CN117737007A - 一种促进杆状病毒增殖的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促进杆状病毒增殖的方法与应用。本发明利用过表达IAP蛋白的细胞系接种杆状病毒后能提高杆状病毒的增殖；同时以表达IAP蛋白的杆状病毒为模板构建表达其它蛋白的杆状病毒，其增殖能力也有显著的提高，具体表现在提高重组后杆状病毒的滴度，这不仅有利于种毒的繁殖和保存，减少种毒的繁殖次数，而且能提高蛋白的生产，从而本发明能有效提高蛋白的生产，缩短蛋白的表达周期，降低生产蛋白的成本。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域和病毒领域，特别涉及一种促进杆状病毒增殖的方法与应用。
背景技术
杆状病毒表达系统(Bac-Bac)是目前主流的蛋白表达系统之一。杆状病毒(Baculovirus)是一类具有囊膜的并专一性感染节肢动物DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组大小为80-180Kb。因其基因组具有较大的柔韧性，可容纳较大的外源DNA插入，所以杆状病毒常用来作为外源基因的表达载体。1983年，G ESmith等首次利用AcMNPV表达载体在草地贪夜蛾卵巢细胞中成功表达出人γ干扰素。随后，杆状病毒表达载体系统不断优化，大量不同来源的外源基因利用该系统成功表达。基于杆状病毒表达系统的自身特点和优势，在药物研发、病毒样颗粒的制备、疫苗生产、哺乳动物基因治疗方面被广泛应用。
做为主流的蛋白表达系统之一，如何提高杆状病毒表达外源蛋白的效率和质量是目前研究人员的主要研究方向。促进杆状病毒的繁殖能有效的缩短表达外源蛋白的周期，以及提高表达外源蛋白的质量(主要与后续蛋白的提纯相关，蛋白表达量越高后续蛋白纯化的浓度和纯度就越好，那么蛋白的利用价值就越高)，能极大的减少生产成本，具有重要的经济意义。
发明内容
本发明课题组前期研究中验证敲除宿主细胞的促进凋亡基因是否影响病毒的复制，包括caspase1和Dronc基因，发现这种操作对杆状病毒的复制并无影响(Knockout ofSf-Caspase-1generates apoptosis-resistant Sf9 cell lines:Implications forbaculovirus expression；2022Jul；17(7):e2100532.doi:10.1002/biot.202100532.Epub2022Apr 22.)。本课题组继续研究，以杆状病毒宿主细胞内的凋亡抑制蛋白(IAP蛋白)为研究对象，发现促进宿主细胞内IAP蛋白的表达能促进杆状病毒的增殖，进而调高杆状病毒表达外源蛋白的能力。本发明的首要目的在于提供一种促进杆状病毒增殖的方法。
本发明的另一目的在于提供上述促进杆状病毒增殖的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种促进杆状病毒增殖的方法，包括方式I或方式II：
方式I的步骤如下：
(1)构建过表达凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)的昆虫细胞；
(2)将杆状病毒感染步骤(1)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞，培养，繁殖杆状病毒；
方式2的步骤如下：
(3)构建过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞；
(4)构建能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒；
(5)将步骤(4)得到的能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒感染步骤(3)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞，培养，繁殖杆状病毒。
步骤(1)和步骤(3)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞通过如下步骤得到：将含有凋亡抑制蛋白编码核酸的DNA片段转入昆虫宿主细胞得到。
所述的凋亡抑制蛋白编码核酸的序列优选如XM_035602447.2所示。
所述的DNA片段还含有强启动子和载体框架。
所述的强启动子优选为IE1启动子、P10启动子或Hr5-IE1-p10组成型启动子；更优选为Hr5-IE1-p10组成型启动子。
所述的Hr5-IE1-p10组成型启动子是杆状病毒的Hr5基因增强子、IE1启动子和p10启动子依次连接得到。
所述的Hr5基因增强子的序列如NC_001623.1第118044～111326所示。
所述的IE1启动子的序列如NC_001623.1第127684～128276所示。
所述的p10启动子的序列如NC_001623.1第119926～120035所示。
所述的载体框架优选为含有能表达EGFP的真核表达载体；更优选为pEGFP-N1。
所述的昆虫宿主细胞优选为sf9细胞。
步骤(2)中所述的感染按杆状病毒感染昆虫细胞的常规方式即可。
步骤(4)中所述的能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒是将凋亡抑制蛋白编码核酸克隆入杆状病毒得到；优选通过如下步骤得到：将凋亡抑制蛋白编码核酸克隆在杆状病毒穿梭质粒上，再将得到的质粒转入大肠杆菌DH10Bac中进行筛选，得到重组杆粒；将重组杆粒转入昆虫宿主细胞中，得到能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒。
所述的凋亡抑制蛋白编码核酸的序列优选如XM_035602447.2所示。
所述的杆状病毒穿梭质粒优选为pFast-Dual
步骤(5)中所述的感染按杆状病毒感染昆虫细胞的常规方式即可。
上述促进杆状病毒增殖的方法在促进杆状病毒增殖或外源蛋白表达中的应用。
所述的外源蛋白优选为亚单位疫苗或者蛋白药物。
所述的外源蛋白包括但不限于猪圆环病毒3外壳蛋白(PCV3 Cap蛋白)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明利用筛选出来的过表达IAP蛋白的细胞系接种杆状病毒后能提高杆状病毒的增殖，同时以表达IAP蛋白的杆状病毒为模板构建表达其它蛋白的杆状病毒，其增殖能力也有显著的提高，具体表现在提高重组后杆状病毒的滴度，不仅有利于种毒的繁殖和保存，减少种毒的繁殖次数，而且有利于提高蛋白的生产，从而能有效提高蛋白的生产，缩短蛋白的表达周期，降低生产蛋白的成本。
附图说明
图1为IAP蛋白表达盒连接到pEGFP-N1载体上的双酶切鉴定结果图；其中，泳道N1-IAP为重组质粒pHr5-IE1-P10-IAP-PURO的简写。
图2为IAP蛋白表达盒连接到pFast-Dual载体上的双酶切鉴定结果图。
图3为免疫印迹检测稳定过表达IAP蛋白细胞系表达IAP蛋白的结果图。
图4为免疫印迹检测重组杆状病毒以及质粒表达IAP蛋白的结果图。
图5为杆状病毒的生长曲线图。
图6为72h杆状病毒表达EGFP蛋白的情况图。
图7为72h杆状病毒表达Cap3蛋白的情况图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
所用的引物如下表所示：
实施例1：IAP蛋白表达盒的构建
一、IAP蛋白基因的扩增
将长满的sf9细胞(昆虫卵巢细胞，来自于ATCC，货号为CRL-1711)弃掉上清后，收集底部的细胞，然后抽提细胞的总RNA并反转录作为模板。根据NCBI数据库中公布的IAP基因序列(XM_035602447.2)，设计相应的引物(SF9IAP-F1和SF9IAP-R1)，扩增出所需的IAP基因并连接pMD18-T，转化到DH5α感受态细胞中，得到18T-IAP载体，测序正确后，保存阳性菌液。
二、构建昆虫细胞的过表达载体
利用质粒提取试剂盒提取DH10BAC菌液中所含的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV杆状病毒)的全基因组质粒，以杆状病毒基因组为模板扩增出Hr5基因(NC_001623.1，118044..118766，所用引物为hr5-F和hr5-R1)、p10基因(NC_001623.1，118839..119123，所用引物为p10-F和p10-R)以及IE1基因(NC_001623.1，127198..128946，所用引物为HIP-ieF和HIP-ieR)，随后利用重叠PCR(overlap PCR)将其构建成Hr5-IE1-p10组成型启动子。
PCR反应体系如下：2×ApexHF FS PCR Master Mix*25μL、样品1 2μL、样品2 2μL、上游引物2μL、下游引物2μL、灭菌双蒸水17μL，总计50μL。
先将Hr5基因(1..483，这是所述构建表达盒的位子)和IE基因(487..1079)分别作为样品1和样品2，利用重叠PCR将Hr5基因与IE1基因整合，此时所用的引物为hr5-F和HIP-ieR；然后将整合的Hr5-IE1基因和P10基因(1088..1197)再作为样品1和样品2进行再次整合，此时所用的引物为hr5-F和p10-R，构建出完整的组合型启动子Hr5-IE1-P10。
PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s、65℃30s、72℃100s，38个循环；72℃5min；4℃∞。
PCR仪中运行完程序，PCR产物使用1％的琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶核酸电泳试验，电泳完观察结果。
然后利用双酶切的方式将Hr5-IE1-P10组合启动子构建到pEGFP-N1载体上，所用的酶为Xho I和Hind III，即得到能在昆虫细胞内过表达蛋白的载体，pHr5-IE1-P10载体。
实施例2：稳定表达IAP蛋白细胞系的构建：
以构建的18T-IAP以及商业化的lentiCRISPRv2 puro载体作为模板分别利用引物对N1HI10-IAP-F1、N1HI10-IAP-R1和IAPpuroR-F、IAPpuroR-R扩增出IAP基因和puro抗性基因，然后利用重叠PCR扩增出IAP-Puro基因。
PCR反应体系同实施例1步骤二，此时，样品1为IAP基因，样品2为puro基因，重叠PCR的引物为N1HI10-IAP-F1和IAPpuroR-R。
PCR反应条件同实施例1步骤二。
随后将IAP-puro基因通过sal I和BamH I酶切位点插入到实施案例1中构建的pHr5-IE1-P10载体上，通过sal I和BamH I酶切鉴定，结果如图1所示，表明已获得阳性克隆；测序正确后，获得重组质粒pHr5-IE1-P10-IAP-PURO。
将上述质粒利用insect LipoInsectTM转染试剂转染到sf9细胞后48h，加入9μg/mL的嘌呤霉素进行筛选，获得阳性的单克隆细胞后，将细胞进行扩大培养，并进行冻存。
将上述步骤获得的细胞系利用Western Blot方法鉴定IAP蛋白的表达，如图3，其中的WT为正常sf9细胞，sf9-IAP为质粒转染sf9筛选得到的改造细胞系，结果如图3所示，表明稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞系构建成功。
实施例3：表达IAP蛋白的重组杆状病毒构建
一、载体pFast-IAP，pFAST-EGFP以及pFAST-Cap3的构建
以18T-IAP为模板，使用引物对pFAST-IAP-F1、pFAST-IAP-R1进行PCR扩增，然后通过双酶切(Sal I和BamH I)的方法将IAP基因与载体pFastBac Dual进行连接并转化到DH5α感受态细胞中，涂板培养12h后利用PCR检测阳性菌落。将获得的阳性菌落进行扩大培养，利用质粒提取试剂盒抽提质粒pFast-IAP(SalI和BamH I)，结果如图2所示，表明已获得阳性克隆；送测，保留测序正确的菌液。
同上述操作一致，以pEGFP-N1载体为模板，使用引物对pFAST-EGFP-F1、pFAST-EGFP-R1以及pFAST-EGFP-F2、pFAST-EGFP-R2进行PCR扩增，然后通过的双酶切方法与载体连接，分别是利用BamH I和Sal I酶将EGFP基因插入到pFAST-Dual载体上，获得pFAST-EGFP质粒，另一个就是通过Xho I和Kpn I将EGFP基因插入到实施案例3中构建好的pFAST-IAP载体上，获得pFAST-IAP-EGFP质粒。
同上述操作一致，在NCBI上搜索猪圆环病毒3外壳蛋白的基因序列(序列号为：MZ004438，位置为1343..1987)，送去公司进行序列合成，然后使用引物对pFAST-Cap-F和pFAST-Cap-R进行PCR扩增，通过双酶切的方法将基因与载体连接，即利用BamH I和Hid III酶将Cap3基因插入到pFAST-Dual载体上，获得载体pFAST-Cap3。
二、重组杆状病毒Bac-IAP、BAC-IAP-EGFP、Bac-EGFP以及Bac-Cap3的构建
取1ng构建好的pFast-IAP质粒、pFAST-EGFP、pFAST-IAP-EGFP以及pFAST-Cap3质粒分别加入到1mL的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，轻轻吹打混匀然后冰浴30min，42℃热激活90s，然后再在冰上放置5min，加入到SOC培养基中并于37℃、220rpm的摇床中培养4h。之后，菌液按照10倍倍比稀释，并取200Ul稀释后的菌液均匀的涂布在含卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)、庆大霉素(7μg/mL)、X-Gal(100μg/mL)、IPTG(40μg/mL)的LB蓝白斑筛选平板上，37℃倒置培养48h，挑取白色菌落进行PCR鉴定，将PCR结果鉴定为阳性的菌液通过平板划线的方式进行纯化，在37℃倒置培养24h，一共纯化三次，并将第三次检测为阳性的菌液进行扩大培养并保存于-80℃，以备后续的实验。
将阳性菌液在37℃、220rpm的恒温摇床中培养12h后，取3mL菌液以12000rpm速度离心1min，弃掉上清收集沉淀。使用溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-Hcl pH 8.0、10mmol/L EDTA pH 8.0)重悬沉淀，加入溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH、1％SDS)轻轻颠倒裂解菌体，加入溶液Ⅲ(60％5mol/L乙酸钾、11.5％冰乙酸)，轻轻上下颠倒，12000rpm、4℃离心10min弃掉沉淀，将上清转移至新的EP管中，加入等量的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置20min，12000rpm、4℃离心10min弃掉上清，加入70％无水乙醇，轻轻颠倒，离心弃掉上清，并重复一次。将沉淀使用无菌风吹干，加入适量的无菌水，静置使其自然溶解，即为重组杆粒Bac-IAP，以及Bac-EGFP，Bac-IAP-EGFP，Bac-Cap3。
将SF9细胞接种在6孔板中，待细胞贴壁且汇合度达50％以上时，使用Grace昆虫细胞培养基替换原有培养基(SF900Ⅱ)。取8μL insect LipoInsectTM转染试剂加入到92μL无血清无双抗的Grace昆虫细胞培养基中，轻轻混匀，得到稀释后的转染试剂。另将实施例3中的重组杆粒Bac-IAP、Bac-EGFP、Bac-IAP-EGFP以及Bac-Cap3各3μg分别加入到97μL无血清无双抗的Grace昆虫细胞培养基中，轻轻混匀，得到稀释的重组杆粒。将稀释的重组杆粒加入到稀释后的转染试剂中，混合均匀，室温孵育20min，将得到的混合物均匀的滴加到6孔板中，每孔200μL。4h后弃掉转染混合物，换为添加有青霉素(0.1mg/mL)、链霉素(0.1mg/mL)、10％(V:V)FBS的SF900Ⅱ完全培养基。27℃继续培养，持续观察直至出现病毒感染征象。待细胞出现脱落或裂解时，收集培养上清，4000rpm、4℃离心5min去掉上清中的大分子物质，使用0.22μm滤器过滤，滤出液即为第一代重组杆状病毒rBV-IAP，rBV-IAP-EGFP，rBV-EGFP以及rBV-Cap3重组杆状病毒，盲传至第三代。收取第三代感染的sf9细胞，利用免疫印迹法检测IAP蛋白是否表达，结果如图4所示，其中的WT组为正常sf9细胞裂解的样品，pFast-IAP组为质粒转染正常sf9细胞后收集裂解的蛋白样本。从图4的结果可看出，杆状病毒的IAP蛋白成功表达，将结果为阳性的病毒液放置在-80℃保存。
实施例4：杆状病毒的增殖和蛋白表达比较
分别将实施例2中构建的稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞与野生型正常的sf9细胞以1×106个细胞/孔铺于6孔板中，于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，12h后野生型正常组sf9细胞分别接种rBV-IAP-EGFP和rBV-EGFP病毒，而稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞组接种rBV-EGFP病毒，接种剂量都为107TCID50/mL。在感染后不同时间点收集样品，测定样品中杆状病毒的TCID50效价，结果如图5，图5中的control代表野生型正常的sf9细胞接种正常病毒rBV-EGFP，sf9IAP代表稳定过表达IAP的sf9细胞接种rBV-EGFP病毒，BAC-IAP代表野生型正常的sf9细胞接种过表达IAP蛋白的病毒rBV-IAP-EGFP，可见，过表达IAP蛋白在120h～144h时显著促进病毒的复制。
之后，将实施例2中构建的稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞与野生型正常的sf9细胞再次以1×106个细胞/孔铺于6孔板中，于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，12h后野生型正常组sf9细胞分别接种rBV-IAP-EGFP、rBV-EGFP以及rBV-Cap3病毒，而稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞组分别接种rBV-EGFP以及rBV-Cap3病毒，接种剂量都为107TCID50/mL。然后在同一时间点收集样品(72h)，利用WB检测样品中外源蛋白的表达情况。图6表示外源蛋白EGFP的表达情况，其中，WT组为野生型正常组sf9细胞接种rBV-EGFP病毒，sf9-IAP组为稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞接种rBV-EGFP病毒，rBV-IAP-EGFP组为野生型正常组sf9细胞接种rBV-IAP-EGFP的毒。图6的结果表明，同WT组相比，过表达IAP蛋白能显著促进EGFP蛋白的表达量。图7表示外源蛋白Cap3蛋白的表达情况，其中，WT组为野生型正常组sf9细胞接种rBV-Cap3病毒，sf9-IAP组为稳定过表达IAP蛋白的sf9细胞接种rBV-Cap3病毒。图7的结果表明同WT组相比，过表达IAP蛋白能显著促进Cap3蛋白的表达量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于包括方式I或方式II：
方式I的步骤如下：
(1)构建过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞；
(2)将杆状病毒感染步骤(1)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞，培养，繁殖杆状病毒；
方式2的步骤如下：
(3)构建过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞；
(4)构建能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒；
(5)将步骤(4)得到的能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒感染步骤(3)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞，培养，繁殖杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
步骤(1)和步骤(3)中所述的过表达凋亡抑制蛋白的昆虫细胞通过如下步骤得到：将含有凋亡抑制蛋白编码核酸的DNA片段转入昆虫宿主细胞得到。
3.根据权利要求2所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
所述的凋亡抑制蛋白编码核酸的序列如XM_035602447.2所示；
所述的昆虫宿主细胞为sf9细胞。
4.根据权利要求2所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
所述的DNA片段还含有强启动子和载体框架。
5.根据权利要求4所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
所述的强启动子为为IE1启动子、P10启动子或Hr5-IE1-p10组成型启动子；
所述的Hr5-IE1-p10组成型启动子是杆状病毒的Hr5基因增强子、IE1启动子和p10启动子依次连接得到；
所述的载体框架为含有能表达EGFP的真核表达载体。
6.根据权利要求5所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
所述的Hr5基因增强子的序列如NC_001623.1第118044～111326所示；
所述的IE1启动子的序列如NC_001623.1第127684～128276所示；
所述的p10启动子的序列如NC_001623.1第119926～120035所示；
所述的载体框架为pEGFP-N1。
7.根据权利要求1所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒是将凋亡抑制蛋白编码核酸克隆入杆状病毒得到。
8.根据权利要求7所述的促进杆状病毒增殖的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒通过如下步骤得到：将凋亡抑制蛋白编码核酸克隆在杆状病毒穿梭质粒上，再将得到的质粒转入大肠杆菌DH10Bac中进行筛选，得到重组杆粒；将将重组杆粒转入昆虫宿主细胞中，得到能表达凋亡抑制蛋白的杆状病毒。
9.权利要求1～8任一项所述的促进杆状病毒增殖的方法在促进杆状病毒增殖或外源蛋白表达中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的外源蛋白为亚单位疫苗或者蛋白药物。
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