CN115197948A - 一种重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap、其基因组、制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种重组的新城疫病毒基因组、包含该基因组的重组新城疫病毒rNDV‑VEGF‑Trap及其制备方法、编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子以及它们在制备用于治疗癌症的药物中的用途。本申请所述的重组新城疫病毒涉及将VEGF‑Trap的编码基因插入其基因组中，由此得到的重组新城疫病毒以较强的复制能力进行复制从而杀死宿主癌细胞，同时对非癌细胞具有可靠的安全性，并且表现出提高的抗肿瘤作用和溶瘤效率。

Description

一种重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap、其基因组、制备方法及 其用途
技术领域
本申请属于癌症治疗用溶瘤病毒领域，具体而言，涉及一种重组的新城疫病毒基因组、包含该基因组的重组新城疫病毒及其制备方法、编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子以及它们的用途。
背景技术
癌症是由于机体细胞失去正常调控、过度增殖而引起的疾病，目前已成为影响健康的第一杀手。我国是癌症尤其是肺癌、胃癌、肝癌及直肠癌高发区。据统计，仅2016年一年全国新增各类癌症患者480万例，230万病人死于各种癌症。随着技术进步，各种新的治疗手段尤其是生物药物治疗不断投入临床使用。但药物的安全性、有效性及病人的生活质量等方面的需求远未得以满足。发展新药或治疗手段势在必行。
1991年，Martuza等人在《Science》杂志发表文章，证明转基因单纯疱疹病毒在恶性胶质瘤治疗中有一定的效果。至此以后，发展溶瘤病毒治疗癌症就日益受到关注。溶瘤病毒治疗癌症的原理是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造，让其选择性地感染肿瘤细胞、在细胞内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。同时它还能激发免疫反应，吸引免疫细胞来继续杀死残余癌细胞或通过免疫反应杀灭已迁移的癌细胞。近几十年来，溶瘤病毒相关研究取得了巨大进展。人们先后用新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、1型单纯疱疹病毒(HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、溶瘤腺病毒(oncolyticadenovirus)来开发溶瘤病毒，但临床表现都远低于预期。例如，2005年CFDA批准了溶瘤腺病毒产品H101上市，然而其治疗效果并不理想。
NDV是一种具有负义单链RNA基因组的禽副粘病毒，它一直是癌症治疗的有希望的方法。但NDV作为单一药物治疗的效果有限，一方面，人体抗病毒免疫反应能够清除病毒，另一方面，人体能够产生中和抗体来抵抗病毒发挥作用。为了提高NDV在癌症中的治疗效率，这些病毒随后用来传递具有抗肿瘤活性的基因，以进一步增强活性。这样的基因包括编码细胞因子或其受体、免疫检查点分子、肿瘤抑制蛋白或免疫刺激蛋白的基因。
此前，本领域已对在其基因组中整合有编码细胞因子或其受体的基因的重组新城疫病毒进行了众多研究，但仍未取得临床上有益的进展。例如，Pascal Buijs等(Recombinant Immunomodulating Lentogenic or Mesogenic Oncolytic NewcastleDisease Virus for Treatment ofPancreatic Adenocarcinoma，Viruses 2015，7，2980-2998)研究了表达干扰素或干扰素拮抗蛋白的重组新城疫病毒。
研究表明血管生成是肿瘤治疗的重要靶标。血管生成是从现有的内皮细胞中生成新的血管，进而向各种器官提供充足氧气和营养的过程，其对于肿瘤的生长和转移至关重要，抗血管生成疗法是癌症治疗的重要方法之一。在肿瘤新生血管形成过程中，支持肿瘤生长的促血管生成因子主要有：血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、血管生成蛋白(angiogenin)和转化生长因子-β(TGF-β)等，这些因子通过与相应的受体结合，激活下游信号通路，从而调控肿瘤新血管的生成。
大多数抗血管生成药物是靶向作用于促血管生长因子及其受体，或下游信号通路中的关键分子，通过阻断肿瘤的营养供应，从而抑制肿瘤的生长和转移。现有获FDA批准上市的抗血管生成药物主要包括大分子单抗药物和小分子靶向抑制剂。其中，抗血管生成因子主要有血小板应答蛋白-1(TSP-1)、血管抑素(angiostain)、内皮抑素(endostain)以及干扰素-α(IFN-α)等，以及VEGF阻断/拮抗剂如VEGF-Trap(通过将VEGFR的Ig结构域与IgG分子的恒定区融合得到)，这些抑制剂可直接抑制血管内皮细胞的增殖与迁移活性，从而抑制血管生成，并阻断肿瘤的生长与转移，能够在癌症治疗中表现出有益的效果。然而，抗血管生成药物的治疗副作用较大。
针对现有技术中存在的NDV作为单一药物的治疗效果有限、响应率以及肿瘤抑制率较小等限制溶瘤病毒的临床应用的问题，对于可以提高抗肿瘤效果、降低副作用的表达抗肿瘤活性的外源蛋白的重组NDV目前仍需要进行深入的研究。
发明内容
本申请的发明人通过将Angiostatin、VEGF-Trap的编码基因分别整合入新城疫病毒基因组的特定位置，提供一种相应的重组溶瘤病毒，经药效试验验证，发现rNDV-VEGF-Trap的抗肿瘤效果显著高于rNDV组和rNDV-Angiostatin组，其可以在癌细胞中以较强的复制能力进行复制从而杀死宿主癌细胞，同时对非癌细胞具有可靠的安全性，由此解决上述技术问题。
一方面，本申请提供了一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF-Trap的编码基因，所述VEGF-Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。
另一方面，本申请提供了一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含上述的重组的新城疫病毒基因组。
又一方面，本申请提供了一种编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子。
又一方面，本申请提供了一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒和/或DNA分子。
又一方面，本申请提供了一种制备上述重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：
(1)将含有VEGF-Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF-Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；
(2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。
又一方面，本申请提供了上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒、DNA分子和/或药物组合物在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途。
通过将VEGF-Trap的编码基因整合入新城疫病毒基因组的特定位置，能够显著提高所得到的重组溶瘤病毒的抗肿瘤作用和溶瘤效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请示例性的技术方案，下面将对附图进行简单介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的示例性方案，因此不应被看作是对保护范围的限定。
图1示出了实施例1中的尿囊液的Western Blot检测结果，其中，实施例1制备的重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap能够稳定表达外源基因VEGF-Trap。
图2示出了接种于DF-1细胞中的各重组新城疫病毒和亲本病毒的增殖曲线。
图3示出了阴性对照组以及各重组新城疫病毒和亲本病毒处理组的小鼠中的肿瘤生长曲线。
图4示出了阴性对照组以及各重组新城疫病毒和亲本病毒处理组的小鼠的肿瘤抑制结果。
图5是示出了阴性对照组以及各重组新城疫病毒和亲本病毒处理组的小鼠中的肿瘤的照片。
图6示出了阴性对照组以及各重组新城疫病毒和亲本病毒处理组的HE染色结果，其中，阴性对照组小鼠的肿瘤组织结构致密，细胞形态完好，生长旺盛；rNDV组小鼠的肿瘤病灶解体，肿瘤细胞结构较为松散；rNDV-Angiostatin组小鼠的肿瘤结构与rNDV组无明显差异，而rNDV-VEGF-Trap组小鼠的肿瘤组织病灶大量解体，肿瘤细胞结构非常松散，免疫细胞多处浸润，肿瘤细胞呈单个分散。
图7示出了免疫组织化学染色结果，其中，阴性对照组小鼠的CD34表达量丰富，rNDV组与阴性对照组类似，而rNDV-VEGF-Trap组小鼠的CD34表达量明显减少。
图8示出了rClone30-Anh-(F)治疗组、rClone30-Anh-(F)-Angiostatin治疗组和rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap治疗组对小鼠肝癌模型肿瘤生长的抑制情况。
图9示出了实施例1制备的重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap的基因组序列。
图10示出了实施例5制备的重组新城疫病毒rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap的基因组序列。
具体实施方式
在下文中对本发明的示例的实施方式进行描述，但是本发明的保护范围不限于此。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY1989)。
在本文中，除非另有说明，术语“治疗”是指以统计学显著的方式治愈、减轻、缓解、减缓、缓和或改进疾病或疾病相关的症状，或者预防、延缓、阻止、中止或停止疾病或相关的症状的发作或进一步发展。
新城疫病毒(NDV)属于单分子负链RNA病毒目的副黏病毒科，具有包膜；核衣壳位于包膜内，含有RNA基因组和核衣壳蛋白。经典的新城疫病毒的基因组全长为约15～16kb，从3’端到5’端依次包含NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，分别用于编码如下6种主要蛋白：核衣壳蛋白(Nucleocapsid Protein，NP)、磷酸化蛋白(Phosphate Protein，P)、基质蛋白(Matrix Protein，M)、融合蛋白(Fusion Protein，F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(Haemagglutinin Neuraminidase Protein，HN)和RNA依赖的RNA聚合酶(LargeProtein，L)。
在一个实施方式中，本申请涉及一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF-Trap的编码基因，所述VEGF-Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。
在一些优选的实施方式中，所述VEGF-Trap的编码基因可处于DNA或RNA的形式。
在一些优选的实施方式中，所述VEGF-Trap的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列或与其具有至少80％(例如80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同一性的序列。
在一些优选的实施方式中，所述重组的新城疫病毒基因组的序列以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5示出(见图9和图10)。
在一个实施方式中，本申请涉及一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含上述的重组的新城疫病毒基因组。
在一些优选的实施方式中，所述新城疫病毒的出发毒株可选自但不限于：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ；以及基于所述出发毒株以基因工程手段构建的任意的嵌合毒株，但不限于此。
在一个实施方式中，本申请涉及一种编码上述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子(例如重组新城疫病毒质粒)。
在一个实施方式中，本申请涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒和/或DNA分子。
在一些优选的实施方式中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的药用辅料可选自例如但不限于溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂、稀释剂等。关于其它可用的药学上可接受的药用辅料，可参见例如《药用辅料手册》(第4版)，R.C.罗等著，郑泽民主译，2005年，化学工业出版社。
在一个实施方式中，本申请涉及一种制备上述重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：
(1)将含有VEGF-Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF-Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；
(2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。
在一些优选的实施方式中，可采用选自如下的载体构建所述克隆载体：PUC57载体、pMD18-T载体、pMD19-T载体、pBlueScript SK(+/-)载体、pBluescript II KS(+/-)。
在一些优选的实施方式中，所述NDV病毒载体可为选自如下的NDV病毒的基因组的全长cDNA序列：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ，但不限于此。
优选地，所述NDV病毒载体可为pBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV、pOLTV5-NDV载体。
在本文中，将所述重组新城疫病毒质粒与能够表达核衣壳蛋白NP、磷酸化蛋白P和RNA依赖的RNA聚合酶L的辅助质粒NP、P和L(它们可为NP、P和L的基因构建至本领域已知的任何真核表达载体上得到的任意的NP、P、L重组质粒)共转染至所述细胞中。在本文中，辅助质粒NP、P和L的基因可以来源于NDV任意毒株，如LaSota、Anhinga、F48E9等。在一些优选的实施方式中，将所述重组新城疫病毒质粒与选自如下的辅助质粒共转染至细胞中：pTM-NP、pTM-P和pTM-L；pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L；或者pBluescript II KS(+/-)-NP(pBL-NP)、pBluescript II KS(+/-)-P(pBL-P)和pBluescript II KS(+/-)-L(pBL-L)，但不限于此。
在本文中，转染是将外源性核酸物质(包括DNA和RNA)导入细胞内的技术，主要包括物理介导(电穿孔法、显微注射和基因枪)、化学介导(磷酸钙共沉淀法、脂质体转染、阳离子物质介导)和生物介导(原生质体转染、病毒介导的转染)三类途径。具体的操作可由本领域技术人员基于本领域的普通知识(例如可参见《分子克隆实验指南》(第4版)，J.萨姆布鲁克等编著，贺福初主译，科学出版社，2017年)选择合适的实验条件和步骤、或者根据可商购的试剂盒中的说明书进行。
在一些优选的实施方式中，所述细胞可选自但不限于BHK-21细胞、BSR-T7/5细胞、VERO细胞、DF-1细胞、293细胞、MDCK细胞。
在本文中，所述经转染的细胞的培养可由本领域技术人员根据细胞的种类选择常规的培养基和培养条件进行(刘斌主编，《细胞培养(第3版)》，世界图书出版公司，2018年01月；兰容、周珍辉主编，《细胞培养技术》，化学工业出版社，2007年8月；章静波主编，《组织和细胞培养技术(第3版)》，人民卫生出版社，2014年06月等)。
在一个实施方式中，本申请涉及上述的重组的新城疫病毒基因组、重组新城疫病毒、DNA分子和/或药物组合物在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途。
在一些优选的实施方式中，所述癌症可选自但不限于：结肠癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、胃癌、直肠癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿路上皮癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、肌肉瘤、子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、肾癌、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征或肉瘤。
本发明的示例性的技术方案可通过如下编号段落的内容进行说明：
1.一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF-Trap的编码基因，所述VEGF-Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。
2.如段落1所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述VEGF-Trap的编码基因处于DNA或RNA的形式。
3.如段落1或2所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述VEGF-Trap的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。
4.如段落1-3中任一段所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述重组的新城疫病毒基因组的序列以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5示出。
5.一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含段落1-4中任一段所述的重组的新城疫病毒基因组。
6.如段落5所述的重组新城疫病毒，其中，所述新城疫病毒的出发毒株选自：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ；以及基于所述出发毒株以基因工程手段构建的任意的嵌合毒株。
7.一种编码段落1-4中任一段所述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子。
8.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含段落1-4中任一段所述的重组的新城疫病毒基因组、段落5或6所述的重组新城疫病毒和/或段落7所述的DNA分子。
9.如段落8所述的重组新城疫病毒，其中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。
10.如段落8或9所述的重组新城疫病毒，其中，所述药学上可接受的药用辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂或稀释剂。
11.一种制备段落5或6所述的重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：
(1)将含有VEGF-Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF-Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；
(2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。
12.如段落11所述的方法，其中，采用选自如下的载体构建所述克隆载体：PUC57载体、pMD18-T载体、pMD19-T载体、pBlueScript SK(+/-)载体、pBluescript II KS(+/-)。
13.如段落11或12所述的方法，其中，所述NDV病毒载体为选自如下的NDV病毒的基因组的全长cDNA序列：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ。
14.如段落13所述的方法，其中，所述NDV病毒载体为pBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV、pOLTV5-NDV载体。
15.如段落11-14中任一段所述的方法，其中，将所述重组新城疫病毒质粒与选自如下的辅助质粒共转染至所述细胞中：pTM-NP、pTM-P和pTM-L；pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L；或者pBluescript II KS(+/-)-NP、pBluescript II KS(+/-)-P和pBluescriptII KS(+/-)-L。
16.如段落11-15中任一段所述的方法，其中，所述细胞选自BHK-21细胞、BSR-T7/5细胞、VERO细胞、DF-1细胞、293细胞或MDCK细胞。
17.段落1-4中任一段所述的重组的新城疫病毒基因组、段落5或6所述的重组新城疫病毒、段落7所述的DNA分子和/或段落8-10中任一段所述的药物组合物在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途。
18.如段落17所述的用途，其中，所述癌症选自：结肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿路上皮癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、肌肉瘤、子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、肾癌、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征或肉瘤。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。除非另外说明，所用试剂、材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
除非另有说明，本申请中涉及的基因的设计、合成和克隆以及载体的构建和转染及电泳等操作，可按照本领域已知的技术进行(例如参见CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY的记载)。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段(例如参见：潘卫主编，《分子病毒学原理与实验技术》，上海第二军医大学出版社，2002年11月；黄祯祥主编，《医学病毒学基础及实验技术》，科学出版社，1990年2月等)。
下述的实施例涉及如下的外源基因：血管抑制剂基因VEGF-Trap和人源血管抑素基因Angiostatin(Genbank登录号NG_016200.1)。
pMD19-T购自宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)。BHK-21细胞(幼仓鼠肾细胞)、人结肠癌细胞HCT116、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠乳腺癌细胞4T1、人脐静脉内皮细胞EA.hy926均购自ATCC。
DMEM(高糖)培养基、McCoy'5A培养基、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、新生牛血清(FCS)、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司。SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。Balb/c小鼠(昆明小鼠)购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。
实施例1重组新城疫病毒的制备
一、插入外源基因的重组新城疫病毒质粒的构建(以pBrNDV-VEGF-Trap为例)
根据文献Jocelyn Holash等(VEGF-Trap：A VEGF blocker with potentantitumor effects，2002年8月；https://doi.org/10.1073/pnas.172398299)的记载获得VEGF-Trap基因的序列(SEQ ID NO.1)，该序列如下所示：
TCCCCGCGGGGAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGATCCACTGGTAGTGATACAGGTAGACCTTTCGTAGAGATGTACAGTGAAATCCCCGAAATTATACACATGACTGAAGGAAGGGAGCTCGTCATTCCCTGCCGGGTTACGTCACCTAACATCACTGTTACTTTAAAAAAGTTTCCACTTGACACTTTGATCCCTGATGGAAAACGCATAATCTGGGACAGTAGAAAGGGCTTCATCATATCAAATGCAACGTACAAAGAAATAGGGCTTCTGACCTGTGAAGCAACAGTCAATGGGCATTTGTATAAGACAAACTATCTCACACATCGACAAACCAATACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGGAATTGAACTATCTGTTGGAGAAAAGCTTGTCTTAAATTGTACAGCAAGAACTGAACTAAATGTGGGGATTGACTTCAACTGGGAATACCCTTCTTCGAAGCATCAGCATAAGAAACTTGTAAACCGAGACCTAAAAACCCAGTCTGGGAGTGAGATGAAGAAATTTTTGAGCACCTTAACTATAGATGGTGTAACCCGGAGTGACCAAGGATTGTACACCTGTGCAGCATCCAGTGGGCTGATGACCAAGAAGAACAGCACATTTGTCAGGGTCCATGAAAAAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGGTTTAAACCC
按照如下方法构建重组质粒pBrNDV-VEGF-Trap：
1.通过上海生工生物工程公司合成含有SacII酶(5')和PmeI酶(3')的酶切位点的VEGF-Trap基因，并连接到pUC57载体上形成pUC57-VEGF-Trap，用于后续实验。
2.用限制性内切酶PmeI和SacII(购自NEB公司)根据制造商的产品说明书酶切步骤1中的质粒pUC57-VEGF-Trap，酶切产物通过核酸琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定，鉴定正确后通过胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP219)根据制造商的产品说明书胶回收酶切产物。
3.用限制性内切酶PmeI和SacII根据制造商的产品说明书酶切pBrNDV质粒(购自NEB)，通过胶回收试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP219)根据制造商的产品说明书胶回收该质粒载体。
4.将步骤2的酶切产物和步骤3的载体用T4 DNA连接酶(购自NEB)根据制造商的产品说明书进行连接，得到重组新城疫病毒质粒pBrNDV-VEGF-Trap，其中，VEGF-Trap基因插入质粒P基因和M基因之间。对上述重组质粒采用宝生物taq酶(购自宝生物)按照制造商的说明书进行PCR(上游引物：5’TCAAGCGCCTTGCTCTAAATGGC 3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’GGGCAGAATCAAAGTACAGCCCAAT 3’(SEQ ID NO.4))以及PmeI和SacⅡ双酶切鉴定(37℃，1h)，鉴定正确的质粒样品分装并送至上海生工生物工程公司进行测序，测序结果使用序列分析软件DNAMAN进行比对，经测序，测序序列与目的序列一致。
采用与上述相同的方法构建和鉴定如下的插入外源Angiostatin基因(NG_016200.1)的重组质粒pBrNDV-Angiostatin(PCR扩增的引物同上)。
二、重组新城疫病毒的制备
通过如下方法利用上述的重组新城疫病毒质粒制备得到重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap：
1.采用脂质体转染技术，将构建成功的重组新城疫病毒质粒pBrNDV-VEGF-Trap与三种辅助质粒pBL-NP、pBL-P和pBL-L(按照葛金英，新城疫病毒反向遗传操作基础与应用研究，2006年所述的方法构建)共转染至稳定表达T7 RNA聚合酶的单层BHK-21细胞中，操作步骤参照Lipofectamine 3000转染试剂(购自Invitrogen)的说明书进行。孵育72h后，于-80℃下反复冻融3次，4℃下12000rpm离心收集上清液，加入0.001％胰酶。
2.取步骤1得到的上清液200μL，接种于9日龄SPF级鸡胚尿囊腔中，然后在孵化箱中于37℃、5％CO2下培养72h后获取尿囊液，并进行血凝效价检测(例如周灵、李燕芳、马夏利，一株鸡源新城疫病毒的分离鉴定[J]，浙江畜牧兽医，2015，40(03):8-10中记载的方法)，阳性尿囊液冻存于-80℃冰箱保存，成功拯救的重组新城疫病毒命名为rNDV-VEGF-Trap。
3.将步骤2得到的重组新城疫病毒按照QIAamp Viral RNA Mini Kit(50)的说明书提取重组病毒RNA，利用随机引物获得cDNA样品，用P/M位点引物P/M-F(序列同SEQ IDNO.3)和P/M-R(序列同SEQ ID NO.4)对插入的VEGF-Trap基因进行RT-PCR扩增(ThermoFisher RT-PCR试剂盒，按照试剂盒说明书合成cDNA第一链并进行PCR)，所扩增的PCR产物送至上海生工生物工程公司进行测序，测序结果使用序列分析软件DNAMAN进行比对，经测序，测序序列与目的序列一致。
4.取步骤3中的外源基因测序正确的病毒，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃下培养72h，收集鸡胚尿囊液进行HA检测(例如参见记载于周灵、李燕芳、马夏利，一株鸡源新城疫病毒的分离鉴定[J]，浙江畜牧兽医，2015，40(03):8-10中的相关方法进行)，选取HA效价大于29的尿囊液进行混合后分装备用。
5.收取各组尿囊液进行Western Blot(例如，可参见记载于An Y,etal.Recombinant Newcastle disease virus expressing P53 demonstrates promisingantitumor efficiency in hepatoma model[J].Journal of Biomedical Science,201623(1):55中的相关方法)检测各外源基因的表达，结果显示，重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap能够稳定表达外源基因VEGF-Trap(参见图1)。
同样地，按照上述方法制备得到重组新城疫病毒rNDV-Angiostatin。
以下描述如无特别指明，rNDV-VEGF-Trap和rNDV-Angiostatin分别指使用重组质粒pBrNDV-VEGF-Trap和pBrNDV-Angiostatin通过上述方法制备的重组病毒。
以下的实施例2-3中的亲本病毒指从新城疫病毒LaSota(购自哈尔滨兽医防疫站)出发，按照王永等(置换HN基因对新城疫病毒LaSota株致病力的影响，微生物学报，2008，48(5)：638～643)中描述的关于“基因替换”的工程化方法，采用新城疫病毒强毒株F48E9的F基因(GenBank登录号:AY508514.1)替换该LaSota毒株的F基因改造得到，在下文中将该亲本毒株命名为rNDV。
实施例2重组病毒增殖稳定性的检测
按照如下的方法进行TCID50的测定：
1.用含有10％FBS、1％抗生素的DMEM培养基接种10000个DF-1细胞于96孔微量培养板内，37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。
2.接种各重组新城疫病毒(rNDV-VEGF-Trap和rNDV-Angiostatin)和亲本病毒前，将步骤1的培养板中的原有细胞培养基弃掉，向其中加入含有10％尿囊液、1％抗生素的180μL新鲜的DMEM培养基。
3.取20μL各重组新城疫病毒和亲本病毒分别接种于最上排细胞孔内，吹打混匀后，吸取20μL混合液向下方细胞孔做连续的10倍梯度稀释。每个病毒设置3个重复样品。
4.在37℃、5％CO2细胞培养箱中，将接种的重组新城疫病毒和亲本病毒孵育1小时后，弃去培养液并用0.2ml的1×PBS缓冲液清洗一次，之后加入含10％尿囊液、1％抗生素的200μL新鲜的DMEM培养基。
5.在37℃、5％CO2细胞培养箱中继续培养，分别于12h、24h、36h、48h、60h、72h后于光学倒置显微镜下观察细胞病变孔并记录病变孔的个数，根据Reed and Muench method方法计算该病毒的效价，并绘制增殖曲线。
结果如图2所示，重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap和rNDV-Angiostatin与亲本病毒的增殖趋势无明显差异，说明外源基因的插入不影响病毒增殖。
实施例3重组新城疫病毒对肿瘤的治疗作用
1建立Balb/c小鼠结肠癌荷瘤动物模型
取小鼠结肠癌细胞CT26，台盼蓝染色确定细胞活度达95％以上，将其用生理盐水稀释成1×106/mL的细胞悬液，将该细胞悬液以每只Balb/c小鼠0.1mL的剂量注入右侧腹部皮下。8-12天后实体瘤的直径达到5-8mm，造模成功，可进行后续实验。去除肿瘤形态、大小差异大的个体，取肿瘤直径在5-8mm的小鼠作为模型小鼠。
2重组病毒对肿瘤的治疗作用
将模型小鼠随机分为4组，每组10只，分别处理如下：
rNDV-VEGF-Trap组：每天向模型小鼠的瘤内注射0.2mL实施例1制备的rNDV-VEGF-Trap病毒的PBS悬液(采用1×PBS缓冲液配制；含107pfu病毒)，治疗14天；
rNDV-Angiostatin组：每天向模型小鼠的瘤内注射0.2mL实施例1制备的rNDV-Angiostatin病毒的PBS悬液(采用1×PBS缓冲液配制；含107pfu病毒)，治疗14天；
rNDV组：每天向模型小鼠的瘤内注射0.2mL亲本病毒的PBS悬液(采用1×PBS缓冲液配制；含107pfu病毒)，治疗14天；
阴性对照组(模型组)：每天向模型小鼠的瘤内注射0.2mL SPF鸡胚尿囊液，治疗14天。
从治疗当天起，隔天测量肿瘤体积，并基于测量结果制作肿瘤生长曲线(图3)。治疗结束后，将小鼠安乐死，剥瘤，测量肿瘤重量和大小(结果在图4和图5中示出)。阴性对照组的肿瘤平均体积是1889.17mm3，亲本NDV(rNDV)治疗组的肿瘤平均体积是728.49mm3，rNDV-Angiostatin治疗组的肿瘤平均体积是774.37mm3；rNDV-VEGF-Trap治疗组的肿瘤平均体积是350.36mm3。结果表明，与阴性对照组相比，亲本病毒和重组新城疫病毒均对肿瘤生长有显著的抑制效果，其中，rNDV-Angiostatin的抗肿瘤效果与rNDV组无明显差异性，而rNDV-VEGF-Trap的抗肿瘤效果显著高于rNDV组。
3肿瘤病理切片的观察
为观察重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap对结肠癌及相关血管的抑制情况，取各组小鼠肿瘤组织，经4％多聚甲醛固定后，按如下方法制备4μm厚度的肿瘤组织石蜡切片，并经HE染色后显微镜下观察各组的肿瘤组织形态，通过免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织中的CD34蛋白的表达。具体操作如下：
3.1石蜡切片的制备
(1)将石蜡放入1L大烧杯中，加入蜂蜡，放入60℃蜡箱，当蜡完全融化后，用滤纸过滤，取出后于室温冷却，然后重新放入蜡箱融化，反复2～3次。
(2)将载玻片逐个放入配好的洗液(重铬酸钾浓溶液：重铬酸钾25g，水75ml，浓硫酸400ml)中浸泡24h后，用自来水冲洗干净，再放入95vol％的酒精中浸泡24h，然后将载玻片用擦镜纸擦干于180℃干热灭菌6h。灭菌后，将载玻片逐个浸入到盛有APES处理剂(APES:丙酮＝1:50)的染缸中处理5min，取出后用蒸馏水冲洗两次，放入切片盒中，60℃烘干备用。
(3)在上述的治疗结束后，取各组小鼠的肺组织放入事先配制好的4％中性甲醛固定液中固定48h，取出组织，用刀片将组织块修成1cm左右大小。
(4)脱水与透明：30vol％乙醇-30min，50vol％乙醇-30min，70vol％乙醇4℃过夜；次日80vol％乙醇-30min，90vol％乙醇-30min，100vol％乙醇-30min(2次)。脱水后的组织于通风橱中浸入到二甲苯:无水乙醇＝1:1的染缸中漂洗20min后，放入纯二甲苯中漂洗20min，并重复2次。此时组织块颜色加深透明，二甲苯溶液澄清。
(5)浸蜡：透明后的组织转入到(1)中充分溶解的石蜡内，于60℃恒温箱放置120min。
(6)包埋：将蜡箱中的石蜡倒入纸盒内，用小镊子将各组织块按顺序排列，确保切面朝下。
(7)修蜡块：待纸盒内石蜡凝固后，将蜡块取出，用刀片将其修成梯形，组织边缘距蜡块边缘之间的距离不得小于2mm。
(8)切片：连续切片，厚度约4μm，将切片在40℃左右摊片机水浴中展开，用(2)中处理的载玻片从水浴中捞取切片，放在摊片机边框上，稍干后立即放入37℃烘箱中过夜，使切片紧贴于载玻片上并呈半透明状。过夜后，将载玻片置于玻片盒，备用。
3.2HE染色
(1)脱蜡：将蜡箱的温度预热到60℃时，将制备的肿瘤组织切片放入60℃烘箱中1h，切片上石蜡融化后浸入二甲苯中5min(3次)。无水乙醇-2min；90vol％乙醇-5min；80vol％乙醇-5min；70vol％乙醇-5min；50vol％乙醇-5min；水-5min(3次)。
(2)染色：切片用苏木精染色30sec后蒸馏水冲洗1min；插入伊红染缸中立即取出，并用蒸馏水浸洗1min(3次)。
(3)脱水：50vol％乙醇-1min；70vol％乙醇-1min；80vol％乙醇-1min；90vol％乙醇-1min；100vol％乙醇-5min(2次)；二甲苯1-5min(2次)。
(4)中性树胶封片：盖玻片干燥后放平，向中央滴加1～2滴中性树胶，载玻片带组织的一面轻轻盖在盖玻片上，让中性树胶沿着盖玻片充分漫延展开，之后倾斜载玻片，用滤纸将多余的二甲苯吸干，同时注意避免有气泡的产生。载玻片烘干后储存于切片盒中，显微镜下观察并比较各组小鼠瘤组织的病理变化。
3.3免疫组织化学染色
1、脱蜡和水化：将制备好的石蜡切片浸入二甲苯进行脱蜡，浸入两次，每次5min，然后放入100vol％、95vol％、90vol％、80vol％、70vol％的各级酒精溶液中各5min，再放入蒸馏水中漂洗两次，每次3min。
2、抗原修复：将0.01M柠檬酸钠缓冲液(pH＝6.0)水浴加热至95℃后，放入切片加热10min。1×PBS缓冲液漂洗3次，每次5min。
3、灭活内源性过氧化物酶：滴加适量的内源性过氧化物酶封闭液(购自Beyotime；货号P0100A)使其完全覆盖样品，室温孵育10min。1×PBS缓冲液液洗涤3次，每次3分钟。
4、封闭：滴加封闭液(购自Beyotime；货号P0260 QuickBlock)封闭组织切片10min。
5、孵育一抗：用封闭液依照抗体说明书的稀释比配制CD34一抗工作液(购自Abcam)，向所述各组织切片滴加一抗工作液，4℃孵育过夜。一抗(抗CD34抗体，购自Abcam)孵育后，1×PBST缓冲液冲洗组织切片3次，每次5min。
6、孵育二抗：用封闭液依照抗体说明书的稀释比配制羊抗兔二抗(购自Abcam)工作液，向所述各组织切片滴加二抗工作液，室温静置孵育1h。二抗孵育后，1×PBST缓冲液冲洗组织切片3次，每次5min。
7、显色：滴加100μl DAB显色工作液(购自Beyotime)，充分覆盖样品。室温避光孵育15min，显色后，去除DAB显色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次以终止显色反应。
结果表明：治疗结束后，阴性对照组(模型组)小鼠的肿瘤组织结构致密，细胞形态完好，生长旺盛；rNDV组小鼠的肿瘤病灶解体，肿瘤细胞结构较为松散；rNDV-Angiostatin组小鼠的肿瘤结构与rNDV组无明显差异，而rNDV-VEGF-Trap组小鼠的肿瘤组织病灶大量解体，肿瘤细胞结构非常松散，免疫细胞多处浸润，肿瘤细胞呈单个分散(参见图6)。免疫组织化学染色结果显示出，模型组小鼠的CD34表达量丰富，rNDV组与模型组类似，而rNDV-VEGF-Trap组小鼠的CD34表达量明显减少。表明rNDV-VEGF-Trap具有抑制血管内皮细胞增生的疗效(参见图7)。
实施例4重组新城疫病毒的安全性检测
选用健康6周SPF级Balb/c小鼠分组，每组10只。对照组小鼠正常饲养。实验组小鼠每只腹腔注射5×108pfu(10倍治疗剂量)重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap后观察30天。出现明显不良反应如精神萎靡、皮毛竖起及死亡的小鼠为阳性。
结果显示：注射第2天时，实验组中的3只小鼠皮毛竖起，饮食饮水未受到影响。连续注射重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap一个星期后，实验组小鼠的皮毛都恢复正常，继续观察一个月，实验组中的各小鼠均未出现明显不良反应(包括精神萎靡、皮毛竖起)，且无小鼠死亡。
因此，本申请制备的重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap具有良好的安全性。
实施例5
如下实施例提供的作为亲本毒株的溶瘤病毒rClone30-Anh-(F)从新城疫病毒LaSota毒株(购自哈尔滨兽医防疫站)出发，按照王永等(微生物学报，2008，48(5)：638～643，同上)中描述的关于“基因替换”的工程化方法，采用新城疫病毒中毒株Anhinga的F基因(GenBank登录号:EF065682.1)替换LaSota毒株的F基因改造得到。该实施例的表达VEGF-Trap的重组新城疫病毒的基因组以SEQ ID NO.5示出(参见图10)；VEGF-Trap的核酸序列以SEQ ID NO.1示出。
首先，按照实施例1中所述的方法采用VEGF-Trap基因(SEQ ID NO.1)和Angiostatin基因(NG_016200.1)分别构建得到相应的重组新城疫病毒质粒和重组新城疫病毒并成功拯救出重组病毒，将拯救成功并鉴定正确的重组新城疫病毒分别命名为rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap和rClone30-Anh-(F)-Angiostatin。
然后，按照实施例4中所述的方法采用H22细胞(购自南京科佰)建立H22皮下荷瘤模型(即，小鼠肝癌模型)。当肿瘤长到100mm3左右，开始向瘤内注射100μL上述的各溶瘤病毒(rClone30-Anh-(F)-Angiostatin和rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap)以及亲本毒株rClone30-Anh-(F)的PBS悬液(利用1×PBS缓冲液配制)。在各治疗组中，将各溶瘤病毒(rClone30-Anh-(F)-Angiostatin、rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap和rClone30-Anh-(F))分别向瘤内每天注射一次，共注射14天，每次注射1×107PFU；向小鼠肝癌模型的瘤内注射1×PBS缓冲液(不含溶瘤病毒)作为阴性对照组(也称为“PBS治疗组”)；每组6只动物，通过解剖肿瘤组织，观察各重组病毒治疗效果。
如图8所示，治疗结束后，阴性对照组的肿瘤平均体积是1421.77mm3，亲本rClone30-Anh-(F)治疗组的肿瘤平均体积是807.30mm3，rClone30-Anh-(F)-Angiostatin治疗组的肿瘤平均体积是668.60mm3；rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap治疗组的肿瘤平均体积是326.05mm3。结果表明，比起阴性对照组，亲本毒株rClone30-Anh-(F)治疗组、rClone30-Anh-(F)-Angiostatin治疗组和rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap治疗组均能抑制肿瘤生长，尤其是rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap治疗组的肿瘤平均体积最小。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司
<120> 一种重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap、其基因组、制备方法及其用途
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> VEGF-Trap的核酸序列
<400> 1
tccccgcggg gagccaccat ggagacagac acactcctgc tatgggtact gctgctctgg 60
gttccaggat ccactggtag tgatacaggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120
cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180
cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240
cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300
gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360
catcgacaaa ccaatacaat catagatgtg gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420
tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480
gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540
ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600
gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660
aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900
aagccgcgcg aggagcagta caacagcacg taccgggtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgatta 1380
agaaaaaata cgggtagaag gtttaaaccc 1410
<210> 2
<211> 18931
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组新城疫病毒rNDV-VEGF-Trap的基因组序列
<400> 2
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 60
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 120
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataagcatga gtgataacac 180
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg ctttttttca 240
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 300
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 360
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 420
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 480
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 540
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta tggatgaacg 600
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 660
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 720
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 780
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 840
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 900
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 960
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1020
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1080
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1140
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1200
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1260
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg ggaacgcctg 1320
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1380
ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1440
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1500
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1560
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1620
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1680
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 1740
tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 1800
cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aagcggccgc taatacgact cactataggg 1860
accaaacaga gaatccgtaa gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 1920
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 1980
catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 2040
agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta gacgtcccgg tattcactct 2100
taacagtgat gacccagaag atagatggag ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt 2160
tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca 2220
ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 2280
cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaacaata ggagtggagt 2340
gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga tctctccctc gggcatgcag 2400
caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga 2460
taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacagtag caaaagccat 2520
gactgcgtat gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga atcaataagt atatgcagca 2580
aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc aggagcacaa tccaactcac 2640
gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc gagctcaaga gaggccgcaa 2700
cacggcaggt ggtacctcta cttattataa cctggtaggg gacgtagact catacatcag 2760
gaataccggg cttactgcat tcttcttgac actcaagtac ggaatcaaca ccaagacatc 2820
agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt 2880
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta cttggtgata gtgaccagat 2940
gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 3000
cctagataaa ggtactggga aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 3060
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca gggaagtagc attaacgagg atatggctgc 3120
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc 3180
cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc ggagtcctca ctgggcttag 3240
cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg atcgaataga tcgcaagggc aaccagaagc 3300
cggggatggg gagacccaat tcctggatct gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga 3360
ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc 3420
ccaagataac gacaccgact gggggtattg atggacaaaa cccagcctgc ttccacaaaa 3480
acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg cggctctata tgaccacacc 3540
ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg tacaactccg cacgccctag 3600
ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa 3660
agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct 3720
cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 3780
tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt aaaccagcag 3840
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg 3900
agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 3960
ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 4020
ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 4080
gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg tccaatgcta 4140
aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca acgtccgact caacagcagg 4200
ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 4260
ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 4320
tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 4380
tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg 4440
aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct agatcttgtc ttgaaacaga 4500
catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca 4560
tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc 4620
tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt agtttcaggc cctggagacc 4680
cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa taaactttcg caaccagtgc 4740
cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg gcctgatata ggagtggaaa 4800
aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gcccaatgca cccgagttct tcagccaagc 4860
tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg 4920
ctctaaatgg ctaattacta ctgccacacg tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac 4980
ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca actctccaag cggcaatcct 5040
ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt aattaatcta gctacattta 5100
agattaagaa aaaatacggg tagaatcccc gcggggagcc accatggaga cagacacact 5160
cctgctatgg gtactgctgc tctgggttcc aggatccact ggtagtgata caggtagacc 5220
tttcgtagag atgtacagtg aaatccccga aattatacac atgactgaag gaagggagct 5280
cgtcattccc tgccgggtta cgtcacctaa catcactgtt actttaaaaa agtttccact 5340
tgacactttg atccctgatg gaaaacgcat aatctgggac agtagaaagg gcttcatcat 5400
atcaaatgca acgtacaaag aaatagggct tctgacctgt gaagcaacag tcaatgggca 5460
tttgtataag acaaactatc tcacacatcg acaaaccaat acaatcatag atgtggttct 5520
gagtccgtct catggaattg aactatctgt tggagaaaag cttgtcttaa attgtacagc 5580
aagaactgaa ctaaatgtgg ggattgactt caactgggaa tacccttctt cgaagcatca 5640
gcataagaaa cttgtaaacc gagacctaaa aacccagtct gggagtgaga tgaagaaatt 5700
tttgagcacc ttaactatag atggtgtaac ccggagtgac caaggattgt acacctgtgc 5760
agcatccagt gggctgatga ccaagaagaa cagcacattt gtcagggtcc atgaaaaaga 5820
caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt 5880
cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg 5940
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg 6000
cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgcgaggag cagtacaaca gcacgtaccg 6060
ggtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg 6120
caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg 6180
gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa 6240
ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg 6300
ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga 6360
cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa 6420
cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct 6480
ctccctgtct ccgggtaaat gattaagaaa aaatacgggt agaaggttta aacccttgga 6540
gtgccccaat tgtgccaaga tggactcatc taggacaatt gggctgtact ttgattctgc 6600
ccattcttct agcaacctgt tagcatttcc gatcgtccta caagacacag gagatgggaa 6660
gaagcaaatc gccccgcaat ataggatcca gcgccttgac ttgtggactg atagtaagga 6720
ggactcagta ttcatcacca cctatggatt catctttcaa gttgggaatg aagaagccac 6780
tgtcggcatg atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct 6840
aggaagcgtc ccaaataccg gagaccttat tgagctggca agggcctgtc tcactatgat 6900
agtcacatgc aagaagagtg caactaatac tgagagaatg gttttctcag tagtgcaggc 6960
accccaagtg ctgcaaagct gtagggttgt ggcaaacaaa tactcatcag tgaatgcagt 7020
caagcacgtg aaagcgccag agaagattcc cgggagtgga accctagaat acaaggtgaa 7080
ctttgtctcc ttgactgtgg taccgaagaa ggatgtctac aagatcccag ctgcagtatt 7140
gaaggtttct ggctcgagtc tgtacaatct tgcgctcaat gtcactatta atgtggaggt 7200
agacccgagg agtcctttgg ttaaatctct gtctaagtct gacagcggat actatgctaa 7260
cctcttcttg catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt 7320
tgacaagctg gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct gtcgggctca gtgatgtgct 7380
cgggccttcc gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact aagcttttgg cacctttctt 7440
ctctagcagt gggacagcct gctatcccat agcaaatgct tctcctcagg tggccaagat 7500
actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc attatccaag caggtaccca 7560
acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct actaagctgg agaaggggca 7620
cacccttgcc aaatacaatc cttttaagaa ataagctgcg tctctgagat tgcgctccgc 7680
ccactcaccc agatcatcat gacacaaaaa actaatctgt cttgattatt tacagttagt 7740
ttacctgtct atcaagttag aaaaaacacg ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc 7800
ctccaggtgc aagatgggcc ccaaatcttc taccaatgtc ccagcacctc tgatgctgac 7860
cgtcaggatt gcgctggcac tgagctgtgt ccgtctgaca aattctctcg atggaaggcc 7920
tcttgcagct gcagggattg tagtaacggg agacaaagca gtcaacatat acacctcatc 7980
tcagacaggg tcaataatag tcaagttact cccaaatatg cctaaggata aagaggcgtg 8040
tgcaaaagcc ccgttggagg catacaacag gacactgact actttgctca ccccccttgg 8100
tgattctatc cgcaggatac aagagtctgc gactacgtcc ggaggaagga ggcagagacg 8160
ctttataggt gccattatcg gcagtgtagc tcttggggtt gccacagatg cccagataac 8220
agcagcctca gctctgatac aagccaacca gaatgctgcc aacatcctcc ggcttaaaga 8280
gagcattgct gcaactaatg aagctgtaca tgaagtcact gacggattat cgcaactagc 8340
agtggcagtt gggaagatgc agcagtttgt taatgaccag tttaataaca cagctcagga 8400
attggactgt ataaaaatta cacagcaggt tggtgtagaa ctcaacctgt acctaactga 8460
attgactaca gtattcgggc cacaaatcac ttcccctgcc ttaactcagc tgactatcca 8520
ggcgctttac aatctagctg gtggtaatat ggattatttg ttgactaagt taggtgttgg 8580
gaacaaccaa ctcagctcat taatcggtag cggcttgatc accggtaacc ctattctgta 8640
cgattcacag actcaactct taggtataca ggtaacttta ccctcagtcg gtaacctaaa 8700
taatatgcgt gctacctact tggagacctt gtctgtaagc acaaccaagg gatttgcctc 8760
agcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt cgggtctgtg atagaggaac ttgacacctc 8820
atactgtgta gagaccgatt tggatttata ttgtacaaga atagtgacat tccctatgtc 8880
tcctggtatt tattcctgtc tgagcggtaa tacatcagct tgcatgtatt caaagactga 8940
aggtgcactt actacgccat atatgactat caagggctca gttattgcca attgcaagat 9000
gacaacatgc agatgtgcag accctccggg tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt 9060
gtctctaata gataggcact catgcaatgt cttatcctta gacgggataa ctttgaggct 9120
cagtggagaa tttgacgtaa cttatcaaaa gaatatctca atattagatt ctcaggtaat 9180
agtgacaggc aatctcgata tctcaactga acttgggaat gtcaacaact cgataagtaa 9240
tgctttggat aagttagagg aaagcaatag caaacttgac aaagtcaatg tcaagctgac 9300
cggcacgtct gctctcatta cctatatagt tttaactatc atatctcttg tttgtggtat 9360
acttagcctg gttctagcat gctatctgat gtataagcaa aaggcgcaac aaaagacctt 9420
attatggctt gggaataata ccctaaatca gatgagggcc actacaagaa tctgaacaca 9480
gatgaggaac gaaggtttcc ctaatagtaa tttgtgtgaa agttctggta gtctgtcagt 9540
taagaaaaaa tacgggtaga aggttaaccg gcccgcggcg acgcgtggcc tgagaggcct 9600
tcagagagtt aagaaaaaac taccggttgt agatgaccaa aggacgatat acgggtagaa 9660
cggtaagaga ggccgcccct caattgcgag ccaggcttca caacctccgt tctaccgctt 9720
caccgacaac agtcctcaat catggaccgc gccgttagcc aagttgcgtt agagaatgat 9780
gaaagagagg caaaaaatac atggcgcttg atattccgga ttgcaatctt attcttaaca 9840
gtagtgacct tggctatatc tgtagcctcc cttttatata gcatgggggc tagcacacct 9900
agcgatcttg taggcatacc gactaggatt tccagggcag aagaaaagat tacatctaca 9960
cttggttcca atcaagatgt agtagatagg atatataagc aagtggccct tgagtctccg 10020
ttggcattgt taaatactga gaccacaatt atgaacgcaa taacatctct ctcttatcag 10080
attaatggag ctgcaaacaa cagtgggtgg ggggcaccta tccatgaccc agattatata 10140
ggggggatag gcaaagaact cattgtagat gatgctagtg atgtcacatc attctatccc 10200
tctgcatttc aagaacatct gaattttatc ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact 10260
cgaataccct catttgacat gagtgctacc cattactgct acacccataa tgtaatattg 10320
tctggatgca gagatcactc acattcatat cagtatttag cacttggtgt gctccggaca 10380
tctgcaacag ggagggtatt cttttctact ctgcgttcca tcaacctgga cgacacccaa 10440
aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaact cccctgggtt gtgatatgct gtgctcgaaa 10500
gtcacggaga cagaggaaga agattataac tcagctgtcc ctacgcggat ggtacatggg 10560
aggttagggt tcgacggcca gtaccacgaa aaggacctag atgtcacaac attattcggg 10620
gactgggtgg ccaactaccc aggagtaggg ggtggatctt ttattgacag ccgcgtatgg 10680
ttctcagtct acggagggtt aaaacccaat tcacccagtg acactgtaca ggaagggaaa 10740
tatgtgatat acaagcgata caatgacaca tgcccagatg agcaagacta ccagattcga 10800
atggccaagt cttcgtataa gcctggacgg tttggtggga aacgcataca gcaggctatc 10860
ttatctatca aggtgtcaac atccttaggc gaagacccgg tactgactgt accgcccaac 10920
acagtcacac tcatgggggc cgaaggcaga attctcacag tagggacatc tcatttcttg 10980
tatcaacgag ggtcatcata cttctctccc gcgttattat atcctatgac agtcagcaac 11040
aaaacagcca ctcttcatag tccttataca ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc 11100
ccttgccagg cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca 11160
tatcccctaa tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat 11220
ggtgtacaag caagacttaa ccctgcgtct gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc 11280
attactcgag tgagttcaag cagtaccaaa gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa 11340
gtggtcaaga ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc 11400
ggagaattca gaatcgtccc gttactagtt gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa 11460
gccaggtctg gctagttgag tcaattataa aggagttgga aagatggcat tgtatcacct 11520
atcttctgcg acatcaagaa tcaaaccgaa tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgttgcc 11580
agttgaccac aatcagccag tgctcatgcg atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg 11640
attaagaaaa aatgtaagtg gcaatgagat acaaggcaaa acagctcatg gtaaataata 11700
cgggtaggac atggcgagct ccggtcctga aagggcagag catcagatta tcctaccaga 11760
gtcacacctg tcttcaccat tggtcaagca caaactactc tattactgga aattaactgg 11820
gctaccgctt cctgatgaat gtgacttcga ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa 11880
aatacttgaa tcggcctctc ctgatactga gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca 11940
ccaaactctt aaccacaatt ccagaataac cggagtgctc caccccaggt gtttagaaga 12000
actggctaat attgaggtcc cagattcaac caacaaattt cggaagattg agaagaagat 12060
ccaaattcac aacacgagat atggagaact gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa 12120
gaaactgctg gggtcatctt ggtctaacaa tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat 12180
tcgtacggat ccggcattct ggtttcactc aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct 12240
ccatataaaa cagatccaga ggcatctgat ggtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa 12300
caaattggtg atgctaaccc ataaggtagg ccaagtcttt gtcactcctg aacttgtcgt 12360
tgtgacgcat acgaatgaga acaagttcac atgtcttacc caggaacttg tattgatgta 12420
tgcagatatg atggagggca gagatatggt caacataata tcaaccacgg cggtgcatct 12480
cagaagctta tcagagaaaa ttgatgacat tttgcggtta atagacgctc tggcaaaaga 12540
cttgggtaat caagtctacg atgttgtatc actaatggag ggatttgcat acggagctgt 12600
ccagctactc gagccgtcag gtacatttgc aggagatttc ttcgcattca acctgcagga 12660
gcttaaagac attctaattg gcctcctccc caatgatata gcagaatccg tgactcatgc 12720
aatcgctact gtattctctg gtttagaaca gaatcaagca gctgagatgt tgtgtctgtt 12780
gcgtctgtgg ggtcacccac tgcttgagtc ccgtattgca gcaaaggcag tcaggagcca 12840
aatgtgcgca ccgaaaatgg tagactttga tatgatcctt caggtactgt ctttcttcaa 12900
gggaacaatc atcaacgggt acagaaagaa gaatgcaggt gtgtggccgc gagtcaaagt 12960
ggatacaata tatgggaagg tcattgggca actacatgca gattcagcag agatttcaca 13020
cgatatcatg ttgagagagt ataagagttt atctgcactt gaatttgagc catgtataga 13080
atatgaccct gtcaccaacc tgagcatgtt cctaaaagac aaggcaatcg cacaccccaa 13140
cgataattgg cttgcctcgt ttaggcggaa ccttctctcc gaagaccaga agaaacatgt 13200
aaaagaagca acttcgacta atcgcctctt gatagagttt ttagagtcaa atgattttga 13260
tccatataaa gagatggaat atctgacgac ccttgagtac cttagagatg acaatgtggc 13320
agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt gaaagttaat ggacggatct tcgctaagct 13380
gacaaagaag ttaaggaact gtcaggtgat ggcggaaggg atcctagccg atcagattgc 13440
acctttcttt cagggaaatg gagtcattca ggatagcata tccttgacca agagtatgct 13500
agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa taagaaacgt atcactgact gtaaagaaag 13560
agtatcttca aaccgcaatc atgatccgaa aagcaagaac cgtcggagag ttgcaacctt 13620
cataacaact gacctgcaaa agtactgtct taattggaga tatcagacaa tcaaattgtt 13680
cgctcatgcc atcaatcagt tgatgggcct acctcacttc ttcgaatgga ttcacctaag 13740
actgatggac actacgatgt tcgtaggaga ccctttcaat cctccaagtg accctactga 13800
ctgtgacctc tcaagagtcc ctaatgatga catatatatt gtcagtgcca gagggggtat 13860
cgaaggatta tgccagaagc tatggacaat gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc 13920
agctagatcg cattgtcgtg ttgcctgtat ggtacagggt gataatcaag taatagcagt 13980
aacgagagag gtaagatcag acgactctcc ggagatggtg ttgacacagt tgcatcaagc 14040
cagtgataat ttcttcaagg aattaattca tgtcaatcat ttgattggcc ataatttgaa 14100
ggatcgtgaa accatcaggt cagacacatt cttcatatac agcaaacgaa tcttcaaaga 14160
tggagcaatc ctcagtcaag tcctcaaaaa ttcatctaaa ttagtgctag tgtcaggtga 14220
tctcagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc caacattgcc tctactgtag cacggctatg 14280
cgagaacggg cttcccaaag acttctgtta ctatttaaac tatataatga gttgtgtgca 14340
gacatacttt gactctgagt tctccatcac caacaattcg caccccgatc ttaatcagtc 14400
gtggattgag gacatctctt ttgtgcactc atatgttctg actcctgccc aattaggggg 14460
actgagtaac cttcaatact caaggctcta cactagaaat atcggtgacc cggggactac 14520
tgcttttgca gagatcaagc gactagaagc agtgggatta ctgagtccta acattatgac 14580
taatatctta actaggccgc ctgggaatgg agattgggcc agtctgtgca acgacccata 14640
ctctttcaat tttgagactg ttgcaagccc aaatattgtt cttaagaaac atacgcaaag 14700
agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt attgtctgga gtgcacacag aggataatga 14760
ggcagaagag aaggcattgg ctgaattctt gcttaatcaa gaggtgattc atccccgcgt 14820
tgcgcatgcc atcatggagg caagctctgt aggtaggaga aagcaaattc aagggcttgt 14880
tgacacaaca aacaccgtaa ttaagattgc gcttactagg aggccattag gcatcaagag 14940
gctgatgcgg atagtcaatt attctagcat gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt 15000
ttcctccagt agatccaacc accccttagt ctcttctaat atgtgttctc tgacactggc 15060
agactatgca cggaatagaa gctggtcacc tttgacggga ggcaggaaaa tactgggtgt 15120
atctaatcct gatacgatag aactcgtaga gggtgagatt cttagtgtaa gcggagggtg 15180
tacaagatgt gacagcggag atgaacaatt tacttggttc catcttccaa gcaatataga 15240
attgaccgat gacaccagca agaatcctcc gatgagggta ccatatctcg ggtcaaagac 15300
acaggagagg agagctgcct cacttgcaaa aatagctcat atgtcgccac atgtaaaggc 15360
tgccctaagg gcatcatccg tgttgatctg ggcttatggg gataatgaag taaattggac 15420
tgctgctctt acgattgcaa aatctcggtg taatgtaaac ttagagtatc ttcggttact 15480
gtccccttta cccacggctg ggaatcttca acatagacta gatgatggta taactcagat 15540
gacattcacc cctgcatctc tctacagggt gtcaccttac attcacatat ccaatgattc 15600
tcaaaggctg ttcactgaag aaggagtcaa agaggggaat gtggtttacc aacagatcat 15660
gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat ctttccaata acaacaacca ggacatatga 15720
tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt tagttgctgt atcagagaag cacctgttgc 15780
ggttcctttc gagctacttg gggtggtacc ggaactgagg acagtgacct caaataagtt 15840
tatgtatgat cctagccctg tatcggaggg agactttgcg agacttgact tagctatctt 15900
caagagttat gagcttaatc tggagtcata tcccacgata gagctaatga acattctttc 15960
aatatccagc gggaagttga ttggccagtc tgtggtttct tatgatgaag atacctccat 16020
aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa 16080
ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc agcacttgaa gtgctcctcg actgttctta 16140
ccaactctat tacctgagag taagaggcct agacaatatt gtcttatata tgggtgattt 16200
atacaagaat atgccaggaa ttctactttc caacattgca gctacaatat ctcatcccgt 16260
cattcattca aggttacatg cagtgggcct ggtcaaccat gacggatcac accaacttgc 16320
agatacggat tttatcgaaa tgtctgcaaa actattagta tcttgcaccc gacgtgtgat 16380
ctccggctta tattcaggaa ataagtatga tctgctgttc ccatctgtct tagatgataa 16440
cctgaatgag aagatgcttc agctgatatc ccggttatgc tgtctgtaca cggtactctt 16500
tgctacaaca agagaaatcc cgaaaataag aggcttaact gcagaagaga aatgttcaat 16560
actcactgag tatttactgt cggatgctgt gaaaccatta cttagtcccg atcaagtgag 16620
ctctatcatg tctcctaaca taattacatt cccagctaat ctgtactaca tgtctcggaa 16680
gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga cagggatact atcctggcgt tgttgttccc 16740
ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt gcaagatatt ggtgctcgag tgaaagatcc 16800
attcacccga caacctgcgg catttttgca agagttagat ttgagtgctc cagcaaggta 16860
tgacgcattc acacttagtc agattcatcc tgaactcaca tctccaaatc cggaggaaga 16920
ctacttagta cgatacttgt tcagagggat agggactgca tcttcctctt ggtataaggc 16980
atctcatctc ctttctgtac ccgaggtaag atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt 17040
agctgaaggg agcggagcca tcatgagtct tctcgaactg catgtaccac atgaaactat 17100
ctattacaat acgctctttt caaatgagat gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac 17160
cccaactcag tttttgaatt cggttgttta taggaatcta caggcggagg taacatgcaa 17220
agatggattt gtccaagagt tccgtccatt atggagagaa aatacagagg aaagtgacct 17280
gacctcagat aaagtagtgg ggtatattac atctgcagtg ccctacagat ctgtatcatt 17340
gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg gtccaatcaa agcttactag atcaactagc 17400
tatcaattta tctctgattg ccatgcattc tgtaagggag ggcggggtag taatcatcaa 17460
agtgttgtat gcaatgggat actactttca tctactcatg aacttgtttg ctccgtgttc 17520
cacaaaagga tatattctct ctaatggtta tgcatgtcga ggagatatgg agtgttacct 17580
ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc 17640
gaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct tttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac 17700
caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag 17760
attaataaag tacttgagga agaatattga cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc 17820
cgtccgtcca ttctgtgcgg agagtctggt gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac 17880
ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt tatccggtct gtgatatata tggaagctga 17940
gggtgatctc gctgacacag tatttctatt taccccttac aatctctcta ctgacgggaa 18000
aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag acagatccta gaggttacaa tactaggtct 18060
tagagtcgaa aatctcaata aaataggcga tataatcagc ctagtgctta aaggcatgat 18120
ctccatggag gaccttatcc cactaaggac atacttgaag catagtacct gccctaaata 18180
tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact caaagaaatg tttacagaca cttctgtact 18240
gtacttgact cgtgctcaac aaaaattcta catgaaaact ataggcaatg cagtcaaagg 18300
atattacagt aactgtgact cttaacgaaa atcacatatt aataggctcc ttttttggcc 18360
aattgtattc ttgttgattt aatcatatta tgttagaaaa aagttgaacc ctgactcctt 18420
aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc ttaaaaaaag gttgcgcaca attattcttg 18480
agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg tttggtttgg tggccggcat ggtcccagcc 18540
tcctcgctgg cgccggctgg gcaacattcc gaggggaccg tcccctcggt aatggcgaat 18600
gggacgcggc cgatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca 18660
ccgctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt 18720
tgctgaaagg aggaactata tccggatcgg ccgatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg 18780
aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta 18840
aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggatgg ccgccaccgg 18900
tgggccttgc agcacatccc cccttcgcca g 18931
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 上游引物
<400> 3
tcaagcgcct tgctctaaat ggc 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 下游引物
<400> 4
gggcagaatc aaagtacagc ccaat 25
<210> 5
<211> 18931
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 重组新城疫病毒rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap的基因组序列
<400> 5
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 60
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 120
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataagcatga gtgataacac 180
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg ctttttttca 240
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 300
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 360
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 420
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 480
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 540
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacgggcagt caggcaacta tggatgaacg 600
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 660
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 720
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 780
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 840
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 900
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 960
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1020
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1080
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1140
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1200
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1260
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg ggaacgcctg 1320
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1380
ctcgtcaggg gggccgagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1440
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1500
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1560
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1620
gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1680
tgagcgcaac gcaattaatg tgagttacct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 1740
tatgcttccg gctcctatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 1800
cagctatgac catgattacg ccaagctcgg aagcggccgc taatacgact cactataggg 1860
accaaacaga gaatccgtaa gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcacggg 1920
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 1980
catgtcttcc gtatttgatg agtacgaaca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 2040
agctcatgga gggggagaaa aagggagtac cttaaaagta gacgtcccgg tattcactct 2100
taacagtgat gacccagaag atagatggag ctttgtggta ttctgcctcc ggattgctgt 2160
tagcgaagat gccaacaaac cactcaggca aggtgctctc atatctcttt tatgctccca 2220
ctcacaggta atgaggaacc atgttgccct tgcagggaaa cagaatgaag ccacattggc 2280
cgtgcttgag attgatggct ttgccaacgg cacgccccag ttcaacaata ggagtggagt 2340
gtctgaagag agagcacaga gatttgcgat gatagcagga tctctccctc gggcatgcag 2400
caacggaacc ccgttcgtca cagccggggc cgaagatgat gcaccagaag acatcaccga 2460
taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacagtag caaaagccat 2520
gactgcgtat gagactgcag atgagtcgga aacaaggcga atcaataagt atatgcagca 2580
aggcagggtc caaaagaaat acatcctcta ccccgtatgc aggagcacaa tccaactcac 2640
gatcagacag tctcttgcag tccgcatctt tttggttagc gagctcaaga gaggccgcaa 2700
cacggcaggt ggtacctcta cttattataa cctggtaggg gacgtagact catacatcag 2760
gaataccggg cttactgcat tcttcttgac actcaagtac ggaatcaaca ccaagacatc 2820
agcccttgca cttagtagcc tctcaggcga catccagaag atgaagcagc tcatgcgttt 2880
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacatta cttggtgata gtgaccagat 2940
gagctttgcg cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 3000
cctagataaa ggtactggga aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 3060
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca gggaagtagc attaacgagg atatggctgc 3120
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag gggcctggca gctgctgccc aacgggtctc 3180
cgaggagacc agcagcatag acatgcctac tcaacaagtc ggagtcctca ctgggcttag 3240
cgaggggggg tcccaagctc tacaaggcgg atcgaataga tcgcaagggc aaccagaagc 3300
cggggatggg gagacccaat tcctggatct gatgagagcg gtagcaaata gcatgaggga 3360
ggcgccaaac tctgcacagg gcactcccca atcggggcct cccccaactc ctgggccatc 3420
ccaagataac gacaccgact gggggtattg atggacaaaa cccagcctgc ttccacaaaa 3480
acatcccaat gccctcaccc gtagtcgacc cctcgatttg cggctctata tgaccacacc 3540
ctcaaacaaa catccccctc tttcctccct ccccctgctg tacaactccg cacgccctag 3600
ataccacagg cacaatgcgg ctcactaaca atcaaaacag agccgaggga attagaaaaa 3660
agtacgggta gaagagggat attcagagat cagggcaagt ctcccgagtc tctgctctct 3720
cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 3780
tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt aaaccagcag 3840
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg 3900
agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 3960
ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 4020
ccgccgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 4080
gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg tccaatgcta 4140
aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca acgtccgact caacagcagg 4200
ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 4260
ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 4320
tatcagctgg tgcaacccct catgctctcc gatcaaggca gagccaagac aatacccttg 4380
tatctgcgga tcatgtccag ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctatgatgg 4440
aggcgatatc acagagagta agtaaggttg actatcagct agatcttgtc ttgaaacaga 4500
catcctccat ccctatgatg cggtccgaaa tccaacagct gaaaacatct gttgcagtca 4560
tggaagccaa cttgggaatg atgaagattc tggatcccgg ttgtgccaac atttcatctc 4620
tgagtgatct acgggcagtt gcccgatctc acccggtttt agtttcaggc cctggagacc 4680
cctctcccta tgtgacacaa ggaggcgaaa tggcacttaa taaactttcg caaccagtgc 4740
cacatccatc tgaattgatt aaacccgcca ctgcatgcgg gcctgatata ggagtggaaa 4800
aggacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gcccaatgca cccgagttct tcagccaagc 4860
tcctaagcaa gttagatgca gccgggtcga tcgaggaaat caggaaaatc aagcgccttg 4920
ctctaaatgg ctaattacta ctgccacacg tagcgggtcc ctgtccactc ggcatcacac 4980
ggaatctgca ccgagttccc ccccgcagac ccaaggtcca actctccaag cggcaatcct 5040
ctctcgcttc ctcagcccca ctgaatgatc gcgtaaccgt aattaatcta gctacattta 5100
agattaagaa aaaatacggg tagaatcccc gcggggagcc accatggaga cagacacact 5160
cctgctatgg gtactgctgc tctgggttcc aggatccact ggtagtgata caggtagacc 5220
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cgtcattccc tgccgggtta cgtcacctaa catcactgtt actttaaaaa agtttccact 5340
tgacactttg atccctgatg gaaaacgcat aatctgggac agtagaaagg gcttcatcat 5400
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cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg 5940
cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg 6000
cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgcgaggag cagtacaaca gcacgtaccg 6060
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tgtcggcatg atcgatgata aacccaagcg cgagttactt tccgctgcga tgctctgcct 6840
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cctcttcttg catattggac ttatgaccac cgtagatagg aaggggaaga aagtgacatt 7320
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cgactccatc cgcaggatac aagggtctgc aactacatct agaggaagga gacagaaacg 8160
ttttgtaggt gctatcattg gcagtatagc tcttggggtt gcgacagctg cacaagtaac 8220
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gagcattgct gcaaccaatg aagctgtgca cgaggtcact gacggattat cacaactagc 8340
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gaacaatcaa cttagctcat taattagtag tggcctgatc actggcaacc ccattttata 8640
tgactcacag acccaactct taggcataca gataaatgta ccctcagtcg ggagcctaaa 8700
taatatgcgt gccacctact tggagacctt atccgtaagc acaaccaggg ggttcgcctc 8760
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atattgtata gaatctaatc tggatttata ttgtacaagg atagtgacat tccccatgtc 8880
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gattacatgt agatgtgcag accccccagg tatcatatcg caaaattacg gagaagctgt 9060
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ccttgccagg cttcagcaag atgccccaac tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca 11160
tatcccctaa tcttctatag aaaccacacc ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat 11220
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gtggtcaaga ctaataagac ctattgtctc agcattgctg aaatatctaa tactctcttc 11400
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gccaggtctg gctagttgag tcaattataa aggagttgga aagatggcat tgtatcacct 11520
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caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag 17760
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tgggccttgc agcacatccc cccttcgcca g 18931

Claims (10)

1.一种重组的新城疫病毒基因组，其中，所述基因组包括VEGF-Trap的编码基因，所述VEGF-Trap的编码基因位于新城疫病毒基因组的P基因与M基因之间。
2.如权利要求1所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述VEGF-Trap的编码基因处于DNA或RNA的形式；
优选地，所述VEGF-Trap的编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。
3.如权利要求1或2所述的重组的新城疫病毒基因组，其中，所述重组的新城疫病毒基因组的序列以SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5示出。
4.一种重组新城疫病毒，其中，所述病毒包含权利要求1-3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组。
5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒，其中，所述新城疫病毒的出发毒株选自：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ；以及基于所述出发毒株以基因工程手段构建的任意的嵌合毒株。
6.一种编码权利要求1-3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组的DNA分子。
7.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组、权利要求4或5所述的重组新城疫病毒和/或权利要求6所述的DNA分子；
优选地，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料；
优选地，所述药学上可接受的药用辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂或稀释剂。
8.一种制备权利要求4或5所述的重组新城疫病毒的方法，其中，所述方法包括：
(1)将含有VEGF-Trap的编码基因的DNA序列的克隆载体与NDV病毒载体分别进行酶切，并将酶切得到的所述VEGF-Trap的编码基因的DNA序列与所述NDV病毒载体进行连接，得到重组新城疫病毒质粒；
(2)将所述重组新城疫病毒质粒转染至细胞中并对经转染的细胞进行培养，获得所述重组新城疫病毒。
9.如权利要求8所述的方法，其中，采用选自如下的载体构建所述克隆载体：PUC57载体、pMD18-T载体、pMD19-T载体、pBlueScript SK(+/-)载体、pBluescript II KS(+/-)；
优选地，所述NDV病毒载体为选自如下的NDV病毒的基因组的全长cDNA序列：弱毒株LaSota、Hitchner B1、V4，中毒株Mukteswar、Anhinga，强毒株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33、NDV-BJ；
优选地，所述NDV病毒载体为pBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV、pOLTV5-NDV载体；
优选地，将所述重组新城疫病毒质粒与选自如下的辅助质粒共转染至所述细胞中：pTM-NP、pTM-P和pTM-L；pCI-neo-NP、pCI-neo-P和pCI-neo-L；或者pBluescript II KS(+/-)-NP、pBluescript II KS(+/-)-P和pBluescript II KS(+/-)-L；
优选地，所述细胞选自BHK-21细胞、BSR-T7/5细胞、VERO细胞、DF-1细胞、293细胞或MDCK细胞。
10.权利要求1-3中任一项所述的重组的新城疫病毒基因组、权利要求4或5所述的重组新城疫病毒、权利要求6所述的DNA分子和/或权利要求7所述的药物组合物在制备用于治疗或改善癌症的药物中的用途；
优选地，所述癌症选自：结肠癌、肝癌、肺癌、胃癌、直肠癌、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、尿路上皮癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈癌、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑下垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽部癌、宫颈癌、肌肉瘤、子宫癌、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经母细胞瘤、肾癌、星形细胞瘤、胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤、黑色素瘤、急性髓系白血病、骨髓增生异常综合征或肉瘤。
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