CN115948471A - 一种h5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程及疫苗制备技术领域，公开了一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法。所述制备方法为：将H5亚型AIV的HA蛋白序列中的血凝素信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列，并设计酶切位点，得到目的基因HA；通过双酶切将目的基因HA和M1蛋白序列分别克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1‑dual，再转化至DH5α感受态细胞，得到重组质粒，然后加入到DH10Bac感受态细胞中培养，提取得到重组杆粒Bacmid‑HA‑M1，最后转染至SF9昆虫细胞进行VLPs表达制备。本发明方法表达的病毒样颗粒与天然AIV病毒粒子相类似，并能显著提升目的蛋白在细胞培养上清中的表达量。

Description

一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法

技术领域

本发明属于生物工程及疫苗制备技术领域，具体涉及一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法。

背景技术

H5亚型禽流感病毒(H5subtypeAvianInfluenzaVirus，H5subtypeAIV)是一种重要的禽类动物疫病病原，以高发病率、高致死率、传播速度快、病毒变异快为主要特点。目前我国针对H5亚型AIV的防控主要依赖灭活疫苗免疫，但由于H5亚型AIV疫苗的生产还需要生物安全3级车间，增加了兽用疫苗生产企业的生产成本及投入。并且传统鸡胚生产的AIV病毒液含有大量杂蛋白，不利于病毒的进一步浓缩和纯化。探索AIV新型亚单位疫苗的生产制备方法，具有良好的应用前景。

病毒样颗粒(Virus-likeparticles,VLPs)由病毒一种或几种结构蛋白自组装成类似于病毒天然结构的蛋白质病毒粒子，具有较强的免疫原性和生物学活性，且不携带病原微生物的遗传物质。相比传统疫苗，VLPs疫苗具有安全性、可同时刺激机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答等优势，是一种相当具有潜力的疫苗研发策略。目前已报道至少有五种表达系统可成功用于表达VLPs，如大肠杆菌系统、真核酵母系统、杆状病毒-昆虫细胞系统、哺乳动物细胞系统和植物表达系统等。但各种表达系统的优势和缺点也很明显，大肠杆菌系统表达的蛋白不能形成正确的三维构象；哺乳动物细胞表达平台表达的蛋白具有与天然蛋白类似的结构，但表达成本较高；杆状病毒-昆虫细胞表达系统较成熟，具有一定的蛋白翻译后修饰过程，且昆虫细胞可无血清大规模悬浮培养，优势明显。

专利CN110240634A及CN113461786A均公开了一种禽流感病毒样颗粒抗原，由H5亚型禽流感病毒HA、NA、M1抗原组装而成。其制备方法包括：将所述HA、NA、M1抗原蛋白基因克隆到同一载体，然后将所获得的载体经转化重组获得含有所述HA、NA、M1抗原蛋白基因的重组杆状病毒质粒，然后转染昆虫细胞sf9，串联表达所述HA、NA、M1抗原蛋白；以及分离在昆虫细胞内自我组装完成后释放到细胞外培养基上清中的由所述HA、NA、M1抗原蛋白组装而成的禽流感病毒样颗粒抗原。上述专利技术均需对相应的蛋白基因进行特定的高效表达序列优化，以提升其在上清液中的表达。

发明内容

针对H5亚型禽流感病毒VLPs在细胞培养上清中目的蛋白表达量低的问题，本发明的目的在于提供一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法。本发明方法通过拯救一株同时表达H5亚型AIVHA蛋白和M1蛋白的重组杆状病毒，在昆虫细胞中实现蛋白自组装，形成具有与天然AIV病毒粒子相类似的病毒样颗粒，并将目的蛋白在细胞培养上清中的表达量从0％提升至50％。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，包括如下制备步骤：

(1)目的基因设计与合成：在H5亚型禽流感病毒的HA蛋白序列(MK554842)的起始密码子之前设计Kozac序列和BamHI酶切位点，并将HA的血凝素信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列(SEQ ID NO：1：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)，在肽链C端设计6×His组氨酸标签和HindIII酶切位点，得到目的基因HA(SEQ ID NO：2)；

(2)杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M1的构建：使用BamHI和HindIII双酶切，将目的基因HA和M1蛋白序列(SEQ ID NO：3)分别克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1-dual，然后转化至DH5α感受态细胞中，鉴定正确的质粒命名为pFastBac-HA-M1；

(3)重组杆状病毒Bacmid-HA-M1的拯救：将杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M1加入到DH10Bac感受态细胞中培养，提取得到重组杆粒Bacmid-HA-M1；

(4)病毒样颗粒的表达制备：将重组杆粒Bacmid-HA-M1转染至SF9昆虫细胞进行VLPs表达制备。

进一步地，步骤(3)中所述培养步骤为：向刚化冻的DH10Bac感受态细胞中加入杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M110ng，于冰上静置30min后，置于42℃水浴锅热击90s，之后向感受态细胞加入900μL不含抗生素的SOC培养基，并置于37℃摇床振荡培养4h，取50μL菌液涂布于抗性LB平板中，37℃温箱培养20h。

进一步优选地，所述抗性LB平板中含卡那霉素50μg/mL、四环素10μg/mL、庆大霉素7μg/mL、IPTG125μg/mL、X-gal100μg/mL。

进一步地，步骤(3)中所述提取步骤为：根据BAC/PACDNA小量提取试剂盒(D2156)说明书抽提重组HA基因的杆状病毒杆粒Bacmid-HA-M1，检测核酸浓度后置于-20冰箱保存备用。

进一步地，步骤(4)中所述转染至SF9昆虫细胞进行VLPs表达制备的具体步骤为：将处于对数生长期的SF9昆虫细胞以1×10⁶个细胞每孔的密度传至6孔细胞培养板，置于27℃温箱培养12h，取3μg的杆粒Bacmid-HA-M1，以脂质体转染的方式将杆粒转染到SF9细胞，转染后培养至96h，细胞经冻融3次后离心取上清，并在SF9细胞中连续盲传3代，直至产生SF9细胞病变。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明方法在不需要生物安全3级实验室条件下，即可制备禽流感病毒VLPs，表达制备的VLPs具有与天然病毒粒子相类似的生物活性。

(2)相比禽流感病毒自身HA蛋白的血凝素信号肽，本发明使用的昆虫细胞蜂毒信号肽可将目的蛋白在细胞培养上清中的表达量从0％提升至50％，HA效价为7log2。

附图说明

图1为本发明实施例中westernblots鉴定HA蛋白表达的结果图；

图2为本发明实施例中westernblots鉴定HA信号肽替换前后HA蛋白的表达情况对比图；

图3为实施例中表达的病毒样颗粒的透射电镜图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、目的基因设计与合成

从NCBI网站上下载H5亚型禽流感病毒中国流行株A/duck/China/1033/2017(H5N1)的HA蛋白序列(MK554842)和M1蛋白序列(MK554845)，在HA基因的起始密码子之前设计Kozac序列和BamHI酶切位点，并将HA的血凝素信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列(SEQID NO：1：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA)，在肽链C端设计6×His组氨酸标签和HindIII酶切位点，基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和合成。所得替换后目的基因HA的基因序列如SEQ ID NO：2所示。

2、杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M1的构建

使用BamHI和HindIII双酶切，将目的基因HA和M1(SEQ ID NO：3)分别克隆至杆状病毒穿梭质粒中pFastBac1-dual，转化至DH5α感受态细胞中，PCR鉴定正确的单菌落送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证，序列完全没有突变的质粒命名为pFastBac-HA-M1。

3、重组杆状病毒Bacmid-HA-M1的拯救

根据说明书构建重组杆状病毒质粒Bacmid-HA-M1，向刚化冻的DH10Bac感受态细胞中加入杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M110ng，于冰上静置30min后，置于42℃水浴锅热击90s，之后向感受态细胞加入900μLSOC培养基(不含抗生素)，并置于37℃摇床振荡培养4h，取50μL菌液涂布于抗性LB平板中。平板中含卡那霉素50μg/mL、四环素10μg/mL、庆大霉素7μg/mL、IPTG125μg/mL、X-gal100μg/mL，37℃温箱培养20h后挑选白色单菌落进行PCR鉴定。根据BAC/PACDNA小量提取试剂盒(D2156)说明书抽提重组HA基因的杆状病毒杆粒Bacmid-HA-M1，检测核酸浓度后置于-20冰箱保存备用。

4、VLPs表达制备

将处于对数生长期的SF9昆虫细胞以1×10⁶个细胞每孔的密度传至6孔细胞培养板，置于27℃温箱培养12h，取3μg的杆粒Bacmid-HA-M1，以脂质体转染的方式将杆粒转染到SF9细胞，转染后培养至96h，细胞经冻融3次后离心取上清，并在SF9细胞中连续盲传3代，直至产生SF9细胞变大、漂浮、脱落等明显细胞病变。

5、重组蛋白的表达鉴定

收集接种杆状病毒病毒液72h的SF9细胞培养上清和细胞总蛋白，通过westernblots试验检测HA蛋白的表达情况。经12％SDS-PAGE电泳、NC膜转印、5％脱脂牛奶封闭后，分别以anti-His鼠源单抗(1:1000稀释)和H5亚型阳性血清(1:250稀释)为一抗，羊抗鼠酶标二抗(1:10000稀释)和兔抗鸡酶标二抗(1:10000稀释)孵育NC膜，最后以化学发光的方法进行成像。结果如图1所示(其中A为His标签抗体检测结果，B为H5亚型阳性血清检测结果；M：蛋白分子量标准；1：His标签抗体检测HA蛋白(65.2ku)；2：H5阳性血清检测P5代重组杆状病毒的HA蛋白(65.2ku)和M1蛋白(27.6ku)；3：H5阳性血清检测P10代重组杆状病毒的HA蛋白(65.2ku)和M1蛋白(27.6ku))，由图1结果可见，用His标签抗体和H5亚型阳性血清均能孵出特异性结合条带。通过westernblots试验分别检测HA信号肽替换前后HA蛋白的表达情况，结果如图2所示(其中A为替换前的表达情况，B为替换后的表达情况；1、血凝素信号肽全细胞蛋白；2、血凝素信号肽细胞培养沉淀；3、血凝素信号肽细胞培养上清；4、蜂毒信号肽全细胞蛋白；5、蜂毒信号肽细胞培养沉淀；6、蜂毒信号肽细胞培养上清)。由图2结果可见，替换信号肽之后，可将目的蛋白在细胞培养上清中的表达量从0％提升至50％，细胞培养上清检测到HA效价为7log2。

6、病毒样颗粒的观察

收集接种杆状病毒病毒液72h的SF9细胞总蛋白，冻融3次后离心取上清，进行负染和透射电镜观察病毒粒子形态。结果如图3所示，由图3结果可见，构建的重组杆状病毒可在SF9细胞内组装成与天然病毒粒子大小形态相类似的病毒粒子。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

(1)目的基因设计与合成：在H5亚型禽流感病毒的HA蛋白序列的起始密码子之前设计Kozac序列和BamHI酶切位点，并将HA的血凝素信号肽序列替换成蜂毒素信号肽序列，在肽链C端设计6×His组氨酸标签和HindIII酶切位点，得到目的基因HA；

(2)杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M1的构建：使用BamHI和HindIII双酶切，将目的基因HA和M1蛋白序列分别克隆至杆状病毒穿梭质粒pFastBac1-dual，然后转化至DH5α感受态细胞中，鉴定正确的质粒命名为pFastBac-HA-M1；

(3)重组杆状病毒Bacmid-HA-M1的拯救：将杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M1加入到DH10Bac感受态细胞中培养，提取得到重组杆粒Bacmid-HA-M1；

(4)病毒样颗粒的表达制备：将重组杆粒Bacmid-HA-M1转染至SF9昆虫细胞进行VLPs表达制备。

2.根据权利要求1所述的一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养步骤为：向刚化冻的DH10Bac感受态细胞中加入杆状病毒供体质粒pFastBac-HA-M110ng，于冰上静置30min后，置于42℃水浴锅热击90s，之后向感受态细胞加入900μL不含抗生素的SOC培养基，并置于37℃摇床振荡培养4h，取50μL菌液涂布于抗性LB平板中，37℃温箱培养20h。

3.根据权利要求2所述的一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，其特征在于，所述抗性LB平板中含卡那霉素50μg/mL、四环素10μg/mL、庆大霉素7μg/mL、IPTG125μg/mL、X-gal 100μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述提取步骤为：根据BAC/PAC DNA小量提取试剂盒D2156说明书抽提重组HA基因的杆状病毒杆粒Bacmid-HA-M1，检测核酸浓度后置于-20冰箱保存备用。

5.根据权利要求1所述的一种H5亚型禽流感病毒病毒样颗粒的表达制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转染至SF9昆虫细胞进行VLPs表达制备的具体步骤为：将处于对数生长期的SF9昆虫细胞以1×10⁶个细胞每孔的密度传至6孔细胞培养板，置于27℃温箱培养12h，取3μg的杆粒Bacmid-HA-M1，以脂质体转染的方式将杆粒转染到SF9细胞，转染后培养至96h，细胞经冻融3次后离心取上清，并在SF9细胞中连续盲传3代，直至产生SF9细胞病变。

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