KR20070101855A - 엔도솜을 이탈하는 능력이 보강된 재조합 비씨지 균주 - Google Patents

Abstract

제 I 형 조직적합성-제한된 CD8⁺ T 세포 면역 반응을 유도하는 능력이 보강된 마이코박테리움 균주를 제공한다. 상기 마이코박테리움 균주를, 중성 pH에서 활성인 에도솜분해성 단백질(예를 들어 퍼프링고리신 O)을 발현하여 상기 마이코박테리움이 엔도솜으로부터 세포의 세포질 내로 이탈될 수 있게 유전자 가공한다. 본 발명은 또한 상기 마이코박테리움 균주를 함유하는 백신 제제를 제공한다.

CD8+ T 세포 면역 반응, 마이코박테리움 균주, 에도솜분해성 단백질

Description

엔도솜을 이탈하는 능력이 보강된 재조합 비씨지 균주{RECOMBINANT BCG STRAINS WITH ENHANCED ABILITY TO ESCAPE THE ENDOSOME}

본 발명은 면역 반응을 유도하는 능력이 보강된 마이코박테리움 균주를 제공한다. 생체 내 실험은 예를 들어 제 I 형 주 조직적합성-제한된 CD8⁺ T 세포 면역 반응을 입증하였다. 특히, 본 발명은 엔도솜으로부터 상기 마이코박테리움의 이탈을 허용하는 퍼프링고리신 O(PfoA) 단백질을 발현하는 마이코박테리움 균주, 및 상기 마이코박테리움 균주를 함유하는 백신 제제를 제공한다.

마이코박테리움 튜베르큘로시스(M.tb)는 전 세계 인구의 1/3을 감염시켜 왔으며, 매년 8백만 명에서 활동성 질병을 일으키고 160만 내지 220만 명이 사망하였으며, 이들 중 대부분은 개발도상국 국민이다. 결핵(TB)은 HIV의 만연과 엇갈려 점점더 증대하고 훨씬 더 치명적으로 되고 있는 세계적인 규모의 전염병이다.

마이코박테리움 보비스의 감독된 균주이고 현재 광범위하게 사용되고 있는 TB 백신인 바실리 칼메트 게랭(BCG)이 80년 전에 개발되었으며 시험 시 폐결핵에 대한 효능은 광범위하게 가변적인 비율을 가졌고, 인도에서 수행된 최종의 대규모 시험에서는 효능이 없었다(Fine et al., Vaccine, 16(20):1923-1928; 1998; Anonymous, Indian J Med Res., Aug;110:56-69; 1999). 그럼에도 불구하고, 세계 보건 기구는 현재 TB가 매우 유행하고 있는 국가에서 모든 아동들(HIV 질병/AIDS 증상이 있는 아동 제외)에게 출생 시 또는 공공 의료 서비스와 최초 접촉 시 BCG를 권장하고 있다. 이러한 정책은 BCG가 TB의 심각한 아동기 형태를 방지하는 증거를 근거로 한다(Lanckriet et al., Int J Epidemiol, 24(5):1042-1049; 1995; Rodrigues et al., J Epidemiol Community Health 45(1):78-80; 1991). 초기 아동기 이후의 TB에 대한 BCG에 의한 보호는 혼합된 결과를 제공하는 제한된 데이터와 함께 논의의 여지가 있는 주제이다. 그러나, 유아 BCG 면역이 광범위하게 실시되는 개발 도상국에서 소아 및 성인 TB의 높은 발병률은 현재 투여되는 BCG가 TB 질병의 위험이 있는 사람들에게는 수년간에 걸쳐 그 다지 효능이 없음을 가리킨다. 따라서, BCG는 TB의 중재 및 억제에 부적합한 공중 보건 도구인 것으로 간주된다.

TB 유기체에 노출된 인간의 대략 70% 및 정상적인 면역계를 갖는 인간은 감염되지 않으며, 감염된 사람들 중 단지 약 5%만이 처음 2 년 내에 발병한다. 감염된 개인의 대부분은 상기 감염을 억제하며, 이는 엠 티비 항원에 대한 강건한 세포 면역 반응의 발생과 관련이 있다. 추가로 5%는 면역성이 쇠퇴하는 경우 나중에 활동을 재개한다. 최초 및 재활동 질병은 모두 HIV/AIDS 환자에서 훨씬 더 흔하며, 이는 감염의 예방 및 억제에서 면역성의 역할을 다시 한번 강조한다.

대부분의 인간은 TB를 억제할 수 있기 때문에, 적합한 종류의 면역성이 오래 지속되도록 유도함으로써 노출 후 초기 감염을 방지하고, 질병으로의 조기 진행을 방지하고, 잠재적인 상태로부터의 재활동을 방지하고, 치료 후 재발을 방지하는 유 효 백신을 개발할 수 있음을 희망하는 것은 타당하다. 궁극적으로, 전신 백신 사용 + 화학요법적 중재의 조합은 결국 인간 병원체로서 엠 티비를 제거할 것이다.

아동기 BCG 예방접종이 급성 TB의 예방을 수행하는 것으로 생각되는 중요한 역할에 비추어, 새로운 TB 백신이 우수한 제품이라는 증거를 간과하지 않으면서 후보 TB 백신을 평가하는 시험에 BCG를 대체하기는 어렵다. 문제는 엠 티비가 인간 특이성 병원체이며 동물 모델은 단지 숙주-병원체 상호작용의 일부를 모방한다는 것이다. 따라서, 새로운 TB 백신이 개선된 효능을 갖는다는 명확한 증거는 오직 인간에서 조절된 방면의 시험으로부터 획득할 수 있다. 이러한 사실은 많은 연구자들로 하여금 개선된 TB 백신을 향한 중요 단계가 BCG의 면역원성을 개선시키는 것이라는 결론을 내리게 하였다.

상기와 같은 전략의 일례는 면역 반응을 보강하기 위해 T 세포를 유도하거나 활성화시키는 BCG의 능력을 개선시키는 것이다. 엠 티비에 대한 면역성에서 제 I 형 주 조직적합성-제한된 CD8⁺ T 세포의 중추적인 역할은 실험적인 엠 티비 감염을 억제함에 대한 β2-마이크로글로불린(β2m)-결핍 마우스의 실패에 의해 입증된다(Flynn et al., PNAS USA, 89(24):12013-12017; 1992). 제 I 형 조직적합성-제한된 CD8⁺ T 세포의 중추적인 역할은 실험적인 엠 튜베르큘로시스 감염을 억제함에 대한 β2-마이크로글로불린(β2m)-결핍 마우스의 실패에 의해 설득력 있게 입증되었다(Flynn et al., 상기 1992). 상기 돌연변이 마우스는 제 I 형 조직적합성이 결여되었기 때문에, 작용성 CD8⁺ T 세포를 나타낼 수 없다. 엠 튜베르큘로시스 감 염과 대조적으로, β2m-결핍 마우스는 BCG 백신 균주의 몇몇 감염 용량을 조절할 수 있다(Flynn et al., 상기, 1992; Ladel C.H., et al., Eur J Immunol, 25:377-384; 1995). 더욱 또한, β2m-결핍 마우스의 BCG 예방접종은 단지 엠 튜베르큘로시스 감염 후 생존을 연장시킨 반면, BCG-면역된 C57BL/6는 엠 튜베르큘로시스에 내성을 나타내었다(Flynn et al., 상기, 1992).

상기 엠 튜베르큘로시스와 BCG간의 차별적인 CD8⁺ T 세포 의존성을 하기와 같이 설명할 수 있다: 엠 튜베르큘로시스 항원은 BCG로부터의 항원보다 세포질에 보다 잘 접근하여 보다 현저한 제 I 형 조직적합성을 나타낸다(Hess and Kaufmann, FEMS Microbiol. Immunol 7:95-103; 1993). 결과적으로, 보다 유효한 CD8 T 세포 반응이 엠 튜베르큘로시스에 의해 생성된다. 이러한 개념은 최근에, BCG보다는 항원 제공 세포(APC)의 동시적인 엠 튜베르큘로시스 감염에 의해, 무관한 항원인 오브알부민의 증가된 제 I 형 조직적합성 발현에 의해 지지되었다(Mazzaccaro et al., Proc Natl Acad Sci USA, Oct 15:93(21):11786-91; 1996).

따라서, 엠 티비 항원은 BCG로부터의 항원보다 숙주 세포 세포질에 더 잘 접근하여, 증가된 제 I 형 조직적합성을 나타내고(Hesss et al., 상기, 1993) 엠 티비에 대한 상승된 CD8⁺ T 세포 반응을 나타낸다. 더욱이, 엠 티비는 마우스 및 인간에서 제 I 형 조직적합성-제한된 CD8⁺ 세포독성 T 세포뿐만 아니라 항원 특이성 제 2 형 조직적합성-제한된 CD4⁺ T 헬퍼 세포를 자극한다(Kaufmann, Annu Rev Immunol 11:129-163; 1993). 연장에 의해, 상기 사실은 엠 티비 감염 세포가 제 I 형 조직적합성-제한된 CD8⁺ 세포독성 T 세포에 의한 인식에 민감함을 가리킨다. TB 유기체에 노출된 면역적격(immunocompetent) 인간의 70%가 감염되지 않는다고 할 때, 엠 티비 감염에 의해 유도된 면역성은 광범위한 경우에 상기 유기체를 억제하는데 매우 유효하다. 따라서, 기존 TB 백신 균주 BCG의 효능은 제 I 형 조직적합성-제한된 CD8⁺ 세포독성 T 세포 반응을 유도하는 BCG의 능력을 증가시킴으로써 개선될 수 있는 것으로 여겨진다(Kaufmann, Fundamental Immunology, 1997).

대체로, 식포 결합된 채로 있는 병원체에 의해 발현된 항원은 주로 제 2 형 조직적합성 분자에 의해 CD4⁺ T 세포에 제공되지만, CD8 T⁺ 세포(통상적으로 제 I 형 조직적합성 분자와 관련하여 제공된 항원을 인식한다)에 의해서는 불충분하게 인식된다(Kaufmann, 상기, 1997). 대조적으로, 상기 식포를 이탈하여 숙주 세포의 세포질에서 복제하는 세포 내 세균, 예를 들어 리스테리아 모노사이토제네스(예를 들어 ATCC#13932)가 제 I 형 조직적합성 항원 제공 경로의 접근 및 CD8⁺ T 세포 반응의 유도에 유효하다(Berche et al., J Immunol, 138:2266-2276; 1987). 리스테리아 모노사이토제네스의 상기 엔도솜 이탈 작용은 최근에 리스테리오리신(Llo)을 암호화하는 서열을 도입시킴으로써 감독된 살모넬라(통상적으로 식포 중에 존재한다)로 옮겨졌다; 생성된 균주는 엔도솜 이탈을 나타내었으며 CD8⁺ T 세포 반응의 유도에 보다 유효하였다(Bielecki et al., Nature(London), 354:175-176; 1990; Gentschev et al., Infect Immun 63(10):4202-4205; 1995; Hess et al., Host Response to Intracellular Pathogens, 75-90; 1997). 보다 최근에, 상기 접근법을 BCG에 적용하였으며; 따라서 Llo를 분비하는 rBCG 균주를, 제 I 형 조직적합성-제한된 면역 반응을 유도하는 BCG의 능력을 개선시키도록 제작하였다(Hess et al., PNAS USA, 95(9):5299-5304; 1998). 초기 증거는 rBCG-Llo⁺ 균주가 CD8⁺ T 세포의 유도에 보다 적합함을 제시하였지만, 상기 균주는 엔도솜을 이탈할 수 없는 것으로 나타났다. 따라서, 이러한 접근법의 한계는 엔도솜 이탈에 필요한, Llo의 용혈 작용이 단지 pH 5.5에서만 충분히 활성이고 pH 7.0에서는 거의 불활성이라는 것이다. 마이코박테리움은 엔도솜의 pH를 약 7.0의 값에서 유지시키므로, 지금까지 보고된 rBCG-Llo 균주에서 Llo가, 상기가 발현된 환경이 용혈 활성 크기에 대해 최적 이하이므로, 기능장애인 것으로 추측하는 것이 논리적이다(Geoffroy et al., Infect Immun 55(7):1641-1646; 1987). 따라서, 상기 접근법의 면역 보강 이점은 Llo를 BCG-조작된 엔도솜에서 작용할 수 있도록 하는 전략이 개발될 때까지 실현되지 않을 것이다.

따라서 종래 기술은 엔도솜 이탈 능력이 증가된 rBCG를 제공하고 이에 의해 예를 들어 제 I 형 주 조직적합성-제한된 CD8⁺ 세포독성 T 세포 반응의 유도를 증가시키는데 실패하였다.

발명의 요약

본 발명의 예시적인 태양은 제 I 형 주 조직적합성(MHC)-제한된 CD8⁺ T 세포 면역 반응을 유도하는 능력이 보강된 재조합 BCG(rBCG) 균주를 제공한다. 상기 신규의 rBCG 균주는 중성 근처의 pH 값(예를 들어 약 pH 6 내지 8 또는 약 6.5 내지 7.5)에서 생물활성인 작용성 엔도솜분해성(endosomalytic) 단백질을 발현하도록 유전자 가공되었다. 따라서 상기 엔도솜분해성 단백질은 마이코박테리움 함유 엔도솜(전형적으로는 중성 근처의 내부 pH를 갖는다) 내에서 활성이다. 상기 rBCG에 의해 생산된 엔도솜분해성 단백질의 활성은 엔도솜을 파괴시켜, 상기 rBCG가 상기 엔도솜으로부터 세포의 세포질 내로 이탈될 수 있게 한다. 따라서 상기 rBCG는 세포질에 노출되고 강한 T-세포 반응, 특히 강한 MHC-I-제한된 CD8⁺ 세포독성 T 세포 반응을 유도한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 유전자 가공에 의해 rBCG 내로 도입된 엔도솜분해성 단백질은 클로스티리디움 퍼프린젠스로부터의 퍼프링고리신 O(PfoA)이다.

따라서 본 발명은 중성 pH에서 활성인 작용성 엔도솜분해성 단백질을 발현하고 분비하도록 유전자 가공된 마이코박테리움을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 작용성 엔도솜분해성 기공 형성 단백질은 PfoA, 또는 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 돌연변이 PfoA(본 발명에서 PfoA_G137Q라 칭한다)이다. 상기 마이코박테리움에 의한 작용성 엔도솜분해성 단백질의 발현은 상기 rBCG의 엔도솜으로부터의 이탈을 허용한다. 상기와 같이 유전자 가공된 마이코박테리움은 BCG와 같은 감독된 마이코박테리움일 수 있다. 본 발명은 또한 PfoA를 발현하고 분비하도록 유전자 가공된 마이코박테리움; 및 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 PfoA_G137Q를 발현하고 분비하도록 유전자 가공된 마이코박테리움을 제공한다.

본 발명은 또한 마이코박테리움 유도체를 엔도솜으로부터 이탈될 수 있게 하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 마이코박테리움을 작용성 엔도솜분해성 단백질, 예를 들어 PfoA 또는 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 PfoA_G137Q를 함유하고, 발현하고 분비하도록 유전자 가공하는 단계를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 마이코박테리움은 감독된 마이코박테리움, 예를 들어 BCG이다.

본 발명은 또한 백신 제제를 제공하며, 상기 제제는 중성 pH에서 활성인 작용성 엔도솜분해성 단백질을 발현하고 분비하도록 유전자 가공된 마이코박테리움을 포함한다. 상기 작용성 엔도솜분해성 단백질은 예를 들어 PfoA 또는 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 PfoA_G137Q일 수 있다. 상기 마이코박테리움에 의한 작용성 엔도솜분해성 효소의 발현은 상기 재조합 마이코박테리움을 엔도솜으로부터 이탈될 수 있게 한다. 일부 실시태양에서, 상기 마이코박테리움은 감독된 마이코박테리움, 예를 들어 BCG이다.

도 1은 자살 벡터 pAF102의 지도이다. DNA 구획 각각에 대한 기호설명은 하기와 같다: L-측면 및 R-측면: 각각 ureC 유전자의 왼쪽 및 오른쪽 측면; pfoA는 137 G(Q)에서 단일 아미노산 변화를 갖는 퍼프링고리신 O의 돌연변이 형태를 암호화하는 유전자이고(유전자 역 수탁 번호: BA000016); LP_PAg85B는 항원 85B(즉 Rv1886c) 리더 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이고; P_Ag85A는 항원 85A 유전자(즉 Rv3804c)의 프로모터 서열이고; aph는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(유전자 은행 수탁 번호: X06402)이며, 플라스미드에 가나마이신 내성을 부여하고; OriE는 pUC 복제 기원이고(유전자 은행 수탁 번호: AY234331); Ble는 플라스미드에 제오신 내성을 부여하는 유전자이고(유전자 은행 수탁 번호: L36850); SacB는 슈크로스에 대한 세균 감수성을 부여하는 레반슈크라제를 암호화하는 유전자이고(유전자 은행 수탁 번호: Y489048); P_hsp60은 열충격 단백질 유전자(즉 Rv0440)의 프로모터 서열이고; MCS는 지시된 제한 효소에 대한 복합 클로닝 부위이다. 2 개의 PacI 부위 간의 카세트를 적용 가능한 경우 다른 엔도솜분해성 효소로 대체시킬 수 있다.

도 2A 및 B에서 A는 클로스트리듐 퍼프린젠스로부터의 PfoA의 유전자 서열(서열식별번호: 1)이고; B는 클로스트리듐 퍼프린젠스로부터의 PfoA의 유전자 서열(서열식별번호: 2)이다.

도 3은 바람직한 돌연변이체 PfA_G137Q의 유전자 서열(서열식별번호: 3)이다.

도 4는 주요 대립유전자 교환 단계에 대한 흐름도이다.

도 5는 상기 대립유전자 교환 플라스미드 pAF102에 대한 제한 효소 절단이다.

레인 1: 1 kb + DNA 리더; 레인 2: 제한 효소 EcoRI에 의해 절단된 플라스미드 pAF102; 레인 3: 플라스미드 pAF102 절단되지 않은 대조군; 레인 4: 제한 효소 EcoRI에 의해 절단된 PFO 카세트 삽입물이 없는 벡터 플라스미드 pAF100; 레인 5:PFO 카세트 삽입물 절단되지 않은 대조군이 없는 벡터 플라스미드 pAF100. 상기 도면으로부터 플라스미드 pAF100이 예상된 대로 제한 효소 EcoRI에 의해 선형화되어 4.4 kb 크기의 단일 밴드를 생성시킨다. 상기 플라스미드 pAF102는 예상된 대로 제한 효소 EcoRI에 의해 각각 2.3 kb 및 6.0 kb 크기의 2 개의 밴드를 생성시켰다.

도 6은 ΔureC::pfoA의 유전자형에 대해 선택된 콜로니의 PCR 분석이다. PCR을 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 수행하였다. PCR 산물을 1.2% 아가로스 젤에서의 젤 전기영동에 의해 분석하였다. 사용된 DNA 사다리는 1Kb + DNA 표준물(Invitrogen으로부터 구입된다)이었다. 레인 1 내지 6: 각각 콜로니 번호 105-1 내지 105-6에 대한 PCR; 레인 7 및 레인 8: 각각 콜로니 번호 142-7 및 142-10에 대한 PCR. 레인 9: BCG 데니쉬 1331 균주에 대한 PCR.

도 7은 AFV102의 생육 및 가나마이신 감수성이다. AFV102, BCG 데니쉬 1331 및 PfoA 구조물 부분 이배수체(Pfo105MI)로부터의 세균을 7H9 생육 배지에 접종하고 각 균주의 생육을 상이한 시점에서 600 ㎚에서의 광학 밀도를 측정하여 비교하였다. 가나마이신 감수성 시험을 위해서, 항생제를 50 ug/㎖의 최종 농도로 가하고 생육을 상기와 같이 측정하였다. 기호 약어: Ctrl: 임의의 세균 접종이 없는 대조용 배지; +Kan 또는 -Kan: 배지 중의 가나마이신의 존재 또는 부재.

도 8은 J774A.1 세포에서 AVF102에 대한 세포독성 시험이다. 세포를 AFV102 또는 BCG 데니쉬 1331로 감염시켰다. 지시된 감염 후 시점에서, 세포 생육력을 감염되지 않은 대조군과의 비교에 의해 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 측정하였다.

도 9는 대식세포에서의 생존 능력에 대한 AFV102의 시험이다. J774A.1 단층 세포를 AFV102 또는 BCG 데니쉬 1331로 감염시키고 지시된 감염 후 시점에서 세포 내 세균을 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 열거하였다.

도 10은 pH 독립적인 용혈 활성을 갖는 Pfo 단백질을 분비하는 능력에 대한 AFV102의 시험이다. 상기 AFV102 배양물을 앞서 개시한 바와 같이 제조하고 상등액을 pH 7.0 및 5.5에서 적혈구를 용해시키는 그의 능력에 대해 시험하였다. 헤모리신 활성을 물질 및 방법에 개시된 바와 같이 측정하였다.

도 11A 내지 D는 도 3의 결과를 도식적으로 예시한다. A: 세균(짙은 타원)은 세포(육각형) 내에서 대식세포(회색 타원)를 침입하여 초기 엔도솜의 형성을 자극하고; B: BCG는 엔도솜 성숙을 정지시키고 BCG는 상기 초기 엔도솜 내부에서 보호되고; C: PfoA를 발현하는 AFV102 세균이 침입 후 초기 엔도솜에서 초기에 발견되나; 상기는 PfoA를 분비하고 엔도솜을 이탈하기 시작할 것이며; D: PfoA를 발현하는 AFV102 세균이 엔도솜으로부터 빠져나오거나 상기 세포에 존재하지 않음을 볼 수 있다.

도 12는 발현 벡터 pAF105 상의 항원 지도이다. DNA 구획 각각에 대한 기호설명은 하기와 같다: P_Rv3130은 항원 Rv3130c의 프로모터 서열이고; P_Ag85B는 항원 Rv1886c의 프로모터 서열이고; 발현 카세트 중의 유전자들은 Rv0288; Rv1886c 및 Rv3804c이고; aph는 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제 유전자(유전자 은행 수 탁 번호: X06402)이며, 가나마이신 내성을 부여하고; OriE는 pUC 복제 기원이고(유전자 은행 수탁 번호: AY234331); leuD는 3-아이소프로필말레이트 데하이드라타제를 암호화하는 유전자(즉 Rv2987c)이고; OriM은 마이코박테리움 중의 복제 기원이다(유전자 은행 수탁 번호: M23557).

본 발명은 엔도솜으로부터 이탈하고 감염시킬 세포의 숙주 세포 세포질에 접근할 수 있는 rBCG를 제공한다. 그 결과, 상기 rBCG에 대한 우수한 CD8⁺ T-세포 반응이 상기 세포에서 유도된다.

상기 rBCG를 상기 rBCG에 의해 발현되고 분비되며 상기 rBCG의 엔도솜 이탈을 매개하는 작용성 엔도소말리신을 함유하도록 유전자 가공한다. 본 발명에서 엔도소말리신이란 용어는 세균 세포가 엔도솜으로부터 시토솔 내로 통과할 수 있게 하기에 충분히 상기 엔도솜 막을 붕괴시킬 수 있는 단백질을 지칭한다. 본 발명에서 엔도솜분해성이란 용어는 상기 붕괴 활성을 갖는 단백질과 관련된다. 본 발명에서 엔도솜 분해란 용어는 세균 세포가 엔도솜으로부터 시토솔 내로 통과할 수 있게 하기에 충분히 상기 엔도솜 막을 붕괴시키는 과정을 지칭한다. 엔도솜 분해성 단백질은 중성 부근의 pH 값을 갖는 환경, 예를 들어 마이코박테리움으로 감염된 세포의 엔도솜 내에서 활성이며, 따라서 상기 세균의 세포질 내로의 이탈을 매개한다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명의 rBCG 균주 내로 도입된 작용성ddpsehtha분해성 단백질은 클로스트리듐 퍼프린젠스로부터의 PfoA 또는 그의 작용성 변체이다. PfoA는 PfoA 유전자(유전자은행 수탁 번호# CPE0163)에 의해 암호화되는 클로스트리듐 퍼프린젠스에 의해 분비되는 사이토리신이다. 상기 유전자 및 그의 단백질 서열을 도 2A 및 B 각각에 나타낸다. PfoA는 클로스트리듐에서 및 비 서브틸리스에 의해 발현시 모두 식포로부터의 세균 이탈을 매개한다(Portnoy et al., Infect Immun. Jul; 60(7):2710-7; 1992). Llo와 달리, PfoA는 pH 5.0 및 pH 7.0 모두에서 활성이며, 따라서 시토솔에서 활성인 채로 있고 감염된 숙주 세포에 대해 손상을 일으킨다(Portnoy et al., 상기, 1992). 따라서, PfOA가 Llo 대신에 엘 모노사이토제네스에서 발현될 때, 상기는 상기 균주를 식포로부터 이탈될 수 있게 하였다(Jones and Portnoy, Infect Immun. Dec; 62(12):5608-13; 1994). 그러나, 그의 발현도 또한 숙주 세포에 대해 손상을 일으켰다. Llo는 PfoA에 대해 유사한 성질을 나타내나, 단 Llo는 pH 5.5에서 최적으로 활성이고 pH 7.0에서 거의 활성을 나타내지 않는다. 따라서, Llo는 상기 엔도솜의 pH가 일단 pH 5.5로 떨어지면 엔도솜 이탈을 매개하나, 중성 근처인 시토솔의 pH는 Llo 활성을 방해하므로 숙주 세포에 영향을 미치지 않는다.

포트노이(Portnoy) 등은 PfoA가 단일 아미노산 변화가 있는 돌연변이 형태의 엘 모노사이토제네스에서 발현될 때, PfoA의 돌연변이 형태는 숙주 세포에 대해 더 이상 독성이 아니나 여전히 액포로부터의 세균 이탈을 매개하고 세포 내 생육을 수행할 수 있음을 추가로 입증하였다(Portnoy et al., 상기, 1992). Pfo에서 Gly137이 Gln137로 변화한 돌연변이가 있는 특정 균주 DP12791(즉 PfoA_G137Q)은 야생형과 유사한 방식으로 식포로부터 이탈될 수 있으나, 숙주 세포에 대한 독성 효과는 생성시키지 않는다. PfoA_G137Q는 감소된 시토솔 반감기와 함께 pH 5.6 및 pH 7.4 모두에서 활성이다. PfoA_G137Q의 유전자 서열을 도 3에 나타낸다(서열식별번호: 3).

PfoA의 발현은 PfoA의 기공형성 활성이 진핵세포 막 손상을 야기하므로 엔도솜으로부터의 이탈을 허용한다. PfoA는 2층 내로의 그의 도메인의 자발적인 삽입에 의해 콜레스테롤 함유 막 중에 기공을 형성한다. 이는 콜레스테롤(이는 수용체로서 작용한다)에의 결합을 통해 일어난다. 결합 후에, 독소는 그의 구조(막 결합 의존성이다) 변화에 의해 단량체-단량체 계면(올리고머 조립에 필요하다), 올리고머화 및 막 내로의 분배를 형성한다. 막-결합된 올리고머의 형성은 막 손상을 일으키고 결국 용해를 일으킨다(Ramachandran et al., Nature structure and Molecular Biology, 11(8), 697-705(1995)). PfoA_G137Q는 상기 방식으로 액포의 용해를 매개할 수 있다. 바람직한 PfoA_G137Q는 그의 숙주 프로테아제에 대한 감수성으로 인해, 감염된 숙주 세포의 세포질에서 제한된 활성을 갖는다.

본 발명의 하나의 실시태양에서, 상기 rBCG에 의해 발현되는 작용성 엔도솜 분해성 효소는 씨 퍼프린젠스로부터 유도되거나 단리되는 PfoA이다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 중성에서 또는 그 부근에서 활성인, 본 발명에 사용하기에 적합한 다른 엔도솜 분해성 단백질들이 또한 존재함을 인식할 것이다. 상기와 같은 엔도솜 분해 단백질의 예로는 비 제한적으로 뉴모리신(스트렙토코커스 뉴모니아에에 의해 생산됨), 스트렙토리신 O(스트렙토코커스 파이오제네스에 의해 생산됨), 세로리신(바실러스 세레우스에 의해 생산됨), α-헤모리신(스타필로코커스 아우레우스에 의해 생산됨) 등 및 이들의 작용성 변체들이 있다.

작용성 엔도솜 분해성 단백질 또는 단백질의 "작용성 형태"(또는 "작용성으로 발현된 유전자의 유전자 산물"이란 상기 rBCG 세균에 의해 생산된 단백질의 형태가 그의 고유 유기체에서 알려진 고유 또는 천연("야생형") 단백질에 대해 특징적인 활성 크기를 나타냄을 의미한다. 상기 rBCG에 의해 생산된 단백질의 작용성 형태의 활성 크기는 일반적으로는 당해 분야의 숙련가들에 의해 인식된 바와 같은 표준 조건 하에서 분석 시 야생형 단백질의 통상적인 활성의 약 50% 이상이다. 상기 단백질의 활성 크기를 임의의 관찰 가능한 상기와 같은 리간드에 대한 물리적 결합, 또는 엔도솜으로부터 rBCG의 이탈과 같은 효과의 생성에 의해 측정할 수 있다. 바람직하게는 상기 활성 크기는 당해 분야의 숙련가들에게 인식된 바와 같은 표준 조건 하에서 분석 시 야생형 단백질의 표준 활성 크기의 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상이다.

단백질의 "작용성 변체"란 아미노산 서열이 야생형 "기준" 단백질의 서열과 약 70% 이상 일치하고 상기 야생형 단백질의 활성의 작용성 크기(상술한 바와 같은)를 유지하는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 기준 야생형 단백질의 아미노산 서열을 전형적으로는 유전자 가공에 의해 수행되는 돌연변이 및 변경의 출발점으로서 사용한다.

바람직하게는, 작용성 변체는 기준 아미노산 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상의 일치를 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이다. 상기와 같은 작용성 변체는 비 제한적으로 하나 이상의 보존 아미노산 치환이 수행된 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 보존 아미노산 치환은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 또 다른 것에 대해 양으로 하전된 아미노산의 치환, 또 다른 것에 대해 음으로 하전된 아미노산 치환, 또 다른 것에 대한 소수성 아미노산 치환을 포함한다. 변체 폴리펩타이드는 하나 이상의 상기와 같은 치환을 함유할 수 있으나, 단 생성된 변체 폴리펩타이드는 본 발명에 정의된 바와 같은 활성의 작용성 크기를 유지해야 한다. "작용성 변체"는 또한 관심 폴리펩타이드의 주 서열에 대한 다른 변화를 포함한다. 변화의 예로는 비 제한적으로 아미노산의 결실 및 첨가, 또는 아미노산의 변경(예를 들어 화학적 변경, 예를 들어 설폰화, 탈아미드화, 포스포릴화, 하이드록실화 등)이 있다. 상기와 같은 변화는 기준 아미노산 서열의 유전자 가공의 결과이거나, 또는 단백질의 번역 후 변경 또는 상기 둘 모두의 결과일 수 있다. 더욱이, 효소의 작용성 변체는 하나의 종의 상이한 균주, 또는 상이한 종, 또는 하나의 종 내의 상이한 개별적인 유기체들로부터 단리한 동일하거나 유사한 활성을 갖는 유사한 단백질들 간에 발생하는 것들과 같은 천연 돌연변이의 결과일 수 있다. 상기와 같은 천연 변체로부터의 단백질은 또한 기준 단백질로서 작용할 수 있으며, 상기와 같은 천연 변체의 아미노산 서열은 기준 서열로서 작용할 수 있다. 어쨌든, 기준 단백질의 모든 상기와 같은 작용성 변체는 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 단백질의 활성 크기를 유지한다.

본 발명에 개시된 바와 같은 서열 상동성 및 정체는 상기 기준 서열 이외의 공급원으로부터 유래되고 다양한 다른 목적을 위한 단백질의 폴리펩타이드 서열에 결합되거나 상기 중에 포함된 이종 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 상기와 같은 이종 서열의 예로는 비 제한적으로 폴리펩타이드 단리를 촉진하는 서열(예를 들어 히스티딘 표지), 상기 세포 내에 폴리펩타이드의 분비 도는 국소화를 촉진하는 서열(예를 들어 다양한 리더 또는 표적화 서열), 및 글리코실화 부위를 암호화하는 서열(글리코실화 서열) 등이 있다.

어쨌든, 상기 작용성 변체는 상기 작용성 변체가 당해 분야의 숙련가에 의해 인식된 바와 같은 표준 조건 하에서 분석 시 그의 단백질의 활성 크기의 약 50% 이상, 및 바람직하게는 약 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 이상을 나타내는 정도로 변체 단백질의 활성 크기를 유지할 것이다.

더욱이, 본 발명은 또한 본 발명에 사용된 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및 상기 단백질의 작용성 변체를 포함한다. 상기 핵산 서열은 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 또는 상기 중 어느 하나의 변경된 형태일 수 있으며, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 본 발명에 나열된 임의의 것을 포함하며, 또한 그의 변체를 포함하고자 한다. 예를 들어, 핵산의 변체는 상기 나열된 서열과 동일하지 않지만 유전자 코드의 잉여성으로 인해 여전히 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 한편으로, 본 발명 서열의 일부 변화(예를 들어 치환, 결실 또는 첨가)를 수행하여, 암호화된 아미노산 서열이 상술한 바와 같은 기준 아미노산 서열의 작용성 변체인 한, 상기 암호화된 아미노산 서열을 변화시킬 수 있다. 예로서 비 제한적으로 효소에서의 보존 아미노산 치환을 일으키는 변화; 및 비 보전 치환을 생성시키는 변화, 또는 아미노산의 결실 또는 첨가가 있다. 상기와 같은 변화를 임의의 이유로, 예를 들어 효소의 번역 후 변경을 변경시키거나; 용해도를 증가 또는 감소시키거나; 번역된 폴리펩타이드의 입체 상호작용을 방지하거나 도입시키는 등을 위해서 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 핵산 서열의 변체는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 비교 과정에 의해 측정 시, 기준 서열에 대해 약 50% 이상, 바람직하게는 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%의 상동성을 나타낼 것이다. 상기와 같은 변체는 또한 매우 엄격한 조건 하에서 본 발명에 사용된 서열에 결합하는 능력을 나타냄을 특징으로 한다. 매우 엄격한 결합 분석은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있으며 본 발명 서열의 잠재적인 변체들을 시험하는데 쉽게 적용시킬 수 있다.

본 발명에 개시된 바와 같은 서열 상동성은 기준 아미노산 서열 이외의 공급원으로부터 유래되고 다양한 다른 목적을 위한 단백질의 폴리펩타이드 서열에 부착되거나 상기 중에 포함된 이종 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 지칭하고자 하지 않는다. 예를 들어, 상기와 같은 핵산 서열은 이종 아미노산 서열, 예를 들어 폴리펩타이드 단리를 촉진하는 서열(예를 들어 히스티딘 표지), 상기 세포 내에 폴리펩타이드의 분비 도는 국소화를 촉진하는 서열(예를 들어 다양한 리더 또는 표적화 서열), 및 글리코실화 부위를 암호화하는 서열(글리코실화 서열) 등을 암호화할 수 있다.

본 발명에 의해 포함시키고자 하는 본 발명의 핵산 서열의 다른 변화는 상기 핵산 서열의 유전자 가공에서 또는 상기 서열이 암호화하는 아미노산 서열의 발현에서 편의성 또는 개선을 위해 변경시킨 서열이다. 일반적으로, 상기와 같은 변경은 상기 핵산 서열로부터 최종적으로 번역되는 폴리펩타이드의 서열에 영향을 미치지 않건; 또는 상기 폴리펩타이드는 작용성 변체에 대해 상기 나타낸 기준을 여전히 충족시킬 것이다. 이러한 유형의 변경으로는 비 제한적으로 서열의 조작(예를 들어 서열의 벡터 내로의 삽입)을 촉진시키기 위한 핵산 서열에서의 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위의 포함; 아미노산 서열의 발현에 관련되는 서열 또는 서열들의 포함, 결실 또는 다른 변화(예를 들어 다양한 프로모터 및/또는 증강인자 서열, 정지 신호, 슈퍼 프로모터, 유도성 프로모터, 및 핵산 서열의 발현을 변경시키는 다양한 다른 서열 중 임의의 것의 포함); 숙주 유기체의 핵산과 벡터와의 상호작용을 촉진하는 서열의 포함; 등이 있다.

더욱이, 본 발명의 핵산 서열을 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 임의의 다수의 이유들을 위해, 예를 들어 핵산의 안정성을 증진시키거나 목적하는 입체 형태를 부여하기 위해서 화학적으로 개질시키거나 비 통상적인 염기를 포함시킬 수 있다.

"중성 pH에서 활성" 및 "약 7.0의 pH에서 활성"이란 효소가 약 6.0 내지 약 8.0 범위, 및 바람직하게는 약 6.5 내지 약 7.5 범위의 pH 값에서 활성임을 의미한다.

본 발명은 재조합 마이코박테리움을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 상기 마이코박테리움은 BCG에 의해 예시되는 바와 같이 감독된다. 그러나, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명에 사용하기에 또한 적합한 다른 감독 및 감독되지 않은 마이코박테리움이 존재함을 알 것이다. 추가적인 유형의 마이코박테리움의 예로는 비 제한적으로 엠 튜베르큘로시스 균주 CDC1551(예를 들어 Griffith et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2):808; 1995), 엠 튜베르큘로시스 균주 베이징(Soolingen et al., 1995), 엠 튜브레큘로시스 균주 H37Ra(ATCC#:25177), 엠 튜베르큘로시스 균주 H37Rv(ATCC#:25618), 엠 보비스(ACTT#:19211 및 27291), 엠 포르튜튬(ATCC#:15073), 엠 스메그마티스(ATCC#:12051 및 12549), 엠 인트라셀룰라레(ATCC#:35772 및 13209), 엠 칸사시(ATCC#:21982 및 35775) 엠 아비움(ATCC#:19421 및 25291), 엠 갈리나룸(ATCC#:19711), 엠 바카에(ATCC#:15483 및 23024), 엠 레프라에(ATCC#:), 엠 마리나룸(ATCC#:11566 및 11567), 및 엠 미크로티(ATCC#:11152)가 있다.

감독된 마이코박테리움 균주의 예로는 비 제한적으로 엠 튜베르큘로시스 판토테네이트 영양요구 균주(Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10):1171;2002), 엠 튜브레큘로시스 rpoV 돌연변이 균주(Collins et al., Proc Natl Acad Sci USA. 92(17):8036; 1995), 엠 튜베르큘로시스 류신 영양요구 균주(Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888; 2000), BCG 데니쉬 균주(ATCC# 35733), BCG 일본 균주(ATCC # 35737), BCG 시카고 균주(ATCC#: 27289), BCG 코펜하겐 균주(ATCC#: 27290), BCG 파스퇴르 균주(ATCC#: 35734), BCG 글락소 균주(ATCC#: 35741), BCG 코나우트 균주(ATCC#: 35745), BCG 몬트리올(ATCC#: 35746)이 있다.

본 발명의 추가의 실시태양에서, 감독된 마이코박테리움 균주를 세포자멸이 증대되도록 변경시키며, 여기에서 상기와 같은 균주는 강한 세포 면역 반응을 유도한다. 세포자멸은 프로그램화된 세포사이며 그의 유도 및 결과의 면에서 괴사성 세포사와 대단히 상이하다. 실제로, 항원 함유 세포의 세포자멸이 세포 면역성을 유도하는 과정을 때때로 교차 프라이밍이라 칭하였다(Heath et al., Immunol Rev 1999:9; 2004, Gallucci et al., Nature Biotechnology. 5:1249; 1999, Albert et al., Nature 392:86; 1988). 항원 특이적인 세포 매개된 면역성을 증가시키는 세포자멸의 유도 기전이 여러 가지 존재한다. 카스파제 8 매개된 세포자멸은 항원 특이적인 세포 면역 보호를 유도한다(Sheridan et al., Science 277:818; 1997).

따라서 본 발명의 또 다른 실시태양은 증대된 전 세포자멸 성질을 나타내는 감독된 마이코박테리움 균주, 예를 들어 비 제한적으로 살모넬라 엔테리디티스(Genbank 수탁 번호 1068147)로부터의 리더 켑티드가 결여된 secA1 분비된 SodA, 에스케리키아 콜라이(Genbank 수탁 번호 1250070) 또는 시겔라 플렉스네리(Genbank 수탁 번호 1079977) 또는 한편으로 리스테리아 모노사이토제네스 EGD-e(Genbank 수탁 번호 986791)로부터의 SodA와 같은 천연으로 분비되지 않는 SodA 단백질을 제공한다. 상기와 같은 감독된 마이코박테리움 균주는 세포 외 Sod를 생산하지 않으며 따라서 숙주 면역 반응을 억제하지 않지만, 세포 내 Sod는 발현하며, 이에 의해 상기 마이코박테리움을 생존할 수 있게 한다(Edwards et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 164(12):2213-9; 2001). 한편으로, 증대된 전 세포자멸 성질을 나타내는 감독된 마이코박테리움 균주는 불활성화된 Rv3238c 유전자를 운반한다.

한편으로, 본 발명에서 감독된 마이코박테리움에 의한 숙주 세포의 세포질에서 살모넬라 SopE(Genbank 수탁 번호# AAD54239, AAB51429 또는 AAC02071) 또는 카스파제 8의 발현은 높은 수준의 항원 특이적인 세포 면역성을 도출하는 상기 감독된 마이코박테리움에 의해 발현된 항원과 관련하여 프로그램화된 세포사를 유도하는 강력한 방법이 될 것이다.

사망 수용체-5(DR-5)(또한 TRAIL-R2(TRAIL 수용체 2) 또는 TNFR-SF-10B(종양 괴사 인자-상과 구성원 10B)로서도 공지됨)가 또한 카스파제 8 매개된 세포자멸을 매개한다(Sheridan et al., 1997). 리오바이러스 유도된 세포자멸은 TRAIL-DR5에 의해 매개되어 상기 바이러스의 후속적인 제거를 발생시킨다(Clarke et al., J. Virol. 74:8135; 2000). 본 발명에서 감독된 마이코박테리움에 의한 DR-5, 예를 들어 인간 DR-5(Genbank 수탁 번호 BAA33723), 헤르페스바이러스-6(HHV-6) DR-5 동족체(Genbank 수탁 번호 CAA58423) 등의 발현은 Mtb 항원에 대한 항원 특이적인 세포 면역성의 유도에 강력한 항원보강 효과를 제공해야 한다.

또한, 숙주 항원 제공 세포(예를 들어 대식세포 및 수지상 세포)를 또한 Fas 연결(이는 항원 특이적인 세포 면역 반응의 유도에 강력한 자극이다)을 통해 세포자멸을 겪도록 유도할 수 있다(Chattergoon et al., Nat Biotechnology 18:974; 2000). Fas 또는 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질을 발현하는 ㄱ감독된 마이코박테리움은 세포자멸 및 증대된 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도할 것이다.

요약하자면, 세포자멸의 유도를 증진시키는 감독된 마이코박테리움 균주는 Mtb-감염된 세포의 면역 매개된 세포 파괴를 유도하는 세포 반응의 유도에 강력한 도구를 제공하며, 후속적으로 상기 Mtb 감염을 제거, 감소 또는 방지한다.

본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 2-성분 TB 백신은 하나 이상의 마이코박테리움 항원을 과발현하는 감독된 마이코박테리움 균주, 예를 들어 비 제한적으로 Rv0125, Rv0203, Rv0287, Rv0288, Rv0603, Rv1196, Rv1223, Rv1271c, Rv1733c, RV1738 Rv1804c, Rv1886, Rv2031c, Rv2032, Rv2253, Rv2290, Rv2389c, Rv2626c, Rv2627c, Rv2779c, Rv2873, Rv2875, Rv3017c, Rv3407, Rv3804c, Rv3810, 또는 Rv3841를 포함할 수 있다. 한편으로, 과 발현된 마이코박테리움 항원은 하나 이상의 상기 마이코박테리움 융합 단백질, 예를 들어 Mtb72f(Brandt et al., Infect. Immun., 72:6622-6632; 2004; Skeiky et al., J. Immunol., 172:7618-7628; 2004), 하이브리드-1(Olsen et al., Infect, Immun., 72:6148-6150; 2004; Langermans et al., Vaccine, 23:2740-2750; 2005), 하이백-4(Dietrich et al., J. Immunol., 174:6332-6339; 2005) 등으로 구성된 융합 단백질의 형태일 수 있다.

본 발명은 병원성 마이코박테리움 종에 대한 백신의 개발 및 항원 전달 백신 벡터의 개발에 유용성을 갖는다. 마이코박테리움 벡터를 본 발명에서는 하기 나타내는 바와 같이 항원, 면역조절 인자 또는 항원보강제의 임의의 조합을 암호화하고 DNA 또는 RNA로 구성된 하나 이상의 승객 뉴클레오타이드 서열(본 발명에서는 "PNS"라 칭함)을 발현하도록 가공된 임의의 마이코박테리움 균주로서 정의한다. 상기 PNS를 염색체 내로 도입시키거나, 또는 당해 분야에 널리 공지된 조성물 및 방법을 사용하여 발현 벡터의 일부로서 도입시킬 수 있다(Jacobs et al., Nature 327:532-535; 1987; Barletta et al., Res Microbiol. 141:931-939; 1990; Kawahara et al., Clin Immunol. 105:326-331; 2002; Lim et al., AIDS Res Hum Retroviruses. 13:1573-1581; 1997; Chujoh et al., Vaccine, 20:797-804; 2001; Matsumoto et al., Vaccine, 14:54-60; 1996; Haeseleer et al., Mol Biochem Parasitol., 57:117-126; 1993).

본 발명에서, 마이코박테리움 벡터는 면역원을 암호화하는 PNS를 운반할 수 있으며, 상기 면역원은 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터의 외부 면역원, 또는 내생 면역원, 예를 들어 비 제한적으로 자가면역 항원 또는 종양 항원일 수 있다. 상기 면역원은 완전 길이 고유 단백질, 외부 면역원과 내생 단백질 또는 유사물질간의 키메릭 융합물, 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터 기원하는 면역원의 단편 또는 그의 단편일 수 있다.

본 발명에 사용된 바와 같이 "외부 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직에서 통상적으로 발현되지 않는 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어 비 제한적으로 바이러스 단백질, 세균 단백질, 기생충 단백질, 사이토킨, 케모킨, 면역조절제, 또는 치료제를 의미한다.

"내생 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직에 천연적으로 존재하는 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어 비 제한적으로 내생 세포 단백질, 면역조절제 또는 치료제를 의미한다. 한편으로 또는 또한, 상기 면역원을 합성 유전자에 의해 암호화하고 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 재조합 DNA 방법을 사용하여 제작할 수 있다.

외부 면역원은 동물 숙주에 들어가거나, 콜로니화하거나, 복제하기 전 또는 도중에 임의의 바이러스, 세균 또는 기생충 병원체에 의해 발현되는 임의의 분자일 수 있으며; 상기 마이코박테리움 벡터는 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터 기원하는 면역원 또는 그의 일부를 발현할 수 있다. 이러한 병원체는 인간, 가축 또는 야생 동물 숙주에서 감염성일 수 있다.

상기 바이러스 항원이 유도되는 바이러스 병원체로는 비 제한적으로 오쏘믹소바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스(분류 ID: 59771); 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLV-1(분류 ID: 39015), 및 HTLV-II(분류 ID: 11909), 파필로마비리다에, 예를 들어 HPV(분류 ID: 337043), 헤르페스바이러스, 예를 들어 EBV 분류 ID: 10295); CMV(분류 ID: 10358) 또는 헤르페스 단순 바이러스(ATCC#: VR-1487); 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1(분류 ID: 12721) 및 HIV-2(분류 ID: 11709); 라브도바이러스, 예를 들어 광견병; 피코르노바이러스, 예를 들어 폴리오바이러스(분류 ID: 12080); 폭스바이러스, 예를 들어 우두(분류 ID: 10245); 로타바이러스(분류 ID: 10912); 및 파르보바이러스, 예를 들어 아데노 관련 바이러스 1(분류 ID: 85106)가 있다.

바이러스 항원의 예를 비 제한적으로 인간 면역결핍 바이러스 항원 Nef(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 183; Genbank 수탁 # AF238287), Gag, Env(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 2433; Genbank 수탁 # U39362), Tat(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 827; Genbank 수탁 # M13137), Tat의 돌연변이 유도체, 예를 들어 Tat-Δ31-45(Agwale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10037; 2002), Rev(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 2088; Genbank 수탁 # L14572), 및 Pol(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 238; Genbank 수탁 # AJ237568) 및 gp120의 T 및 B 세포 에피토프(Hanke and McMichael, AIDS Immunol Lett., 66:177; 1999); (Hanke, et al., Vaccine, 17:589; 1999); (Palker et al., J. Immunol., 142:3612-3619; 1989) HIV-1 Env 및 gp120의 키메릭 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp120과 CD4 간의 융합(Fouts et al., J. Virol. 2000, 74:11427-11436; 2000); HIV-1 env의 불활성화 또는 개질된 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp140(Stamatos et al., J Virol, 72:9656-9667; 1998) 또는 HIV-1 Env 및/또는 그의 gp140의 유도체(Binley, et al., J Virol, 76:2606-2616; 2002); (Sanders, et al., J Virol, 74:5091-5100(2000)); (Binley, et al., J Virol, 74:627-643; 2000), B형 간염 표면 항원(Genbank 수탁 번호 AF043578); (Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989); 로타바이러스 항원, 예를 들어 VP4(Genbank 수탁 # AJ293721); (Mackow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522; 1990) 및 VP7(GenBank 수탁 # AY003871); (Green et al., J. Virol., 62:1819-1823; 1988), 인플루엔자 바이러스 항원, 예를 들어 헤마글루티닌 또는 (GenBank 수탁 # AJ404627); (Pertmer and Robinson, Virology, 257:406; 1999); 핵단백질(GenBank 수탁 # AJ289872); (Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:9654-9658; 2000) 헤르페스 단순 바이러스 항원, 예를 들어 티미딘 키나제(Genbank 수탁 # AB047378); (Whitley et al., In: New Generation Vaccines, pages 825-854)의 그룹에서 찾을 수 있다.

세균 항원이 유도되는 세균 병원체로는 비 제한적으로 마이코박테리움 스페시즈, 헬리코박터 파이로리, 살모넬라 스페시즈, 시겔라 스페시즈, 이 콜라이, 리켓차 스페시즈, 리스테리아 스페시즈, 레지오넬라 뉴모니아에, 슈도모나스 스페시즈, 비브리오 스페시즈, 바실러스 안트라시스 및 보렐리아 부르그도르페리가 있다.

세균 병원체의 보호 항원의 예로는 장독성 이 콜라의 체 항원, 예를 들어 CFA/I 가는털 항원(Yamamoto et al., Infect. Immun., 50:925-928; 1985) 및 열 불안정성 독소의 무독성 B-서브유닛(Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893; 1983); 보르데텔라 페루투시스(Roverts et al., Vacc., 10:43-48; 1992), 비 페르투시스의 아데닐레이트 사이클라제-헤모리신(Guiso et al., Micro. Path., 11:423-431; 1991), 클로스트리듐 테타니의 테타누스 독소의 단편 C(Fairweather et al., Infect. Immun., 58:1323-1326; 1990), 보렐리아 부르그도르페리의 OspA(Sikand et al., Pediatrics, 108:123-128; 2001); (Wallich et al., Infect Immun, 69:2130-2136; 2001), 리켓차 프로와제키 및 리켓차 타이피의 보호성 파라결정성-표면층 단백질(Carl et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87:8237-8241; 1990), 리스테리오리신(또한 "Llo" 및 "Hly"로서 공지됨) 및/또는 리스테리아 모노사이토젠의 초산화 디스뮤타제(또한 "SOD" 및 "p60"으로서 공지됨)(Hess, J., et al., Infect. Immun. 65:1286-92; 1997); Hess, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1458-1463; 1996); (Bouwer et al., J. Exp. Med. 175:1467-71; 1992), 헬리코박터 파이로리의 우레아제(Gomez-Duarte et al., Vaccine 16, 460-71; 1998); (Corthesy-Theulaz, et al., Infection & Immunity 66, 581-6; 1998), 및 바실러스 안트라시스 보호 항원 및 치사 인자 수용체 결합 도메인(Price, et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001)이 있다.

기생충 병원체가 유도되는 기생충 병원체로는 비 제한적으로 플라스모듐 스페시즈, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸(ATCC# 30145); 트립파노솜 스페시즈, 예를 들어 트립파노소마 크루지(ATCC# 50797); Giardia 스페시즈, 예를 들어 지아르디아 인테스티날리스(ATCC# 30888D); 부필루스 스페시즈, 바베시아 스페시즈, 예를 들어 바베시아 미크로티(ATCC# 30221); 엔타모에바 스페시즈, 예를 들어 엔타모에바 히스톨리티카(ATCC# 30015); 에이메리아 스페시즈, 예를 들어 에이메리아 막시마(ATCC# 40357); 레이슈마니아 스페시즈(분류 ID: 38568); 치스토솜 스페시즈, 브루지아 스페시즈, 파치다 스페시즈, 디로필라리아 스페시즈, 우체레리아 스페시즈 및 온코세레아 스페시즈가 있다.

기생충 병원체의 보호 항원의 예로는 플라스모듐 스페시즈의 써큠스포로조아이트 항원(Sadoff et al., Science, 240:336-337; 1988), 예를 들어 피 베르제리의 써큠스포로조아이트 항원 또는 피 팔시파룸의 써큠스포로조아이트 항원; 플라스모듐 스페시즈의 메로조아이트 표면 항원(Spetzler et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 43:351-358; 1994); 엔타모에바 히스톨리티카의 갈락토스 특이성 렉틴(Mann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248-3252; 1991), 레이슈마니아 스페시즈의 gp63(Russell et al., J. Immunol., 140:1274-1278; 1988); (Xu and Liew, Immunol., 84:173-176; 1995), 레이슈마니아 메이저의 gp46(Handman et al., Vaccine, 18:3011-3017; 2000) 브루지아 말라이의 파라미오신(Li et al., Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991), 치스토소마 만소니의 트리오스-포스페이트 아이소머라제(Shoemaker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1842-1846; 1992); 트리코스트론질루스 콜루브리포르미스의 분비된 글로빈형 단백질(Frenkel et al., Mol. Biochem. Parasitol., 50:27-36; 1992); 프라시올라 헤파티카의 글루타치온-S-트랜스퍼라제(Hillyer et al., Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992), 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰(Bashir et al., Trop. Geog. Med., 46:255-258; 1994); 및 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰의 KLH(Bashir et al., 상기, 1994)가 있다.

앞서 언급한 바와 같이, 상기 마이코박테리움 벡터는 내생 면역원을 암호화하는 PNS를 운반할 수 있으며, 상기 면역원은 임의의 세포 단백질, 면역조절제, 또는 치료제 또는 그의 일부일 수 있고, 수용 세포, 예를 들어 비 제한적으로 종양, 이식 및 자가면역 면역원, 또는 종양, 이식 및 자가면역 면역원의 단편 및 유도체에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 마이코박테리움 벡터는 종양, 이식편, 또는 자가면역 면역원, 또는 그의 일부 또는 유도체를 암호화하는 PNS를 운반할 수 있다. 한편으로, 상기 마이코박테리움 벡터는 합성 PNS를 운반할 수 있으며(상술한 바와 같이), 상기 PNS는 종양 특이적이거나, 이식편 또는 자가면역 항원 또는 그의 일부를 암호화한다.

종양 특이 항원의 예로는 전립선 특이 항원(Gattuso et al., Human Pathol., 26:123-126; 1995), TAG-72 및 CEA(Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9:53-60; 1994), MAGE-1 및 티로시나제(Coulie et al., J. Immunothera., 14:104-109; 1993)가 있다. 최근에, 마우스에서 종양 항원을 발현하는 비 악성 세포에 의한 면역화가 백신 효과를 제공하며, 또한 동일한 항원을 나타내는 악성 종양 세포를 제거하는 면역 반응을 상기 동물에게 제공하는데 일조하는 것이 입증되었다(Koeppen et al., Anal. N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993).

이식 항원의 예로는 T 세포 상의 CD3 분자가 있다(Alegre et al., Digest. Dis. Sci., 40:58-64; 1995). CD3 수용체에 대한 항체 처리는 순환하는 T 세포를 신속히 제거하고 세포 매개된 이식 거부를 역전시키는 것으로 나타났다(Alegre et al., 상기, 1995).

자가면역 항원의 예로는 IAS β 쇄가 있다(Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:8005-8009; 1994). IAS β 쇄로부터의 18 개 아미노산 펩타이드에 의한 마우스의 백신화는 실험적인 자가면역 뇌척수염이 있는 마우스에게 보호 및 치료를 제공하는 것으로 나타났다(Topham et al., 상기, 1994).

항원보강제를 발현하는 마이코박테리움 벡터

면역원 및 항원보강제를 암호화하는 PNS를 운반하고 상기 벡터 및 PNS-암호화된 면역원에 대한 숙주 반응을 증가시키는데 유용한 마이코박테리움 벡터를 제작할 수 있다. 한편으로, 상대 마이코박테리움 벡터에 의해 암호화된 면역원에 대한 숙주 반응을 증가시키기 위해 하나 이상의 면역원을 암호화하는 PNS를 수반하는 다른 마이코박테리움 벡터와 혼합하여 투여되는, 항원보강제를 암호화하는 PNS를 운반하는 마이코박테리움 벡터를 제작할 수 있다.

상기 마이코박테리움 벡터에 삽입된 PNS에 의해 암호화된 특정한 항원보강제는 본 발명에 중요하지 않으며 콜레라 독소의 A 서브유닛(즉 CtxA; GenBank 수탁 번호 X00171, AF175708, D30053, D30052) 또는 그의 일부 및/또는 돌연변이 유도체(예를 들어 Ctx의 A 서브유닛의 A1 도메인(즉, CtxA1; GenBank 수탁 번호 K02679), 임의의 전통적인 비브리오 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 395, ATCC# 39541) 또는 E1 Tor 브이 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 2125, ATCC# 39050) 균주일 수 있다. 한편으로, 세균 아데노신 다이포스페이트-비로실화 외독소 계열의 일원인 임의의 세균 독소(Krueger and barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995)를 CtxA 대신에 사용할 수 있으며; 예를 들어 장독성 에스케리키아 콜라이(GenBank 수탁# M35581)의 열 불안정성 독소의 A 서브유닛, 페르투시스 독소 S1 서브유닛(예를 들어 ptxS1, GenBank 수탁# AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157 등)이 있으며; 추가의 대안으로서, 상기 항원보강제는 보르데텔라 페르투시스(ATCC# 8467), 보르데텔라 브론치셉티카(ATCC# 7773) 또는 보르데텔라 파라페르투시스(ATCC# 15237)의 아데닐레이트 사이클라제 헤모리신 중 하나, 예를 들어 비 페르투시스(GenBank 수탁 번호 X14199), 비 파라페르투시스(GenBank 수탁 번호 AJ249835) 또는 비 브론치셉티카(GenBank 수탁 번호 Z37112)의 cyaA 유전자일 수 있다.

면역조절제를 발현하는 마이코박테리움 벡터

더욱 또 다른 접근법은 면역원과 사이토킨을 암호화하는 하나 이상의 PNS를 운반하는 마이코박테리움 벡터의 사용을 포함하며, 상기는 PNS-암호화된 면역원 마이코박테리움 벡터에 대한 증대된 숙주 반응을 유도하는데 사용된다. 한편으로, 상대 마이코박테리움 벡터에 의해 발현된 PNS-암호화된 면역원 대한 숙주 반응을 증가시키기 위해 면역원을 암호화하는 PNS를 수반하는 하나 이상의 다른 마이코박테리움 벡터와 혼합하여 사용되는, 상기 사이토킨 만을 암호화하는 PNS를 운반하는 마이코박테리움 벡터를 제작할 수 있다.

상기 마이코박테리움 벡터에 의해 암호화된 특정한 사이토킨은 본 발명에 중요하지 않으며, 비 제한적으로 인터류킨-4(본 발명에서 "IL-4"라 칭한다; GenBank 수탁 번호 AF352783(쥐 IL-4) 또는 NM_000589(인간 IL-4), IL-5(GenBank 수탁 번호 NM_010558(쥐 IL-5) 또는 NM_000879(인간 IL-5), IL-6(GenBank 수탁 번호 M20572(쥐 IL-6) 또는 M29150(인간 IL-6), IL-10(GenBank 수탁 번호 NM_010548(쥐 IL-10) 또는 AF418271(인간 IL-10), IL-12_p40(GenBank 수탁 번호 NM_008532(쥐 IL-12 p40) 또는 AY008847(인간 IL-12 p40), IL-12_p-70(GenBank 수탁 번호 NM_008351/NM_008352(쥐 IL-12 p35/40) 또는 AF093065/AY008847(인간 IL-12 p35/40), TGFβ(GenBank 수탁 번호 NM_011577(쥐 TGFβ1) 또는 M60316(인간 TGFβ1), 및 TNFα Genbank 수탁 번호 X02611(쥐 TNFα) 또는 M26331(인간 TNFα)를 포함한다.

BCG의 게놈 내로 Pfo 유전자를 암호화하는 유전자를 도입시키는데 사용되는 특정한 방법은 본 발명의 중요한 특징이 아니며 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법으로부터 선택될 수 있다(Parish et al., Microbiology, 145:3497-3503; 1999). 바람직한 방법은 상기 Pfo 유전자를 ureC 좌에 표적화하고, 이에 의해 상기 나중의 유전자가 불활성화되고 변경된 균주에 대한 선택 마커를 생성시킴을 포함한다(Qadri et al., J Clinic Micro. 20(6), 1198-1199; 1984). 상기를 성취하기 위해서, 합성 대립유전자 교환 플라스미드, 예를 들어 하기 실시예 섹션에 개시된 플라스미드를 ureC 유전자(Genome Database# Mb1881)의 5-프라임 및 3-프라임에 인접한 1 kb 서열을 갖도록 변경시킬 수 있다. 이어서 PfoA 유전자(Genome Database#CPE0163)를 Ag85B 프로모터의 조절 하에서 인접 서열들 사이에 삽입한다. PfoA 단백질을 분비시키기 위해서, Ag85B 리더 펩타이드 서열을 고유 PfoA 신호 서열 대신에 사용하여 재조합 BCG 균주로부터 유효한 분비를 보장한다.

대립유전자 교환 플라스미드를 표적 균주에 도입시키는 방법은 본 발명에 중요한 특징이 아니며 마이코박테리움에 대한 표준 일렉트로포레이션 프로토콜에 의해 수행할 수 있다. 유사하게, 대립유전자 교환을 수행하고 Pfo 대립유전자를 ureC 좌에 도입시키는 특정한 방법은 본 발명에 중요한 특징이 아니며 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법들 중에서 선택될 수 있다. 도 1에 도시한 바와 같은 자살 벡터는 상기 플라스미드가 2 개의 항생제 선택 마커를 함유하며, 따라서 자발적인 항생제 내성 돌연변이체의 선택을 최소화하므로 바람직한 방법을 제공한다. 대립유전자 교환 중에, 상기 PfoA 유전자 구획은 왼쪽 및 오른쪽 인접 서열의 상동성 재조합의 결과로서 ureC 유전자를 대체하여 PfoA의 안정한 염색체 통합 및 발현을 생성시킨다. 상기 접근법의 이점은 최종 생성물을 유지하는데 항생제가 필요하지 않으며, 항생제 내성 유전자형 또는 표현형이 최종 균주에 존재하지 않는다는 것이다. 이는 인간 용도의 생성물(상기는 항생제가 없다)에 바람직한 실시태양이다. UreC-음성 표현형은 대립유전자 교환을 겪고 ureC가 Pfo로 교체된 균주를 표시할 것이며, 상기 UreC 양성 표현형도 또한 일부 용도에 사용할 수 있음은 물론이다.

본 발명에서, BCG에서 pfoA의 위치는 ureC에 국한되지 않는다. 다른 위치들로는 비 제한적으로 플라스미드에 통합된 pfoA 및 염색체상의 attB 부위가 있다. 당해 분야의 숙련가들은 pfoA 통합 및 발현에 잠재적인 부위들인 염색체상의 다른 위치들을 알 것이다.

본 발명은 또한 결핵에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 백신 제제를 제공한다. 상기 백신 제제는 본 발명에 개시한 바와 같은 하나 이상의 rBCG 균주 및 약물학적으로 적합한 담체를 포함한다. 백신으로서 사용하기 위한 상기와 같은 조성물의 제제는 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 전형적으로는, 상기와 같은 조성물을 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조하나, 정제, 환제, 분말 등과 같은 고체 형태도 또한 고려된다. 투여 전에 액체에 용해 도는 현탁시키기에 적합한 고체 형태를 또한 제조할 수 있다. 상기 제제를 또한 유화시킬 수 있다. 활성 성분을 약학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로스, 라피노스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 이들의 조합이다. 또한, 상기 조성물은 소량의 보조 물질, 예를 들어 습윤 또는 유화제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 다른 보조제를 함유할 수 있다.

상기 조성물의 경구 형태를 투여하고자 하는 경우, 다양한 증점제, 풍미제, 희석제, 유화제, 분산제 또는 결합제 등을 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 조성물을 투여에 적합한 형태로 제공하기 위해서 임의의 상기와 같은 추가적인 성분들을 함유할 수 있다. 상기 제형 중의 rBCG 세균의 최종 량은 다양할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 상기 제형 중의 양은 약 1 내지 99%일 것이다. 본 발명의 백신 제제는 항원보강제(그의 적합한 예로는 비 제한적으로 Seppic, Quil A, Alhydrogel 등이 있다)를 추가로 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 백신 제제는 단일 유형의 rBCG를 함유할 수 있다. 한편으로, 하나보다 많은 유형의 rBCG를 백신에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 결핵에 대한 면역 반응을 유도하는 방법 및 결핵에 대해 포유동물을 예방접종하는 방법을 제공한다. 면역 반응을 유도함이란 본 발명의 백신 제제의 투여로, 예를 들어 ³H 티미딘 통합에 의해 측정 시, 특이 항체(1 내지 1 x 10⁶, 바람직하게는 1 x 10³, 보다 바람직하게는 1 x 10³ 내지 1 x 10⁶, 가장 바람직하게는 1 x 10⁶ 범위의 역가로)의 합성 및/또는 세포 증식이 발생함을 의미한다. 상기 방법은 약물학적으로 허용 가능한 담체 중의 본 발명의 rBCG 균주를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여함을 포함한다. 본 발명의 백신 제제를 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 다수의 적합한 수단들 중 임의의 수단, 예를 들어 비제한적으로 정맥, 경구, 비 내, rBCG를 함유하는 식품의 섭취 등에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 투여 방식은 피하 또는 근육 내이다.

하기의 실시예는 본 발명의 다양한 태양들의 예시로서 간주되어야 하며 본 발명의 실시를 제한하고자 하는 것은 아니다. 당해 분야의 통상의 숙련가들은 또 다른 물질, 조건 및 과정이 다양할 수 있으며 이는 명세서에 교시된 바와 같은 본 발명의 일반적인 범위로부터 이탈됨 없이 통상적인 숙련가의 기술 내에 있음을 알 것이다.

TB 면역 보호에서 제 I 형 MHC 제한된 CD8+ T 세포의 중추적인 역할은 입증되었다(Flynn et al., 상기, 1992). 상기 CD8 T 세포 반응을 개선시키고자, 재조합 BCG 균주를 리스테리아 모노사이토제네스의 리스테리오리신을 발현하도록 가공하였다. 그러나, 상기 재조합 BCG(rBCG)는 증가된 엔도솜 이탈 능력을 나타내는데 실패하였으며, 따라서 예를 들어 제 I 형MHC 제한된 CD8+ 세포독성 T 세포 반응의 증가된 유도를 일으키지 못한다. 검사 시, 상기 균주는 엔도솜으로부터 1% 미만의 탈출을 나타낸다. 이는 리스테리오리신의 활성이 매우 pH 감수성이므로 놀라운 일이 아니며, 따라서 상기 효소는 엔도솜 내의 pH에서 활성이 아닌 듯하다. 이러한 결점에도 불구하고, 상기 재조합 균주의 보호 및 안전성은 모두 대단히 개선되었다. 이러한 관찰을 근거로, 클로스트리듐 퍼프린젠스로부터 유도된 PfoA_G137Q를 BCG의 염색체 내로 도입시킴으로써 신규의 rBCG 균주를 제작하였다. PfoA_G137Q는 137 위치에서 G에서 Q의 하나의 아미노산 변화를 갖는다. 이러한 단일 아미노산 변화는 포유동물 세포에서 야생형 PfoA의 독성을 상실시키나, 아직 상기 효소는 그의 엔도솜 분해 작용을 유지한다. 상기 생성된 균주는 마우스 모델에서 안전하고 면역원성인 것으로 나타났다.

일반적인 물질 및 방법:

하기 섹션에 개시된 각각의 실험에 대해서, 제한 엔도뉴클레아제(본 발명에서 "RE"; New England Biolabs Beverly, MA), T4 DNA 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 Taq 폴리머라제(Life Technologies, Caithersburg, MD)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하고; 플라스미드 DNA를 소규모(Qiagen Miniprep(등록상표) 키트, Santa Clarita, CA) 또는 대규모((Qiagen Maxiprep(등록상표) 키트, Santa Clarita, CA) 플라스미드 DNA 정제 키트를 제조사의 프로토콜(Qiagen, Santa Clarita, CA)에 따라 사용하여 제조하고; 뉴클레아제-비 함유 분자 생물 등급 밀리-Q 수, 트리스-HCl(pH 7.5), EDTA pH 8.0, 1M MgCl, 100%(v/v) 에탄올, 초순수 아가로스 및 아가로스 젤 전기영동 완충제를 라이프 테크놀로지스(Caithersburg, MD)로부터 구입하였다. RE 절단, PCR, DNA 연결 반응 및 아가로스 젤 전기영동을 널리 공지된 과정에 따라 수행하였다(Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1,2,3; 1989); (Straus, et al., Proc Natl Acad Sci USA. Mar; 87(5):1889-93; 1990). 하기 섹션에 개시된 각 재조합 플라스미드의 DNA 서열을 확인하기 위한 뉴클레오타이드 서열화를 어플라이드 바이오시스템스 자동화된 서열화기, 모델 373A를 사용하여 통상적인 자동화된 DNA 서열화 기법에 의해 수행하였다.

PCR 프라이머를 상업적인 판매자, 예를 들어 시그마(St. Louis, MO)로부터 구입하거나, 또는 어플라이드 바이오시스템스 DNA 합성기(모델 373A)를 사용하여 합성하였다. PCR 프라이머를 150 내지 250 μM의 농도로 사용하고 PCR 반응에 대한 어닐링 온도를 클론 매니저 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC)을 사용하여 측정하였다. PCR을 스트라타진 로보사이클러(Strategene Robocycler), 모델 400880(Strategene, La Jolla, CA)에서 수행하였다. 증폭용 PCR 프라이머를 클론 매니저 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC)을 사용하여 디자인하였다. 상기 소프트웨어는 PCR 프라이머의 디자인을 가능하게 하며 조작하려는 특정 DNA 단편들과 상용성인 RE 부위를 식별한다. PCR을 열사이클러 장치, 예를 들어 스트라타진 로보사이클러, 모델 400880(Strategene)에서 수행하고, PCR에서 프라이머 어닐링, 연신 및 변성 시간을 표준 과정에 따라 설정하였다(Straus et al. 상기 1990). 상기 RE 절단 및 PCR을 후속적으로 표준 과정을 사용하는 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다(Straus et al., 상기 1990; and Sambrook et al., 상기 1989). 양성 클론을 적합한 RE 패턴 및/또는 PCR 패턴을 나타내는 것으로서 정의한다. 상기 과정을 통해 식별된 플라스미드를 상기 개시한 바와 같이 표준 DNA 서열화 과정을 사용하여 추가로 평가하였다.

에스케리키아 콜라이 균주, 예를 들어 DH5α 및 Sable2(등록상표)를 라이프테크놀로지스(Bethesda, MD)로부터 구입하고 재조합 플라스미드의 초기 숙주로서 사용하였다. 재조합 플라스미드를 개시한 바와 같이, 고전압 전기펄스 장치, 예 를 들어 진 펄서(Gene Pulser, BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 100 내지 200 Ω, 15 내지 25 μF 및 1.0 내지 2.5 kV에서 사용하는 일렉트로포레이션에 의해 이 콜라이 균주에 도입시켰다. 최적 일렉트로포레이션 조건을 최대 형질전환율/mcg DNA/세균을 생성시킨 세팅을 사용하여 확인하였다.

세균 균주를 제조사의 지시에 따라 제조한 트립신 간장 아가(Difco, Detroit, MI) 또는 트립신 간장 브로쓰(Difco, Detroit, MI) 상에서 증식시켰다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 세균을 서서히 교반하면서 5%(v/v) CO₂ 중에서 37 ℃에서 증식시켰다. 배지에 필요에 따라 항생제(Sigma, St. Louis, MO)를 보충하였다. 세균 균주를 30%(v/v) 글리세롤을 함유하는 트립신 간장 브로쓰(Difco)(Sigma, St Louis, MO)에 약 10⁹ 콜로니-형성 단위(본 발명에서 "cfu"라 칭함)/㎖에서 -80 ℃에서 보관하였다.

BCG에서 대립유전자 교환

종래 기술은 변경된 대립유전자를 마이코박테리움 균주에 도입하는 방법을 교시하며 당해 분야의 숙련가들은 상기 방법을 해석하고 실행할 수 있다(Parish et al., Microbiology, 146:1969-1975; 2000). 대립유전자 교환 플라스미드를 생성시키는 신규의 방법은 합성 DNA의 사용을 포함한다. 상기 접근법의 이점은 플라스미드 산물이 매우 한정된 역사를 가지며 연방 규제에 순응성인 반면, 이전에 사용된 방법은 유효하더라도 실험실 배양 기록이 불충분하게 문헌에 보고되어 있으며 따라서 연방 규제에 순응성이지 않을 듯하다는 것이다. 이러한 규제에 대한 순응 성은 생성물이 미국 및 유럽 규제 당국에 의해 인간에 사용을 허용받으려면 필수적이다.

마이코박테리움에서 대립유전자 교환용 자살 벡터는 이 콜라이 균주에서 복제하는 능력을 갖지만 마이코박테리움 스페시즈, 예를 들어 엠 티비 및 BCG에서는 복제할 수 없는 플라스미드이다. 본 발명의 대립유전자 교환 과정에 사용하기 위한 특정 자살 벡터는 중요하지 않지만 학회(Parish et al., 상기, 2000) 및 상업적인 출처로부터 입수할 수 있는 것들 중에서 선택될 수 있다. 대립유전자 교환용 자살 플라스미드의 바람직한 디자인을 도 1에 나타낸다. 상기 플라스미드는 하기의 DNA 구획들로 구성된다: 플라스미드가 이 콜라이에서 복제하는 oriE 서열(Genebank 수탁 # L09137), 이 콜라이 및 마이코박테리움 모두에서 선별을 위한 가나마이신 내성 서열(Genebank 수탁 # AAM97345), 및 추가적인 항생제 선별 마커, 예를 들어 제오신 내성 유전자(Genebank 수탁 # AAU06610)(이는 마이코박테리움 프로모터(예를 들어 hsp60 프로모터)의 조절 하에 있다). 상기 두 번째 항생제 선별 마커는 필수적이지 않지만 대립유전자 교환 과정 동안 자발적인 가나마이신 내성 단리물의 성장을 방지하기 위해 이중 선별을 할 수 있도록 포함시킬 수 있다.

상기와 같은 자살 벡터의 제작을 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 그러나, 현행 규제 기준(예를 들어 연방 규제)은 BSE-감염된 물질을 함유하는 소 생성물에 노출된 생성물로부터 획득된 프리온 입자의 도입 망령을 제기하였다. 따라서, 물질(예를 들어 DNA 서열)이 미지 기원의 표적 균주에 도입되는 것을 피하기 위해서, 상기 자살 벡터 중의 모든 DNA를 상업적인 출처(예를 들어 Picoscript, Inc.)에 의해 합성적으로 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 자살 벡터를 제작하기 위한 바람직한 방법은 DNA 소프트웨어(예를 들어 클론 매니저)를 사용하여 DNA 서열의 플랜을 정리하고, 이어서 상기와 같은 서비스를 제공하는 임의의 상업적인 출처(예를 들어 Picoscript Inc.)에 의해 행위별 수가제에 준하여 DNA를 합성하는 것이다. 이러한 과정을 사용하여 하기 실시예 섹션에 사용된 자살 벡터를 디자인하고 수득하였다.

상술한 자살 벡터의 형태(도 1)는 상기 플라스미드가 2 개의 항생제 선별 마커를 함유하고, 따라서 하나의 항생제에 대한 내성(세대당 약 1/10⁸으로 발생함)을 나타내는 자발적인 돌연변이체의 선별을 최소화하므로 유리하다. 2 개의 항생제에 대한 자발적인 내성은 매우 드물며 단지 세대당 약 1/10¹⁶으로 발생한다. 따라서, 상기 대립유전자 교환 과정을 실행하는데 사용되는 배양물 중에서 이중 내성 균주가 나타날 확률은 1/10⁶ 미만이다.

대립유전자 교환 과정 동안 음성 선별을 위해서, 슈크로스 감수성 표현형을 부여하는 sacB 유전자(Genebank 수탁 # NT01BS4354)를 포함시켜 최종 DNA 재조합 단계를 겪고 대립유전자 교환을 완성한 균주를 배양물에 농축시킬 수 있다.

마이코박테리움의 배양

선택된 BCG 균주를 액체 배지, 예를 들어 미들브룩(Middlebook) 7H9 또는 셜튼(Saulton) 합성 배지에서, 바람직하게는 37 ℃에서 배양한다. 상기 균주를 정적 또는 교반된 배양물로서 유지시킬 수 있다. 또한, BCG의 증식율을 올레산 (0.06% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 01257) 및 세제, 예를 들어 타이록사폴(0.05% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 70400)을 첨가하여 향상시킬 수 있다. BCG 배양물의 정제를 인산염 완충 염수(본 발명에서 PBS라 칭함)로 연속 희석한(예를 들어, 순수-10^-8에서 10 배 단계) BCG 배양물의 100 mcl 분액을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지, 예를 들어 미들브룩 7H10 상에 균일하게 확산시켜 평가할 수 있다. 또한, 상기 배양물의 정제를 상업적으로 입수할 수 있는 배지, 예를 들어 티오글리콜레이트 배지(Science Lab, 목록 번호 1891) 및 대두-카제인 배지(BD, 목록 번호 211768)를 사용하여 추가로 평가할 수 있다.

BCG 시드 로트를 -80 ℃에서 0.1-2 x 10⁷ cfu/㎖로 보관한다. 전형적으로는, 상기 액체 배양물을 멸균 대조군에 비해 0.2 내지 4.0의 광학 밀도(600 ㎚)에서 수확하고; 배양물을 적합한 크기의 원심분리기 튜브에 넣고 유기체를 8,000 x g에서 5 내지 10 분간 원심분리시킨다. 상등액을 버리고 유기체를 10 내지 30%(v/v) 글리세롤을 함유하는 미들브룩 7H9를 0.1-2 x 10 cfu/㎖의 밀도로 포함하는 저장 용액에 재현탁시킨다. 상기 현탁액을 멸균 1.5 ㎖ 붕소 실리케이트 냉동기 바이알에 1 ㎖ 분액으로 분배하고 이어서 -80 ℃에서 보관한다.

실시예 1. 엔도솜을 이탈시킬 수 있는 rBCG-ProA 균주의 제작

엔도솜을 이탈시킬 수 있는 rBCG-PfoA 균주의 제작을 ureC 유전자의 인접 부분들의 대립유전자 교환에 의해 수행하였다. 그 결과, 상기 PfoA 유전자 구획이 ureC 유전자를 대체하였으며, 이는 PfoA의 안정한 염색체 발현을 허용하였다. 구 체적인 세부사항을 하기에 개시한다.

대립유전자 교환 플라스미드의 제작:

대립유전자 교환 플라스미드는 하기의 DNA 구획들로 구성된다: 플라스미드가 이 콜라이에서 복제하는 oriE 서열, 이 콜라이 및 마이코박테리움 모두에서 선별을 위한 가나마이신 내성 서열, 및 추가적인 항생제 선별 마커(제오신 내성 유전자)(이는 Hsp60 프로모터에 의해 발현된다). 상기 두 번째 마커는 이중 선별의 수행에 사용되었으며, 따라서 상기 과정 동안 자발적인 가나마이신 내성을 방지한다. 상기 대립유전자 교환 과정 동안 음성 선별을 위해서, 슈크로스 감수성 유전자를 사용하였다. 최종적으로, 표적 BCG 데니쉬 1331 균주에 대한 ureC 유전자의 왼쪽 및 오른쪽 1 kb 인접 서열을 상기 사이에서 PfoA 유전자와 함께 포함시켰다. 상기 PfoA 유전자는 Ag85B 프로모터의 조절 하에서 발현된다. 상기 Ag85B 리더 펩타이드 서열을 PfoA의 분비를 위해 PfoA 원 분비 신호 서열 대신에 사용하였다. 최종적으로, 모든 이러한 성분들은 피코스크립트 인코포레이티드(Houston, TX)에 의해 합성되고 조립되었다. 생성된 플라스미드는 마이코박테리움 자살 벡터이고 수득된 플라스미드에 대한 지도는 도 1에 도시된 바와 같다. 생성된 플라스미드 구조물은 도 5에 나타낸 바와 같이 확인되었다.

대립유전자 교환 플라스미드의 마이코박테리움 데니쉬 BCG 데니쉬 1331 균주 내로의 도입

대립유전자 교환 과정을 도 4에 도식적으로 예시하며, 이는 상기 과정의 주요 단계들을 개략한다. 상기 단계들을 하기에 상세히 개시한다.

BCG 데니쉬 1331을 10%의 OADC(올레산-알부민-덱스트로스-카탈라제)(BD Gibco) 및 0.05%(v/v)의 티록사폴(연구 및 진단 실험실)이 보충된 7H9 배지에서 배양하였다. 상기 배양물이 대수기에 도달했을 때, 세균을 수거하고 일렉트로포레이션에 대해 앞서 개시한 바와 같이(Sun et al., 2004) 제조하였다. 5 ㎍의 대립유전자 교환 플라스미드를 표준 방법을 사용하여 새로 제조한 전기적격 세포 내에 도입시켰다.

상기 제작한 대립유전자 교환 플라스미드를 마이코박테리움에 대한 표준 마이코박테리움 일렉트로포레이션 프로토콜에 의해 엠 데니쉬 BCG 데니쉬 1331 균주 내로 도입시켰다. 일렉트로포레이션 후, 상기 세포를 10%(v/v) OADC 및 0.05%(v/v)의 틸록사폴이 보충된 7H9 배지에서 밤새 배양하였다. 이어서 상기 세포를 가나마이신 및 제오신을 모두 50 ug/㎖ 함유하는 7H10 플레이트 상에 도말하였다. 생성된 콜로니를 골라내어 슈크로스 10%(v/v)를 함유하는 7H9 배지에서 배양하였다. 수득된 배양물을 개별적인 콜로니(ureC 대신에 PfoA 유전자의 존재에 대해 동정하였다)를 획득하기 위한 클로닝을 위해 7H10 플레이트 상에 도말하였다. 상기 과정의 주요 단계들을 개략하는 흐름도를 도 4에 제공하며, 표 1은 자살 벡터, pAF 102를 개시하고, 이는 또한 도 1에 도시된다.

[표 1]

실시예 1은 마이코박테리움 BCG 균주가 중성 pH에서 활성인 선택된 엔도솜 분해성 단백질을 발현하여, 마이코박테리움이 엔도솜으로부터 세포의 세포질 내로 이탈되도록 유전자 가공됨을 나타낸다.

실시예 2. rBCG-PfoA 균주의 확인

실시예 2에 대한 물질 및 방법

마이코박테리움의 배양: 하기의 실험에 대해서, BCG 균주를 10% OADC가 보충된 미들브룩 7H9 배지(BD biosciences)에서 37 ℃에서 배양하였다. 타이록사폴(0.05% v/v, Research Diagnostics Cat. No. 70400)을 사용하여 상기 세균을 분산시켰다. 상이한 균주들 간의 생육을 비교하는 실험에서, 광학 밀도(600 ㎚)를 접종 후 상이한 시점에서 측정하였다. 가나마이신에 대한 감수성을 시험하기 위해서, 상기 배양물을 제조하고, 가나마이신을 50 ug/㎖의 최종 농도로 가함을 제외하고 상기와 같이 측정하였다. 고체 배지를 사용하여 세균을 배양하는 경우, 미들브룩 7H10 아가(BD biosciences)를 사용하였다. 적합한 경우, 가나마이신을 50 ug/㎖의 최종 농도로 가하고 슈크로스를 3%의 최종 농도로 가하였다.

우레아제 활성 시험:

실시예 1에 개시된 슈크로스 플레이트로부터 생성된 콜로니를 먼저 제조사의 지시에 따라 우레아제 시험 키트(BD Difico)를 사용하여 우레아제 활성의 결여에 대해 스크리닝하였다. 간단히, 충분한 세균을 투명 튜브 중의 제조사 공급한 시험 완충제에 현탁시켰다. BCG 데니쉬 1331 균주를 우레아제 양성 대조군으로서 사용하였다. 완충제만을 음성 대조군으로서 사용하였다. 반응 혼합물을 실온에 서 30 분간 배양하고 결과를 제조사의 지시를 근거로 판단하였다.

ΔureC:pfoA를 운반하는 rBCG 균주의 유전자형 분석

순방향 프라이머[acggctaccgtctggacat](서열식별번호: 4) 및 역방향 프라이머[cgatggcttcttcgatgc](서열식별번호: 5)를 갖는 PCR을 수행하여 Pfo-특이적 삽입 대립유전자의 DNA 서열 및 ureC 유전자에 인접한 BCG 게놈DNA 서열을 증폭시켰다. PCR 매개변수는 다음과 같았다: 단계 1: 95 ℃ 4 분 1 주기; 단계 2: 총 30 주기 동안 95 ℃ 1 분, 60 ℃ 1 분 및 이어서 72 ℃ 1 분; 단계 3: 1 주기로 72 ℃ 10 분; 단계 4: 4 ℃ 보관. 생성된 PCR 산물을 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하고 자동화된 다이데옥시뉴클레오타이드 서열화 기법에 의해 서열화하고, ureC 유전자(즉 ΔureC::PfoA) 대신에 완전한 길이의 PfoA 유전자의 존재를 확인하였다.

대식세포에서 AFV102의 생육:

동일 반응계에서 rBCG 균주 AFV102의 생육을, 감염된 대식세포에서 마이코박테리움 콜로니 형성 단뒤(CFU)를 측정함으로써 J774A.1 대식세포 형 세포에서 시험하였다. 마이코박테리움 식균작용을 J774A.1 세포의 감염 후 3 시간 째에 세포 내 CFU를 시험하여 측정하였다. 후속의 장기적인 세포 내 생존을 앞서 개시한 바와 같이(Sun et al., 2004), PBS로 5 회 세척 후 상기 CFU를 세기 위해 상기 세포 내 세균을 방출하도록 상기 세포를 용해시켜 수행하였다.

AFV102에 의해 발현된 Pfo의 용혈 활성의 분석:

AFV102에 의한 PfoA의 분비를 평가하기 위해서, 상기 균주를 상술한 바와 같이 중간 대수기로 증식시켰다. 이어서 배양 상등액 및 세균을 수거하였다. 상 기 AFV102 세균 펠릿을 96웰 V-바닥 플레이트에서 0.1% BSA를 함유하는 PBS(pH 7.0) 10 ㎕에 재현탁하였다. 상기 PfoA 단백질이 배양 상등액 내로 분비되는 지를 시험하기 위해서, 액체 배양물을 회전시키고 상등액을 상기 시험에 사용하였다. 상기 발현된 PfoA를 그의 pH 의존성 용혈 활성에 대해 시험하기 위해서, 샘플을, 상이한 pH 값을 갖는 PBS 완충제를 반응 완충제로서 사용함을 제외하고 상기와 같이 제조하였다. 1% 세척된 양 적혈구 100 ㎕를 각 웰에 가하였다. 반응물을 서서히 혼합하고 37 ℃에서 1 시간 동안 교반하면서 배양하였다. BCG 데니쉬 1331 균주 세균을 용혈 음성 대조군으로서 사용하였다. 공지된 단위의 헤모리신 활성을 갖는 α-헤모리신(Sigma)을 용혈 양성 대조군으로서 일련의 희석물로 사용하였다. 배양의 끝에서, 상기 반응물을 500g에서 15 분간의 원심분리에 의해 펠릿화하고 이어서 상기 V 바닥 플레이트로부터의 상등액을 편평한 바닥 96-웰 플레이트의 동등한 위치들로 옮기고 광학 밀도를 측정하였다(450 ㎚에서의 흡광도 - 540 ㎚에서의 흡광도). PfoA 분자의 용혈 활성을 적혈구 용해 후 색상 변화의 광학 밀도를 측정함으로써 정량화하였다. 상기 측정된 색상의 진하기는 적혈구 용혈량에 비례하며, 이어서 이는 헤모리신의 양에 비례한다. 이어서 샘플 값을 공지된 표준을 사용하여 표준 곡선으로부터 판독하였다. 용혈 단위를 양 적혈구의 50%가 용혈되는 샘플의 희석률로서 정의하였다.

AFV102의 대식세포에 대한 세포독성:

J774A.1 대식세포(ATCC No. A TIB-67) 상의 재조합 균주의 세포독성을 셀 티터 96 아쿠어스 원 솔류션 셀 프로리퍼레이션 어세이(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay) 키트(Promega, cat#: G3580)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 감염된 세포로부터 방출된 락테이트 데하이드로게나제(LDH)를 측정함으로써 측정하였다. 간단히, 상기 세포를 10의 감염 배수에서 AFV102 세균으로 감염시켰다. 상이한 감염 후 시점에서 상등액을 상기 세포로부터 방출된 LDH의 양에 대해 측정하였으며, 이어서 이를 BCG 데니쉬 1331 균주의 양과 비교하였다. 감염되지 않은 정상 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. 생육가능한 세포의 퍼센트를 음성 대조군 세포(100% 세포 생육성)의 경우에 대한 감염 세포로부 터 방출된 LDH의 양을 근거로 계산하였다.

실시예 2의 결과

AFV102 제작:

AFV102를 제작하는 동안, 그의 염색체상에, 선택된 부분 이배수체 세균(그의 염색체상에 그의 동종 DNA 구획과 녹아웃 플라스미드상의 구획과의 대립유전자 교환을 통해 전체 녹아웃 플라스미드를 갖는다)을 PfoA 발현 카세트에 의해 ureC 유전자를 교체하기 위해 최종 대립유전자 교환을 위해 슈크로스 함유 미들브룩 7H10 플레이트상에서 배양하였다. 상기 슈크로스 플레이트상에 생성된 콜로니들 중에서 하나의 콜로니 Pfo-105-5(AFV102라 다시명명함)가 우레아제 음성인 것으로 밝혀졌으며, 이는 상기 ureC 유전자가 Pfoa 발현 카세트로 대체되었음을 암시한다. 상기 세균 콜로니에 대해 ΔureC::ΩpfoA의 유전자형에 대한 PCR에 의한 유전자형분석을 추가로 수행하였다. 생성된 PCR 반응을 1.2% 아가로스 젤 상에서 젤 전기영동에 의해 분석하고 결과를 도 6에 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 주형으로 서 상기 세균을 사용한 PCR은 예상된 크기(모 BCG 데니쉬 1331 균주의 크기보다 더 크다)의 PCR 산물을 생성시켰다. ΔureC::ΩpfoA의 유전자형에 대한 DNA 밴드의 예상 크기는 2180 bp인 반면, 모 BCG 데니쉬 1331 균주의 경우 크기가 1967 bp이다. 콜로니 105-5에 대한 PCR 산물을 추가로 젤 정제하고 존스 홉킨스 대학(Baltimore, MD)의 상업적인 서열화 설비에 의해 서열화하였다. 상기 서열화 결과는 상기 콜로니가 예상된 ΔureC::ΩpfoA의 유전자형을 가짐을 보였다. 또한, AFV102 균주로부터의 sac B 유전자 및 가나마이신 유전자의 증폭을 표적으로 한 PCR은 임의의 PCR 산물을 생성시키지 못했다(데이터 도시 안됨). 이러한 발견은 AFV102가 최종 대립유전자 교환 단계를 겪으며 목적하는 ΔureC::ΩpfoA의 유전자형을 가짐을 암시한다.

AFV102에 대한 생육 특성화 및 가나마이신 감수성 시험:

우레아제 활성 시험 및 유전자형 결과를 근거로, 클론 105-5(AFV102라 다시 명명함)는 예상된 표현형 및 목적하는 ΔureC::ΩpfoA의 유전자형을 나타내었다. 이어서 AFV102를 모 BCG 데니쉬 1331 균주의 경우에 대한 7H0 생육 배지에서 증식하는 그의 능력에 대해 추가로 시험하였다. 결과를 도 7에 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, 상기 AFV102 구조물은 모 균주의 경우와 매우 유사한 7H0 생육 배지에서의 증식 곡선을 갖는다. 또한, 가나마이신의 존재 하에서, AFV102 생육은 모 BCG 데니쉬 1331 균주의 경우와 유사한 정도로 감퇴하며, 이는 예상된 바와 같이 상기가 가나마이신에 대해 유사한 감수성을 가짐을 암시한다.

AFV102의 세포독성:

PfoA 단백질의 단일 아미노산 변화(Gly를 암호화하는 gga로부터 Gln을 암호화하는 cag로의 코돈 137 치환 돌연변이)로 포유동물 세포에 대한 독성이 상실됨을 보고하였다. 그러나 상기 단백질은 여전히 액포로부터 세균 이탈을 매개하는 능력을 유지한다(Portnoy 상기, 1996). AFV102로부터 발현된 단백질의 독성을 J7741A 세포를 AFV102 세균으로 감염시켜 평가하였다. 감염 후 상이한 시점에서 감염되지 않은 정상 세포 대조군과 비교 시, AFV102는 현재 사용되는 BCG 데니쉬 1331 백신 균주보다 더 현저한 세포사를 유발하지 않았다(도 8).

폐포 대식세포 세포주에서의 생존:

구조물이 대식세포 내에서 생존할 수 있는지를 조사하기 위해서, 중간 지수기 배양물을 사용하여 J774A.1 폐포 대식세포를 감염시켰다. 새포를 1:1의 감염 배수(MOI)로 감염시켰다. 마이코박테리움의 세포 내 생존을 다양한 감염 후 시간 간격으로 상기 세균을 함유하는 플레이트에 의해 모니터하였다. 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 AFV102 구조물은 모 균주의 경우와 유사한 지속적인 표현형을 나타내었으며, 이는 J774A.1 세포에서 상기 구조물에 대한 세포 내 생존에 결함이 없음을 암시한다.

AFV102에 의한 PfoA 단백질의 분비:

AFV102 구조물을 함유하는 세균에 의한 PfoA 단백질의 분비를, BCG 데니쉬 1331 균주의 경우에 비해 향상된 용혈 활성에 대한 세균 배양 상등액을 측정함으로써 시험하였다. AFV102 및 BCG 데니쉬 1331 균주 모두에 대한 배양 상등액을 동일한 광학 밀도에서 수확하고 적혈구를 용해시키는 능력에 대해 비교하였다. 결 과를 도 10에 나타낸다. 선행 보고서와 일치하게, 상기 BCG 배양 상등액은 생육 도중 대사산물을 방출하는 세균의 결과로서 기준선 수준의 용혈 활성을 나타내었으며, 이는 적혈구 용해를 생성시킬 수 있다(Grode et al., Journal of Clinical Investigation, 115:2472-2479; 2005). 대조적으로, AFV102 배양 상등액은 BCG 데니쉬 1331 균주의 경우에 비해 현저하게 더 높은 용혈 활성을 가졌으며, 이는 배양 상등액 내로의 PfoA 분자의 분비와 일치한다. 또한, 상기 PfoA의 pH 의존성 용혈 활성을 추가로 시험하고 pH 5.5 및 7.0 모두에서 비교하고 결과를 도 10에 나타낸다. 볼 수 있는 바와 같이, AFV102로부터의 상등액은 pH 5.5 및 7.0 모두에서 유사한 용혈 능력을 가지며, 이는 상기 PfoA 단백질에 의해 분비된 용혈 활성이 예상대로 pH 의존적임을 암시한다.

실시예 2는 상기 제작된 균주가 예견된 생물 활성을 가지며, 상기 균주에 의해 제조된 Pfo가 분비되고 pH 의존 활성을 가짐을 나타낸다.

실시예 3. rBCG-PfoA 엔도솜 이탈 및 동물 면역원성 시험

마이코박테리움 튜베르큘로시스 병인의 중심 범례는 식포 성숙의 저지이다. 얌스트롱과 하트(Armstrong and Hart)(1971)는 엠 튜베르큘로시스 식포가 페리틴-표지된 리소솜과 혼합되지 않음을 확립하였다(식포-리소솜 융합의 억제로서 지칭됨). 백신 균주 엠 보비스(BCG)가 또한, 말단 세포내 이입 소기관으로부터 격리된, 식포 구획에 존재하는 것으로 밝혀졌다(Clemens and Horwitz, 1995; Hasan et al., 1997; Via et al., 1997). 클레멘스와 호위치(Clemens and Howitz, 1995)는 마이코박테리움 식포가 트랜스페린 수용체(TfR)를 혈장막 상의 경우와 유사한 밀도 로 지속적으로 염색함을 발견하였다. 상기 트랜스페린 수용체는 전형적으로 엔도솜으로부터 신속히 제거되며(t 1/2 분) 다시 상기 혈장막으로 운반되나; 마이코박테리움 식포에서 상기 과정은 정지하며 상기 식포는 트랜스페린 수용체를 함유할 것이다. 이러한 현상은 우리로 하여금 마이코박테리움을 함유하는 식포를 볼 수 있게 한다. 상기 식포를 트랜스페린 수용체에 대한 항체로 표지하였다. 동시에, 상기 마이코박테리움을 일단 상기 식포 내에 들어간 세균의 운명을 가시적으로 모니터할 수 있게 하는 형광 염료로 염색하였다. 결과는 rBCG-Pro 구조물이 세포 감염 후 엔도솜을 이탈할 수 있음을 보였다.

엔도솜 이탈 시험을 위한 물질 및 방법:

데니쉬 1331 및 rBCG-ΔureC::ΩpfoA_G137Q(AFV102)를 10%(v/v) OADC 및 0.05%(v/v)의 타이록사폴이 보충된 7H9 배지(생육 배지)에서 약 0.8 내지 1.0의 OD₆₀₀로 증식시켰다. 감염 전에, 세균 세포를 제조사의 지시에 따라 실온에서 1 내지 1.5 시간 동안 PBS 중의 알렉사 플라워(Alexa Flour) 568 숙신이미딜 에스터(Molecular Probes, Eugene, OR)로 표지하였다. 상기 염료는 세균 표면 상의 단백질 상에 위치한 1 차 아민에 매우 안정한 아미드 결합을 형성한다. 간단히, 세균 배양물 10 ㎖을 펠릿화하고 PBS(pH 7.2) 중의 알렉사 플라워 568 0.625 ug/㎖의 25 ㎖에 재현탁시키고 실온에서 1 내지 1.5 시간 동안 배양시켜 세균을 표지하였다. 이어서 상기 표지된 세균 세포를 PBS로 3 회 세척하고 7H9 생육 배지에 재현탁시키고 냉장고에서 밤새 보관하였다. J774A.1 세포를 인간 피브로넥틴 코팅 된 커버슬립 상의 6웰 세포 배양 플레이트에서 앞서 개시한 바와 같이(Sun et al., 2004) DMEM 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 3 x 10⁶ 세포/웰의 밀도로 도말하고 5% CO₂ 및 습도가 있는 37 ℃ 배양기에서 2일간 배양하였다. 상기 감염 도중, 표지된 세균을 펠릿화하고 DMEM+10% FBS 배지에 재현탁시키고 J774A.1 세포에 각 세포에 대해 10의 감염 배수(MOI)로 직접 가하였다. 20 분, 8 시간 및 24 시간 후에, 상기 세포를 실온(RT) 포스페이트 완충 염수(PBS, pH 7.2)로 세척하였다. 이어서 상기 세포를 RT에서 PBS(pH 7.2) 중의 2% 파라폼알데하이드로 20 분간 고정시켰다. 이어서 상기 고정된 세포를 RT에서 10 분간 PBS(pH 7.2) 중의 0.1% 트리톤 X-100로 침투시킨 다음 PBS(pH 7.2)로 2 회 세척하였다. RT에서 2 시간 이상 또는 4 ℃에서 밤새 3% 소 혈청 알부민(BSA), 5% 통상적인 염소 혈청(NGS) 및 PBS(pH 7.2) 중의 0.5% 나트륨 아지드로 차단시켰다. 차단 완충제를 제거하고 이어서 수용체-FITC를 운반하는 래트 항 마우스(US Biological, Swampscott, MA)를 1% BSA, 3% NGS 및 0.5% 나트륨 아지드를 함유하는 PBS(pH 7.2) 중의 1:50의 희석비로 가한 다음 RT에서 1 시간 이상 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 2 내지 3 회 세척하고 유리 슬라이드 상의 벡실드(vectsheild) 적재 배지와 함께 적재하였다. 영상화를 위해서 레티가(Retiga) EXI 모노, 12 비트 냉각된, IR 여과된 디지털 카메라가 장착된 니콘 TE2000 역 현미경을 사용하여 1500의 배율로 분석을 수행하였다.

결과:

현미경 하에서 검사 시, BCG 및 rBCG-PfoA 세균이 모두 감염 후 15 분째에 숙주 세포에 의해 내부화되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 감염 후 8 시간째에 rBCG-PfoA 세균은, 주로 숙주 식포 내부에 위치하는 것으로 밝혀진 BCG 세균과 대조적으로 엔도솜 밖에 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 결과를 도 11A 내지 D에 도식적으로 예시하며, 상기 도면들은 대식세포의 세균 침입(도 11A), 엔도솜 내부의 BCG의 지속성(도 11B), 초기 엔도솜 내부의 AFV102 세균(도 11C), 및 재조합 PfoA의 분비로 인해 엔도솜으로부터 세포질 내로 이탈하는 AFV102 세균(도 11D)을 예시한다. 세균의 나열은 138 개 중 100 개의 AVF102가 감염 후 8 시간째에 엔도솜을 이탈한 반면(72%), 100 중 단지 29 개의 BCG(26%)는 식포를 이탈하였다. 감염 후 24 시간째에 세균 샘플의 검사는 유사한 결과를 생성시켰다. 이러한 발견은 PfoA의 발현이 식세포로부터 AVF102의 방출을 증가시킴을 나타낸다.

상기 결과의 추가적인 확인을, pH 감수성 염료를 사용하여 엔도솜 및 리소좀(Lysotracker-Red, Molecular probes, 목록 번호 L-7528)을 유사한 실험 세팅 및 상기와 같은 과정 하에서 표지하는 상이한 시스템을 사용하여 수행하였다.

실시예 3은 재조합 균주 AVF102가 엔도솜을 이탈할 수 있는 반면 BCG 균주는 엔도솜을 이탈하는데 훨씬 덜 효율적임을 보인다. 따라서, 균주 AVF102는 BCG보다 제 I 형 조직적합성 면역 반응을 훨씬 더 잘 유도하는듯하다.

실시예 3에 대한 참고문헌

실시예 4. 제형화 및 백신화 전략

백신 제형에 대한 전략은 제조 과정 전체를 통한 최대 생육력 및 안정성을 측정하는 연구를 기본으로 한다. 여기에는 글리세롤, 당, 아미노산 및 세제 또는 염의 첨가를 포함하는 마이코박테리움 배양물에 통상적으로 사용되는 다양한 배지를 사용하여 배양 중에 최대 유기체 생육력(생존율 대 치사율)을 측정함이 포함된다. 배양 후, 세포를 원심분리 또는 접선 유동 여과에 의해 수확하고 동결 또는 동결 건조 동안 세포를 보호하는 안정화 배지에 재현탁시킨다. 통상적으로 사용되는 안정화제에는 나트륨 글루타메이트, 아미노산 또는 아미노산 유도체, 글리세 롤, 당 및 통상적으로 사용되는 염이 포함된다. 최종 제형은 분배 및 사용 동안 적합한 저장 수명을 유지하기에 충분한 안정성으로 피 내, 경피 주사, 주입 또는 경구 전달에 의해 전달되기에 충분한 생육 가능한 유기체를 제공할 것이다.

TB 백신의 임상 전 평가

일반적인 안전성 시험

6 개 그룹 중의 BALB/c 마우스를 관심 rBCG 균주(들) 및 유사한 모 균주 2 x 10 CFU로 복강 내 감염시킨다. 상기 동물들을 감염 후 14 일간 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. BCG 및 rBCG 균주를 제공한 동물은 여전히 건강하며, 관찰 기간 동안 체중 손실이나 명백한 질병 징후를 보이지 않는다.

면역적격 마우스에서 신규의 rBCG 균주의 독성

15 마리의 면역적격 BALB/c 마우스 그룹을 각각 2 x 10⁶ rBCG 및 BCG 모 균주로 정맥 내 감염시킨다. 감염 후 1 일째에, 각 그룹의 3 마리의 마우스를 죽이고 비장, 폐 및 간의 CFU를 분석하여 각 동물이 동등한 감염 용량을 가짐을 확실히 한다. 감염 후 4, 8, 12 및 16 주째에, 각 그룹 중 3 마리의 마우스를 죽이고 비장, 간 및 폐의 CFU를 획득하여 모 BCG 균주에 대한 rBCG 균주의 생체 내 생육을 평가한다.

면역타협된 마우스에서 엄격한 안전성 시험

10 개 그룹 중의 SCID(중증 합병 면역결핍증) 표현형을 갖는 면역타협된 마우스를 2 x 10⁶ cfu rBCG 및 모 BCG 균주로 정맥 내 감염시킨다. 감염 후 1 일째 에 각 그룹 중 3 마리의 마우스를 죽이고 비장, 간 및 폐의 cfu를 평가하여 접종 용량을 확인한다. 각 그룹의 나머지 7 마리 마우스를 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. 이들 마우스의 생존을 추적하고 rBCG-감염된 마우스의 생존을 전체 관찰 기간 동안 모 균주 감염된 동물의 생존과 비교한다.

기니 피그 안전성 시험

rBCG 균주의 안전성을 또한 모 BCG 백신(인간에서 안전성 프로파일이 잘 확립되어 있다)과 비교하여 기니 피그 모델에서 평가한다. 먼저, 체중 증가를 포함하여, 동물의 일반적인 건강 상태에 대한 상기 백신의 효과를 검사한다. 기니 피그를 재조합 및 모 균주 10⁷(100 x 백신 용량) CFU로 근육 내 면역시키고 상기 동물을 6 주간 일반적인 건강 및 체중에 대해 모니터한다. 상기 6 주전에 죽은 동물에 대해 검시를 수행한다. 모든 동물을 감염 후 6 주의 끝에서 죽이고 전체 병리를 수행한다. 상기 시험 하 확인의 경우, 체중 손실 및 비정상적인 양상이 관찰되지 않으며, 모든 기관은 6 주 부검에서 정상으로 보이고/보이거나 rBCG-ProA 백신에 대해 부정적인 건강 효과가 관찰되지 않으며, rBCG-PfoA-백신화된 동물은 상기 모 균주 접종된 동물에 비해 체중이 정상적인 속도로 증가한다.

동시에, 동물 기관에서 세균 수준을 모니터한다. t아기 모 또는 재조합 백신으로 면역시킨 기니 피그를 접종 후 다양한 간격으로 안락사시키고, 그 후 폐, 비장 및 국소(서혜부) 림프절을 BCG 또는 rBCG의 CFU에 대해 분석한다.

독성 시험

rBCG 균주의 독성을 평가하기 위해서, 기니 피그(각 그룹에서 12 마리)를 인간 용 rBCG 균주, BCG 모균주 또는 염수의 1 회 용량보다 4 배 더 많거나 4 배 더 적은 1 회 용량으로 피 내 예방접종한다. 예방접종 후 3일째에, 6 마리의 동물을 죽여 상기 동물에 대한 상기 배신의 급성 효과를 평가한다. 예방접종 후 28일째에, 나머지 6 마리의 동물을 죽여 상기 동물에 대한 만성 효과를 평가한다. 상기 두 시점 모두에서, 각 동물의 체중을 획득하고, 전체 병리 및 주사 부위의 외관을 검사한다. 혈액 화학을 위해 채혈하고 내부 기관 및 주사 부위의 조직병리를 수행한다.

쥐 보호 연구

13 개 그룹 중의 C57B1/6 마우스(암컷, 5 내지 6 주된 것)를 10⁶ CFU의 rBCG, 모 BCG 또는 염수로 피하 면역시킨다. 또 다른 그룹의 마우스를 건강한 대조군으로서 사용한다. 면역화 후 8주째에, 앞서 개시한 바와 같이(Brodin et al., J Infect Dis., 190(1):115-122; 2004), 마우스를 총 10⁷ CFU의 시험접종 균주를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 생성된 에어로졸에 의해 각 동물의 폐에 ∼100 개의 생 세균을 전달하는 용량으로 엠 티비 에드만 균주(또는 H37Rv Kan-내성 균주)로 시험접종한다. 상기 접종된 동물을 시험접종하지 않은 동물과 함께 생존에 대해 모니터한다. 상기 시험접종에 이어서, 동물들을 체중 손실 및 일반적인 건강에 대해 모니터한다. 시험접종 후 1일째에, 각 그룹의 3 마리 마우스를 폐 CFU를 위해 죽여 시험접종 용량을 확인하고 비장 및 폐 조직병리에 대해 한 마리의 동물을 죽인다. 시험접종 후 5주째에, 각 그룹의 9 마리의 동물을 죽이고 상기 동물의 조직병리 및 미생물학적 분석을 수행한다. 6 마리의 마우스로부터 폐 및 비장 조직을 CFU 수에 대해 평가한다(선택된 보충물이 있는 플레이트를 사용하여 상기 시험접종 균주로부터 백신 균주를 식별한다). H37Rv-kan 내성 균주로 시험접종하는 경우, Kan 또는 TCH(티오펜-2-카복실산 하이드라지드)를 사용하여 상기 백신 균주로부터 시험접종 균주를 식별한다. 상기 엠 티비 에드만 균주를 사용하여 시험접종하는 경우, TCH를 사용하여 상기 시험접종 균주로부터 백신 균주를 식별한다(BCG는 민감성이지만 엠 티브는 천연 내성이다).

피부의 지연된 유형의 과민성(DTH)의 유도

특정한 병원체 비 함유(SPF) 기니 피그를 10³ rBCG 또는 BCG 모균주로 피 내 면역시킨다. 면역 후 9주째에, 동물의 등을 면도하고 100 ㎕의 포스페이트 완충된 염수 중의 PPD(단백질 정제된 유도체) 10 ㎍으로 피 내 주입한다. 24 시간 후에, 단단한 경화부(DTH)의 직경을 측정할 것이다. rBCG 균주는 모 BCG 균주에 의해 유도된 것 이상의 DTH를 유도한다.

기니 피그 시험접종 연구

엠 티비 시험접종에 대한 rBCG 백신의 효능을 측정하기 위해서, 기니 피그(초기 성숙한 것, SPF Hartley, 250 내지300 g, 수컷)를 12 개의 그룹에서 면역화한다(각각 rBCG, 모BCG 균주 또는 염수로). 상기 백신 및 대조군을 10⁶ cfu로 피 내 투여한다. 면역 후 10 주째에, rBCG-, BCG- 및 모의-면역된 동물을 총 10⁷ cfu의 엠 티비를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 생성된 에어로졸에 의해 엠 티비를 갖는 에어로졸로 시험접종하며; 상기 과정은 앞서 개시한 바와 같이(Brodin et al., 2004), 각 동물의 폐에 ∼100 개의 생 세균을 전달한다. 상기 시험접종에 이어서, 상기 동물들을 예방접종하지 않고, 시험접종하지 않은 동물의 건강한 그룹과 함께 생존, 체중 손실 및 일반적인 건강에 대해 모니터한다. 시험접종 후 10 주째에, 각 그룹의 6 마리 동물을 죽이고 각 그룹의 나머지 6 마리의 동물은 장기 평가를 위해 시험접종 후 70 주째에 죽인다. 상기 두 시점 모두에서, 상기 동물의 조직병리 및 미생물학적 분석을 수행한다. 폐 및 비장 조직을 조직병리학 및 CFU 수에 대해 평가한다(선택된 보충물이 있는 플레이트를 사용하여 상기 시험접종 균주로부터 백신 균주를 식별한다). H37Rv-kan 내성 균주로 시험접종하는 경우, Kan 또는 TCH를 사용하여 상기 백신 균주로부터 시험접종 균주를 식별한다. 상기 엠 티비 에드만 균주를 사용하여 시험접종하는 경우, TCH를 사용하여 상기 시험접종 균주로부터 백신 균주를 식별한다(BCG는 민감성이지만 엠 티브는 천연 내성이다). 성공적인 시험접종 연구를 위해서, 모의 면역된 동물은 시험접종 후 가장 빠르게 죽고, rBCG-면역된 동물은 BCG 모균주 면역된 동물보다 더 오래 생존한다.

영장류 안전성 및 시험접종 연구

보다 최근에, 비인간 영장류를 엠 티비에 대한 백신의 평가를 위해 사용하였다. 인간과 비인간 영장류간의 진화 관계 및 이들 중에서 결핵의 유사한 임상 및 병리학적 표현은 상기 비인간 영장류 모델을 TB 질병 및 백신 효능의 실험 연구에 매력적으로 만들었다.

폐 공동의 발생을 특징으로 하는 상기 모델은 인간 TB에 적용가능한 것으로 보인다. 감염 및 질병 과정을 X-선 및 체중 손실뿐만 아니라, 각종 혈액 시험, 예를 들어 적혈구 침전율(ESR), 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 증식 및 사이토킨 생산, 세포독성 T 림프구(CTL) 활성 및 항체 반응에 의해 추적한다. 감염에 이어서, 키노몰구스 원숭이는 특징적인 병변을 갖는 폐 병리상태를 나타내며, 시험접종 용량에 따라, 급성 호흡기 감염으로부터의 사망이 감염 후 4 내지 6 개월 내에 일어난다. 보다 낮은 감염 용량은 질병 없이 만성 감염을 유도할 수 있으며, 이는 인간에서 훨씬 더 그럴 것이다.

상기 연구는 BCG 모 균주의 다양한 용량을 단독으로 투여되는 재조합 BCG 또는 rBCG 구조물에서 과 발현되는 서열을 포함하는 백신에 의한 2 회의 후속 추가접종과 비교한다. 후자를 임의의 다수의 공지된 수단에 의해, 예를 들어 비 제한적으로 적합한 항원보강제 제형에 기초한 재조합 단백질, DNA 또는 Ad35 구조물로서 전달한다.

상기 첫 번째 연구는 추가 접종 없이 모 BCG 대 rBCG 구조물의 보호 효능을 평가한다. 상기 연구는 각 그룹에 10 마리 동물을 갖는 3 개 그룹을 포함한다: 하나의 그룹은 각각 BCG, rBCG 및 염수를 포함한다. 각 그룹으로부터 2 마리의 동물을 rBCG 구조물 중의 과발현된 항원뿐만 아니라 표준 PPD 및 대조용으로서 염수로 피부 시험한다. BCG와 비교한 rBCG 그룹에서의 양성 및 보다 큰 경화부는 생체 내 백신 흡수 및 면역 반응의 유도를 가리킨다. 각 그룹으로부터의 나머지 8 마리의 동물을 저 용량의 엠 티비 에드만 균주로 에어로졸 시험접종하고 보호를 시험접종 후 16 주째 세균 부하의 감소 또는 종점으로서 생존에 의해 측정한다.

후속의 BCG 프라임 프로토콜은 동물들을 먼저 BCG, rBCG 및 염수로 예방접종한 다음 과 발현된 항원으로 2 회 추가접종함을 제외하고 상기와 필수적으로 동일하다.

비인간 영장류 모델에서 면역원성 및 보호 연구는 rBCG 구조물에 대한 효능 연구를 위해 짧은 꼬리 원숭이에서 결핵의 면역생물학 및 면역병리학적 태양을 조사한다. 상기 동물들은 실험 시작 전에 철저히 처리한 2 내지 3 ㎏의 평균 중량을 갖는 사로잡혀 사육된 초기 성숙한 것이다. 접종 전 연구는 통상적인 조혈 연구 및 적혈구 침전 속도뿐만 아니라 림프구 증식 분석을 포함하는 기준선 혈액 시험을 포함한다. 피부 시험을 PPD를 사용하여 수행하여 튜베르큘린에 대한 감수성의 결여를 보장하고 가슴 x-선을 감염 전 프로파일의 일부로서 획득한다. 면역화 기간은 총 21 주간 지속되며, 이는 0 주째 BCG 또는 rBCG, 및 12 및 16 주째 항원 추가접종에 의한 1 차 예방접종을 포함한다. 항원 특이성 면역성을 림프구 자극 시험에서 증식 및 인터페론 γ(IFN γ)를 측정함으로써 평가한다. IFN γ 생산 림프구의 회수를 효소 결합된 면역흡수 분석(ELISPOT) 또는 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)에 의해 측정한다. 이 때문에, 혈액 샘플을 1 차 예방접종에 비해 0, 4, 8, 12, 16 및 20 주째에 채혈한다.

최종 면역화 후 4 내지 6 주째에, 동물들을 같은 날 같은 제제로 엠 튜브레큘로시스 에드만 균주 3 ㎖(1,000 cfu)을 기관지 내 설치에 의해 시험접종한다. 감염 과정을 체중 손실, 발열, 상승된 적혈구 침전율(ESR), DTH 대 PPD, PPD로 자극한 PBMC의 생체 외 증식 반응 및 rBCG에서의 항원 과발현에 대해 평가한 다음 IFN-g 생산 수준을 측정한다. 가슴 x-선을 수행하여 폐 TB와 일치하는 이상을 검출하고 최종적으로 시험접종 후 12 내지 16 주째에 검시한다.

TB 벡터 및 백신의 임상 평가

안전성 및 독성 연구

연방 규제에 의해 위임된 임상 전 안전성 및 독성 연구를 상술한 바와 같이 임산 전 독성학 및 안전성 연구에 따라 수행한다. 이러한 연구에 이어서, 인간 안전성 연구를 수행한다. 이들 연구를 처음에는 건강한 콴티페론 음성 성인에서 수행한 다음 아동 및 신생아로 연령 감소시켜 수행한다.

면역원성 연구:

마우스 및 영장류에서 면역원성 연구를 사용하지만 상기 연구는 세포 면역성을 평가하는 표준 방법, 예를 들어 INFγ, ELISPOT, 단기 및 장기 항원 또는 펩타이드 자극을 사용하는 유식 세포측정 등으로 제한되지 않는다. 유사한 방법을 인간 반응의 평가에 사용한다. 사량체 연구를 인간의 예방접종에 이어서 CD4 및 CD8 반응의 평가에 사용한다.

1차-추가 접종 전략의 최적화:

rBCG는 TB 또는 관련 항원을 발현하도록 가공된 다른 질병에 대한 독립 백신으로서 잘 수행한다. 다른 질병에 대한 보호를 위해 항원을 발현하거나 또는 TB 대한 백신으로서 본 명에 개시된 바와 같은 rBCG는 또한 항원보강제 또는 바이러스 또는 세균 벡터화된 항원과 혼합된 재조합 단백질에 의한 추가 면역화를 위한 면역 시스템을 시동하는 것을 매우 잘 수행한다. 동물 임상 전 연구 및 인간 연구 모두에서, 상기 BCG는 1 차 접종에 이어서 재조합 단백질/항원보강제 또는 벡터 추가접종을 섭생 및 용량 면에서 최적화한다. 이러한 1 차 추가 접종 전략은 본 발명 에 포함된 BCG 1차 접종의 효능으로 인해 인간에서 면역성을 유도하고, 이어서 재조합 단백질 또는 벡터에 의해 상기 면역계의 추가접종 반응을 집중하고 향상시키는데 가장 효능 있는 수단이다.

동물에서 노출 후 치료 백신 연구:

C57BL/6 마우스(상기 동물로 제한되지 않는다)를 잠재적인 감염의 확립에 사용할 것이며; 치료 백신을 단지 무시할 정도의 엠 티비 특이적 면역성이 저 용량 감염에 의해 유도되는 시점 및 엠 티비 특이적 면역성이 유도되고 기억 T 세포에 의해 진정되고 지배되는 나중 시점에서 마우스에게 제공할 것이다. 이어서, 상기 백신의 치료 이점을 개별적인 마우스의 폐 및 비장에서의 cfu 카운트 측정에 의해 최종 치료 백신 전달 후 2 및 5 개월째에 마우스에서 평가할 것이다. 상기 cfu 카운트를 마우스의 그룹에서 표준 통계학적 방법에 의해 분석할 것이며, 상기 결과를 사용하여 치료학적 예방접종이 마우스에서 잠재적인 엠 티비 감염을 현저하게 감소시키는 지의 여부를 다룰 것이다. 유사한 방법을 필요에 따라 다른 동물들의 반응을 평가하는데 사용한다.

BCG 벡터의 임상 평가: rBCG 백신의 경구 투여

본 발명의 rBCG에 의한 표적 동물의 경구 예방접종을 앞서 개시한 방법을 사 용하여 수행한다(Miller et al., Can Med Assoc J. 121(1):45-54; 1979). 경구 투여되는 본 발명의 rBCG 양은 환자의 종뿐만 아니라 치료하려는 질병 또는 증상에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 약 10³ 내지 10¹¹ 생육성 유기체, 및 바람직하게는 약 10⁵ 내지 10⁹ 생육성 유기체이다.

rBCG를 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. 사용되는 특정한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 본 발명에 중요하지 않다. 희석제의 예로는 인산염 완충 염수, 위의 위산 완충용 완충제, 예를 들어 슈크로스를 함유하는 시트레이트 완충제(pH 7.0), 바이카보네이트 완충제(pH 7.0) 단독(Levine et al., J. Clin. Invest., 79:888-902; 1987); (Black et al., J. Infect. Dis., 155:1260-1265; 1987), 또는 아스코브산, 락토오스 및 임의로 아스파탐을 함유하는 바이카보네이트 완충제(pH 7.0)(Levine et al., Lancet, II: 467-470; 1988)가 있다. 담체의 예에는 단백질, 예를 들어 탈지유에서 발견되는 바와 같은 단백질, 설탕, 예를 들어 슈크로스, 또는 폴리비닐피롤리돈이 있다. 전형적으로는 상기 담체를 약 0.1 내지 90%(w/v)의 농도, 바람직하게는 1 내지 10%(w/v)의 범위로 사용할 수 있다.

실시예 5. 중중 합병 면역결핍증(SCID) 마우스에서의 안전성

앞서 언급한 바와 같이, BCG에서 Llo의 발현은 추정 상 BCG가 존재하는 개질된 엔도솜의 미세환경의 중성 pH에서 Llo의 낮은 활성으로 인해, 엔도솜 이탈을 촉진시키는데 비교적 무효한 것으로 나타났다(Hess, et al., Proc Natl Acad Sci 95:5299; 1998; Grode et al., J. Clin. Invest, J Clin Invest. 115(9):2472; 2005). 그럼에도 불구하고, Llo의 발현은 상기 엔도솜을 SCID 마우스에서 BCG-Llo+의 독성을 감소시키기에 충분히 명백하게 개질시켰다(Grode et al., 2005). 이러한 관찰은 숙주 세포의 세포질로의 BCG의 재 표적화가 상기 구세대의 생 TB 백신의 면역원성과 안전성을 개선시키는 능력을 가짐을 암시한다. 따라서, 상기 연구의 목표는 SCID 마우스에서 PfoA_G137Q를 발현하는 엔도솜 이탈 균주 AFV102의 안전성을 측정하는 것이다.

이 때문에, 모 균주 BCG 데니쉬 1331(BCG₁₃₃₁) 및 PfoA_G137Q를 발현하는 BCG의 유도체, 균주 AFV102를 교반하면서(분당 150회 진동) 2L 플라스크에서 말기 대수기(540 ㎚에서 6.5 내지 7.5의 광학 밀도)로 증식시켰다. 세균을 원심분리에 의한 수확에 의해 수확하고 +0.05%(v/v) 틸록사폴 + 10%(v/v) 글리세롤 중에서 -80 ℃에서 1.5 x 10⁹ cfu/㎖에서 보관하였다.

상기 벌크 바이알을 얼음 상에서 해동시키고 엔도톡신 부재(＜0.05 EU/㎖) 규정 염수(0.85% w/v NaCl) 중의 일련의 희석물 세트를 만들어 접종물을 제조하였다. 이러한 희석물을 사용하여 0.1 ㎖의 부피로 현탁된, 표 2에 나타낸 각각의 용량을 6 개의 SCID 마우스 그룹에 피하 접종하였다.

[표 2]

SCID 마우스 안전성 연구의 디자인

접종 후, 마우스들을 접종 후 100일의 기간에 걸쳐 생존에 대해 모니터한다. 상기 연구의 결과는 AFV102를 접종한 마우스들이 유사한 용량의 BCG₁₃₃₁를 제공한 마우스들보다 더 오래 생존함을 보인다.

BCG에 의해 유도된 면역성을 북돋아 주기 위한 이종 추가접종 백신의 사용이 최근에 주목되었다. 따라서, BCG-1차 접종된 실험실 동물과 인간은 Mtb 항원 85A(본 발명에서 "Ag85A"라 칭함; 또한 Rv3804c로서 공지됨; Vordemeier et al., Immunol. 112(3):461; 2004; Mashane et al., Nature Med. 10(11):1240; 2004)를 암호화하는 개질된 우두 앙카라(MVA)로 구성된 이종 추가접종에 따라 인상적인 세포 면역 반응을 나타내며; 대조적으로 접종 받은 적이 없는 개인은 MVA-Ag85A 벡터 에 대해 비교적 인상적이지 않은 반응을 나타낸다(McShane et al., 2004). 더욱 또한, BCG를 1 차 접종하고 MVA-Ag85A(Williams et al., Infect Immun. 73(6):3814; 2005) 또는 서브유닛 백신 Mtb72f(Brandt et al., Infect. Immun. 72(11):6622; 2004)를 추가 접종한 실험실 동물이 상기 접근법을 위해 보강된 지지체인 BCG 만으로 예방접종하여 성취된 경우보다 더 큰 수준의 Mtb 시험접종 내성을 나타낸다. 이러한 연구는 보호의 상관성을 한정하지 않았지만, 이종 1차-추가 예방접종 전략이 Mtb에 대한 보호를 자극하기에 유효한 수단을 제공함은 분명하다.

따라서 상기 및 하기 실시예의 목적은 1차-추가 예방접종 섭생에서 엔도솜 이탈 균주 AFV102를 평가하는 것이다. 본 실시예의 실험 목적은 엔도솜 이탈 균주 AFV102가 1 차 및 복제-결손 아데노바이러스 혈청형 35 백신 벡터(Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003; Barouch et al., J. Immunol. 172(10):6290; 2004)로서 사용되는 1차-추가 접종 섭생에서 간격을 최적화하는 것이며, 상기 벡터는 추가접종물로서 사용되는 거대세포바이러스 초기 프로모터(Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003)의 조절 하에서 Mtb 유전자 Rv3804c-Rv1886-Rv0288로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 상기 추가 접종물을, TB 항원을 발현하는 아데노바이러스는 통상적인 비 경구 투여 경로에 의해서보다 비 내 경로에 의해 보다 유효하므로 상기 비 내 경로에 의해 투여한다(Wang et al., J. Immunol. 173(10):6357; 2004).

따라서, 10 SPF 수컷 하틀리 기니 피그(250 내지 300 g)의 그룹을 표 3에 나타낸 바와 같이 면역시켜 14, 18 및 21 주 1차-추가 접종 간격을 평가한다.

[표 3]

기니 피그 섭생 연구 디자인

각주: Ad35-TBS는 복제 결손 아데노바이러스 혈청형 35 백신 벡터를 나타내며(Voges et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003; Barouche et al., J. Immunol. 172(10):6290; 2004), 상기는 거대세포바이러스 초기 프로모터(Vogels et al., J Virol. 77(15):8263-71; 2003)의 조절 하에서 Mtb 유전자 Rv3804c-Rv1886-Rv0288로 구성된 융합 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다)

상기 1차 접종물을 0.1 ㎖의 10% 글리세롤 중의 10⁶ cfu의 용량으로 피 내 투여한다. 대조용 마우스에게 0.1 ㎖ 10% 글리세롤을 피 내 단독 제공한다. 상기 1차 접종 후 14주째에, 기니 피그에게 Ad35-TBS로 구성된 추가 접종물을 제공하고 PBS 10 ㎕ 중에 현탁된 10⁹ 플라크 형성 단위(즉 Vogels et al., 2003; Barouch et al. 2004)의 용량으로 비 내 투여한다.

상기 추가 접종 후 14주째에, 동물들을 총 10⁷ cfu의 Mtb를 함유하는 10 ㎖ 단일 세포 현탁액으로부터 생성된 에어로졸에 의해 Mtb 균주 에드만을 갖는 에어로졸에 의해 시험접종하며; 이러한 과정은 앞서 개시한 바와 같이(Brodin et al., 2004), 각 동물의 폐로 ∼100 개의 생 세균을 전달한다. 시험접종 후 5 주째에, 각 그룹의 동물을 죽이고 폐 및 비장을 조직학 및 미생물학적 분석을 위해 수거한다. 후자의 경우, 기니 피그로부터의 폐 및 비장 조직을 cfu 카운트에 대해 평가한다. Mtb 에드만 균주를 시험접종에 사용하므로, TCH를 상기 배지에 가하여, TCH에 감수성인 백신 균주를 상기 시험접종 균주와 식별한다.

상기 연구의 결과는 rBCG 1차 접종과 Ad35-TBS 추가접종 간의 최적 간격을 확인한다.

실시예 6. 면역화 시험접종

Mtb 시험접종에 대한 후보 TB 백신 균주 AFV102의 효능을 측정하개 위해서 8 개 그룹(다 자란 어린 SPF 하틀리 기니 피그, 250 내지 300 g)을 표 4에 나타낸 바와 같이 면역시킨다.

[표 4]

그룹 4 및 5의 1차 접종물을 0.1 ㎖의 10% 글리세롤 중의 10⁶ cfu의 용량으로 피 내 투여한다. 그룹 1 및 3의 대조용 마우스에게 0.1 ㎖ 10% 글리세롤을 피 내 단독 제공한다. 그룹 2의 대조용 마우스에게 0.1 ㎖의 10% 글리세롤 중의 10⁶ cfu의 BCG 데니쉬 1331을 투여한다.

상기 1차 접종 후 14주째에, 기니 피그를 추가 접종한다. 그룹 5에서, 상기 추가 접종물은 AFV102로 구성되고 0.1 ㎖의 10% 글리세롤 중의 10⁶ cfu의 용량으로 피 내 투여된다. 그룹 4 및 6에서, 상기 추가 접종물은 Ad35-TBS로 구성되며 PBS 10 ㎕ 중에 현탁된 10⁶ 플라크 형성 단위(즉 Vogels et al., 2003; Barouch et al. 2004)의 용량으로 비 내 투여된다.

최종 면역화 후 14주째에, 동물들을 총 10⁷ cfu의 Mtb를 함유하는 10 ㎖ 단 일 세포 현탁액으로부터 생성된 에어로졸에 의해 Mtb를 갖는 에어로졸에 의해 시험접종하며; 이러한 과정은 앞서 개시한 바와 같이(Brodin et al., 2004), 각 동물의 폐로 ∼100 개의 생 세균을 전달한다. 시험접종에 이어서, 상기 동물들을 예방접종하지 않고, 시험 접종하지 않은 건강한 그룹과 함께 생존에 대해 모니터한다. 상기 동물들을 체중 손실 및 일반적인 건강에 대해 모니터한다.

상기 연구의 결과는 모의-면역된 동물들은 대부분 시험 접종 후 급속히 죽고, 추가접종 없이 BCG를 피 내로 예방접종한 동물들은 중간 평균 사망 시간을 보이며, AFV102로 면역화되고 Ad35-TBS로 피 내 추가접종한 동물들은 가장 오래 생존함을 나타낸다.

실시예 7. 세포자멸

세포자멸은 프로그램화된 세포사이며 그의 유도 및 결과의 면에서 괴사성 세포사와 대단히 상이하다. 외부 항원을 함유하는 세포의 세포자멸은 상기와 같은 항원에 대한 세포 면역성의 강력한 공지된 자극이다. 항원 함유 세포의 세포자멸이 세포 면역성을 유도하는 과정을 때때로 교차 프라이밍이라 칭하였다^1,2,3. 항원 특이적인 세포 매개된 면역성을 증가시키는 세포자멸의 유도 기전이 여러 가지 존재한다. 카스파제 8 매개된 세포자멸은 항원 특이적인 세포 면역 보호를 유도한다⁴. 세포질에서 엔도솜을 이탈하는 재조합 BCG에 의한 카스파제 8의 발현은 높은 수준의 항원 특이적인 세포 면역성을 도출하는 BCG 자체의 항원뿐만 아니라 BCG 및상기 재조합 BCG에 의해 과발현된 다른 결핵 항원에 대해, 상기 재조합 BCG에 의해 발현된 외부 항원과 관련하여 프로그램화된 세포사를 유도하는 강력한 방법이 될 것이다. 사망 수용체-5(DR-5)(또한 TRAIL-R2(TRAIL 수용체 2) 또는 TNFR-SF-10B(종양 괴사 인자-상과 구성원 10B)로서도 공지됨)가 또한 카스파제 8 매개된 세포자멸을 매개한다⁴. 리오바이러스 유도된 세포자멸은 TRAIL-DR5에 의해 매개되어 상기 바이러스의 후속적인 제거를 발생시킨다⁵. 엔도솜을 이탈하는 재조합 BCG에 의한 DR-5의 발현은 rBCG 발현된 항원에 대한 항원 특이적인 세포 면역성의 유도에 강력한 항원보강 효과를 제공해야 한다. 항원 발현 세포를 또한 Fas 연결(이는 항원 특이적인 세포 면역 반응의 유도에 강력한 자극이다)을 통해 세포자멸을 겪도록 유도할 수 있다⁶. Fas 또는 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질을 발현하는 rdsRN은 rdsRN에 의해 발현되는 항원에 대해 세포자멸 및 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도할 것이다.

rBCG 엔도솜 이탈 균주 또는 상술한 세포자멸의 추가적인 향상제를 생산하는 rBCG 엔도솜 이탈 균주에 의한 세포 면역성의 향상은 rBCG 항원 또는 rBCG에 의한 과발현을 특이적으로 암호화하는 항원으로 국한되지 않고 상기 rBCG가 침입할 수 있는 진핵 세포 중의 임의의 항원을 포함한다. 일례로서, 상기와 같은 rBCG가 세포자멸을 유도하는 종양 세포로 전달되는 경우, 중요한 종양 항원에 대한 세포 면역성이 상기 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방과 함께 유도될 것이다. 이러한 항종양 효과는 방광암의 경우와 같이 국소적으로 제공되는 경우 BCG가 생성시키는 일반적인 항종양 효과 이외의 것일 것이다.

본 발명의 추가의 실시태양에서, 엔도솜을 이탈하는 rBCG 또는 세포자멸의 특정한 매개체의 생산에 의해 향상되는 엔도솜을 이탈하는 rBCG는 상기와 같은 rBCG가 또한 강한 세포 면역 반응이 실리는 외부 항원을 생산하는 내부 종양 또는 다른 세포를 전달하여 상기 종양 세포 또는 상기 항원을 함유하는 다른 진핵 세포에 대한 강한 세포 반응의 생성을 유도할 것이다. 이러한 세포 반응은 후속적인 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방과 함께 면역 매개된 종양 세포 파괴, 추가로 상기 종양 또는 다른 중요한 항원에 대한 세포 면역성의 교차 프라이밍 및 유도를 도출할 것이다. 상기와 같은 외부 항원의 예는 강한 이종 세포 반응이 실리는 숙주 세포 HLA와 상이한 HLA 항원이다.

엔도솜 이탈 rBCG 또는 세포자멸을 유도하는 성질이 또한 특정 종양 항원을 전달하는 세포자멸의 특정한 매개체의 발현에 의해 향상되는 엔도솜 이탈 rBCG는 상기 종양 항원에 대한 강한 항원 특이적 세포 반응을 유도하여, 상기 항원의 일부 허용성을 파괴하여 상기 rBCG의 상기 종양 자체로의 직접적인 전달의 필요없이 종양 및/또는 전이를 제거, 감소 또는 예방함을 포함한, 상기 항원에 대한 강한 항원 특이적인 세포 반응을 유도할 것이다.

DNA 손상에 이은 세포자멸 또는 카스파제 9는 몇몇 항원에 대한 허용성을 유도한다. 허용성의 유도는 자가면역 질병, 예를 들어 비 제한적으로 당뇨병, 류마티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증의 억제 또는 예방에 중요하다. 세포, 예를 들어 비 제한적으로 β 췌장 세포, 결장직장 및 신경 세포에서 rdsRN에 의한 카스파제 9 또는 다른 세포자멸 매개된 허용성 유도 단백질의 생 산은 제한된 세포자멸을 유도할 것이며 이는 상기 세포에서 자가면역성의 항원 표적에 대한 허용성을 유도하여 자가면역 질병 증상을 치료 또는 예방할 것이다. 자가면역 반응에 관련된 특이 항원의 동정은 상기 항원 및 카스파제 9 또는 세포자멸 매개된 허용성을 유도할 수 있는 다른 분자의 엔도솜 이탈 rBCG의 생산을 통해 상기 자가면역 표적 항원에 대한 허용성을 유도할 것이다. 상기와 같은 rBCG는 상기 자가면역 질병을 치료하고/하거나 예방할 것이다.

실시예 7에 대한 참고문헌

실시예 8. 엔도솜을 이탈할 수 있는 rBCG 균주에서 백신 항원의 과 발현

TB 항원을 rBCG 균주 AFV102로 과 발현하기 위해서, Rv3804(또한 Ag85A로서 공지됨), Rv1886(또한 Ag85B로서 공지됨) 및 Rv0288(또한 TB10.4로서 공지됨)을 암 호화하는 서열에 작용적으로 결합된 Rv3031 프로모터를 암호화하는 서열을 pAF100의 PacI 부위에 삽입하였다. 생성된 플라스미드, pAF105(도 12)를 제한 엔도뉴클레아제 NdeI로 후속 절단하여 이 콜라이 복제단위 및 가나마이신-내성 유전자를 제거하고, T4 리가제를 사용한 연결에 의해 다시 원형화하였다. 상기 DNA(1 내지 2 ㎍)를 일렉트로포레이션에 의해 rBCG 균주 AFV102 내로 도입하였다. 상기 세균을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지(Middlebook 7H10)를 함유하는 8.75 ㎝ 플레이트에서 배양하였다. 항원 발현 플라스미드를 함유하는 콜로니를 검출하기 위한 PCR에 의한 예비선별에 이어서, 선택된 rBCG 콜로니(모두 PfA-양성이고 TB 항원 발현 카세트를 함유한다)를 AFV112로 표시하고 37 ℃에서 교반된 액체 배지(Middlebook 7H9)에 500 ㎖로 확장시킨다. 일단 배양물이 말기 대수기에 도달하면, 글리세롤을 상기 500 ㎖ 배양물에 10%(v/v)의 최종 농도로 가하고 프리마스터 종자를 5 ㎖ 분액으로 -80 ℃에서 보관한다.

BCG 및 rBCG 배양물의 정제를, 인산염 완충 염수(PBS)로 연속 희석된(예를 들어 순수-10^-8에서 10 배 단계) BCG 배양물의 100 ㎕ 분액을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지, 예를 들어 미들브룩 7H10 상에 균일하게 확산시켜 평가한다. 플라스미드 DNA의 PCR 및 제한 엔도뉴클레아제 분석을 사용하여 목적하는 유전자형이 각각의 rBCG 단리물 중에 존재하는 지를 확인한다. 또한, PCR-생성된 DNA 단편을 자동화된 다이데옥시뉴클레오타이드 서열화 기법에 의해 서열화하여 완전한 길이의 유전자의 존재를 확인한다.

TB 항원 발현 플라스미드를 함유하는 AFV102 및 AFV112에 의한 PfoA의 분비를 평가하기 위해서, 상기 두 균주를 모두 상술한 바와 같이 중간 대수기로 증식시킨다. 상기 배양물의 배양 상등액을 수거하고 앞서 개시한 바와 같이(Hess et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95:5299-304; 1998), 0.2 ㎜ 멤브레인 필터를 통해 여과한다. 이어서 상기 배양 여액 단백질을 상술한 바와 같이 용혈 활성에 대해 평가한다. 결과는 AFV102 및 AFV112가 유사한 수준의 용혈 활성을 나타내고 AFV112가 ΔureC::ΩpfoA 대립유전자를 유지하며 작용성 PfoA 단백질을 발현함을 보인다.

최종적으로, TB 항원의 발현을 10 내지 15% SDS-PAGE 젤상에서 분리된 배양 상등액에서 평가한다. 결과는 Rv3804c 및 Rv1886의 증가된 발현을 보인다. Rv0288은 상기 배양 상등액에서 과발현되는 것으로 예상되지 않으므로, 상기 10 kDa 단백질의 과발현(Rv3804c 및 Rv1886으로서 동일한 mRNA 상에서 발현된다)은 Rv3804c 및 Rv1886이 과발현된다는 관찰에 의해 추론된다.

전체적으로, 본 실시예는 PfoA를 발현하고 TB 항원을 과 발현하는 rBCG 균주를 생성시킬 수 있음을 입증한다. 상기와 같은 균주는 2 세대 TB 백신으로서 작용할 잠재력을 갖는다.

본 발명을 그의 특정한 실시태양을 참고로 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 다양한 변화 및 변경이 상기의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 상기 중에서 수행될 수 있음은 자명할 것이다.

<110> Aeras Global TB Vaccine Foundation <120> Recombinant BCG Strains with Enhanced Ability to Escape the Endosome <130> 08560014ta <150> US 60/631,973 <151> 2004-12-01 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 1 atgataagat ttaagaaaac aaaattaata gcaagtattg caatggcttt atgtctgttt 60 tctcaaccag taatcagttt ctcaaaggat ataacagata aaaatcaaag tattgattct 120 ggaatatcaa gcttaagtta caatagaaat gaagttttag ctagtaatgg agataaaatt 180 gaaagttttg ttccaaagga aggtaaaaag actggtaata aatttatagt tgtagaacgt 240 caaaaaagat cccttacaac atcaccagta gatatatcaa taattgattc tgtaaatgac 300 cgtacatatc caggagcatt acaacttgca gataaagcct ttgtggaaaa tagacctaca 360 atcttaatgg taaaaagaaa gcctattaac attaatatag atttaccagg attaaagggt 420 gaaaatagta taaaggttga tgatccaacc tatggaaaag tttctggagc aattgatgag 480 ttagtgtcta agtggaatga aaagtattca tctacacata ctttaccagc aagaactcaa 540 tattcagaat ctatggttta tagtaaatca caaatatcaa gtgcccttaa tgttaatgct 600 aaagtccttg aaaactcact tggagtagac tttaatgcag tagcaaacaa tgagaaaaaa 660 gttatgattt tagcatataa acaaatattc tatacagtaa gtgcagactt acctaagaat 720 ccatcagatc tttttgatga cagtgttaca tttaatgatt taaaacaaaa gggagtaagt 780 aatgaagcac ctccacttat ggtttcaaat gtagcttatg gaagaactat atatgttaag 840 ttagaaacta cttctagtag taaagatgta caagctgctt tcaaagctct tataaagaac 900 actgatataa aaaatagtca acaatataaa gatatttatg aaaatagttc cttcacagca 960 gtagttttag gaggagatgc acaagaacat aacaaagttg taactaagga ctttgatgaa 1020 ataagaaaag taattaaaga caatgcaact tttagtacaa aaaacccagc atatccaata 1080 tcttatacta gtgttttctt aaaagataac tcagttgctg ctgttcacaa taaaacagat 1140 tatatagaaa caacttctac agagtattct aagggaaaaa taaacttaga tcatagtgga 1200 gcctatgttg cacagtttga agtagcatgg gatgaagttt catatgacaa agaaggaaat 1260 gaagttttaa ctcataaaac atgggatgga aattatcaag ataaaacagc tcactattca 1320 acagtaatac ctcttgaagc caatgcaaga aatataagaa taaaggcaag agagtgtaca 1380 ggtcttgctt gggaatggtg gagagatgtt ataagtgaat atgatgttcc attaacaaat 1440 aatataaatg tttcaatatg gggaactact ttataccctg gatctagtat tacttacaat 1500 taa 1503 <210> 2 <211> 500 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 2 Met Ile Arg Phe Lys Lys Thr Lys Leu Ile Ala Ser Ile Ala Met Ala 1 5 10 15 Leu Cys Leu Phe Ser Gln Pro Val Ile Ser Phe Ser Lys Asp Ile Thr 20 25 30 Asp Lys Asn Gln Ser Ile Asp Ser Gly Ile Ser Ser Leu Ser Tyr Asn 35 40 45 Arg Asn Glu Val Leu Ala Ser Asn Gly Asp Lys Ile Glu Ser Phe Val 50 55 60 Pro Lys Glu Gly Lys Lys Thr Gly Asn Lys Phe Ile Val Val Glu Arg 65 70 75 80 Gln Lys Arg Ser Leu Thr Thr Ser Pro Val Asp Ile Ser Ile Ile Asp 85 90 95 Ser Val Asn Asp Arg Thr Tyr Pro Gly Ala Leu Gln Leu Ala Asp Lys 100 105 110 Ala Phe Val Glu Asn Arg Pro Thr Ile Leu Met Val Lys Arg Lys Pro 115 120 125 Ile Asn Ile Asn Ile Asp Leu Pro Gly Leu Lys Gly Glu Asn Ser Ile 130 135 140 Lys Val Asp Asp Pro Thr Tyr Gly Lys Val Ser Gly Ala Ile Asp Glu 145 150 155 160 Leu Val Ser Lys Trp Asn Glu Lys Tyr Ser Ser Thr His Thr Leu Pro 165 170 175 Ala Arg Thr Gln Tyr Ser Glu Ser Met Val Tyr Ser Lys Ser Gln Ile 180 185 190 Ser Ser Ala Leu Asn Val Asn Ala Lys Val Leu Glu Asn Ser Leu Gly 195 200 205 Val Asp Phe Asn Ala Val Ala Asn Asn Glu Lys Lys Val Met Ile Leu 210 215 220 Ala Tyr Lys Gln Ile Phe Tyr Thr Val Ser Ala Asp Leu Pro Lys Asn 225 230 235 240 Pro Ser Asp Leu Phe Asp Asp Ser Val Thr Phe Asn Asp Leu Lys Gln 245 250 255 Lys Gly Val Ser Asn Glu Ala Pro Pro Leu Met Val Ser Asn Val Ala 260 265 270 Tyr Gly Arg Thr Ile Tyr Val Lys Leu Glu Thr Thr Ser Ser Ser Lys 275 280 285 Asp Val Gln Ala Ala Phe Lys Ala Leu Ile Lys Asn Thr Asp Ile Lys 290 295 300 Asn Ser Gln Gln Tyr Lys Asp Ile Tyr Glu Asn Ser Ser Phe Thr Ala 305 310 315 320 Val Val Leu Gly Gly Asp Ala Gln Glu His Asn Lys Val Val Thr Lys 325 330 335 Asp Phe Asp Glu Ile Arg Lys Val Ile Lys Asp Asn Ala Thr Phe Ser 340 345 350 Thr Lys Asn Pro Ala Tyr Pro Ile Ser Tyr Thr Ser Val Phe Leu Lys 355 360 365 Asp Asn Ser Val Ala Ala Val His Asn Lys Thr Asp Tyr Ile Glu Thr 370 375 380 Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Lys Gly Lys Ile Asn Leu Asp His Ser Gly 385 390 395 400 Ala Tyr Val Ala Gln Phe Glu Val Ala Trp Asp Glu Val Ser Tyr Asp 405 410 415 Lys Glu Gly Asn Glu Val Leu Thr His Lys Thr Trp Asp Gly Asn Tyr 420 425 430 Gln Asp Lys Thr Ala His Tyr Ser Thr Val Ile Pro Leu Glu Ala Asn 435 440 445 Ala Arg Asn Ile Arg Ile Lys Ala Arg Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp 450 455 460 Glu Trp Trp Arg Asp Val Ile Ser Glu Tyr Asp Val Pro Leu Thr Asn 465 470 475 480 Asn Ile Asn Val Ser Ile Trp Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Gly Ser Ser 485 490 495 Ile Thr Tyr Asn 500 <210> 3 <211> 1419 <212> DNA <213> Clostridium perfringens <400> 3 aaggatatca ccgacaagaa ccagagcatc gatagcggca tctccagcct gtcgtacaac 60 cgcaacgaag tgctagcctc gaacggcgac aagatcgaaa gcttcgttcc gaaggagggt 120 aagaagacgg gtaataagtt catcgtcgta gaacgtcaga agcgatcctt gaccacgtcg 180 ccagtcgata tcagcatcat tgattcggtg aacgaccgga cctatccggg cgcactgcaa 240 cttgccgaca aagcctttgt ggaaaaccgc ccgaccatcc taatggtgaa gcgcaagccg 300 atcaacatta acatcgacct gccgcagctg aagggtgaga actcgatcaa ggtggacgac 360 ccgacctatg gcaaggtgtc cggcgcgatc gacgagctgg tgtcgaagtg gaacgagaag 420 tattcatcca cccatactct cccagcgcgg acccagtatt cagagagcat ggtctactcg 480 aagtcccaga tatcaagtgc cctgaatgtg aatgctaagg tcctggaaaa ctcgctgggc 540 gtggacttta acgcagtagc gaacaacgag aagaaggtga tgattttggc ctacaaacaa 600 atcttctata cggtgtcggc ggacctgccc aagaacccca gcgacctgtt cgacgactcg 660 gttacgttca acgacctcaa gcagaagggg gtgagcaatg aggcgcctcc gctgatggtc 720 tcgaacgtgg cctacggacg gacgatctac gtcaagttag aaaccacctc ttcctcgaag 780 gacgtccagg ccgccttcaa agccctgatc aagaacaccg acatcaagaa ctcccagcag 840 tacaaggaca tttacgagaa ttcgtccttc accgcggtcg tcttgggcgg cgatgcgcag 900 gaacacaaca aagtggtcac caaggacttc gatgagatac ggaaagtcat taaggacaac 960 gcgactttct ccacaaaaaa cccggcatac ccgatcagct ataccagtgt gttcctcaag 1020 gacaacagcg tcgccgctgt tcacaacaag accgactaca tcgagacgac ctcgaccgag 1080 tacagcaagg ggaaaatcaa cctggatcac tcgggcgcct acgttgccca gttcgaggtg 1140 gcctgggacg aagtcagcta tgacaaggag ggcaatgaag tgctcacgca caaaacgtgg 1200 gacgggaact accaagataa gacagcccac tactcaaccg tgatccccct cgaggccaac 1260 gcgaggaaca tccgcatcaa ggcgcgggag tgcacgggtc ttgcgtggga gtggtggcgc 1320 gacgtcatct cggagtacga cgtgccgttg accaacaaca tcaatgtgag catctgggga 1380 accaccctgt accccgggtc gtcgatcacc tacaactga 1419 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic forward oligonucleotide primer <400> 4 acggctaccg tctggacat 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic reverse oligonucleotide primer <400> 5 cgatggcttc ttcgatgc 18

Claims (38)

1. 6 내지 8의 pH에서 활성인 발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성(endosomalytic) 단백질을 포함하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
2. 제 1 항에 있어서,

   발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 또는 그의 작용성 변체인 마이코박테리움.
3. 제 1 항에 있어서,

   발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질의 아미노산 서열을 서열식별번호: 2로 나타내는 마이코박테리움.
4. 제 1 항에 있어서,

   발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 또는 그의 돌연변이체에 특이적인 유전자 서열에 의해 암호화되는 마이코박테리움.
5. 제 4 항에 있어서,

   유전자 서열이 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 마이코박테리움.
6. 제 1 항에 있어서,

   세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자를 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
7. 제 6 항에 있어서,

   세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자가 카스파제 8, 사망 수용체-5, Fas 및 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 마이코박테리움.
8. 제 1 항에 있어서,

   관심 유전자를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
9. 제 1 항에 있어서,

   세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자; 및

   관심 유전자

   를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
10. 마이코박테리움에 의해 감염된 세포의 엔도솜 중에 존재하는 pH에서 발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질을 포함하도록 유전자 가공된 상기 마 이코박테리움.
11. 제 10 항에 있어서,

    발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 또는 그의 작용성 변체인 마이코박테리움.
12. 제 10 항에 있어서,

    발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질의 아미노산 서열을 서열식별번호: 2로 나타내는 마이코박테리움.
13. 제 10 항에 있어서,

    발현가능하고 분비성인 작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 또는 그의 돌연변이체에 특이적인 유전자 서열에 의해 암호화되는 마이코박테리움.
14. 제 13 항에 있어서,

    유전자 서열이 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 3으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 마이코박테리움.
15. 제 10 항에 있어서,

    BCG인 마이코박테리움.
16. 제 10 항에 있어서,

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자를 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
17. 제 16 항에 있어서,

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자가 카스파제 8, 사망 수용체-5, Fas 및 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 마이코박테리움.
18. 제 10 항에 있어서,

    관심 유전자를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
19. 제 10 항에 있어서,

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자; 및

    관심 유전자

    를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 마이코박테리움.
20. 마이코박테리움이 엔도솜으로부터 이탈될 수 있게 하는 방법으로,

    상기 마이코박테리움을 작용성 엔도솜분해성 단백질을 함유하고, 발현하고 분비하도록 유전자 가공하는 단계를 포함하는 방법.
21. 제 20 항에 있어서,

    작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 O 또는 그의 돌연변이체인 방법.
22. 제 21 항에 있어서,

    작용성 엔도솜분해성 단백질이 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 돌연변이 퍼프링고리신 O인 방법.
23. 제 20 항에 있어서,

    마이코박테리움이 감독된 마이코박테리움인 방법.
24. 제 23 항에 있어서,

    감독된 마이코박테리움이 BCG인 방법.
25. 제 20 항에 있어서,

    마이코박테리움을, 세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자를 발현하도록 유전자 가공하는 방법.
26. 제 25 항에 있어서,

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자를 카스파제 8, 사망 수용체-5, Fas 및 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택하는 방법.
27. 제 20 항에 있어서,

    마이코박테리움을, 관심 유전자를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공하는 방법.
28. 제 20 항에 있어서,

    마이코박테리움을

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자; 및

    관심 유전자

    를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공하는 방법.
29. 작용성 엔도솜분해성 단백질을 발현하고 분비하도록 유전자 가공된 마이코박테리움을 포함하고, 이때 상기 작용성 엔도솜분해성 단백질이 중성 pH에서 활성인 백신 제제.
30. 제 29 항에 있어서,

    작용성 엔도솜분해성 단백질이 퍼프링고리신 O인 백신 제제.
31. 제 30 항에 있어서,

    작용성 엔도솜분해성 단백질이 서열식별번호: 3에 의해 암호화된 돌연변이 퍼프링고리신 O인 백신 제제.
32. 제 29 항에 있어서,

    마이코박테리움에 의해 발현된 작용성 엔도솜분해성 단백질의 발현이 재조합 마이코박테리움의 엔도솜으로부터의 이탈을 허용하는 백신 제제.
33. 제 29 항에 있어서,

    마이코박테리움이 감독된 마이코박테리움인 백신 제제.
34. 제 33 항에 있어서,

    감독된 마이코박테리움이 BCG인 백신 제제.
35. 제 29 항에 있어서,

    마이코박테리움이 세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자를 발현하도록 유전자 가공된 백신 제제.
36. 제 35 항에 있어서,

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자가 카스파제 8, 사망 수용체-5, Fas 및 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신 제제.
37. 제 29 항에 있어서,

    마이코박테리움이 관심 유전자를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 백신 제제.
38. 제 29 항에 있어서,

    마이코박테리움이

    세포자멸 단백질 또는 작용성 세포자멸 증강인자; 및

    관심 유전자

    를 작용적으로 발현하도록 유전자 가공된 백신 제제.

Images