп ТЕ2000, снабженным цифровой камерой Кейда ЕХ1 Мопо с 12-разрядной глубиной представления цвета с ИК-фильтром.

Результат. При исследовании под микроскопом было обнаружено, что обе бактерии ВСО и гВСОРГоА интернализуются клетками-хозяевами через 15 мин после инфицирования. Однако через 8 ч после инфицирования было обнаружено, что бактерии гВСО-РГоА высвобождались из эндосом, в отличие от бактерий ВСО, которые локализовались, главным образом, в фагосоме хозяина. Эти результаты схематически проиллюстрированы на фиг. 11А-Э, где продемонстрирована бактериальная инвазия макрофагов (фиг. 11 А), устойчивая локализация ВСО в эндосоме (фиг. 11В), присутствие бактерии АЕУ102 в ранней эндосоме (фиг. 11С) и высвобождение бактерии АЕУ102 из эндосомы в цитоплазму клетки (фиг. 11Ό), обусловленное секрецией рекомбинантного РГоА. Подсчет бактерий показал, что 100 из 138 бактерий АУЕ102 высвобождались из эндосомы (72%) через 8 ч после инфицирования, тогда как из фагосомы высвобождались только 29 из 100 ВСО (26%). Анализ бактерий через 24 ч после инфицирования образца дал аналогичные результаты. Эти результаты показали, что экспрессия РГоА повышает уровень высвобождения АУЕ102 из фагосом.

Дополнительное подтверждение этого результата проводили с использованием другой системы, в

- 18 012434 которой для мечения эндосом и лизосом (ЬукоГгаскег-Кей, Мо1еси1аг ргоЬек, номер по каталогу Ь-7528) использовали чувствительный к рН краситель в аналогичных экспериментальных условиях и в соответствии с процедурой, описанной выше. Бактерии визуализировали при излучении на длине волны 568, а фагосомы визуализировали при излучении на длине волны 488. Полученный результат совпадал с наблюдениями, описанными выше.

В примере 3 показано, что рекомбинантный штамм АУР102 способен высвобождаться из эндосомы, а штамм ВСС обладал гораздо меньшей способностью к такому высвобождению. Таким образом, штамм АУР102 должен индуцировать иммунный ответ в ассоциации с молекулами гистосовместимости класса I, с гораздо большей вероятностью, чем ВСС, а поэтому он должен быть более эффективным в качестве вакцины.

Библиография для примера 3.

АгткГгопд, 1., НагГ Р.Э., 1971. Кекропке оГ сиНигей тасгорЬадек Го МусоЬасГепит ГиЬегси1ок1к, χνίΐΗ оЬкегуаГюпк оп Гикюп оГ 1укокотек χνίΐΗ рЬадокотек, 1. Ехр. Мей., 134: 713-40.

МусоЬасГепит ГиЬегси1ок1к апй ЬедюпеПа рпеиторЫ1а рНадокотек ехЫЫГ аггекГей таГигайоп йекрНе асс.|шкН|оп оГ КаЬ7. 1пГесГ. 1ттип., 68(9): 5154-66.

Накап, Ζ., 8сЬ1ах, С., КиЬп, Ь., ЬеГкоуйк, I., Υоиπд, И., ТЬо1е, 1., Р1еГегк, 1., 1997. 1ко1айоп апй сЬагас1ег1/а11оп оГ (Не тусоЬасГепа1 рЬадокоте: кедгедаГюп Ггот (Не епйокота1/1укокота1 раГЕгау. Мо1. М1сгоЬю1., 25(2): 427.

У1а, Ь.Е., Иегейс, И., И1тег, К.Е, Н1Ь1ег, N.8., НиЬег, Ь.А., Иегейс, V. АггекГ оГ тусоЬасГепа1 рЬадокоте таГигайоп ίκ саикей Ьу а Ь1оск ш уекю1е Гикюп ЬеГ^ееп кГадек сопГго11ей Ьу гаЬ5 апй гаЬ7. 1. Вю1. СЬет., 1997. 272(20): 13326-31.

8ип, К., Сопуегке, Р.Ь, Ко, С., Туад1, 8., Моткоп, КЕ., В1кНа1, ^.К., 2004. МусоЬасГейит ГиЬегси1ок1к ЕСР ыдта ГасГог ыдС 1к гес.|шгей Гог 1еГйа1йу ίπ т1се апй Гог ГНе сопййюпа1 ехргеккюп оГ а йеПпей депе кеГ. Мо1. МюгоЬю1., 52(1): 25-38.

Пример 4. Стратегия изготовления вакцины и вакцинации.

Стратегия изготовления вакцины основана на исследованиях, проводимых в целях определения максимальной жизнеспособности и стабильности этой вакцины в процессе ее изготовления. Такая стратегия включает оценку максимальной жизнеспособности данного микроорганизма (времени жизни) в процессе культивирования с использованием различных сред, обычно применяемых для культивирования МусоЬасГепа, с добавлением глицерина, сахаров, аминокислот, детергентов или солей. После культивирования клетки собирают путем центрифугирования или фильтрации в тангенциальном потоке и ресуспендируют в стабилизирующей среде для защиты клеток во время замораживания или лиофилизации. Обычно используемыми стабилизирующими агентами являются глутамат натрия, аминокислоты или их производные, глицерин, сахара или обычно используемые соли. Конечная композиция должна содержать микроорганизмы, которые являются достаточно жизнеспособными для ее доставки путем внутрикожного введения, чрескожного введения, вливания или перорального введения, и достаточно стабильными при ее хранении, при этом указанная композиция должна иметь адекватный срок годности для ее доставки и применения.

Преклиническая оценка вакцин против ТБ.

Общая процедура испытания на безопасность. Мышей ВАИВ/с, по 6 животных в группе, внутрибрюшинно инфицировали 2х10⁶ к.о.е. представляющего интерес штамма(ов) гВСС и аналогичных родительских штаммов. Мониторинг общего состояния животных и их массы тела проводили в течение 14 дней после инфицирования. Животные, которым вводили штаммы ВСС и гВСС, оставались здоровыми, и за время обследования у них не наблюдалось снижения массы тела и не обнаруживалось каких-либо явных признаков заболевания.

Вирулентность новых штаммов гВСС у иммунокомпетентных мышей. Иммунокомпетентных мышей ВАИВ/с, в группах по 15 животных, внутривенно инфицировали 2х10⁶ гВСС и родительского штамма ВСС, соответственно. На 1-й день после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о.е. в селезенке, легких и печени для подтверждения того, что каждое животное получило одну и ту же дозу заражения. Через 4, 8, 12 и 16 недель после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о.е. в селезенке, печени и легких для анализа роста штаммов гВСС ш νί\Ό по сравнению с ростом родительского штамма ВСС.

Строгий тест на безопасность, проводимый на мышах с иммунодефицитом. Мышей с иммунодефицитом 8СШ (с тяжелым комбинированным иммунодефицитом), распределенных на группы по 10 животных в каждой, внутривенно инфицировали 2х10⁶ к.о.е. штамма гВСС и родительского штамма ВСС, соответственно. На день 1 после инфицирования трех мышей в каждой группе умерщвляли и оценивали к.о. е. в селезенке, печени и легких для подтверждения доз заражения. Остальных семь мышей в каждой группе подвергали мониторингу на их общее состояние и массу тела. Затем оценивали выживаемость этих мышей, и в течение всего периода наблюдения показатели выживаемости гВСС-инфицированных мышей сравнивали с показателями выживаемости животных, которые были инфицированы родительским штаммом.

- 19 012434

Тест на безопасность для морских свинок. Безопасность штаммов гВСО по сравнению с вакциной ВСО, полученной на основе родительского штамма и имеющей хорошо установленный профиль безопасности для человека, также оценивали на морских свинках, используемых в качестве модели. Сначала оценивали влияние вакцины на общее состояние здоровья животных, включая прирост массы тела. Морских свинок внутримышечно иммунизировали 10⁷ (100х дозой вакцинации) к.о.е. рекомбинантного и родительского штаммов, и проводили мониторинг общего состояния здоровья животных и их массы тела в течение шести недель. Животных, которые погибали до завершения этого шестинедельного периода времени, подвергали паталогоанатомическому исследованию. По истечении шести недель после инфицирования всех животных умерщвляли и проводили макроскопический патологический анализ. Результаты теста считались удовлетворительными, если после введения у животных не наблюдалось какой-либо потери массы тела и какого-либо аномального поведения, и при аутопсии, проводимой через 6 недель, все органы были нормальными, и/или если не наблюдалось какого-либо ухудшения состояния животных, а прирост массы ^ВСО-Ρίο-вакцинированных животных оставался на нормальном уровне по сравнению с животными, инокулированными родительским штаммом.

Одновременно с этим проводили мониторинг уровней бактерий в органах животных. Морских свинок, иммунизованных вакциной, полученной на основе либо родительского, либо рекомбинантного штамма, подвергали эвтаназии через различные промежутки времени после инокуляции, а затем легкие, селезенку и региональные (паховые) лимфоузлы анализировали на уровень к.о.е. ВСО или гВСО.

Тест на токсичность. Для оценки токсичности штаммов гВСО, морских свинок (по 12 животных в каждой группе) внутрикожно вакцинировали одной дозой, которая была в 4 раза выше или в 4 раза ниже разовой дозы штаммов гВСО, родительского штамма ВСО или физиологического раствора, вводимых человеку. На 3-й день после вакцинации шесть животных умерщвляли для оценки быстроты действия данной вакцины у этих животных. Через 28 дней после вакцинации шесть оставшихся животных умерщвляли для оценки продолжительности действия этих вакцин у животных. В обоих случаях одновременно регистрировали массу тела каждого животного и осуществляли исследование на наличие макропатологий, а также проводили осмотр участков тела в месте инъекции. Затем брали кровь для биохимического анализа и проводили гистопатологический анализ внутренних органов и участков тела в месте инъекции.

Исследование иммунитета у мышей. Мышей С57В1/6 (самок в возрасте 5-6 недель), по 13 животных в каждой группе, подкожно иммунизировали 10⁶ к.о.е. гВСО, родительского ВСО или физиологического раствора. Другую группу здоровых мышей использовали в качестве нормального контроля. Через восемь недель после иммунизации мышей инокулировали штаммом М. ΐΒ Эрдмана (или резистентным к канамицину штаммом Η37Βν) путем аэрозольной ингаляции из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ к.о.е. штамма для инокуляции, т.е. в дозе, доставляющей ~100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано выше (Вгойш е1 а1., 1 1пГес1 Όίδ. 190(1): 115-122; 2004). Мониторинг выживаемости инокулированных животных проводили одновременно с мониторингом выживаемости неинокулированных животных. После инокуляции животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние. На 1-й день после инокуляции трех мышей в каждой группе умерщвляли и проводили анализ на уровни к.о.е. в легких для подтверждения дозы инокуляции, а одну мышь умерщвляли для проведения гистопатологического анализа селезенки и легких. Через пять недель после инокуляции девять животных в каждой группе умерщвляли и проводили гистопатологический и микробиологический анализ каждого животного. Ткани легких и селезенки, взятых у шести мышей, оценивали на уровни к.о.е. (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые добавляли селективные маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом Η37Βν, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Кап или ТСН (гидразид тиофен-2-карбоновой кислоты). Если инокуляцию проводили штаммом М. ΐΒ Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали ТСН (ВСО является восприимчивым штаммом, а М. ΐΒ обычно является резистентным).

Индуцирование кожной гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Морских свинок, не имеющих каких-либо обнаружимых патогенов (8ΡΡ), внутрикожно иммунизировали 10³ штамма гВСО или родительского штамма ВСО. Через девять недель после иммунизации спинки животных выбривали и чрескожно инъецировали 10 мкг ΡΡΌ (очищенного белкового деривата) в 100 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора. Через 24 ч измеряли диаметр твердого уплотнения (ГЗТ). Штаммы гВСО должны индуцировать ГЗТ, равную или превышающую ГЗТ, индуцируемую родительскими штаммами ВСО.

Исследование путем инокуляции морских свинок. Для определения эффективности гВСО-вакцин против инокулирующего патогена М. ΐΒ, морских свинок (молодых взрослых животных 8ΡΡ Нагйеу, массой 250-300 г, самцов), по 12 животных в группе, иммунизировали гВСО, родительским штаммом ВСО или физиологическим раствором. Вакцины и контроль вводили внутрикожно в дозе 10⁶ к. о. е. Через 10 недель после иммунизации животных, иммунизованных штаммом гВСО, штаммом ВСО и ложноиммунизованных животных заражали путем ингаляции аэрозоля, содержащего патоген М. ΐΒ и генерируемого из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ к. о. е. М. ΐΒ; и эта процеду

- 20 012434 ра позволяет вводить ~100 живых бактерий в легкие каждого животного, как было описано ранее (Вгобш е! а1., 2004). После инокуляции проводили мониторинг выживаемости, потери массы тела и общего состояния животных одновременно с мониторингом здоровых животных в группах, которые не были подвергнуты вакцинации и заражению. Через 10 недель после инокуляции шесть животных в каждой группе умерщвляли, а остальные шесть животных в каждой группе через 70 недель после инокуляции подвергали продолжительному обследованию. Одновременно проводили гистопатологический и микробиологический анализы каждого животного. Ткани легких и селезенки подвергали гистопатологическому анализу и анализу на уровни к. о. е. (для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали планшеты, в которые были добавлены селективные маркеры). Если инокуляцию проводили резистентным к канамицину штаммом Η37Βν, то для идентификации инокулирующего штамма от вакцинного штамма использовали Кап или ТСН. Если инокуляцию проводили штаммом М. 1Ь Эрдмана, то для идентификации вакцинного штамма от инокулирующего штамма использовали ТСН (ВСС является восприимчивым, а М. 1Ь обычно является резистентным). Исследование с применением инокуляции можно считать успешным в том случае, если ложноиммунизованные животные погибали вскоре после заражения, а гВСС-иммунизованные животные жили дольше, чем животные, иммунизованные родительским штаммом ВСС.

Исследования безопасности вакцин и картины заражения у приматов. Совсем недавно оценку эффективности вакцины против М. 1Ь проводили на приматах, не являющихся человеком. Эволюционное родство между человеком и другими приматами и аналогичные клинические и патологические симптомы туберкулеза у этих видов делают указанных приматов, не являющихся человеком, привлекательной моделью для экспериментальных исследований заболеваний ТБ и эффективности вакцин против ТБ.

Эта модель, характеризующаяся образованием каверн в легких, может быть, очевидно, использована для исследования развития ТБ у человека. За процессом инфицирования и развития заболевания наблюдали путем проведения рентгеновского анализа и оценки потери массы тела, а также путем проведения различных гематологических анализов, включая анализ на скорость оседания эритроцитов (СОЭ), анализ на пролиферацию мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) и продуцирование цитокинов, анализ на активность цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и анализ на гуморальные ответы. После инфицирования у собакоподобных обезьян развивалась патология легких с характерными поражениями, и в течение четырех-шести месяцев после инфицирования, в зависимости от дозы заражения, животные погибали от острой инфекции дыхательных путей. Более низкие дозы инфицирования могут приводить к возникновению хронических инфекций без развития заболевания, как это часто наблюдается у людей.

В этом исследовании проводили прямое сравнение различных доз родительского штамма ВСС с дозами рекомбинантного ВСС, вводимых отдельно, или с последующим введением двух бустер-доз вакцины, содержащей последовательности, сверхэкспрессирующиеся гВСС-конструкциях. Последние дозы могут быть введены любыми способами, без каких-либо ограничений, например, в виде рекомбинантного белка в подходящей адъювантной композиции, в виде ДНК-конструкции или в виде Α635конструкции.

В первом исследовании оценивали протективную эффективность родительского штамма ВСС по сравнению с гВСС-конструкциями, вводимыми без последующего применения бустер-инъекций. Это исследование, в котором участвовали три группы животных (по 10 животных в каждой группе), проводили в соответствии со следующим протоколом: одному животному из каждой группы вводили ВСС, гВСС и физиологический раствор. Двух животных из каждой группы подвергали кожному тесту на сверхэкспрессию антигенов в гВСС-конструкциях, а также тесту с использованием стандартного ΡΡΌ и физиологического раствора в качестве контроля. Явные и более крупные уплотнения у мышей гВССгруппы, наблюдаемые по сравнению с мышами ВСС-группы, указывали на то, что данная вакцина функционировала ίη νίνο и вырабатывала иммунный ответ. Остальных восемь животных из каждой группы инокулировали аэрозолем, содержащим низкую дозу штамма М. 1Ь Эрдмана, а уровень иммунного ответа определяли по снижению бактериальной нагрузки через 16 недель после заражения или по выживаемости как конечной цели исследования.

Протокол эксперимента по введению первичной дозы ВСС был, по существу, аналогичен описанному выше, за исключением того, что животных сначала вакцинировали штаммом ВСС, штаммом гВСС и физиологическим раствором, а затем вводили две бустер-дозы со сверхэкспрессированными антигенами.

Для изучения иммунобиологических и иммунопатологических аспектов туберкулеза у макак проводили исследования иммуногенности и иммунитета у приматов-моделей, не являющихся человеком, в целях оценки эффективности гВСС-конструкций. Перед началом эксперимента, неполовозрелых животных или молодых взрослых животных, содержащихся в неволе и имеющих среднюю массу 2-3 кг, подвергали длительной адаптации к условиям эксперимента. Исследования путем предварительной инокуляции предусматривали проведение основных анализов крови, которые включают рутинные гематологические анализы, анализы на скорость оседания эритроцитов, а также анализы на пролиферацию лимфоцитов. Перед инфицированием проводили кожные тесты с использованием ΡΡΌ для подтверждения от

- 21 012434 сутствия у животного чувствительности к туберкулину и рентгеновский анализ грудной клетки. Период иммунизации продолжался всего 21 неделю, в течение которых проводили первичную вакцинацию штаммом ВСС или гВСС, на неделю = 0, и бустер-инъекции антигенов на недели 12 и 16. Антигенспецифический иммунитет оценивали путем определения уровня пролиферации и секреции интерферона у (ΣΕΝγ) в тестах на стимуляцию лимфоцитов. Уровень продуцирования ΣΕΝγ лимфоцитами определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8РОТ) или клеточного сортинга с активацией флуоресценции (ЕАС8). Для этой цели брали пробы крови на недели 0, 4, 8, 12, 16 и 20 после первичной вакцинации.

Через четыре-шесть недель после последней иммунизации животных инокулировали путем интратрахеального введения 3 мл (1000 к. о. е.) штамма М. !иЬегси1ок1к Эрдмана в один и тот же день и одного и того же препарата. За процессом инфицирования наблюдали по потере массы, температуре, повышенной скорости оседания эритроцитов (СОЭ), РГЗТ в ответ на РРЭ, пролиферативному ответу ш уйго МКПК, стимулированных РРЭ и по уровню антигенов, сверхэкспрессируемых в гВСС, с последующим измерением, уровней продуцирования ΣΕΝγ. Для детекции патологий, ассоциированных с туберкулезом легких, проводили рентгеновский анализ грудной клетки, и наконец, через 12-16 недель после инокуляции, животных подвергали аутопсии.

Клиническая оценка ТБ-векторов и вакцин против ТБ.

Исследования на безопасность и токсичность. Преклинические исследования на безопасность и токсичность, разрешенные Федеральными Регуляторными органами, проводили аналогично преклиническим исследованиям на безопасность и токсичность, описанным выше. После этих исследований проводили исследования вакцин на безопасность для человека. Эти исследования сначала проводили с участием здоровых взрослых индивидуумов с отрицательным результатом теста на квантиферон, а затем аналогичные исследования проводили с участием детей и новорожденных.

Исследования на иммуногенность. Исследования на иммуногенность у мышей и приматов могут быть проведены стандартными методами оценки клеточного иммунитета, такими как, но не ограничивающимися ими, оценка уровней ΓΕΝγ, ЕЫ8РОТ, проточная цитометрия с кратковременной и длительной стимуляцией антигеном или пептидом и т.п. Аналогичные методы были применены для оценки ответов у человека. Для оценки СЭ4- и СЭ8-ответов после вакцинации человека проводили исследования с использованием тетрамеров.

Оптимизация стратегий комбинированной иммунизации прайм-буст. Штамм гВСС является достаточно эффективным при его использовании в качестве отдельно взятой вакцины против ТБ или других заболеваний, для борьбы с которыми он был сконструирован, где указанный штамм экспрессирует соответствующие антигены. Описанный здесь гВСС, служащий в качестве вакцины против ТБ или экспрессирующий антигены для выработки иммунитета против других заболеваний, также является исключительно эффективным для примирования иммунной системы в целях бустер-иммунизации рекомбинантными белками, смешанными с адъювантами или вирусными или бактериальными векторными антигенами. В преклинических исследованиях на животных и в исследованиях с участием человека, первичное введение ВСС с последующей бустер-инъекцией рекомбинантного белка/адъюванта или вектора оптимизировали в отношении схемы и дозы введения. Эти прайм-буст стратегии являются наиболее сильным средством для индуцирования иммунитета у человека, что обусловлено эффективностью первичного введения ВСС, описанного в настоящем изобретении, а также локализацией и усилением бустерответа иммунной системы на введение рекомбинантного белка или вектора.

Исследование действия терапевтической вакцины у животных после их заражения. Для выявления латентной инфекции использовали мышей С57ВЬ/6 (но могут быть использованы и другие животные), которым вводили терапевтические вакцины на той стадии, когда М. !Ь-специфический иммунитет, индуцированный низкой дозой инфекции, вырабатывался лишь на очень незначительном уровне, и на более поздней стадии, когда индуцированный М. !Ь-специфический иммунитет был пониженным, и основную его часть составляли лишь Т-клетки памяти. Затем, через 2 и 5 месяцев после введения последней терапевтической вакцины эту терапевтическую вакцину оценивали на терапевтическую эффективность путем подсчета числа к.о.е. в легких и селезенке отдельных мышей. Число к.о.е. в группах мышей анализировали стандартными статистическими методами, и полученные результаты использовали для того, чтобы определить, приводит ли терапевтическая вакцинация к значительному снижению латентной М. !Ьинфекции у мышей. Аналогичные методы, если это необходимо, могут быть применены для оценки иммунных ответов у других животных.

Клиническая оценка ВСС-векторов: пероральное введение гВСС-вакцин. Пероральная вакцинация нужного животного штаммом гВСС согласно изобретению может быть проведена описанными ранее методами (МШег е! а1., Сап Меб Аккос 1 121(1): 45-54; 1979). Количество перорально вводимого гВСС согласно изобретению может варьироваться в зависимости от вида индивидуума, а также от заболевания или состояния, подвергаемого лечению. В общих чертах, используемая доза содержит примерно 10³10¹¹жизнеспособных микроорганизмов, а предпочтительно примерно 10⁵-10⁹ жизнеспособных микроорганизмов.

- 22 012434 гВСС обычно вводят вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Выбор какого-либо конкретного фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя не имеет решающего значения для осуществления настоящего изобретения. Примерами разбавителей являются забуференный фосфатом физиологический раствор, буфер для забуферивания против действия кислоты желудочного сока, образующегося в желудке, такой как цитратный буфер (рН 7,0), содержащий сахарозу, отдельно взятый бикарбонатный буфер (рН 7,0) (Ьеуте е! а1., I. С1т. 1пуе§!., 79: 888-902; 1987; и В1аск е! а1., I. 1пГес1. Όΐδ.., 155: 1260-1265; 1987) или бикарбонатный буфер (рН 7,0), содержащий аскорбиновую кислоту, лактозу, и необязательно, аспартам (Ьеуте е! а1., см. выше, 1989; Рапсе! II: 467-470; 1988). Примерами носителей являются белки, например белки, содержащиеся в сепарированном молоке, сахара, например сахароза или поливинилпирролидон. Обычно эти носители используются в концентрации, составляющей примерно 0,1-90% (мас./об.), а предпочтительно в пределах 1-10% (мас./об.).

Пример 5. Безопасность для мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (8СГО).

Как упоминалось ранее, экспрессия Ь1о в ВСС является относительно неэффективной при стимуляции высвобождения из эндосомы, что, вероятно, обусловлено низкой активностью Ь1о при нейтральном рН микроокружения модифицированной эндосомы, в которой присутствует ВСС (Н姧, е! а1., Ргос. N11. Асай. 8с1. 95: 5299; 1998; Сгойе е! а1., I. С1т. 1пуе§!, I. С1т. 1пуе§!. 115(9): 2472; 2005). Тем не менее, экспрессия Ь1о, очевидно, приводит к модификации эндосомы, достаточной для снижения вирулентности ВСС-Ь1о⁺ у мышей 8СГО (Сгойе е! а1., 2005). Это наблюдение позволяет предположить, что направленный транспорт ВСС в цитоплазму клеток-хозяев может повышать иммуногенность и безопасность этой давно известной живой вакцины против ТБ. Поэтому целью данного исследования является оценка безопасности высвобождаемого из эндосомы штамма ΆΡν102, который экспрессирует РГоЛ_С1₃₇р у мышей 8СГО.

Для этой цели родительские штаммы ВСС Дания 1331 (ВСС_П31) и производный штамм ВСС1_33Ь которые экспрессируют РГоА_С1₃₇р, а также штамм АЕУ102 культивировали в 2-литровых колбах при перемешивании (150 об/мин) до достижения поздней логарифмической фазы (оптическая плотность при 540 нм = 6,5-7,5). Затем бактерии собирали путем центрифугирования и хранили при 1,5х 10⁹ к.о.е./мл при -80°С в физиологическом растворе + 0,05% (об./об.) тилоксапола + 10% (об./об.) глицерина.

Инокуляты получали путем оттаивания вышеуказанных заполненных сосудов на льду и приготовления серий серийных разведений в нормальном физиологическом растворе (0,85% мас./об. №СТ), не содержащем эндотоксина (<0,05 ЭЕ/мл). Эти разведения использовали для подкожной инокуляции групп, состоящих из 6 мышей 8СГО, соответствующими дозами, указанными в табл. 2, суспендированными в объеме 0,1 мл.

Таблица 2

Протокол исследования на безопасность для мышей 8СГО

Группа	Вакцина	Доза
1	РВЗ 1	_
2	ВСС1331	ЗхЮ4
3	ВС613з1	ЗхЮ5
4	ВСС1331	ЗхЮ6
5	ВСС1331	ЗхЮ7
6	АГУЮ2	ЗхЮ5
7	АЕУ102	ЗхЮ6
8	АЕУ102	ЗхЮ7
9	АЕУ102	ЗхЮ8

После инокуляции проводили мониторинг выживаемости мышей в течение 100 дней после заражения. Результаты этих исследований показали, что мыши, инокулированные штаммом АΡV102, жили дольше, чем мыши, которым была введена аналогичная доза ВСС1331.

Недавно внимание исследователей было обращено на использование гетерологичной бустервакцины для усиления иммунитета, вырабатываемого вакциной ВСС. Таким образом, у ВССпримированных лабораторных животных и людей вырабатывались сильные клеточные иммунные ответы после введения им гетерологичной бустер-вакцины, состоящей из модифицированной вакцины Анкара (МОД), кодирующей антиген 85А М. !Ь (обозначаемой здесь ^85^', также известной, как Ку3804с; Vо^йете^е^ е! а1., 1ттипо1. 112(3): 461; 2004; Мс81апе е! а1., №!иге Мей. 10(11): 1240; 2004); в отличие от относительно слабых ответов на вектор МVΆ-Άд85Ά, которые вырабатывались у непримированных индивидуумов (Мс81апе е! а1., 2004). Кроме того, независимые исследования показали, что у лабораторных животных, которые были примированы ВСС и которым была введена бустер-доза либо МVΆ-Άд85Ά (^Ш1ат§ е! а1., 1пГес! 1ттип. 73(6): 3814; 2005), либо субъединичной вакцины М!Ь72Г (Вгапй! е! а1., 1пГес!. 1ттип. 72(11): 6622; 2004), вырабатывались более высокие уровни резистентности к заражению М. !Ь, чем это было достигнуто путем вакцинации одной вакциной ВСС, используемой для

- 23 012434 дополнительного подтверждения этого подхода. Хотя эти исследования не установили четкой корреляции для такой защиты, однако очевидно, что стратегии гетерологичной прайм-буст-вакцинации являются эффективным средством для вырабатывания иммунитета против М. !Ь.

Поэтому в этом и в следующем примере проиллюстрированы исследования, целью которых была оценка высвобождаемого из эндосомы штамма АЕУ102 в схеме прайм-буст-вакцинации. Целью данного эксперимента, описанного в этом примере, является оптимизация интервалов времени в схеме праймбуст-вакцинации, при которой высвобождаемый из эндосомы штамм АЕУ102 используется для первичной иммунизации, а вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (Уоде1к е! а1., 1. У1го1. 77(15): 8263-71; 2003; Вагоисй е! а1., 1. 1ттипо1. 172(10): 6290; 2004), и содержащей экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из генов Ку3804сΚν188 6-Κν0288 М. !Ь под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Уоде1к е! а1., 1. У1го1. 77(15): 8263-71; 2003), используется для бустер-иммунизации. Бустер-дозу вводили интраназально (1.п.), поскольку аденовирусы, экспрессирующие антигены ТБ, являются более эффективными при введении именно этим методом, а не стандартным парентеральным способом введения (Шапд е! а1., 1. 1ттипо1. 173(10): 6357; 2004).

В соответствии с этим животные группы, состоящие из 10 самцов морских свинок 8РЕ Наг!1еу (250300 г), были иммунизованы, как описано в табл. 3, и их обследование проводили через 14, 18 и 21 неделю после прайм-буст-иммунизации.

Таблица 3 Протокол исследования, проводимого на морских свинках

Группа	Первичная иммунизация I (день 1)	Первичная иммунизация II (неделя 3)	Первичная иммунизация III (неделя 7)	Бустериммунизация (неделя 21)
1	Физиологический раствор (ΐ.ά.)	-	-	-
2	АГУ 102 (ΐ.ά.)	-	-	Αά35-ΤΒ8 (ΐ.η.)
3	-	АГУ 102 (ΐ.ά.)	-	Αά35-ΤΒ8 (ΐ.η.)
4	-	-	АГУ 102 (ΐ.ά.)	Αά35-ΤΒ8 (ΐ.η.)
5	-	-	-	Αά35-ΤΒ8 (ΐ.η.)

Примечание: А035-ТВ8 означает вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (Уоде1к е! а1., 1. У1го1., 77(15): 8263-71; 2003; Вагоисй е! а1., 1. 1ттипо1., 172(10): 6290; 2004), и содержащий экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из генов Ка3804с-Ку1886-Ку0288 М. !Ь под контролем раннего промотора цитомегаловируса (Уоде1к е! а1., 1. У1го1., 77(15): 8263-71; 2003).

Первичные дозы вводили внутрикожно (ΐ.ά.) в количестве 10⁶ к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам внутрикожно вводили только 0,1 мл 10% глицерина. Через 14 недель после введения первичной дозы морским свинкам вводили бустер-дозу, содержащую А035-ТВ8, и интраназально вводили дозу 10⁹ бляшкообразующих единиц (Уоде1к е! а1., 2003; Вагоисй е! а1., 2004), суспендированных в 10 мкл РВ8.

Через 14 недель после введения бустер-дозы животных инокулировали аэрозолем, содержащим штамм М. !Ь Эрдмана, и генерируемым из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ к.о.е. М. !Ь; эта процедура позволяет вводить ~100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано ранее (Вгодш е! а1., 2004). Через 5 недель после инокуляции животных в каждой группе умерщвляли и брали легкие и селезенку для проведения гистологического и микробиологического анализа. В последнем случае ткани легких и селезенки морских свинок оценивали на уровни к.о.е. Поскольку для инокуляции был использован штамм М. !Ь Эрдмана, то в эту среду добавляли ТСН для идентификации вакцинного штамма, восприимчивого к ТСН, от инокулирующего штамма.

Результаты данного исследования позволяют идентифицировать оптимальный интервал времени между введением первичной дозы гВСО и бустер-дозы А035-ТВ8.

Пример 6. Повторная иммунизация.

Для определения эффективности штамма АЕУ102 как вакцины-канцитата против М. !Ь-заражения, группы из 8 морских свинок (молодых взрослых морских свинок 8РЕ Наг!1еу, массой 250-300 г) иммунизировали, как описано в табл. 4.

- 24 012434

Таблица 4

Протокол исследования путем инокуляции морских свинок

Группа

Первичная иммунизация (день 1)

Бустер-иммунизация (неделя η*)

Физиологический раствор (ί.ά.)

Штамм ВСО Дания 1331 (ί.ά.)

Физиологический раствор (ί.ά.)

Αά35-ΤΒ8 (ΐ.η.)

ΑΡΥ102 (ί.ά.)

ΑΡΥ102 (ί.ά.)

ΑΡΥ102 (ί.ά.)

Α035-ΤΒ8 (ΐ.η.)

Инокуляция (бустердоза + 14 недель)

100 к.о.е. штамма

Эрдмана

100 к.о.е. штамма

Эрдмана

100 к.о.е. штамма Эрдмана

100 к.о.е. штамма

Эрдмана

100 к.о.е. штамма

Эрдмана

Примечание:

1. п* означает интервал времени между введением первичной дозы и бустер-дозы, величина кото рого определена в предыдущем примере.

2. АД35-ТВ8 означает вакцинный вектор серотипа 35, полученный на основе дефицитного по репликации аденовируса (УодеП е! а1., I. Уно1. 77(15): 8263-71; 2003; Вагоисй е! а1., I. 1ттипо1. 172(10): 6290; 2004), и содержащий экспрессионный кластер, кодирующий гибридный белок, состоящий из генов Ку3804с-Ку1886-Ку0288 М. !Ъ под контролем раннего промотора цитомегаловируса (УодеП е! а1., I. У1го1. 77(15): 8263-71; 2003).

Эти первичные дозы в группах 4 и 5 вводили внутрикожно в количестве 10⁶ к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам в группах 1 и 3 внутрикожно вводили только 0,1 мл 10% глицерина. Контрольным мышам в группе 2 вводили 10 к.о.е. ВСО штамма Дания 1331 в 0,1 мл 10% глицерина.

Через 14 недель после введения первичной дозы морским свинкам вводили бустер-дозу. Животным группы 5 вводили бустер-дозу, содержащую АТУ102, и внутрикожно вводили дозу 10⁶ к.о.е. в 0,1 мл 10% глицерина. Животным в группах 4 и 6 вводили бустер-дозы, содержащие АД35-ТВ8, и интраназально вводили дозу 10⁹ бляшкообразующих единиц (УодеП е! а1., 2003; Вагоисй е! а1. 2004), суспендированых в 10 мкл РВ8.

Через 14 недель после последней иммунизации животных инокулировали аэрозолем, содержащим

М. !Ъ и генерируемым из 10-миллилитровой моноклеточной суспензии, содержащей всего 10⁷ к.о.е. М. !Ъ; эта процедура позволяет вводить ~100 живых бактерий в легкие каждого животного, как описано ранее (ВгоФп е! а1., 2004). После инокуляции проводили мониторинг выживаемости животных, а также проводили наблюдение за здоровыми животными в невакцинированной, неинокулированной группе. Этих животных также обследовали на потерю массы и на общее состояние.

Результаты данного исследования продемонстрировали, что ложноиммунизованные животные очень быстро погибали после инокуляции; при этом животные, внутрикожно вакцинированные штаммом ВСО без введения бустер-инъекции, погибали только через определенное время после инокуляции, а животные, иммунизованные АРУ 102 с последующей интраназальной бустер-иммунизацией АД35-ТВ8, имели наибольшую продолжительность жизни.

Пример 7. Апоптоз.

Апоптоз представляет собой запрограммированную клеточную гибель, которая, по характеру и по последствиям ее индуцирования, значительно отличается от некротической клеточной гибели. Апоптоз клеток, содержащих чужеродные антигены, представляет собой известный мощный стимулятор развития клеточного иммунитета против таких антигенов. Механизм, посредством которого апоптоз антигенсодержащих клеток приводит к вырабатыванию клеточного иммунитета, иногда называют перекрестным примированием^{* 1, * * * М. 2 3}. Существует несколько механизмов индуцирования апоптоза, которые приводят к усилению антигенспецифического клеточно-опосредуемого иммунитета.

Опосредуемый каспазой 8 апоптоз приводит к вырабатыванию антигенспецифического клеточноопосредуемого иммунного ответа⁴. Продуцирование каспазы 8 в цитоплазме клеток рекомбинантным штаммом ВСО, который высвобождается из эндосомы, представляет собой дополнительный эффективный метод индуцирования запрограммированной клеточной гибели в присутствии чужеродных антигенов, экспрессируемых рекомбинантным штаммом ВСО, антигенов против ВСО и других туберкулезных антигенов, сверхэкспрессируемых рекомбинантным штаммом ВСО, а также против самих антигенов ВСО; и этот метод позволяет вырабатывать высокие уровни антигенспецифического клеточного иммунитета. Рецептор-5 гибели клеток (ΌΚ-5), также известный, как ΤΡΑΙΓ-Ρ2 (рецептор 2 ΤΡΑΙΓ) или ТЛРК-8Р-10В (член суперсемейства факторов некроза опухоли 10В), также индуцирует опосредуемый каспазой 8 апоптоз⁴. Индуцируемый реовирусом апоптоз опосредуется ΤΚΑΙΒ-ΌΒ5 и приводит к последующему выведению вируса⁵. Экспрессия ΌΚ-5 рекомбинантным штаммом ВСО, который высвобождается из эндосомы, должна обеспечивать сильное стимулирующее действие, направленное на индуциро- 25 012434 вание антигенспецифического клеточного иммунитета против гВСС-экспрессируемых антигенов. Апоптоз антигенэкспрессирующих клеток также может быть индуцирован посредством присоединения Раз, который является сильным стимулятором индуцирования антигенспецифических клеточных иммунных ответов⁶.

Рекомбинантный ВСС, высвобождающийся из эндосомы и экспрессирующий Раз или гибридный белок, содержащий цитоплазматический домен Раз/эктодомен СЭ4, индуцирует апоптоз и антигенспецифические клеточные иммунные ответы.

Усиление клеточного иммунитета под действием штаммов гВСС, высвобождающихся из эндосомы, или штаммов гВСС, которые высвобождаются из эндосомы и которые продуцируют дополнительные стимуляторы апоптоза, описанные выше, не ограничивается сверхэкспрессией только антигенов ВСС или антигенов, специфически кодируемых в гВСС, и оно может быть вызвано сверхэкспрессией любого антигена, присутствующего в эукариотической клетке, которая может быть инфицирована вышеупомянутым штаммом гВСС. Так, например, если такой штамм гВСС ввести в опухолевые клетки, апоптоз которых он индуцирует, то это будет приводить к вырабатыванию клеточного иммунитета против важных опухолевых антигенов с последующей элиминацией, подавлением или предотвращением роста опухоли и/или возникновения метастазов. Такой противоопухолевый эффект может быть продуцирован в дополнение к общему противоопухолевому эффекту, который вырабатывается штаммом ВСС при его местном введении, например, при раке мочевого пузыря.

В другом варианте настоящего изобретения гВСС высвобождаемый из эндосомы, или гВСС, высвобождаемый из эндосомы и стимулируемый посредством продуцирования специфических медиаторов апоптоза, доставляемых внутрь опухоли или других клеток, где указанный гВСС также продуцирует чужеродные антигены, против которых будут вырабатываться сильные клеточные иммунные ответы, будет индуцировать вырабатывание сильных клеточных ответов против этих опухолевых клеток или других эукариотических клеток, содержащих эти антигены. Такие клеточные ответы будут приводить к иммуноопосредуемой деструкции опухолевых клеток, а также к перекрестному примированию и индуцированию клеточного иммунного ответа против опухолевых или других важных антигенов с последующим уничтожением опухоли и/или метастазов или подавлением или предупреждением развития этой опухоли и/или метастазов. Примером такого чужеродного антигена является антиген НЬА, отличающийся от НЬА клеток-хозяев, против которого вырабатывается сильный гетерологичный клеточный ответ.

Штамм гВСС, который высвобождается из эндосомы, или гВСС, который высвобождается из эндосомы, и способность которого к индуцированию апоптоза усиливается путем экспрессии специфических медиаторов апоптоза, также экспрессирующих специфические опухолевые антигены, будет индуцировать сильные антигенспецифические клеточные ответы против этих опухолевых антигенов, включая подавление, до некоторой степени, толерантности к этим антигенам, что будет приводить к уничтожению опухоли и/или метастазов или к подавлению или предупреждению развития опухоли и/или метастазов, и не требует прямой доставки гВСС в саму опухоль.

Апоптоз, вызываемый разрушением ДНК или действием каспазы 9, индуцирует толерантность к некоторым антигенам.

Индуцирование толерантности играет важную роль в лечении или предупреждении аутоиммунных заболеваний, таких как, но не ограничивающихся ими, диабет, ревматоидный артрит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и рассеянный склероз. Продуцирование каспазы 9 или других белков, индуцирующих опосредуемую апоптозом толерантность, штаммом гВСС, высвобождающимся из эндосомы, в клетках, таких как, но не ограничивающихся ими, панкреатические β-клетки, клетки ободочной кишки и нервные клетки, будет приводить к ограниченному апоптозу, который будет индуцировать толерантность к антигенам-мишеням, индуцирующим аутоиммунитет в этих клетках, и тем самым благоприятствовать лечению или предупреждению аутоиммунных заболеваний. Идентификация специфических антигенов, участвующих в аутоиммунных реакциях, позволяет индуцировать толерантность к этим аутоиммунным антигенам-мишеням посредством продуцирования штаммом гВСС, высвобождающимся из эндосомы, этих антигенов и каспазы 9 или других молекул, способных индуцировать опосредуемую апоптозом толерантность. Такой гВСС может быть использован для лечения и/или предупреждения указанных аутоиммунных заболеваний.

Ссылки к примеру 7.

1. \ν.Ρ. НеаШ, С.Т. Век, С.М. Вейгепз, С.М. 8тйй, 8.Р. Рогейап, 1.А. Ралзй, С.М. Оатеу, N.8. \¥Пзоп, Р.К. СагЬопе, апб РА. УШапбапдоз, 2004. Сгозз-ргезеп!аюп, бегИпРс се11 зиЬзе!з, апб 1йе депегайоп оГ пптипйу !о се11и1аг апйдепз. 1ттипо1 Кет., 199: 9.

2. 8. Са11исс1, М. Ьо1кета, апб Р. Мактдег, 1999. №11ига1 аб)итап1з: Епбодепоиз асРтаЮгз о£ бепбгЮс се11з. №11иге Вю!есйпо1оду, 5: 1249.

3. М.Ь. А1Ьей, В. 8аи!ег, апб N. Вйабгб^а.), 1998. Оепб1г111с се11з асс.|шге апйдеп £гот арор!ойс се11з апб тбисе с1азз 1-гез1г1с(еб СТЬз. №!иге, 392: 86.

4. !Р. 8йепбап, 8.А. Магз!егз, К.М. Рйб, А. Сгипеу, М. 8ки!Ьа!сй, Ό. Ва1бтап, Ь. Катакпзйпап, СЬ. Сгау, К. Вакег, ν.Ι. -№ооб, А.Э. Соббагб, Р. Собо^зк1, апб А. Азйкепахк 1997. Соп!го1 о£ ТгаП тбисеб арор!оз1з Ьу а ГатПу о£ з1дпа1тд апб бесоу гесерЮгз. 8аепсе, 277: 818.

- 26 012434

5. Ρ. С1агке, 8.М. МейНхег. 8. 6ίΕ5οι·ι. С. У1йтапп, Τ.Ρ. ОатпдФп, О.Ь. Ιο^δο^ апй К.Ь. Ту1ег, 2000. Κ.еον^^иδ-^πйисей ηρορίοδίδ ίδ тей1а1ей Ь у ΤΚΑΙΕ. 1. νίτοί., 74: 8135.

6. МА СкаЦе^дοοπ. 1.1. К1т, 1.8. Уапд, Т.М. ΚοΕΕίπδοπ, Ό.Ι. Ьее, Т. ВеЩсНеу, О.М. Αίίδοπ, V. Αууаνοο, апй. Э.В. ХУетег 2000. Тагде1ей апйдеп йекгегу ίο апНдеп-ргехепНпд се11з тс1ийшд йепйгШс се11з Ьу епдшеегей Раз-тей1а1ей Βρορίοδίδ. №1. В^есИш^^у, 18: 974.

7. 8. Нидиез, Е. Мοидπеаи, У. Рег1ш, Ό. 1езке, Ρ. Ό. ^тапп, Ь. Веян^т, Ό. 8скпке, М. νοπ

НеггаШ, Α. Ьекиеп, апй N. ОЫскепепкаиз, 2002. ТИеи-тсе ίο 1з1е1 апйдепз апй р1^еп1юп Ггот ФаЬе1ез тйисей Ьу Пт1(ей аρορίοδ^δ οί рапсгеайс Ьеίа се11з. 1ттипйу, 1б: 1б9.

Пример 8. Сверхэкспрессия вакцинных антигенов в штамме гВСО, способном высвобождаться из эндосомы.

Для сверхэкспрессии ТБ-антигенов в штамме гВСО ΑΡν102, последовательности, кодирующие промотор Βν3031, функционально присоединенный к последовательностям, кодирующим Ру3804с (также известный, как Αд85Α), Ву188б (также известный, как Αд85В) и Ρν0288 (также известный, как ТВ 10.4), встраивали в ΡасI-сайт ρΑΡ100. Затем полученную плазмиду ρΑΡ105 (фиг. 12) гидролизовали рестриктирующей эндонуклеазой №е1 для удаления репликона Е. сο1^ и гена резистентности к канамицину, и подвергали рециркуляризации путем лигирования с лигазой Т4. Полученную ДНК (1-2 мкг) встраивали в штамм гВСО ΑΡν102 путем электропорации. Бактерии культивировали в 8,75-см планшетах, содержащих 25-30 мл твердой среды (среда ΙΗΜΕΕίΌοΙί 7Н10). После предварительного скрининга с помощью ПЦР для детекции колоний, содержащих антигенэкспрессирующую плазмиду, выбранную гВСО-колонию, которая была ΡίοΑ-позитивной и содержала кластер, экспрессирующий ТБ-антиген, обозначали ΑΡν112 и доводили до объема 500 мл в перемешиваемой жидкой среде (среда ΙΗΜΕΕίΌοΙί 7Н9) при 37°С. После того как культура достигала поздней логарифмической фазы роста, к 500 мл этой культуры добавляли глицерин до конечной концентрации 10% (об./об.), и маточный посевной материал хранили в 5-мл аликвотах при -80°С.

Чистота культур ВСО и гВСО может быть оценена путем равномерного посева 100-мкл аликвот культуры ВСО, серийно разведенной (например, 10-кратно разведенной чистой культуры (№а1) - 10^-8) в забуференном фосфатом физиологическом растворе ^В8), на 8,75-см чашках, содержащих 25-30 мл твердой среды, (среда ΙΗΜΕΕίΌοΙί 7Н10). Для подтверждения присутствия нужного генотипа в каждом изоляте гВСО проводили ПЦР и анализ плазмидной ДНК с использованием рестриктирующей эндонуклеазы.

Кроме того, для подтверждения присутствия полноразмерных генов, ПЦР-генерированные ДНКфрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе методом обрыва дедезоксинуклеотидной цепи.

Для оценки секреции ΡίοΑ штаммами ΑΡν102 и ΑΡν112, содержащими плазмиду, экспрессирующую антиген ТБ, оба штамма культивировали до середины фазы логарифмического роста, как описано выше. Затем супернатанты этих культур собирали и фильтровали через мембранные 0,2-мм фильтры, как описано в литературе (Незз еί а1., Бгос. Νίί. Αсай. 8ск, 95: 5299-304; 1998). Затем белки фильтрата культуры оценивали на гемолитическую активность, как описано выше. Полученные результаты показали, что штаммы ΑΡν102 и ΑΡν112 обнаруживают аналогичные уровни гемолитической активности, и что штамм ΑΡν112 сохраняет аллель Δυ^χΩρίοΑ^γρ и экспрессирует функциональный белок ΡίοΑ.

И наконец, экспрессию ТБ-антигенов оценивали в белках супернатантов культуры, выделенных с помощью электрофореза в 10-15% ПААГ с ДСН. Результаты указывали на повышенный уровень экспрессии Ку3804с и Ру188б. Поскольку не было высказано каких-либо предположений относительно сверхэкспрессии Βν0288 в супернатанте данной культуры, то вывод о сверхэкспрессии этого 10 кДа белка, который экспрессируется из той же мРНК, что и Ру3804с и Яу188б, был сделан, исходя из наблюдения сверхэкспрессии Ру3804с и Ру188б.

В целом, этот пример продемонстрировал, что может быть генерирован штамм гВСО, который будет экспрессировать ΡίοΑ и сверхэкспрессировать ТБ-антигены. Такой штамм может служить в качестве вакцины против ТБ второго поколения.

Хотя настоящее изобретение подробно описано со ссылками на конкретные варианты его осуществления, однако, для специалиста в данной области очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные замены и модификации, не выходящие за рамки существа и объема изобретения.

Claims (35)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Микобактерия (Му^ка^еЛит), генетически сконструированная так, что она включает экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок, который является активным при рН б-8, где указанным экспрессируемым и секретируемым функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из СЬбййшш или его мутант.
2. 2. Микобактерия по п.1, где аминокислотная последовательность указанного экспрессируемого и секретируемого функционального эндосомолитического белка представлена последовательностью 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2.

   - 27 012434
3. 3. Микобактерия по п.1, где указанный экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок кодируется генной последовательностью, специфичной для перфринголизина или его мутанта.
4. 4. Микобактерия по п.3, где указанная генная последовательность выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8ЕО ΙΌ N0: 3.
5. 5. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза.
6. 6. Микобактерия по п.5, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Рах и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Рах и эктодомена 0Ό4.
7. 7. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген.
8. 8. Микобактерия по п.1, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген.
9. 9. Микобактерия, генетически сконструированная так, что она включает экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок, который является активным при значении рН в эндосомах клеток, инфицированных указанной микобактерией.
10. 10. Микобактерия по п.9, где указанным экспрессируемым и секретируемым функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин или его функциональный вариант.
11. 11. Микобактерия по п.9, где аминокислотная последовательность указанного экспрессируемого и секретируемого функционального эндосомолитического белка представлена последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 2.
12. 12. Микобактерия по п.9, где указанный экспрессируемый и секретируемый функциональный эндосомолитический белок кодируется генной последовательностью, специфичной для перфринголизина или его мутанта.
13. 13. Микобактерия по п.12, где указанная генная последовательность выбрана из группы, состоящей из 8ЕО ΙΌ N0: 1 и 8ЕО ΙΌ N0: 3.
14. 14. Микобактерия по п.9, где указанной микобактерией является ВСС.
15. 15. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза.
16. 16. Микобактерия по п.15, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Рах и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Рах и эктодомена ί.Ό4.
17. 17. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген.
18. 18. Микобактерия по п.9, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген.
19. 19. Способ индуцирования высвобождения микобактерии из эндосом, включающий стадию генетического конструирования указанной микобактерии так, чтобы она содержала, экспрессировала и секретировала функциональный эндосомолитический белок, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из С1ох!пбшш или его мутант.
20. 20. Способ по п.19, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является мутантный перфринголизин О, кодируемый 8ЕЦ ΙΌ N0: 3.
21. 21. Способ по п.19, где указанной микобактерией является аттенуированная микобактерия.
22. 22. Способ по п.21, где указанной аттенуированной микобактерией является ВСС.
23. 23. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза.
24. 24. Способ по п.23, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Рах и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Рах и эктодомена ί.Ό4.
25. 25. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген.
26. 26. Способ по п.19, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген.
27. 27. Вакцинный препарат, включающий микобактерию, генетически сконструированную так, что она экспрессирует и секретирует функциональный эндосомолитический белок, который является активным при нейтральном рН, где указанным функциональным эндосомолитическим белком является перфринголизин О из С1ох!пбшш или его мутант.
28. 28. Вакцинный препарат по п.27, где указанным функциональным эндосомолитическим белком яв

    - 28 012434 ляется мутантный перфринголизин О, кодируемый 8Е^ II) ΝΟ: 3.
29. 29. Вакцинный препарат по п.27, где экспрессия указанного функционального эндосомолитического белка указанной микобактерией способствует высвобождению указанной рекомбинантной микобактерии из эндосом.
30. 30. Вакцинный препарат по п.27, где указанной микобактерией является аттенуированная микобактерия.
31. 31. Вакцинный препарат по п.30, где указанной аттенуированной микобактерией является ВСб.
32. 32. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза.
33. 33. Вакцинный препарат по п.32, где указанный апоптотический белок или указанный функциональный энхансер гена апоптоза выбран из группы, состоящей из каспазы 8, рецептора гибели-5, Рак и гибридного белка, состоящего из цитоплазматического домена Рак и эктодомена СЭ4.
34. 34. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует представляющий интерес ген.
35. 35. Вакцинный препарат по п.27, где указанная микобактерия генетически сконструирована так, что она функционально экспрессирует апоптотический белок или функциональный энхансер гена апоптоза и представляющий интерес ген.