CN116121304A - 一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，包括：引物设计与合成；重组表达质粒pVL1393‑G的构建；可视化绿色荧光重组杆状病毒的制备。本发明可以通过一步转染法即获得大量抗原性、免疫原性较好的可视化绿色荧光重组杆状病毒表达的糖蛋白，适用于乌鳢水泡病毒糖蛋白的高效表达及DNA疫苗制备。

Description

一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法
技术领域
本发明涉及水产病原微生物防控领域，更具体地，涉及一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法。
背景技术
乌鳢水泡病毒属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)，Perhabdovirus属，能够感染多种鳢科鱼类，引起鱼类患病与急性死亡，给鳢科鱼类养殖业造成了巨大的经济损失。但是目前对于该病毒的研究十分有限，对其引起的疾病还未有有效的药物及疫苗能够对症治疗，也没有相关的防控措施。因此，我们非常有必要建立一种有效表达该病毒抗原蛋白的方法，为乌鳢水泡病毒样颗粒疫苗的制备奠定基础。
在各种蛋白表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，但原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。而杆状病毒表达体系用杆状病毒做载体，可高效表达外源基因，其主要特点是可以获得大量抗原性、免疫原性较好的与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白。重组杆状病毒感染昆虫细胞后，可以对外源蛋白进行许多真核细胞的转录后加工作用，包括糖基化、磷酸化、酰基化、正确的信号肽切割、蛋白水解以及适当的折叠作用，而且还可将重组蛋白聚集定位于天然蛋白的同一细胞器上，还能进行适当的寡聚化装配，是表达有生物活性的蛋白质的理想载体。但目前杆状病毒表达外源蛋白时常用的是Bac-to-bac杆状病毒表达系统，需要先将重组质粒转化DH10Bac菌株中，制备重组穿梭质粒，再将穿梭质粒提取出来转化昆虫细胞，制备重组杆状病毒。该方法操作繁琐，需要外源细菌的参与，重组病毒制备周期长。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，解决目前缺乏可视化的杆状病毒表达乌鳢病毒糖蛋白方法的问题，提供一种表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，该重组杆状病毒的构建不需要先在外源细菌中制备重组杆粒，而是直接在昆虫Sf9细胞内通过一步转染获得重组杆状病毒，并且该重组杆状病毒能特异性高效表达乌鳢水泡病毒糖蛋白，而且所表达的蛋白通过紫外线照射即发荧光肉眼可鉴定，无需通过传统的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳检测。
为解决上述技术问题，本发明提供一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，包括：
设计并合成引物F、R，所述引物F、R的核苷酸序列为SEQ ID NO：1(TGGATCCATGTACCCACTGTTTGTTCC)和SEQ ID NO：2(CATGAATTCCTAGTGATGGTGGTGATGATGAGTTCCCACCCACTCA)；
以乌鳢水泡病毒基因组为模板，以F、R为引物扩增糖蛋白基因；
采用双酶切法酶切pVL1393载体和糖蛋白基因，回收纯化后用T4DNA连接酶连接再转化至感受态细胞，涂布筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后提取质粒再进行鉴定，得到重组质粒pVL1393-G；
利用TransITinsectreagent转染试剂将重组质粒pVL1393-G与杆状病毒DNAProGreen baculovirusDNA转入sf9昆虫细胞；
将sf9细胞均匀铺入6孔板，每孔加入15μLProGreenbaculovirusDNA，1.5μg的转移质粒，250μL的Grace’s培养基及10μL的转染试剂TransITinsectreagent，混匀后室温静置30min；将该混合物加入6孔板中，在27℃培养5天，离心后收获感染细胞，洗涤后反复冻融收获上清，得到融合了绿色荧光蛋白GFP的乌鳢水泡病毒重组糖蛋白。
优选地，所述糖蛋白基因的扩增程序为：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。
优选地，所述糖蛋白基因的扩增体系为：cDNA模板×1μL、引物GF×1μL、引物GR×1μL、PremixTaq×10μL、ddH2O×7μL，总量20μL。
优选地，所述酶切采用BamHI和EcoRI限制性内切酶限制性内切酶，酶切的载体为pVL1393载体。
优选地，所述融合了绿色荧光蛋白GFP的乌鳢水泡病毒糖蛋白的检测方法为：直接通过紫外线照射，看是否发绿色荧光；或者在乌鳢水泡病毒糖蛋白添加His标签，以His标签抗体为一抗，以IgG为二抗，化学发光法检测。
本发明所达到的有益效果：
(1)本发明选用杆状病毒表达系统，不需要先将重组质粒转化DH10Bac菌株中，制备重组穿梭质粒，再将穿梭质粒提取出来转化昆虫细胞，而是直接通过一步转染法获得重组杆状病毒，诱导目的基因高效表达；且所制备的重组杆状病毒带有绿色荧光蛋白GFP，可以直接在紫外线照射下肉眼观察鉴定，不需要通过SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)相比于原核表达系统，该系统表达的蛋白能够形成二硫键和糖基化、磷酸化等从而产生与天然蛋白结构相似的重组蛋白。本发明通过克隆乌鳢水泡病毒的G蛋白基因，构建重组载体pVL1393-G再利用带有绿色荧光蛋白GFP的杆状病毒DNA在Sf9昆虫细胞中成功表达融合了绿色荧光蛋白GFP的乌鳢水泡病毒重组G蛋白，为以后乌鳢水泡病毒疫苗的研发建立基础。
附图说明
图1为ProGreenbaculovirusDNA结构模式图。
图2为表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化绿色荧光重组杆状病毒感染sf9细胞病变图。
图3为可视化绿色荧光重组杆状病毒表达乌鳢水泡病毒重组糖蛋白WesternBlot鉴定分析：1：蛋白质分子质量标准；2：阴性对照；3：ProGreenbaculovirusDNA重组病毒表达蛋白。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实验材料及试剂：TransITinsectreagent转染试剂、ProGreenbaculovirusDNA购于Mirus公司。限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝日医生物技术(北京)有限公司)；pfuDNA聚合酶(南京钟鼎生物技术有限公司)；细菌LB培养基(青岛海博生物技术有限公司)；琼脂糖(上海基因公司)；DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(爱思进生物技术有限公司)；DNA胶回收试剂盒、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)(南京三舒生物科技有限公司)；其他试剂均为国产分析纯。
实施例1：一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法
1、引物设计与合成
根据已发表的乌鳢水泡病毒基因的序列设计引物。其中G基因5’的信号肽和3’的疏水区被去除后设计引物。
上游引物F：ATGGATCCATGTACCCACTGTTTGTTCC(SEQ ID NO：1)，
下游引物R：CATGAATTCCTAGTGATGGTGGTGATGATGAGTTCCCACCCACTCA(SEQ ID NO：2)。
引物均由南京擎科生物技术有限公司合成。
2、目的基因的扩增与纯化
以乌鳢水泡病毒基因组为模板，以F、R为引物扩增糖蛋白基因(Ggene)，扩增反应体系参照试剂盒说明书，扩增反应体系为：cDNA模板×1μL、引物F×1μL、引物R×1μL、PremixTaq×10μL、ddH2O×7μL，总量20μL。反应程序扩增：95℃5min，95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃延伸5min。用1％琼脂糖电泳检测PCR产物，胶回收PCR产物后4℃保存。
3、重组质粒pVL1393-G的构建
分别用BamHI和EcoRI限制性内切酶双酶切pVL1393载体和G基因，回收纯化后用T4DNA连接酶连接，再转化至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布含AMP(100mg/mL)的平板，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行酶切鉴定及测序，将鉴定正确的重组质粒命名为pVL1393-G。
实验结果：扩增出乌鳢水泡病毒糖蛋白去除部分区域后，经常规DNA酶切和连接，将G插入到pVL1393载体中，通过测序，表明成功构建了pVL1393-G重组质粒。
4、重组杆状病毒的制备
利用TransITinsectreagent转染试剂将重组质粒pVL1393-G与杆状病毒DNAProGreen baculovirusDNA(图1)转入sf9昆虫细胞；将sf9细胞均匀铺入6孔板，每孔加入15μL杆状病毒DNAProGreenbaculovirusDNA，1.5μg的转移质粒，250μL的Grace’s培养基及10μL的TransITinsectreagent，混匀后室温静置30min；将混合物加入6孔板中，在27℃培养5天。
实验结果：在无血清条件下，用转染试剂TransITinsectreagent介导转染对数生长期的Sf9细胞单层，逐日观察发现，在转染5天后离心后收获感染细胞(图2)，洗涤后反复冻融收获上清，低速离心去除细胞及碎片即可获得表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化绿色荧光重组杆状病毒。
5、目的蛋白的Westernblot检测
将上述表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化绿色荧光重组杆状病毒感染正常Sf9细胞，5天后3000r·min-1离心10min收获感染细胞，PBS离心洗涤，按培养液10％体积加入PBS悬起细胞，反复冻融3次，离心后收获上清，制备成细胞裂解抗原液进行SDS-PAGE电泳，并电转印至PVDF膜，封闭液室温2h；在乌鳢水泡病毒糖蛋白添加His标签抗体为一抗，4℃培养过夜；以IgG(1:200倍稀释)为二抗，室温孵育1h，PBS洗涤三次，ECL(化学发光法)检测。
实验结果：对感染乌鳢水泡病毒糖蛋白的重组杆状病毒5天的Sf9细胞超声破碎后进行Western-blot鉴定，以正常细胞为对照。Western-blot结果(图3)显示在50kDa处有一条特异性条带，而对照组则无，表明重组蛋白成功获得表达。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，其特征是，包括：
设计并合成引物F、R，所述引物F、R的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
以乌鳢水泡病毒基因组为模板，以F、R为引物扩增糖蛋白基因；
采用双酶切法酶切pVL1393载体和糖蛋白基因，回收纯化后用T4 DNA连接酶连接再转化至感受态细胞，涂布筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后提取质粒再进行鉴定，得到重组质粒pVL1393-G；
将测序正确的重组质粒转化至感受态细胞，涂布进行抗生素筛选，纯化后经PCR及测序鉴定，得到重组质粒；
将转染试剂TransIT insect reagent、杆状病毒DNAProGreenbaculovirus DNA、Grace’s培养基混合物转染Sf9昆虫细胞；将该混合物加入铺有Sf9细胞的6孔板中，在27℃培养5天，离心后收获感染细胞，洗涤后反复冻融收获上清，得到一种表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化绿色荧光重组杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，其特征是，选择的表达载体为pVL1393载体，所述酶切采用BamH I和EcoRI限制性内切酶。
3.根据权利要求1所述的一种表达乌鳢病毒糖蛋白的可视化重组杆状病毒构建方法，其特征是，将sf9细胞均匀铺入6孔板，每孔加入15μL ProGreen baculovirus DNA，1.5μg的转移质粒，250μL的Grace’s培养基及10μL的TransIT insect reagent，混匀后室温静置30min；将混合物加入6孔板中，在27℃培养5天，离心后收获感染细胞，洗涤后反复冻融收获上清，得到表达乌鳢水泡病毒糖蛋白的可视化绿色荧光重组杆状病毒。
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