CN114272364A

CN114272364A - 一种结核分枝杆菌串联dna疫苗w541及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN114272364A
Application number: CN202111580812.4A
Authority: CN
Inventors: 吴雪琼; 梁艳; 阳幼荣; 赵卫国; 李鹏川; 贾再兴; 薛勇; 王小鸥; 龚文平; 王兰; 王杰; 张俊仙; 刘银萍
Original assignee: 8th Medical Center of PLA General Hospital
Current assignee: 8th Medical Center of PLA General Hospital
Priority date: 2021-12-22
Filing date: 2021-12-22
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用。本发明通过基因工程将Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位，Rv3407和Rv1733c的表位基因融合在一起，并连接到真核表达载体pVAX1上，构建得到的多抗原免疫优势表位的新型结核分枝杆菌DNA疫苗。本发明所制备的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541，可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，治疗小鼠结核潜伏感染模型可使其肺、肝脏组织细菌数减少，肺组织病变范围显著减少，病变减轻。本发明制备的疫苗在结核潜伏感染者的预防性治疗方面将具有广阔的应用前景。

Description

一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用，具体涉及一种应用基因工程技术制备的新型结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W541及其应用，属于结核病医学免疫学预防和治疗技术领域。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)一直是人们关注的一个全球性健康问题。世界卫生组织(WHO)2020年全球结核病报告指出，在2019年，全球有1000万结核病新发病例，120万死亡病例。全世界大概有1/3的人存在结核分枝杆菌(M.tb)潜伏感染，其中5％～10％的感染者最终会发展为TB患者。我国的结核病人数位居世界第三。我国约有三分之一人口感染了结核菌，其中5％可能早期发病，5％在其一生中的任何时候可能发病，而且耐药结核病人多。因此，结核感染人群的预防治疗可有效减少肺结核的发病率，结核病患者的早期诊断、有效化疗将控制结核病及结核菌的传播。对处于不同阶段的M.tb感染进行有效防治至关重要。

结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性呼吸道传染病，合理、规律的化疗一般在1～2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗3～4个月，甚至更长时间。由于耐药菌株的传播，耐药结核病(尤其是耐多药结核病和广泛耐药结核病)的治疗是我国未来结核病控制重点关注的问题。目前在临床使用的十几种抗结核药物已数十年，初治结核病化疗方案通常需3-4个药物治疗6个月以上，而复治或耐药结核病通常需5-6种药物治疗1年以上，再加上药物的毒副作用，二线药物价格昂贵，部分病人难以坚持。由于研制新的抗结核药物，不仅投入大，周期长，比新的治疗性疫苗的研制更困难，而且新药也可能很快产生耐药性。而疫苗治疗在几个月中只注射几针，远比每天服药方便，且副作用较少，费用低。抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，疫苗治疗可以通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的潜力，来达到治疗疾病的目的。因此，近年来通过免疫调节治疗结核病成为研究的热点之一，治疗性疫苗的研究与开发成为一个十分重要的研究方向。

疫苗接种是预防结核病最有效的途径。目前国内外结核病疫苗研究的种类主要有下列三种：活疫苗、亚单位疫苗和灭活疫苗。亚单位疫苗只用结核分枝杆菌的一部分成份引起机体产生免疫保护反应，主要包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗或多肽疫苗(加佐剂)、多肽以外的其它纯化的主要成份(如枝菌酸、糖脂等)，它可作为卡介苗的加强疫苗，也可作为治疗性疫苗。与其它类型的疫苗相比，核酸疫苗具有以下优点：DNA疫苗可诱导全面的免疫应答：既可激活体液免疫，也可诱发细胞免疫，尤其是可诱导产生CTL应答，其能够识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体，这对于杀死寄生于巨噬细胞内的结核分枝杆菌是有效清除途径，这可弥补卡介苗诱导CTL应答弱的不足，是结核重组蛋白亚单位疫苗和灭活疫苗所不能比拟的；(2)可克服蛋白亚单位疫苗易发生错误折叠和糖基化不完全的问题；(3)通过表达多种抗原的质粒混合或构建能同时表达多种抗原的复杂的质粒制备多价疫苗，这符合WHO儿童疫苗计划长远目标(用一种疫苗预防多种疾病)的要求；(4)产生持久免疫应答，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫；(5)接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力反祖或残留毒力病毒颗粒而引发疾病的危险，应用较安全；(6)制备简便，生产成本较低；(7)核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，易于贮存和运输。此外，DNA疫苗制备及应用较简单，不需要任何化学载体，对于免疫低下者比BCG更安全。该疫苗研制的关键在于保护性抗原的选择、剂量的确定，抗结核免疫主要是细胞介导的免疫反应，选择抗原作为DNA疫苗的主要标准是它们能否诱导保护性T细胞反应，保护人群抗结核，抗原的筛选和构建至关重要。目前的研究证明结核分枝杆菌多种保护性抗原混合、融合或嵌合的疫苗刺激的CD4⁺和CD8⁺T细胞反应及获得的保护效力、治疗效果和长期存活能力均比单一疫苗成分强。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对不同时期的结核分枝杆菌(M.tb)感染做出快速有效的细胞免疫应答、抑制体内结核分枝杆菌的生长、抑制M.tb的内源性复燃，并且用于结核潜伏感染的预防性治疗的结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种结核分枝杆菌DNA疫苗，并将其命名为W541。

本发明提供的结核分枝杆菌DNA疫苗的活性成分是表达融合蛋白的重组真核细胞表达载体；所述融合蛋白包括抗原表位甲、抗原表位乙、抗原表位丙、抗原表位丁和抗原表位戊；

所述抗原表位甲的氨基酸序列如序列表中序列1第3-296位所示；

所述抗原表位乙的氨基酸序列如序列表中序列1第304-611位所示；

所述抗原表位丙的氨基酸序列如序列表中序列1第617-631位所示；

所述抗原表位丁的氨基酸序列如序列表中序列1第637-672位所示；

所述抗原表位戊的氨基酸序列如序列表中序列1第678-705位所示。

上述DNA疫苗中，抗原表位甲为Ag85A蛋白抗原表位。Ag85A蛋白不仅可以刺激机体产生体液免疫，尚可激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8⁺T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升。

抗原表位乙为Ag85B蛋白抗原表位。Ag85B蛋白可诱导实验动物产生Th1型细胞免疫应答，产生高浓度IFN-γ和TNF-α，其抵抗结核分枝杆菌再感染的能力优于BCG。Ag85A与Ag85B同属Ag85复合物，是培养滤液蛋白中的主要构成。该复合物的成员参与M.tb致病过程中的细胞活动，抑制吞噬体成熟。研究表明，Ag85复合物具有很强的免疫原性，可通过诱导较强的T细胞免疫应答来对抗M.tb感染。

抗原表位丙和抗原表位丁均为Rv3407蛋白抗原表位。Rv3407蛋白是一种休眠相关(DosR)抗原，是M.tb从潜伏状态再活化时产生的特异性蛋白。研究表明，其可以增强巨噬细胞对M.tb的杀伤能力，可在Rv3407 DNA疫苗接种的小鼠中诱导Th1型免疫反应，降低肺细菌负荷。

抗原表位戊为Rv1733c蛋白抗原表位。Rv1733c蛋白是M.tb在休眠期表达量比较高的一种保守的跨膜蛋白，它诱导结核感染人群产生的IFN-γ水平较高，被识别的频率最高，而且可诱导强烈的体液和/或细胞Th1型(IL-2和IFN-γ)免疫反应。研究发现，在感染了M.tb的动物模型中，pVAX1-Rv1733c DNA对小鼠结核模型均有一定的治疗作用。

上述DNA疫苗中，编码所述抗原表位甲的核酸分子如序列表中序列2第7-888位所示；

编码所述抗原表位乙的核酸分子如序列表中序列2第910-1833位所示；

编码所述抗原表位丙的核酸分子如序列表中序列2第1849-1893位所示；

编码所述抗原表位丁的核酸分子如序列表中序列2第1909-2016位所示；

编码所述抗原表位戊的核酸分子如序列表中序列2第2032-2115位所示。

上述DNA疫苗中，所述融合蛋白具体为如下R1)-R4)所示的蛋白质：

R1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

R2)在R1)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合标签蛋白得到的具有相同功能的融合蛋白；

R3)将R1)或R2)所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

R4)与R1)或R2)所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述R2)所述的蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

上述R3)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述R4)所述的蛋白质中，“同一性”包括与本发明的序列1所示的氨基酸序列具有90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同源性的氨基酸序列。

上述R1)或R2)或R3)或R4)所述的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述DNA疫苗中，所述重组真核细胞表达载体为将编码所述融合蛋白的核酸分子插入真核表达载体的酶切位点后得到的载体。

进一步的，编码所述融合蛋白的核酸分子为序列表中序列2第1-2115位所示的DNA分子。

更进一步的，所述真核表达载体包括可在真核细胞中表达目的蛋白的所有载体，如逆转录病毒载体、腺病毒载体、质粒载体等。所述质粒载体具体为pVAX1。

在本发明的一个具体实施例中，所述重组真核细胞表达载体为pVAX1-W541，其为将质粒载体pVAX1中NheI和EcoRI酶切位点间的DNA分子替换为序列表中序列2第1-2115位所示的DNA分子后得到的载体。

上述重组真核细胞表达载体、融合蛋白、以及编码上述融合蛋白的核酸分子均属于本发明的保护范围。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述DNA疫苗或重组真核细胞表达载体或融合蛋白或核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体的新用途。

本发明提供了上述DNA疫苗或重组真核细胞表达载体或融合蛋白或核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体在如下S1)-S7)任一种中的应用：

S1)制备用于预防和/或治疗结核潜伏感染的产品；

S2)预防和/或治疗结核潜伏感染；

S3)制备抑制结核分枝杆菌生长和/或增殖和/或内源性复燃的产品；

S4)抑制结核分枝杆菌生长和/或增殖和/或内源性复燃；

S5)制备提高或增强细胞免疫功能或细胞免疫应答水平的产品；

S6)提高或增强细胞免疫功能或细胞免疫应答水平；

S7)作为结核潜伏感染预防治疗制剂。

上述任一所述应用中，所述提高或增强细胞免疫功能或细胞免疫应答水平为提高或增强Th1型免疫反应。

上述任一所述应用中，所述产品可为药物或疫苗。

为了实现上述目的，本发明最后还提供了一种结核潜伏感染预防治疗制剂。

本发明提供的结核潜伏感染预防治疗制剂含有上述DNA疫苗或重组真核细胞表达载体或融合蛋白或核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒或重组载体。

本发明的有益效果如下：本发明通过基因工程技术克隆、表达、纯化新型结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541，可刺激机体的体液免疫和细胞免疫应答，抑制体内结核分枝杆菌的生长，抑制M.tb的内源性复燃，能用于结核潜伏感染者的预防性治疗。

本发明提供了一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541，该疫苗是通过基因工程将Ag85A蛋白和Ag85B蛋白抗原表位，Rv3407和Rv1733c的表位基因融合在一起，并连接到真核表达载体pVAX1上，构建得到的多抗原免疫优势表位的新型结核分枝杆菌DNA疫苗，是一种新型的针对不同结核分枝杆菌感染阶段的候选疫苗。本发明的结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W541作为免疫调节制剂用于免疫小鼠，可使其分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数显著增高，血浆中的抗W541蛋白抗体及亚型水平略有增高，呈现Th1型的免疫应答(主要刺激Th1型的免疫反应)，获得较好的免疫调节作用，显著增强小鼠特异的细胞免疫功能；作为预防性治疗制剂用于预防性治疗小鼠结核潜伏感染模型可使其肺、肝脏组织细菌数减少，肺组织病变范围显著减少，病变减轻，其治疗效果与现有商品化的结核潜伏感染预防治疗制剂微卡菌苗的治疗效果相当。因此，本发明制备的疫苗在结核潜伏感染者的预防性治疗方面将具有广阔的应用前景。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。

附图说明

图1为应用限制性内切酶NheI和EcoRI对重组质粒pVAX1-W541进行消化。M：DM10000 DNA分子量标准；W541：应用限制性内切酶NheI和EcoRI消化重组质粒pVAX1-W541。

图2为本发明实施例2中各组小鼠第3次免疫后脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数。

图3为本发明实施例2中各组小鼠免疫前后血浆中抗W541IgG抗体水平。

图4为本发明实施例2中各组小鼠第3次免疫后血浆中抗W541 IgG1抗体水平。

图5为本发明实施例2中各组小鼠第3次免疫后血浆中抗W541 IgG2a抗体水平。

图6为本发明实施例2中各组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ表达水平。

图7为本发明实施例2中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-2表达水平。

图8为本发明实施例2中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-4表达水平。

图9为本发明实施例2中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-6表达水平。

图10为本发明实施例3中不同阶段小鼠肺脏重量指数。

图11为本发明实施例3中不同阶段小鼠肝脏重量指数。

图12为本发明实施例3中不同阶段小鼠脾脏重量指数。

图13为本发明实施例3中各组小鼠肺脏重量指数。

图14为本发明实施例3中各组小鼠肝脏重量指数。

图15为本发明实施例3中各组小鼠脾脏重量指数。

图16为本发明实施例3中各组小鼠分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数。

图17为本发明实施例3中各组小鼠脾淋巴细胞CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺细胞百分比。

图18为本发明实施例3中各组小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ表达水平。

图19为本发明实施例3中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-2表达水平。

图20为本发明实施例3中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-4表达水平。

图21为本发明实施例3中各组小鼠脾细胞培养上清中IL-6表达水平。

图22为本发明实施例3中不同阶段小鼠肺脏菌落计数结果。

图23为本发明实施例3中不同阶段小鼠肝脏菌落计数结果。

图24为本发明实施例3中各组小鼠肺组织病理。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的ag85ab质粒DNA及构建方法记载于发明名称为结核杆菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用，专利号为ZL201010191243.X的发明专利中，公众可从中国人民解放军总医院第八医学中心获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、一种结核分枝杆菌特异性串联DNA疫苗W541的制备方法

本发明设计的结核分枝杆菌串联DNA疫苗是通过基因工程将结核分枝杆菌增殖期抗原Ag85A、Ag85B、及激活相关抗原Rv3407和潜伏相关抗原Rv1733c的免疫优势表位基因串联融合在一起，并连接到真核表达载体pVAX1上，构建得到的多抗原免疫优势表位的新型结核分枝杆菌DNA疫苗。具体构建方法如下：

一、重组质粒pVAX1-W541的构建

1、基因设计及合成

本发明设计并优化后的适于真核表达DNA疫苗W541的DNA序列如序列表中序列2第1-2115所示，并将其记作W541基因。其中序列2第7-888位为Ag85A抗原表位的编码基因、序列2第910-1833位为Ag85B抗原表位的编码基因、序列2第1849-1893及1909-2016位均为Rv3407抗原表位的编码基因、序列2第2032-2115位为Rv1733c抗原表位的编码基因。人工并合成W541基因序列。

2、PCR扩增W541基因

以步骤1中的W541基因序列为模板，采用W541-F和W541-R引物进行PCR扩增，引物序列如下：

W541-F：5'-CTAGCTAGCGCCGCCACCATGGTCAGC-3'(下划线所示序列为Nhe I酶切位点)；

W541-R：5'-CGGAATTCTCAGGGGTGTCTTGTCTG-3'(下划线所示序列为EcoR I酶切位点)。

PCR程序如下：于98℃变性2min；然后于98℃变性10s，于60℃退火20s，于72℃延伸45s，共进行37个循环；最后于72℃延伸5min；置4℃5min。

参考Omega胶回收试剂盒说明书，回收W541的PCR扩增产物。

3、双酶切载体质粒pVAX1和W541基因

用NEB的限制性内切酶NheI和EcoRI对载体质粒pVAX1(Thermo旗下invitrogen产品，Lot：1724963，购自北京永泽浩嘉生物技术发展中心)和步骤2获得的W541的PCR扩增产物进行双酶切，酶切体系如下：10xCutSmart 5μl，NheI 2μl，EcoRI 2μl，pVAX1(4μg)或W541产物(20μl)，加水补齐到50μl，37℃酶切过夜，65℃终止反应。参考Omega胶回收试剂盒说明书，回收酶切产物。

4、连接反应

用NEB的T4 DNA Ligase进行连接，得到连接产物。

连接反应体系如下：10xT4 Ligase buffer 2μl，T4 Ligase 1μl，pVAX1双酶切产物1μl；W541基因双酶切产物3μl，加水补齐至20μl，16℃连接过夜。

5、连接产物转化大肠杆菌DH5a

将1μl连接产物加入到大肠杆菌DH5a感受态细胞中冰浴30min，42℃热激90s，迅速置冰中5min；加入500μL无抗生素LB培养液，于37℃、180rpm振摇1h，离心后全部涂布于含卡那霉素的LB平板上，于37℃倒置培养过夜。

二、重组质粒pVAX1-W541的酶切鉴定

挑取平板上的单克隆接种于2mL含Kan+的LB培养液的试管中，37℃、220rpm振摇培养过夜；次日将过夜菌进行质粒提取，采用omega无内毒素质粒中提试剂盒进行提取。然后用NEB的限制性内切酶NheI和EcoRI对重组质粒pVAX1-W541进行双酶切，酶切体系如下：10xCutSmart 5μl，NheI 2μl，EcoRI 2μl，重组质粒pVAX1-W541(4μg)或pVAX1(4μg)，加水补齐到50μl，37℃酶切过夜，65℃终止反应。将酶切产物在1％琼脂糖凝胶中电泳，结果见图1。从图1可以看出，酶切出的各个片段大小与理论长度基本吻合，酶切鉴定结果是正确的。

三、重组质粒pVAX1-W541基因测序鉴定

将纯化的重组质粒pVAX1-W541送公司进行基因测序，测序结果与设计的原始序列经对比分析显示两个序列完全一致。该测序结果正确的重组质粒pVAX1-W541即为本发明的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541。该质粒表达的W541蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其中序列1第3-296位为Ag85A抗原表位氨基酸序列、序列1第304-611位为Ag85B抗原表位氨基酸序列、序列1第617-631位和637-672位均为Rv3407抗原表位氨基酸序列、序列1第678-705位为Rv1733c抗原表位氨基酸序列。

实施例2、结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541作为免疫调节制剂的免疫保护效果评价

将本发明实施例1所构建、纯化的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541用于免疫小鼠，以其作为免疫调节制剂，获得了较好的免疫调节作用。小鼠免疫免疫调节过程如下所示：

一、实验方法和材料

1、动物选择

从北京维通利华实验动物技术有限公司院购进有合格证的体重为18-20g的56-62日龄雌性BALB/c小鼠40只，同批试验体重差异不超过2g。

2、结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541的免疫原性

(1)动物免疫

将小鼠分为5组，每组8只，处理方法分别如下：

①生理盐水组：每只小鼠肌肉注射100μl生理盐水；

②pVAX1载体组(pVAX-1载体组)：每只小鼠肌肉注射100μg/100μl pVAX1溶液(pVAX1载体溶于生理盐水中，配制成100μg/100μl pVAX1溶液)；

③微卡菌苗组：每只小鼠肌肉注射22.5μg/100μl微卡菌苗(安徽龙科马生物制药有限责任公司，批号：20191001)；

④ag85ab质粒DNA组：每只小鼠肌肉注射100μg/100μl ag85ab质粒DNA；

⑤W541质粒DNA组：每只小鼠肌肉注射100μg/100μl W541质粒DNA。

各组小鼠每2周肌肉注射1次，共注射3次。

(2)通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测小鼠分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数

采用Mouse IFN-γELISPOT PLUS试剂盒(购自Mabtech科技有限公司)进行酶联免疫斑点试验(ELISPOT)，按试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：小鼠第3次免疫后5周杀鼠取脾脏，分离脾细胞，调节脾淋巴细胞浓度为3×10⁶/ml。在测试板中，分别加入1640完全细胞培养液、W541蛋白(终浓度为30μg/ml)、植物血凝素(PHA)(终浓度为30μg/ml)，脾淋巴细胞为3×10⁵/孔，置CO₂温箱中于37℃温育20h，用ELISPOT方法检测各组分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数。

(3)通过ELISA检测小鼠血浆中抗体水平

小鼠第3次免疫后5周杀鼠时取血，放入肝素锂抗凝管中，分离血浆，于-20℃冻存。用ELISA方法同时检测小鼠血浆中抗W541蛋白特异性抗体水平。

(4)用CBA方法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1和Th2细胞因子表达水平

第3次免疫治疗后3周杀鼠取脾脏，分离脾细胞，将每组脾淋巴细胞混合，用蛋白刺激培养后，将培养上清吸出，冻存。用CBA方法检测脾细胞培养上清中Th1、Th2细胞因子表达水平。

3、统计学分析

应用SAS6.12软件处理数据，正态分布的定量资料用单因素方差分析，两两比较用Dunnett’s t检验；偏态分布的定量资料用秩和(Kruskal-Wallis)检验，两两比较用q(Student-Newman-Keuls)检验。

二、实验结果

1、各组小鼠脾淋巴细胞中分泌γ干扰素的T淋巴细胞斑点数

结果见图2。结果显示：生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组均可见少量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞；ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组均可见中等量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞。与生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组比较，ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组均能诱导产生中等量的分泌IFN-γ的T淋巴细胞(P<0.0001或P<0.05)，ag85ab质粒DNA组分泌IFN-γ的T淋巴细胞也显著高于W541质粒DNA组(P<0.0001)。

2、各组小鼠血浆中抗W541抗体水平

结果见图3-图5。结果显示：在第3次免疫后，微卡菌苗组、W541质粒DNA组和ag85ab质粒DNA组的抗W541 IgG抗体和其亚型IgG2a和IgG1水平均高于生理盐水组和pVAX-1载体组，ag85ab质粒DNA组抗W541 IgG抗体和其亚型IgG2a水平显著增高(P<0.05或P<0.01或P<0.0001)，但W541质粒DNA组抗W541 IgG抗体和其亚型IgG2a和IgG1水平与生理盐水组和pVAX-1载体组差异没有统计学意义(P＞0.05)。

3、各组小鼠脾淋巴细胞培养上清中的Th1和Th2细胞因子表达水平

治疗结束后3周，检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2)、Th2型细胞因子(IL-4、IL-6)的表达水平。

IFN-γ水平检测结果见图6。结果显示：与生理盐水组(0.27pg/ml±0.34pg/ml)、pVAX-1载体组(0.79pg/ml±0.80pg/ml)和微卡菌苗组(0.42pg/ml±0.37pg/ml)比较，W541质粒DNA组(10.26pg/ml±5.32pg/ml)和ag85ab质粒DNA组(68.97pg/ml±3.66pg/ml)均显著增高(P<0.05或P<0.0001)，ag85ab质粒DNA组显著高于W541质粒DNA组(P<0.0001)。

IL-2水平检测结果见图7。结果显示：与生理盐水组(2.55pg/ml±1.50pg/ml)、pVAX-1载体组(0.86pg/ml±0.74pg/ml)和微卡菌苗组(2.55pg/ml±1.63pg/ml)比较，ag85ab质粒DNA组(20.23pg/ml±4.55pg/ml)的IL-2水平显著增高(P<0.01)，而W541质粒DNA组(1.94pg/ml±3.37pg/ml)与对照组没有统计学差异(P>0.05)。

IL-4水平检测结果见图8。结果显示：与生理盐水组(2.77pg/ml±1.27pg/ml)、pVAX-1载体组(2.61pg/ml±1.16pg/ml)比较，微卡菌苗组(0.73pg/ml±0.63pg/ml)比较，W541质粒DNA组(0pg/ml±0pg/ml)和ag85ab质粒DNA组(1.57pg/ml±1.69pg/ml)小鼠的脾淋巴细胞的IL-4表达水平均有不同程度的降低，但W541质粒DNA组显著低于生理盐水组(P<0.05)。

IL-6水平检测结果见图9。结果显示：W541质粒DNA组IL-6水平(147.55pg/ml±21.20pg/ml)低于生理盐水组(214.60pg/ml±21.95pg/ml)、pVAX-1载体组(150.98pg/ml±12.40pg/ml)、微卡菌苗组(179.47pg/ml±36.88pg/ml)和ag85ab质粒DNA组(214.90pg/ml±39.77pg/ml)，但仅显著低于生理盐水组(P<0.05)。

实施例3、结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541在预防性治疗结核潜伏感染中的应用

将本发明实施例1所构建、纯化的结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541应用于小鼠潜伏感染结核模型的预防性治疗，以其作为治疗制剂，获得了较好的治疗效果，与现有商品化的结核潜伏感染预防治疗制剂微卡菌苗的治疗效果相当。小鼠潜伏感染结核模型免疫治疗过程如下所述：

一、实验方法和材料

1、动物选择

从北京维通利华实验动物技术有限公司购进有合格证的42-62日龄雌性BALB/c小鼠101只。

2、疫苗对小鼠潜伏感染结核模型的预防治疗作用

(1)小鼠结核病潜伏感染模型的制备

①给91只小鼠每只小鼠经尾静脉注射0.4ml含3.6×10⁵CFUs的结核分枝杆菌标准株H37Rv悬液，制备小鼠结核病感染模型。

②化疗治疗：小鼠感染4周开始用吡嗪酰胺(吡嗪酰胺片：规格：0.25g/片，批号：2004051，沈阳红旗药药有限公司)和异烟肼(异烟肼片：规格：100mg/片，批号：200811，太极西南药业股份有限公司)治疗，每天将2g吡嗪酰胺和0.03g异烟肼溶于250ml温灭菌蒸馏水中，使吡嗪酰胺终浓度为8g/L，异烟肼终浓度为0.12g/L，化疗治疗12周，建立小鼠结核潜伏感染模型。

③激素治疗：为了验证结核潜伏感染模型是否建立成功，在第3次DNA疫苗预防性治疗后3周给各组小鼠肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠(国药准字H20093293，批号：20200311D1，常州四药制药有限公司)，每只小鼠注射0.5mg/0.1ml，每周3次，连续3周。

(2)实验分组

①小鼠感染组

A、感染4周组：5只小鼠，感染结核菌后4周；

B、感染16周组：8只小鼠，感染结核菌后16周；

C、感染29周组：10只小鼠，感染结核菌后29周。

②化疗治疗组

A、化疗12周组：8只小鼠，感染结核菌后4周，化疗治疗12周；

B、化疗停药13周组：10只小鼠，感染结核菌后4周，化疗治疗12周，停药13周；

C、激素治疗停药3周组(生理盐水组)：10只小鼠，感染结核菌后4周，化疗治疗12周，激素治疗3周，停药3周。

③DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组

50只小鼠感染结核菌后4周，化疗治疗12周，将小鼠随机均匀分为5组，每组10只小鼠，进行DNA疫苗免疫治疗，具体处理方法分别如下：

A、生理盐水组：每次每只小鼠肌肉注射100μl生理盐水，每2周免疫1次，共3次；

B、pVAX1载体组：每次每只小鼠肌肉注射100μg/100μl pVAX1溶液(pVAX1载体溶于生理盐水中，配制成100μg/100μl pVAX1溶液)，每2周免疫1次，共3次；

C、微卡菌苗组：每次每只小鼠肌肉注射22.5μg/100μl微卡菌苗，每2周免疫1次，共3次；

D、ag85ab质粒DNA组：每次每只小鼠肌肉注射100μg/100μl ag85ab质粒DNA，每2周免疫1次，共3次；

E、W541质粒DNA组：每次每只小鼠肌肉注射100μg/100μl W541质粒DNA，每2周免疫1次，共3次。

各组小鼠在第3次DNA疫苗预防性治疗后3周进行激素治疗。

④正常对照组

10只小鼠，在动物实验室正常饲养，不进行任何感染且不进行任何治疗。

(3)各组小鼠的重量指数检测

小鼠感染组、化疗治疗组、DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组、正常对照组杀鼠；解剖前准确称量小鼠体重，然后精确称取脾、肺、肝重量，并计算肺、肝、脾重量指数(WI)，计算公式如下：脏器重量指数(WI)＝(脏器重量/小鼠体重)×100％。

(4)用ELISPOT法检测脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数

DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组和正常对照组杀鼠取脾脏，分离脾细胞，调节脾淋巴细胞浓度为3×10⁶/ml。在测试板中，分别加入1640完全细胞培养液、W541蛋白(终浓度为30μg/ml)、植物血凝素(PHA)(终浓度为30μg/ml)，脾淋巴细胞为3×10⁵/孔，置CO₂温箱中于37℃温育20h，用ELISPOT方法检测各组分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数，以各组小鼠空白对照孔为对照，计算各组小鼠检测孔的细胞斑点数。

(5)流式检测小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的比例

DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组和正常对照组杀鼠，用流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺细胞百分比。

(6)用CBA方法检测小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1和Th2细胞因子表达水平

DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组和正常对照组杀鼠，将每组脾淋巴细胞混合，用蛋白刺激培养后，将培养上清吸出，冻存。用CBA方法检测脾细胞培养上清中Th1、和Th2细胞因子表达水平。

(7)肺、肝菌落计数

小鼠感染组、化疗治疗组、DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组、正常对照组杀鼠并解剖取肺左叶、肝脏上半部分称重并作菌落计数。取肺左叶和肝上半部分置于灭菌研磨器中，加生理盐水匀浆，倍比稀释后取100μl接种于罗氏平皿培养基中，置37℃温箱培养4周，观察菌落生长情况，计数菌落数。将得到的肺左叶菌落数根据肺左叶和全肺的重量换算为全肺菌落数，将得到的肝脏上半部分菌落数根据肝脏上半部分和全肝的重量换算为全脾菌落数。

(8)肺组织病理检查

小鼠感染组、化疗治疗组、DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组、正常对照组杀鼠，将小鼠肺右叶固定于装10％中性甲醛的病理离心管中，并嵌入石蜡中包埋切片，苏木精/伊红(HE)染色后，5μm连续切片，在显微镜下观察肺组织的组织病理学病变，并通过Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics，Inc.，美国马里兰州罗克维尔)计算肺的病变面积。

3、统计学分析

二、实验结果

1、各组小鼠死亡情况

各组小鼠死亡率统计结果如下：感染16周组小鼠死亡5只，死亡率为62.5％；化疗12周组小鼠死亡1只，死亡率为12.5％；感染29周组小鼠死亡率为80％；其他组小鼠死亡率均为0％。

2、各组小鼠的脏器重量指数

小鼠感染组和化疗治疗组小鼠肺、肝和脾脏重量指数统计结果见图10-12。结果显示：感染29周组肺脏重量指数显著高于感染16周组，感染29周组和感染16周组肺脏重量指数显著高于感染4周组、化疗12周组、化疗停药13组和激素治疗停药3周组(P＜0.0001)，化疗12周组显著高于化疗停药13组和激素治疗停药3周组(P＜0.05)。感染29周组和感染16周组肝脏重量指数显著高于感染4周组、化疗停药13组和激素治疗停药3周组(P＜0.0001)，化疗12周组肝脏重量指数显著高于感染4周组和激素治疗停药3周组(P＜0.0001)。感染16周组脾脏重量指数显著高于感染29周组(P＜0.05)，感染29周组和感染16周组均显著高于感染4周组，化疗12周组、化疗停止13周组和激素治疗停药3周组(P＜0.0001)。

DNA疫苗免疫治疗+激素治疗3周停药3周组和正常对照组小鼠肺、肝和脾脏重量指数统计结果见图13-15。结果显示：各组小鼠肺脏重量指数之间差异没有统计学意义(P>0.05)；与生理盐水组比较，pVAX1载体组、微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组肝脏重量指数均呈降低趋势，但各组小鼠肝脏重量指数之间差异没有统计学意义(P>0.05)；与生理盐水组和pVAX1载体组比较，微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组脾脏重量指数均降低，但无统计学差异(P>0.05)。

3、各组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的淋巴细胞斑点数

结果见图16。结果显示：小鼠激素治疗停药3周，正常对照组、生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组均可见少量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞；ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组均可见中等量的W541蛋白特异的分泌IFN-γ的T淋巴细胞。与正常对照组、生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组比较，ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组分泌IFN-γ的T淋巴细胞显著增加(P<0.0001或P<0.01)，ag85ab质粒DNA组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数也显著高于W541质粒DNA组(P<0.05)，生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数显著高于正常对照组(P<0.0001或P<0.05)，生理盐水组分泌IFN-γ的T淋巴细胞数显著高于pVAX-1载体组(P<0.01)。

4、各组小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞的百分比

结果见图17。结果显示：小鼠激素治疗停药3周，正常对照组小鼠脾细胞中FoxP3调节性T细胞(CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺)的百分比显著高于其他组(P<0.0001)，微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组小鼠脾细胞中的CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺百分比显著高于生理盐水组和pVAX-1载体组(P<0.0001或P<0.01或P<0.05)。

5、各组小鼠脾淋巴细胞培养上清中Th1和Th2细胞因子表达水平

IFN-γ水平检测结果见图18。结果显示：小鼠激素治疗停药3周，ag85ab质粒DNA组和W541质粒DNA组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ水平显著高于正常对照组、生理盐水组、pVAX-1载体组和微卡菌苗组(P<0.0001或P<0.01或P<0.05)。

IL-2水平检测结果见图19。结果显示：ag85ab质粒DNA组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-2水平显著高于pVAX-1载体组、微卡菌苗组和正常对照组(P<0.0001或P<0.01或P<0.05)，W541质粒DNA组和生理盐水组也显著高于正常对照组(P<0.0001或P<0.05)。

IL-4水平检测结果见图20。结果显示：与生理盐水组和pVAX-1载体组比较，微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-4水平略有降低，但差别没有统计学意义(P>0.05)。

IL-6水平检测结果见图21。结果显示：与pVAX-1载体组和正常对照组比较，微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IL-6水平略有升高，但差别没有统计学意义(P>0.05)。

6、各组小鼠肺、肝菌落计数结果

各组小鼠肺、肝菌落数统计结果见图22-23及表1。从肺菌落计数结果看，感染4周组小鼠肺菌落数为7.78Log₁₀，说明小鼠结核感染模型建立成功。治疗12周组肺菌落数减少到0CFU，说明化疗有效。随着感染时间的延长，感染16周组和感染29周组肺菌落数达到6.90Log₁₀和7.33Log₁₀，略有降低，可能是因为BALB/c小鼠对结核分枝杆菌天然有抵抗力的原因。3周激素治疗后停药3周，生理盐水组和载体组肺CFU值增加到4.07Log₁₀和5.20Log₁₀，提示小鼠体内MTB感染内源性再活化模型的建立成功，证明了小鼠结核潜伏感染模型建立成功。化疗停药13周组肺菌落数为1.95Log₁₀，说明小鼠体内潜伏的结核分枝杆菌发生了复燃。用DNA疫苗对小鼠进行预防性治疗后再用激素诱发小鼠潜伏性MTB内源性活化，以评价该疫苗预防潜伏MTB再活化的治疗效果。与生理盐水组和pVAX-1载体组相比，微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组小鼠肺菌落数和肝脏菌落数均不同程度降低，ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组小鼠肝脏菌落数均为0CFU，说明微卡菌苗组、ag85ab质粒DNA组、W541质粒DNA组对潜伏期MTB感染具有一定的免疫抑制及清除作用，可降低小鼠脏器荷菌量，抑制MTB的复燃，预防TB的再发。

表1、各组小鼠肺、肝菌落计数结果

组别	肺菌落计数(Log<sub>10</sub>CFU)	肝菌落计数(Log<sub>10</sub>CFU)
			生理盐水组	4.07±1.55	0.63±1.32
pVAX-1载体组	5.20±0.73	0.71±1.50
			微卡菌苗组	2.43±2.66	0.31±0.99
ag85ab质粒DNA组	0.83±1.75	0±0
			W541质粒DNA组	1.65±2.60	0±0

7、各组小鼠肺组织病理

各组小鼠肺组织病理代表性图片见图24。结果显示：生理盐水组病变较重，病变范围为55.91％±13.96％；pVAX-1载体组病变较重，病变范围为51.05％±9.75％；微卡菌苗组病变局限，病变较轻，病变范围为45.65％±17.17％；ag85ab质粒DNA组病变局限，病变较轻，病变范围为45.06％±8.33％；W541质粒DNA组病变局限，病变较轻，病变范围为45.33％±17.27％。结果提示W541质粒DNA组、微卡菌苗组和ag85ab质粒DNA组的小鼠肺部病变范围均小于生理盐水组和pVAX-1载体组。

上述实验结果表明W541可显著增强小鼠特异的细胞免疫功能，主要刺激Th1型的免疫反应，预防性治疗小鼠结核潜伏感染模型，可使其肺、肝脏组织细菌数减少，肺组织病变范围显著减少，病变减轻，其治疗效果与现有商品化的结核潜伏感染预防治疗制剂微卡菌苗的治疗效果相当。因此，本发明在结核潜伏感染者的预防性治疗方面将具有广阔的应用前景。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第八医学中心

<120> 一种结核分枝杆菌串联DNA疫苗W541及其制备方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Val Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser

1 5 10 15

Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Ala

20 25 30

Asn Ser Pro Ala Leu Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp

35 40 45

Phe Ser Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Asp Gln

50 55 60

Ser Gly Leu Ser Val Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr

65 70 75 80

Ser Asp Trp Tyr Gln Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr

85 90 95

Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gly Trp Leu Gln Ala

100 105 110

Asn Arg His Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Val Val Gly Leu Ser Met

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Ala Leu Thr Leu Ala Ile Tyr His Pro Gln Gln Phe

130 135 140

Val Tyr Ala Gly Ala Met Ser Gly Leu Leu Asp Pro Ser Gln Ala Met

145 150 155 160

Gly Pro Thr Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys

165 170 175

Ala Ser Asp Met Trp Gly Pro Lys Glu Asp Pro Ala Trp Gln Arg Asn

180 185 190

Asp Pro Leu Leu Asn Val Gly Lys Leu Ile Ala Asn Asn Thr Arg Val

195 200 205

Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Lys Pro Ser Asp Leu Gly Gly Asn Asn

210 215 220

Leu Pro Ala Lys Phe Leu Glu Gly Phe Val Arg Thr Ser Asn Ile Lys

225 230 235 240

Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Gly Gly Gly His Asn Gly Val Phe Asp

245 250 255

Phe Pro Asp Ser Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu

260 265 270

Asn Ala Met Lys Pro Asp Leu Gln Arg Ala Leu Gly Ala Thr Pro Asn

275 280 285

Thr Gly Pro Ala Pro Gln Gly Ala Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

290 295 300

Arg Arg Leu Met Ile Gly Thr Ala Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu

305 310 315 320

Val Gly Leu Ala Gly Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Phe Ser Arg Pro

325 330 335

Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg

340 345 350

Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val

355 360 365

Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp

370 375 380

Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile

385 390 395 400

Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser

405 410 415

Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe

420 425 430

Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys

435 440 445

Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala

450 455 460

Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser

465 470 475 480

Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile

485 490 495

Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp

500 505 510

Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln

515 520 525

Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly

530 535 540

Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe

545 550 555 560

Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr

565 570 575

Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly

580 585 590

Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly

595 600 605

Asp Leu Gln Gly Pro Gly Pro Gly Leu Arg Gln His Ala Ser Arg Tyr

610 615 620

Leu Ala Arg Val Glu Ala Gly Gly Pro Gly Pro Gly Ser Gly Val Leu

625 630 635 640

Ile Pro Ala Arg Arg Pro Gln Asn Leu Leu Asp Val Thr Ala Glu Pro

645 650 655

Ala Arg Gly Arg Lys Arg Thr Leu Ser Asp Val Leu Asn Glu Met Arg

660 665 670

Gly Pro Gly Pro Gly Ile Pro Phe Ala Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val

675 680 685

Gln Asp Ser Arg Ser His Val Tyr Ala His Gln Ala Gln Thr Arg His

690 695 700

Pro

705

<210> 2

<211> 2118

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggtcagca gacccggcct gcccgtggag tacctgcagg tgcctagccc cagcatgggc 60

agggacatca aggtgcagtt tcagtccggc ggcgccaact cccccgccct gtatctgctg 120

gacggcctga gggcccagga cgacttttcc ggctgggaca tcaatacccc tgccttcgag 180

tggtacgacc agagcggcct gtccgtggtg atgcctgtgg gcggccagag cagcttttac 240

agcgactggt accagcccgc ctgcggcaag gccggatgcc aaacatacaa gtgggagacc 300

ttcctgacca gcgagctgcc tggctggctg caggccaata ggcacgtgaa gcccaccggc 360

tccgccgtgg tgggactgtc tatggccgcc agcagcgccc tgaccctggc tatctaccac 420

cctcagcagt ttgtgtacgc cggcgccatg agcggcctgc tggatcctag ccaggccatg 480

ggccccaccc tgatcggcct ggctatgggc gacgccggcg gatacaaggc ctccgacatg 540

tggggcccca aggaggatcc tgcctggcag aggaatgacc ctctgctgaa cgtgggcaag 600

ctgatcgcca acaatacaag ggtgtgggtg tactgcggca acggcaagcc tagcgatctg 660

ggcggcaata acctgcccgc caagtttctg gagggcttcg tgagaaccag caatatcaag 720

tttcaggacg cctacaacgc cggcggcggc cataatggcg tgttcgattt tcccgatagc 780

ggcacacaca gctgggagta ctggggcgcc cagctgaatg ccatgaagcc cgacctgcag 840

agagccctgg gcgccacacc caatacaggc cccgccccac agggcgctgg cagcggagga 900

ggaagcggag gaagaagact gatgatcggc accgccgccg ccgtggtgct gcctggactg 960

gttggcctgg ccggcggagc tgctaccgct ggagctttta gcagacccgg actgcccgtg 1020

gaatacctgc aggtcccttc ccccagcatg ggaagggaca tcaaagtgca gtttcaatcc 1080

ggcggcaaca atagccctgc cgtgtacctg ctggacggac tgagagccca ggacgattac 1140

aatggctggg acattaatac ccctgctttt gagtggtact accagtccgg cctgtccatc 1200

gtgatgcctg tcggcggcca gtccagcttt tactccgact ggtactcccc cgcctgtggc 1260

aaggccggct gtcagaccta caagtgggaa acctttctga cctccgagct gcctcagtgg 1320

ctgtccgcca atagagccgt gaagcccaca ggctccgccg ccatcggcct gtctatggct 1380

ggctccagcg ccatgatcct ggccgcctac cacccccagc agtttatcta cgccggcagc 1440

ctgtccgccc tgctggaccc tagccagggc atgggcccta gcctgatcgg cctcgccatg 1500

ggcgacgctg gcggatacaa agccgccgat atgtggggcc catccagcga ccccgcctgg 1560

gaaaggaacg accccaccca gcagatccct aagctggtgg ccaacaacac aaggctgtgg 1620

gtgtactgtg gcaacggcac acctaatgag ctgggcggcg ccaatatccc cgccgagttt 1680

ctggagaatt ttgtgaggtc ctccaatctg aagttccagg atgcctacaa cgctgccggc 1740

ggccacaacg ccgtgttcaa tttcccccct aatggcacac actcctggga gtactgggga 1800

gcccagctga acgccatgaa gggcgacctg cagggccctg gccccggact gagacagcac 1860

gcttccaggt acctggccag ggtggaggcc ggcggaccag gacctggaag cggagtgctg 1920

atccccgcca gaaggcctca gaacctgctg gacgtgaccg ccgagcccgc cagaggaaga 1980

aagagaacac tgagcgacgt gctgaacgag atgagaggcc ctggccctgg catccccttc 2040

gccgctgctg ctggcaccgc cgttcaggac agcaggagcc acgtgtacgc ccaccaggcc 2100

cagacaagac acccctga 2118

Claims

1.一种结核分枝杆菌DNA疫苗，其活性成分是表达融合蛋白的重组真核细胞表达载体；所述融合蛋白包括抗原表位甲、抗原表位乙、抗原表位丙、抗原表位丁和抗原表位戊；

2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：

编码所述抗原表位甲的核酸分子如序列表中序列2第7-888位所示；

3.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于：所述融合蛋白为如下R1)-R4)所示的蛋白质：

R1)氨基酸序列是序列1所示的蛋白质；

4.根据权利要求1或2所述的DNA疫苗，其特征在于：所述重组真核细胞表达载体为将编码所述融合蛋白的核酸分子插入真核表达载体的酶切位点后得到的载体。

5.根据权利要求1-3任一所述的DNA疫苗，其特征在于：编码所述融合蛋白的核酸分子为序列2第1-2115位所示的DNA分子。

6.权利要求1-5中任一所述的重组真核细胞表达载体。

7.权利要求1-5中任一所述的融合蛋白。

8.编码权利要求7所述融合蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体。

9.权利要求1-5任一所述的DNA疫苗或权利要求6所述的重组真核细胞表达载体或权利要求7所述融合蛋白或权利要求8所述的核酸分子或表达盒或重组载体在如下S1)-S7)任一种中的应用：

S1)制备用于预防和/或治疗结核潜伏感染的产品；

S2)预防和/或治疗结核潜伏感染；

S4)抑制结核分枝杆菌生长和/或增殖和/或内源性复燃；

S6)提高或增强细胞免疫功能或细胞免疫应答水平；

S7)作为结核潜伏感染预防治疗制剂。

10.一种结核潜伏感染预防治疗制剂，其活性分成为权利要求1-5任一所述的DNA疫苗或权利要求6所述的重组真核细胞表达载体或权利要求7所述融合蛋白或权利要求8所述的核酸分子。