CN114410587A - 一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞ma-104细胞系感染滴度的方法 - Google Patents

一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞ma-104细胞系感染滴度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及非洲猪瘟病毒技术领域，具体涉及一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA‑104细胞系感染滴度的方法。将非洲猪瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体，然后将重组慢病毒转染MA104细胞系，得到稳定表达D1133L基因的MA‑104细胞系MA‑104/D1133L，利用该细胞系接种非洲猪瘟病毒，可大大提高非洲猪瘟病毒滴度。感染ASFV后的MA‑104/D1133L可以多次收毒。本发明得到的MA‑104/D1133L细胞株与野生型MA‑104相比，ASFV病毒滴度显著提高。

Description

一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的 方法
技术领域
本发明涉及非洲猪瘟病毒技术领域，具体涉及一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法。
背景技术
非洲猪瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）是一种双链DNA病毒，是唯一的虫媒DNA病毒，家猪和野猪感染后会引起出血性疾病。自2018年传入中国，对国内养猪业造成重大的经济损失。研究表明ASFV编码50多种结构蛋白和100多种非结构蛋白，其中ASFV编码五种解旋旋酶，分别为D1133L、Qp509L、Q706L、B962L和A859L，这些蛋白对病毒复制过程中的转录阶段发挥重要的功能。D1133L基因与牛痘病毒的D6R具有相似的结构域，与病毒转录起始相关。
猪肺泡巨噬细胞（PAM细胞）是非洲猪瘟病毒的靶细胞之一，但PAM细胞无法传代复制，通常获取PAM细胞是需从猪体内分离新鲜的肺获得，对于诊断实验室来说此操作过程耗时耗力，甚至有的诊断实验室不易获取PAM细胞。
MA-104属于非洲绿猴细胞，组织来源于肾细胞，属于可传达的上皮样细胞，MA-104细胞为商业化可以传代细胞系，可避免获取原代细胞节省时间。但MA-104细胞为非ASFV感染的靶细胞。申请人前期将ASFV感染MA-104细胞后，ASFV病毒滴度极低。
公开号为CN 103525773A的中国发明专利公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用，该发明专利采用基因克隆方法从猪肺泡巨噬细胞克隆猪蓝耳病病毒受体蛋白基因编码片段，插入到真核表达载体，通过脂质体介导方式稳定转染到PRRSV敏感细胞，并采用极限稀释法，从单个阳性细胞克隆逐步扩繁，建立单个PRRSV 受体或多个PRRSV 受体遗传修饰的细胞系（株），利用该细胞接种猪蓝耳病病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，可以多次收毒，并最终确保所生产PRRSV 疫苗效力的稳定性。由此可以看出，该发明专利采用的仍然病毒的敏感细胞，其通过表达目标病毒的病毒受体来提高病毒感染滴度。
发明内容
本发明提出了一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系培养非洲猪瘟病毒时的病毒滴度，以进一步实现利用该可传代细胞系对非洲猪瘟病毒进行持续培养。
本发明的技术方案为：
一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，将非洲猪瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体，然后将重组慢病毒转染MA104细胞系进行筛选，得到稳定表达D1133L基因的MA-104细胞系，利用该细胞系接种非洲猪瘟病毒，可显著提高非洲猪瘟病毒滴度。
具体操作步骤如下：
步骤1：重组慢病毒载体Lv-D1133L构建；
步骤2：包装慢病毒：
293T细胞消化，接种于10cm皿，包装慢病毒Lv-D1133L病毒液。终止感染，48小时后收集病毒液，利用0.45μm滤器过滤，然后对慢病毒Lv-D1133L进行病毒液浓缩，-80℃保存备用。
步骤3：慢病毒Lv-D1133L感染MA-104细胞，8小时后终止。
步骤4：筛选培养：利用3μg/mL的puromycin对各组细胞株进行药筛培养，48小时后更换培养基并传代，维持培养，收集各组细胞株，提取各组细胞RNA，进行qRT-PCR验证。筛选得到细胞株MA104/D1133L，D1133L在该细胞株中能够高效、稳定表达。
本发明将MA-104/D1133L细胞株感染ASFV，qPCR结果显示，MA-104/D1133L细胞株与野生型MA-104相比促进了ASFV病毒的复制，ASFV病毒滴度提高。
本发明的有益效果为：
本发明建立了基于慢病毒载体构建的稳定表达D1133L的MA-104细胞系MA-104/D1133L，利用该细胞接种非洲猪瘟病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，并可以多次收毒。本发明实施例中，MA-104/D1133L细胞株与野生型MA-104相比，ASFV病毒滴度显著提高。
附图说明
图1为细胞株pCDH-MA104、MA104/D1133L中D1133L的表达量对比图。图1A和图1B分别表示初次感染感染复数moi为2以及提高感染复数至4时，MA-104/D1133L细胞株对照组细胞株pCDH-MA-104中D1133LmRNA水平的表达量比较图。图中MA-104表示细胞株pCDH-MA-104。
图2为细胞株pCDH-MA-104、MA104/D1133L的D1133L和β-actin的qRT-PCR产物电泳检测图。图中D1133L-MA-104表示MA-104/D1133L细胞株。
图3为细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV后D1133LmRNA的表达图。
图4为细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV后p30 /GAPDH mRNA表达图。
图5为细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV后p72/GAPDH mRNA表达图。
图6为细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV后p72蛋白表达图。
图7为细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV荧光病毒后p30蛋白表达图。
图8为细胞株MA-104/D1133L传代4次后的ASFV的收毒情况（A）和细胞株MA-104、MA-104/D1133L感染ASFV后的病毒滴度对比图（B）。
保藏信息：
保藏时间：2021年5月14日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC NO:C2021129；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
分类命名：非洲绿猴肾细胞MA-104/D1133L。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
材料来源：
ASFV病毒株CN/GS/2018于中国农业科学院兰州兽医研究所P3实验室分离，并记载于2021年3月10发表的文献中（African Swine Fever Virus MGF-110-9L-deficientMutant Has Attenuated Virulence in Pigs[J]. VirologicaSinica, 2021:1-9.）。公众经中华人民共和国农业农村部批准后，可通过中华人民共和国农业农村部批示的委托函从国家非洲猪瘟区域实验室（兰州）-中国农业科学院兰州兽医研究所获得ASFV CN/GS/2018分离株。
ASFV荧光病毒为含有eGFP筛选表达盒基因片段、缺失的MGF-360-9L基因的ASFV荧光病毒，其制备方法参考公开号为CN 111593028 A的中国发明专利申请。
MA-104细胞由中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队保存。JetPRIME-购于北京达科为生物技术有限公司，DMEM、0.25%EDTA胰酶和FBS均购于ThermoScientific公司；PBS溶液购于Hyclone公司；ECL显色试剂盒、鼠抗β-actin单抗购于ThermoScientific；NP-40裂解液和PMSF购于碧云天公司；反转录试剂盒由诺维赞生物公司生产。ASFVD1133L单抗是由兰州兽医研究所口蹄疫流行病学团队制备，制备方法详见公开号为CN 112481220 A的中国发明专利申请。免疫荧光兔二抗购于CST公司，兔二抗购于ProteintechGroup公司。
1.稳定表达D1133L的MA-104/D1133L细胞株的构建
1.1慢病毒载体的构建及病毒包装
具体包括以下步骤：
步骤1：重组慢病毒载体Lv-D1133L和Lv-pCDH的构建：化学合成法合成D1133L基因，基因序列见NCBI上NC_044959.2；D1133L基因5’端和3’端引入有EcoRI和NotI酶切位点，将合成的D1133L基因和慢病毒载体Lv-pCDH载体后重连，得到重组慢病毒载体Lv-D1133L。并利用EcoRI和NotI双酶切鉴定重组质粒。
步骤2：包装慢病毒：
（1）用293T细胞分别包装慢病毒Lv-pCDH和Lv-D1133L病毒液；
①293T细胞的消化接种：
将生长状态良好的293T细胞用0.25%胰蛋白酶消化制备单细胞悬液并调整浓度为4×105/mL，取10 mL接种于10 cm培养皿中。在37℃、5% CO2培养箱内培养过夜，第二天细胞汇合度达到80%，备用。
②病毒包装：
将包装质粒3 µg pMD2G、6 µg psPAX和7.5 µg慢病毒载体质粒Lv-D1133L或Lv-pCDH加到150 µL OPTI-MEM内混匀，得慢病毒载体混合物；取25µLLipo 2000加入到500 µLOPTI-MEM内混匀，室温静置5 min，得Lipo 2000混合物；将慢病毒载体混合物缓慢加入Lipo 2000混合物中，混匀后室温静置15 min。然后逐滴加入到①中得到的汇合度达80%的293T细胞中，充分混匀。6 h后更换为含10%FBS的DMEM新鲜培养液。
慢病毒载体要求：浓度为1 µg/µL，纯度：OD260/OD280的值在1.8～2.0范围内。
（2）培养48 h后收集培养液（含慢病毒），于1500g、4 ℃条件下离心10 min去细胞碎片，然后用0.45 µm滤膜过滤病毒上清液，用0.45μm滤器过滤、保存备用。
1.2慢病毒可以插入细胞基因组，稳定表达，持续时间长，包装周期短，感染效率相对于腺病毒要低很多。慢病毒不能扩增，一次包装的病毒用完后如果需要只能重新包装。在慢病毒Lv-D1133L感染目的细胞（MA104）的时候，首次感染（感染复数moi为2）后发现，D1133L表达量只是空载细胞3倍多（图1A），远低于预期，这表明此方法感染后病毒滴度低。接着通过调整感染复数，采用最初moi4倍的感染复数，加大病毒量去感染目的细胞，同时也在辅助感染试剂终浓度2～5μg/mLpolybrene的条件下进行感染，最终D1133L表达量提高至空载的7.5倍（图1B）。
1.2 稳定表达D1133L的MA-104细胞株MA-104/D1133L的筛选及鉴定
1.2.1慢病毒感染MA-104细胞：
将1.1得到的Lv-pCDH、Lv-D1133L病毒过滤液，分别按照4:1的比例加入5 ×pEGit病毒浓缩液（BioVisionCatalog#K904-50/200）。4℃静置过夜后，于3200g、4℃条件下离心20 min。弃去上清，用含5% FBS的DMEM培养液重悬病毒团块，并以200 µL/管分装，-80℃保存。
然后将慢病毒Lv-pCDH、Lv-D1133L感染MA-104细胞（10cm培养皿），病毒体积200μL，病毒数量约2×107，用完全培养基补足至2mL，加入2μL转染增强剂聚凝胺（polybrene，终浓度2～5μg/mL），感染MA-104细胞（moi=4），8h后终止。两组细胞分别记为pCDH-MA-104和MA-104/D1133L。
1.2.2 pCDH-MA-104、MA-104/D1133L细胞株的筛选：
感染48h后，加入puromycin进行药物筛选，筛选48h～72h后更换培养基并传代，维持培养，得到阳性细胞株pCDH-MA-104、MA-104/D1133L。通过筛选得到的阳性细胞株MA-104/D1133L即为稳定表达D1133L蛋白的MA-104细胞株。
1.2.3 qRT-PCR检测D1133L的表达量：
（1）设计D1133L的qRT-PCR引物，引物序列如表1。
表1 引物序列表
引物名称 碱基序列（5'-3'）
D1133L-F CTTCTGGAAAACGGGGTACA
D1133L-R CAAGATAAGAACCCCCGACA
β-actin- human-F AGAGCTACGAGCTGCCTGAC
β-actin- human -R AGCACTGTGTTGGCGTACAG
GAPDH-F（M） CATGTTCCAGTATGACTCCACT
GAPDH-R（M） GTAGACTCCACGACATACTCAG
p30-F CTCCGATGAGGGCTCTTGCT
P30-R AGACGGAATCCTCAGCATCTTC
P72-F TGCGATGATGATTACCTT
P72-R ATTCTCTTGCTCTGGATAC
（2）Trizol提取阳性pCDH-MA-104、MA-104/D1133L细胞株的RNA，并测定RNA的浓度。
（3）按500ng RNA逆转录成10µL体系cDNA的标准进行逆转录，将逆转录成功的cDNA作为模板，以步骤（1）合成的引物作为扩增引物进行qRT-PCR检测。反应体系为：AceQ®qPCRSYBR®Green Master Mix 10µL，DEPC水7.2µL，Primer1（10µM）0.4µL，Primer2（10µM）0.4µL，模板cDNA 2 µL。扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。qRT-PCR结果如图1B所示，结果显示MA-104/D1133L细胞株中D1133L在mRNA水平的表达量较对照组细胞株pCDH-MA-104提高约7.5倍。
（4）qRT-PCR实验结束后，利用核酸电泳技术对qRT-PCR的产物进行检测，结果如图2所示：对于D1133L基因，MA-104/D1133L细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带与pCDH-MA-104细胞株的相比，差异显著；对于β-actin基因，两个细胞株的qRT-PCR扩增产物的条带基本相当。β-actin基因的qRT-PCR引物序列见表1。
qRT-PCR检测和电泳结果说明：通过以上步骤筛选到了稳定表达D1133L的细胞株MA-104/D1133L，且D1133L在该细胞株中能够高效、稳定表达。
2．MA-104/D1133L细胞促进ASFV病毒复制、提高病毒滴度
MA-104细胞属于非ASFV感染的靶细胞，ASFV感染效率低，通过相对定量PCR测定P30、P72和D1133L转录水平表达量发现，MA-104/D1133L细胞株相比野生型MA-104细胞P30、P72和D1133L转录水平表达量显著提高，同时通过WB测定p30、p72蛋白水平发现MA-104/D1133L细胞株的表达量也显著高于野生型。
2.1、qRT-PCR验证MA-104/D1133L细胞感染ASFV后D1133L表达情况
（1）用无血清的DMEM将ASFV病毒毒液稀释至1:500的浓度。
（2）将野生型MA-104细胞、MA-104/D1133L细胞消化后分别铺于细胞板中，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞长至70%～90%时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。
（3）将稀释好的ASFV毒液按照适当的体积加入到细胞中（2mL的细胞培养基加4μL的ASFV），置于37℃、5%CO2培养箱孵育1 h之后，弃去毒液，换成2%FBS DMEM维持液，继续培养。在24h收取样品。
（4）提取样品RNA，反转录，然后进行利用引物对D1133LF/R、引物对GAPDH-F /R分别对反转录的cDNA进行qRT-PCR，引物对序列详见表1。
结果如图3所示，图3结果表明MA-104/D1133L感染ASFV后D1133L的表达量远高于野生型MA-104。
2.3、qRT-PCR验证MA-104/D1133L细胞感染ASFV后p30、p72/GAPDH mRNA表达情况
（1）将野生型MA-104细胞、MA-104/D1133L细胞消化后分别铺于细胞板中，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞长至70%～90%时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。
（2）将用ASFV（moi=1）感染细胞中置于37℃、5%CO2培养箱孵育1 h之后，弃去毒液，换成2%FBS DMEM维持液，继续培养。在0、6h、12h、24h收取样品。
（3）按时间点收取样品，弃去培养基，用Trizol法提取RNA，测定浓度后进行反转录，随后将反转得到的cDNA，进行qRT-PCR，所用设计的p30、p72引物详见表1。内参基因为猴源GAPDH基因，其扩增引物详见表1。
结果如图4、图5所示，在6h、12h、24h时收取的样品中，MA-104/D1133L细胞中p30、p72/GAPDH mRNA表达量均高于野生型MA-104细胞中p30、p72/GAPDH mRNA表达量，特别是ASFV感染12h、24h时MA-104/D1133L细胞中p30、p72/GAPDH mRNA表达量远高于野生型MA-104细胞中p30、p72/GAPDH mRNA表达量。这表明MA-104/D1133L细胞株与野生型MA-104细胞株相比，在ASFV感染6h、12h、24h时均能促进ASFV的复制，即提高了ASFV的病毒滴度。这表明MA-104/D1133L细胞可以用来过量表达D1133L进而促进病毒的复制，提高ASFV病毒的滴度。
2.4、Western-blot验证MA-104/D1133L细胞感染ASFV后p72表达情况
（1）将野生型MA-104细胞、MA-104/D1133L细胞消化后分别铺于细胞板中，置于37℃、5%CO2培养箱中，待细胞长至70%～90%时，用无血清的DMEM将细胞清洗两遍，以去除细胞中残留的血清。
（2）将用ASFV（moi=1）感染细胞中置于37℃、5%CO2培养箱孵育1 h之后，弃去毒液，换成2%FBS DMEM维持液，继续培养。在0、6h、12h、24h、36h收取样品。
（3）按时间点收取样品，弃去培养基，用PBS清洗后加入SDS上样缓冲液，100℃金属浴10～15min使蛋白变性；4℃，12000rpm离心10min，样品-20℃保存，后续用于SDS-PAGE电泳，通过电泳，转印后将膜用5%的脱脂奶粉室温封闭2h，通过孵育p30单抗，4℃孵育过夜，TBST清洗3次，每次10min，室温孵育二抗1～2h，用凝胶化学高分辨图像采集系统进行ECL显影。
结果如图6所示，在24h、36h时收取的样品中，MA-104/D1133L细胞中p72蛋白表达量远高于野生型MA-104细胞中p72表达量。即MA-104/D1133L细胞株与野生型MA-104细胞株相比在24h、36h均能促进ASFV的复制。这是因为MA-104/D1133L细胞株在ASFV感染后过量表达D1133L，进而促进了ASFV的复制。这表明MA-104/D1133L细胞可以用来过量表达D1133L进而促进病毒的复制，提高ASFV病毒的滴度。
2.5、Western-blot验证MA-104/D1133L细胞感染ASFV荧光病毒后p30表达情况
将ASFV荧光病毒感染长满单层MA-104细胞和MA-104/D1133L细胞，36h后弃去上清，PBS清洗后加入适当比例的RAPI细胞裂解液和SDS上样缓冲液（内含PMSF，使用浓度1mM）；100℃金属浴10～15min使蛋白变性；4℃，12000rpm离心10min，样品-20℃保存。将蛋白胶夹好放入电泳槽内，浓缩胶75Ⅴ跑30～40min后电压改为120Ⅴ继续跑至电泳结束，电泳结束后将凝胶转印至NC膜上，冰上转印1.5h，脱脂奶粉封闭室温2～3h，孵育抗体4℃过夜，二抗室温孵育1～2h，用凝胶化学高分辨率图像采集系统进行ECL显影。
结果如图7所示，感染重组荧光ASFV36h后，MA-104/D1133L细胞中病毒结构蛋白p30的蛋白水平明显高于MA-104细胞，说明MA-104/D1133L细胞ASFV复制能力高于MA-104。
2.6、MA-104/D1133L感染非洲猪瘟病毒后多次收毒情况
本实施例采用绝对定量法测定病毒核酸（病毒拷贝数），以检测感染非洲猪瘟病毒的MA-104/D1133L传代多代后收毒情况。
具体的，在12孔板铺MA-104/D1133L，待细胞密度为70～80%，接种F0代ASFVCN/GS/2018 分离株（moi=2），用无血清的DMEM培养2h后，更换为2%FBS的DMEM培养基，感染后36h，收取F1代样品，在-80℃和37℃间反复冻融三次，反复冻融3次收取细胞上清及沉淀，3000rpm离心5min，在生物安全柜收取后，置于-80℃保存备用。100℃灭活10min，3000rpm离心5min，绝对定量法测定F1代样品拷贝数。然后将前述收取离心后保存的上清感染新铺的MA-104/D1133L，感染后36h，收取F2代样品，对样品处理后采用绝对定量法测定F1代样品拷贝数，接着按照上述方法测定F3、F4代样品拷贝数。
如图8A所示，F0、F1、F2、F3、F4代样品中病毒均具有一定的拷贝数，这表明非洲猪瘟病毒可在MA-104/D1133L储毒。
2.7、ASFV病毒在细胞株MA-104/D1133L中HAD50的测定
本实施例中非洲猪瘟病毒的滴度采用半数血细胞吸附量（50％haemadsorption,HAD50）表示，HAD50实验具体操作参考文献（Borca MV, Ramirez-Medina E, Silva E,Vuono E, Rai A, Pruitt S, Holinka LG, Velazquez-Salinas L, Zhu J,GladueDP.Development of a highly effective African swine fever virus vaccineby deletion of the I177L gene results in sterile immunity against the currentepidemic Eurasia strain. J Virol. 2020. pii: JVI.02017-19），同时对其进行适当调整：在 96 孔板中按照约1×105/孔细胞接种原代MA-104/D1133L或MA-104细胞细胞，加入20μL的1%的红细胞，取F1代收取的病毒液，连续 10 倍梯度稀释为10-1～10-6，将ASFV感染MA-104/D1133L或MA-104细胞，做两个重复板，36h开始观察花环，连续观察6天。记录出现花环的孔数的稀释度和个数，根据kerber法计算半数血细胞吸附量HAD50。
MA-104细胞的HAD50为10-4.18/mL，MA-104/D1133L细胞系的HAD50测定结果为10- 4.81mL，结果如图8B所示。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (5)

1.一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，其特征在于，在MA-104细胞中稳定表达D1133L基因以提高MA-104细胞系的非洲猪瘟病毒感染滴度。
2.根据权利要求1所述的一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，其特征在于，在MA-104细胞中稳定表达D1133L基因的方法为：将非洲猪瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒载体中，得到重组慢病毒载体，然后将重组慢病毒转染MA104细胞系进行筛选，得到稳定表达D1133L基因的MA-104细胞系。
3.根据权利要求2所述的一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，其特征在于，所述稳定表达D1133L基因的MA-104细胞系的保藏编号为CCTCC NO:C2021129。
4.根据权利要求2所述的一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，其特征在于，重组慢病毒转染MA104细胞系时，感染复数为4。
5.根据权利要求2所述的一种提高非洲猪瘟病毒非靶细胞MA-104细胞系感染滴度的方法，其特征在于，重组慢病毒转染MA104细胞系时，添加助感染试剂Ploybrene。
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