JP2024516370A - 組換えニューカッスル病ウイルスｒＮＤＶ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、そのゲノム、そのための調製方法及びその使用 - Google Patents

組換えニューカッスル病ウイルスｒＮＤＶ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ、そのゲノム、そのための調製方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

本出願は、組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、そのゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trap及びそのための調製方法、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子、並びにがんの処置のための薬物の調製における該ゲノム及び組換えニューカッスル病ウイルスの使用に関する。本出願により提供される組換えニューカッスル病ウイルスは、VEGF-Trapのコード遺伝子を組換えニューカッスル病ウイルスのゲノムに挿入することで、そこから得られる組換えニューカッスル病ウイルスが強力な複製能力で複製され、それによって宿主がん細胞を殺傷すること、さらに、組換えニューカッスル病ウイルスが非がん細胞に対して確実な安全性を有し、改善された抗腫瘍効果及び腫瘍溶解効率を示すことに関する。【選択図】図３

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 「Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｅｘｅｒｔｓ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｉｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌ」 ウェブサイトの掲載日２０２２年４月５日 掲載アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０２６４８９６ 出力日２０２３年１１月１４日
本出願は、がん処置のための腫瘍溶解性ウイルスの分野に属し、特に、組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、そのゲノムを含む組換えニューカッスル病ウイルス及びそのための調製方法、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子、並びにその使用に関する。
がんは、身体の細胞の正常な調節の喪失及びその過剰増殖によって引き起こされる疾患である。現在のところ、がんは健康に影響を及ぼす第1の死因になっている。中国は、がん、特に肺がん、胃がん、肝臓がん及び直腸がんが高発生率の地域である。統計によれば、2016年単独で、様々ながん患者の480万の新たな症例が中国で生じ、230万人の患者が様々ながんから死亡した。技術の進展と共に、様々な新たな処置手段、特に生物製剤療法が、継続的に臨床使用に入っている。しかしながら、薬物の安全性、有効性及び患者のクオリティオブライフに対する必要性は、満たされるにはほど遠い。新たな薬物又は処置手段の開発は必須である。
1991年に、Martuzaらは、トランスジェニック単純ヘルペスウイルスが神経膠芽腫の処置においてある特定の効果を有することを実証する論文をScienceに公開した。その後、がんを処置するための腫瘍溶解性ウイルスの開発に注目が増加している。がんの腫瘍溶解性ウイルス処置の原理は、弱い病原性を有する一部の天然に存在するウイルスを遺伝子改変し、それらを腫瘍細胞に選択的に感染させ、細胞内で広く複製させ、最終的に腫瘍細胞を破壊することである。同時に、これはまた、免疫応答を刺激し、免疫細胞を引き寄せて、残っているがん細胞の死滅を継続することができ、又は免疫応答を通して遊走したがん細胞を死滅させることができる。最近数十年間、腫瘍溶解性ウイルスに対する研究は驚異的に進展している。ニューカッスル病ウイルス(NDV)、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)、レオウイルス及び腫瘍溶解性アデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスを開発するために成功裏に使用されているが、それらの臨床所見は予想をはるかに下回っている。例えば、2005年に、CFDAは上市のために腫瘍溶解性アデノウイルス製品H101を承認したが、その治療効果は理想的ではなかった。
NDVはマイナスセンス一本鎖RNAゲノムを有する鳥類パラミクソウイルスであり、常にがん処置のための有望な方法である。しかしながら、単一薬物処置としてのNDVの効果は限定されている。一面において、ヒト身体における抗ウイルス免疫応答はウイルスを排除することができる。別の面において、ヒト身体は中和抗体を産生して、ウイルスに抵抗し、効果に影響を及ぼすことができる。がんにおけるNDVの治療有効性を改善するために、これらのウイルスはその後、それらの活性を更に増強するために、抗腫瘍活性を有する遺伝子を送達するために使用されている。そのような遺伝子は、サイトカイン若しくはそれらの受容体、免疫チェックポイント分子、腫瘍抑制タンパク質又は免疫刺激タンパク質をコードする遺伝子を含む。
そのゲノムにサイトカイン又はそれらの受容体をコードする遺伝子が組み込まれている組換えニューカッスル病ウイルスに対する多くの研究は、以前に本分野において実施されたが、臨床的に有益な進展は行われなかった。例えば、Pascal Buijsら(Recombinant Immunomodulating Lentogenic or Mesogenic Oncolytic Newcastle Disease Virus for Treatment of Pancreatic Adenocarcinoma、Viruses 2015、7、2980～2998頁)は、インターフェロン又はインターフェロンアンタゴニストタンパク質を発現する組換えニューカッスル病ウイルスを研究した。
研究は、血管新生が腫瘍処置のための重要な標的であることを示す。血管新生は、既存の内皮細胞から新たな血管が発生して、様々な器官に十分な酸素及び栄養素を提供するプロセスであり、これは腫瘍成長及び転移に重要である。抗血管新生療法はがん処置のための重要な方法の1つである。腫瘍の新血管形成の間に、腫瘍成長をサポートする血管新生促進因子は主に、血管内皮増殖因子(VEGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、アンジオゲニン及びトランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)を含む。これらの因子は、対応する受容体に結合することによって下流のシグナル伝達経路を活性化し、それによって腫瘍における新たな血管の形成を調節する。
ほとんどの抗血管新生薬は、血管新生促進因子及びそれらの受容体、又は下流のシグナル伝達経路の重要分子を標的にし、それによって腫瘍への栄養素の供給を遮断することを介して腫瘍成長及び転移を阻害する。FDAによって現在承認されている抗血管新生薬には主に、巨大分子モノクローナル抗体及び小分子標的化阻害因子が含まれる。それらのうち、抗血管新生因子には主に、トロンボスポンジン1(TSP-1)、アンジオスタチン、エンドスタチン及びインターフェロン-α(IFN-α)等、並びにVEGF遮断薬/アンタゴニスト、例えば、VEGF-Trap(VEGFRのIgドメインをIgG分子の定常領域と融合することによって得られる)が含まれる。これらの阻害因子は、血管内皮細胞の増殖及び遊走活性を直接阻害することができ、それによって血管新生を阻害し、腫瘍成長及び転移を遮断し、がん処置において有益な効果を示すことができる。しかしながら、抗血管新生薬は著しい治療副作用を有する。
腫瘍溶解性ウイルスの臨床適用を制限する従来技術におけるこの課題、例えば、単一薬物としてのNDVの限定的な治療効果、低奏効率及び低腫瘍阻害率を考慮して、抗腫瘍有効性を改善し、副作用を低減することができる、抗腫瘍活性を有する外因性タンパク質を発現する組換えNDVに対する更なる研究が依然として必要とされている。
本出願の発明者らは、アンジオスタチン及びVEGF-Trapのコード遺伝子をニューカッスル病ウイルスゲノムの特異的位置に組み込むことによって、対応する組換え腫瘍溶解性ウイルスを提供する。薬力学的試験を介して検証された後、組換え腫瘍溶解性ウイルスrNDV-VEGF-Trapの抗腫瘍効果は、rNDV群及びrNDV-アンジオスタチン群の抗腫瘍効果よりも有意に高いことが見出された。これは、強い複製能力を有するがん細胞において再現されて、宿主がん細胞を死滅させることができる一方で、非がん細胞に対する信頼性のある安全性を有し、このようにして上記の技術的課題を解決することができる。
一態様において、本出願は、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムであって、ゲノムが、ニューカッスル病ウイルスゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間に位置するVEGF-Trapをコードする遺伝子を含む、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムを提供する。
別の態様において、本出願は、組換えニューカッスル病ウイルスであって、ウイルスが上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノムを含む、組換えニューカッスル病ウイルスを提供する。
また別の態様において、本出願は、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子を提供する。
また別の態様において、本出願は、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス及び/又はDNA分子を含む、医薬組成物を提供する。
また別の態様において、本出願は、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスを調製するための方法であって、
(1)VEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列を含むクローニングベクター及びNDVウイルスベクターに対してそれぞれ酵素切断を行い、酵素切断から生じたVEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列とNDVウイルスベクターとの間のライゲーションを実施して、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを得ること、
(2)組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養して、組換えニューカッスル病ウイルスを得ること
を含む、方法を提供する。
また別の態様において、本出願は、がんを処置又は改善するための医薬の調製における、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物の使用を提供する。或いは、本出願は、がんの処置又は改善における使用のための、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物を提供する。或いは、本出願は、がんを処置又は改善するための、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物の使用を提供する。或いは、本出願は、がんを処置又は改善する方法であって、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
VEGF-Trapコード遺伝子をニューカッスル病ウイルスゲノムの特異的位置に組み込むことによって、得られた組換え腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果及び腫瘍溶解効率を有意に改善することができる。
本出願の例示的な技術的解決手段をより明確に説明するために、添付の図面が下記に簡潔に導入される。以下の図面が本出願の例示的な技術的解決手段を説明するだけであることが理解されるべきであり、そのため保護範囲を限定するものとして見なされるべきではない。
実施例1における尿膜腔液のウエスタンブロット検出結果を示す図であり、ここで、実施例1において調製された組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapは外因性遺伝子VEGF-Trapを安定に発現することができる。 DF-1細胞に接種されたそれぞれの組換えニューカッスル病ウイルス及び親ウイルスの増殖曲線を示すグラフである。 陰性対照群並びにそれぞれの組換えニューカッスル病ウイルス処置群及び親ウイルス処置群のマウスにおける腫瘍成長曲線を示すグラフである。 陰性対照群並びにそれぞれの組換えニューカッスル病ウイルス処置群及び親ウイルス処置群のマウスの腫瘍阻害結果を示すグラフである。 陰性対照群並びにそれぞれの組換えニューカッスル病ウイルス処置群及び親ウイルス処置群のマウスにおける腫瘍を示す写真である。 陰性対照群並びにそれぞれの組換えニューカッスル病ウイルス処置群及び親ウイルス処置群のHE染色結果を示す図であり、ここで、陰性対照群のマウスの腫瘍組織構造は、密で、無傷の細胞形態及び活発な成長を伴い;rNDV群のマウスの腫瘍病変は崩壊し、腫瘍細胞の構造は比較的緩く;rNDV-アンジオスタチン群のマウスの腫瘍構造は、rNDV群の腫瘍構造と有意に異ならないが、rNDV-VEGF-Trap群のマウスの腫瘍組織病変は広く崩壊し、腫瘍細胞構造は非常に緩く、免疫細胞は複数の場所において浸潤し、腫瘍細胞は個々に散らばっている。 免疫組織化学的染色結果を示す図であり、ここで、陰性対照群のマウスにおけるCD34の発現は豊富であり、rNDV群は陰性対照群に類似するが、rNDV-VEGF-Trap群のマウスにおけるCD34の発現は有意に低減される。 rClone30-Anh-(F)処置群、rClone30-Anh-(F)-アンジオスタチン処置群及びrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap処置群によるマウス肝臓がんモデルにおける腫瘍成長の阻害を示す図である。 実施例1において調製された組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapのゲノム配列を示す図である。 図９－１の続き。 図９－２の続き。 実施例5において調製された組換えニューカッスル病ウイルスrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trapのゲノム配列を示す図である。 図１０－１の続き。 図１０－２の続き。
本出願の例示的な実施形態を下記に記載するが、本出願の保護範囲はそれらに限定されない。他に定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有し、これは例えば、Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 第2版、J. Wiley & Sons (New York、NY 1994); Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor、NY 1989)に見ることができる。
他に規定されない限り、本明細書における「処置」という用語は、統計学的に有意な様式で疾患若しくは関連症状を治癒すること、低減すること、軽減すること、減速させること、緩和すること若しくは寛解させること、又は疾患若しくは関連症状の開始若しくは更なる発生を予防すること、遅延させること、停止すること、中断すること若しくは休止することを意味する。
他に規定されない限り、成分の量、測定値又は反応条件を表すために本明細書において使用される数は全て、可能な測定誤差を示す「約」という用語によって全ての場合において修飾されていると理解されるべきである。例えば、パーセンテージに接続されている場合、「約」という用語は、それを限定する目的の値の±1％、例えば、±0.5％の範囲内の変動を表すことができる。
他に規定されない限り、本明細書における単数形の用語は複数の指示対象を包含し、逆もまた同様である。同じく、その文脈において他が明確に指示されない限り、「又は」という用語は「及び」を含むことが意図され、逆もまた同様である。
他に規定されない限り、本明細書における「含む(comprise、comprises及びcomprising)」という用語又はそれらの等価物(例えば、含有する(contain、containing)、含む(include、including))は、オープンエンドの表現であり、「含むが、それに限定されない」として理解されるべきであり、これはリストされた要素、構成要素及び工程に加えて、他の規定されていない要素、構成要素及び工程も包含され得ることを意味する。
本明細書における配列間の同一性パーセンテージ(相同性の度合い)は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために通常使用される自由に利用可能なコンピュータプログラム、例えば、BLASTp又はBLASTnをデフォルト設定で使用して2つの配列を整列させることによって決定することができる。
ニューカッスル病ウイルス(NDV)はモノネガウイルス目(Mononegavirales)、パラミクソウイルス科(Paramyxoviridae)に属し、エンベロープを有し、ヌクレオカプシドは、エンベロープ内に位置し、RNAゲノム及びヌクレオカプシドタンパク質を含有する。古典的なニューカッスル病ウイルスのゲノムの長さは約15～16kbであり、3'末端から5'末端の方向にNP遺伝子、P遺伝子、M遺伝子、F遺伝子、HN遺伝子及びL遺伝子を含み、これは以下の6つの主なタンパク質:ヌクレオカプシドタンパク質(NP)、ホスフェートタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質(HN)及び大型タンパク質(L)をコードするために使用される。
一実施形態において、本出願は、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムであって、ゲノムがVEGF-Trapコード遺伝子を含み、VEGF-Trapコード遺伝子がニューカッスル病ウイルスゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムに関する。
一部の好ましい実施形態において、VEGF-Trapコード遺伝子はDNA又はRNAの形態であり得る。
一部の好ましい実施形態において、VEGF-Trapコード遺伝子は配列番号1に示される配列又はそれと少なくとも80％(例えば、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％又は99％)の同一性を有する配列を有する。
一部の好ましい実施形態において、組換えニューカッスル病ウイルスゲノムの配列は配列番号2又は配列番号5に示される(図9及び10を参照されたい)。
一実施形態において、本出願は、組換えニューカッスル病ウイルスであって、ウイルスが上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノムを含む、組換えニューカッスル病ウイルスに関する。
一部の好ましい実施形態において、ニューカッスル病ウイルスの出発株は、限定されるものではないが、低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJ;及びそれらに限定されるものではないが、出発株に基づいて遺伝子操作手段によって構築された任意のキメラ株から選択することができる。
一実施形態において、本出願は上記に記載される組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子(例えば組換えニューカッスル病ウイルスプラスミド)に関する。
一態様において、本出願は、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス及び/又はDNA分子を含む、医薬組成物に関する。
一部の好ましい実施形態において、医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤を更に含む。薬学的に許容される賦形剤は、例えば限定されるものではないが、溶媒、噴霧剤、可溶化剤、共溶媒、乳化剤、着色剤、崩壊剤、フィラー、滑沢剤、湿潤剤、浸透圧調節剤、安定剤、流動促進剤、香味剤、保存剤、懸濁化剤、抗酸化剤、浸透増強剤、pH調整剤、界面活性剤、希釈剤等から選択することができる。他の利用可能な薬学的に許容される薬学的賦形剤について、それらは例えば「Handbook of Pharmaceutical Excipients」(第4版)、R.C. Roweら編、Junmin ZHENG訳、2005、Chemical Industry Pressに見出すことができる。
一実施形態において、本出願は、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスを調製するための方法であって、
(1)VEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列を含むクローニングベクター及びNDVウイルスベクターに対してそれぞれ酵素切断を行い、酵素切断から生じたVEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列とNDVウイルスベクターとの間のライゲーションを実施して、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを得ること、
(2)組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養して、組換えニューカッスル病ウイルスを得ること
を含む、方法に関する。
一部の好ましい実施形態において、クローニングベクターは、PUC57ベクター、pMD18-Tベクター、pMD19-Tベクター、pBlueScript SK(+/-)ベクター、pBluescript II KS(+/-)から選択されるベクターを使用して構築することができる。
一部の好ましい実施形態において、NDVウイルスベクターは、それらに限定されるものではないが、低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJから選択されるNDVウイルスのゲノムの全長cDNA配列であり得る。
好ましくは、NDVウイルスベクターはpBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV又はpOLTV5-NDVベクターであり得る。
本開示において、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドは、ヌクレオカプシドタンパク質NP、ホスホプロテインP及びRNA依存性RNAポリメラーゼLを発現することができるヘルパープラスミドNP、P及びL(当技術分野において公知の任意の真核生物発現ベクターにNP、P及びL遺伝子を構築することから得られる任意のNP、P及びL組換えプラスミドであり得る)と共に細胞に共トランスフェクトされる。本開示において、ヘルパープラスミドNP、P及びLの遺伝子は、NDVの任意の株、例えば、LaSota、Anhinga、F48E9等に由来し得る。一部の好ましい実施形態において、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドは、それらに限定されるものではないが、pTM-NP、pTM-P及びpTM-L;pCI-neo-NP、pCI-neo-P及びpCI-neo-L;又はpBluescript II KS(+/-)-NP(pBL-NP)、pBluescript II KS(+/-)-P(pBL-P)及びpBluescript II KS(+/-)-L(pBL-L)から選択されるヘルパープラスミドと共に細胞に共トランスフェクトされる。
本明細書におけるトランスフェクションは、外因性核酸基質(DNA及びRNAを含む)を細胞に導入する技術であり、主に3つの経路:物理的媒介(エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及び遺伝子銃)、化学的媒介(リン酸カルシウム共沈殿、リポソームトランスフェクション、カチオン性基質媒介)及び生物学的媒介(プロトプラストトランスフェクション、ウイルス媒介トランスフェクション)が含まれる。具体的な操作は、適切な実験条件及び工程を選択することにより当技術分野における一般的な知識(例えば、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(第4版)、J. Sambrookら編、Fuchu HE訳、Science Press、2017に見ることができる)に基づいて当業者によって実行することができ、又は市販のキットにおける指示に従って実行することができる。
一部の好ましい実施形態において、細胞は、限定されるものではないが、BHK-21細胞、BSR-T7/5細胞、VERO細胞、DF-1細胞、293細胞及びMDCK細胞から選択することができる。
本明細書におけるトランスフェクトされた細胞の培養は、細胞の種類に従って慣用的な培養培地及び培養条件(「Cell Culture (第3版)」、編集責任者Bin LIU、World Publishing Corporation、2018年1月;「Cell Culture Technology」、編集責任者Rong LAN及びZhenhui ZHOU、Chemical Industry Press、2007年8月;「Tissue and Cell Culture Technology(第3版)」、編集責任者Jingbo ZHANG、People's Medical Publishing House、2014年6月等)を選択することによって、当業者であれば行うことができる。
一実施形態において、本出願は、がんを処置又は改善するための医薬の調製における、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物の使用に関する。
或いは、本出願は、がんの処置又は改善における使用のための、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物を提供する。或いは、本出願は、がんを処置又は改善するための、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物の使用を提供する。或いは、がんを処置又は改善する方法であって、上記で述べた組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物をそれを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
一部の好ましい実施形態において、がんは、限定されるものではないが、結腸がん、肝臓がん(例えば肝細胞癌)、肺がん(例えば非小細胞肺がん、小細胞肺がん)、胃がん、直腸がん、白血病、リンパ腫、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、膀胱がん、尿路上皮癌、気管支癌、骨がん、前立腺がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部がん、精巣がん、内分泌腺癌、副腎がん、下垂体がん、皮膚がん、軟部組織がん、血管腫、脳がん、神経癌、眼がん、髄膜腫、中咽頭がん、下咽頭がん、子宮頸がん、筋肉腫、子宮がん、神経膠芽腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は肉腫から選択され得る。
本発明の例示的な技術的解決手段を、以下の番号付け項における内容により説明することができる。
1. 組換えニューカッスル病ウイルスゲノムであって、ゲノムがVEGF-Trapコード遺伝子を含み、VEGF-Trapコード遺伝子がニューカッスル病ウイルスゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する、組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
2. VEGF-Trapコード遺伝子がDNA又はRNAの形態である、項1に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
3. VEGF-Trapコード遺伝子が配列番号1に示される配列又はそれと少なくとも80％の同一性を有する配列を有する、項1又は2に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
4. 組換えニューカッスル病ウイルスゲノムの配列が配列番号2又は配列番号5に示される、項1から3のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
5. 組換えニューカッスル病ウイルスであって、ウイルスが項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノムを含む、組換えニューカッスル病ウイルス。
6. ニューカッスル病ウイルスの出発株が低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJ;及び出発株に基づいて遺伝子操作手段によって構築された任意のキメラ株から選択される、項5に記載の組換えニューカッスル病ウイルス。
7. 項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子。
8. 項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、項5若しくは6に記載の組換えニューカッスル病ウイルス、及び/又は項7に記載のDNA分子を含む、医薬組成物。
9. 医薬組成物が薬学的に許容される賦形剤を更に含む、項8に記載の組換えニューカッスル病ウイルス。
10. 薬学的に許容される賦形剤が溶媒、噴霧剤、可溶化剤、共溶媒、乳化剤、着色剤、崩壊剤、フィラー、滑沢剤、湿潤剤、浸透圧調節剤、安定剤、流動促進剤、香味剤、保存剤、懸濁化剤、抗酸化剤、浸透増強剤、pH調整剤、界面活性剤又は希釈剤等から選択される、項8又は9に記載の組換えニューカッスル病ウイルス。
11. 項5又は6に記載の組換えニューカッスル病ウイルスを調製するための方法であって、
(1)VEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列を含むクローニングベクター及びNDVウイルスベクターに対してそれぞれ酵素切断を行い、酵素切断から生じたVEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列とNDVウイルスベクターとの間のライゲーションを実施して、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを得ること、
(2)組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養して、組換えニューカッスル病ウイルスを得ること
を含む、方法。
12. クローニングベクターがPUC57ベクター、pMD18-Tベクター、pMD19-Tベクター、pBlueScript SK(+/-)ベクター、pBluescript II KS(+/-)から選択されるベクターを使用して構築される、項11に記載の方法。
13. NDVウイルスベクターが低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJから選択されるNDVウイルスのゲノムの全長cDNA配列である、項11又は12に記載の方法。
14. NDVウイルスベクターがpBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV又はpOLTV5-NDVベクターである、項13に記載の方法。
15. 組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドがpTM-NP、pTM-P及びpTM-L;pCI-neo-NP、pCI-neo-P及びpCI-neo-L;又はpBluescript II KS(+/-)-NP、pBluescript II KS(+/-)-P及びpBluescript II KS(+/-)-Lから選択されるヘルパープラスミドと共に細胞に共トランスフェクトされる、項11から14のいずれか一項に記載の方法。
16. 細胞がBHK-21細胞、BSR-T7/5細胞、VERO細胞、DF-1細胞、293細胞又はMDCK細胞から選択される、項11から15のいずれか一項に記載の方法。
17. がんを処置又は改善するための医薬の調製における、項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、項5若しくは6に記載の組換えニューカッスル病ウイルス、項7に記載のDNA分子及び/又は項8から10のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
18. がんが結腸がん、肝臓がん、肺がん、胃がん、直腸がん、白血病、リンパ腫、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、膀胱がん、尿路上皮癌、気管支癌、骨がん、前立腺がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部がん、精巣がん、内分泌腺癌、副腎がん、下垂体がん、皮膚がん、軟部組織がん、血管腫、脳がん、神経癌、眼がん、髄膜腫、中咽頭がん、下咽頭がん、子宮頸がん、筋肉腫、子宮がん、神経膠芽腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は肉腫から選択される、項17に記載の使用。
本出願の実施例の目的、技術的課題及び利点を明らかにするために、本出願の実施例における技術的課題を明確且つ完全に下記に記載する。具体的な条件が実施例において与えられない場合に、実施例は、慣用的な条件又は製造業者によって推奨された条件に従って行われる。他に述べられない限り、使用される試薬、材料又は装置は、製造業者が示さない場合に、商業的に購入することができる慣用的な製品である。以下に、本出願の特徴及び性能の更に詳細な記載を実施例と併せて提供する。
[実施例]
他に述べられない限り、本出願に含まれる、遺伝子の設計、合成及びクローニングの操作、並びにベクターの構築及びトランスフェクション、及び電気泳動等は当技術分野において公知の技法(例えばCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYにおける記録を参照されたい)に従って行うことができる。具体的に規定されていない場合、実施例において使用される技術的手段は、当業者に周知の慣用的な手段である(例えば、「Principle and Experimental Technology of Molecular Virology」、編集責任者Wei PAN、Shanghai Second Military Medical University Press、2002年11月;「Fundamentals and Experimental Technologies of Medical Virology」、編集責任者Zhenxiang HUANG、Science Press、1990年2月等を参照されたい)。
以下の実施例は以下の外因性遺伝子:血管阻害因子遺伝子VEGF-Trap及びヒト由来アンジオスタチン遺伝子アンジオスタチン(Genbankアクセッション番号NG_016200.1)を含む。
pMD19-TはTaKaRa Bioengineering (Dalian) Co., Ltd.(Dalian TaKaRa Company)から購入した。BHK-21細胞(ベビーハムスター腎細胞)、ヒト結腸がん細胞HCT116、マウス結腸がん細胞CT26、マウス乳がん細胞4T1及びヒト臍帯静脈内皮細胞EA.hy926は全てATCCから購入した。
DMEM(高グルコース)培地、McCoyの5A培地、RPMI 1640培地、トリプシン、仔ウシ血清(FCS)及びウシ胎仔血清(FBS)はGIBCO companyから購入した。SPFニワトリ胚はBeijing Boehringer Ingelheim Viton Biotechnology Co., Ltd.から購入した。Balb/cマウス(Kunmingマウス)はSipeifu (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.から購入した。
[実施例1]
組換えニューカッスル病ウイルスの調製
I. 外因性遺伝子が挿入された組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドの構築(例えばpBrNDV-VEGF-Trapを得る)
Jocelyn Holashら(VEGF-Trap: A VEGF blocker with potent antitumor effects、2002年8月;https://doi.org/10.1073/pnas.172398299)の文献の記録に従って、以下の通り示されたVEGF-Trap遺伝子の配列(配列番号1)を得た。
Figure 2024516370000002
Figure 2024516370000003
組換えプラスミドpBrNDV-VEGF-Trapを以下の方法に従って構築した。
1. Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.によって、SacII酵素(5')及びPmeI酵素(3')の酵素切断部位を含有するVEGF-Trap遺伝子を合成し、pUC57ベクターにライゲーションして、pUC57-VEGF-Trapを形成し、これをその後の実験のために使用した。
2. 工程1のプラスミドpUC57-VEGF-Trapを、製造業者の指示に従って、制限エンドヌクレアーゼPmeI及びSacII(NEB Companyから購入)によって切断した。酵素切断産物を核酸アガロースゲル電気泳動によって同定した。酵素切断産物が正しいと同定された後、酵素切断産物を製造業者の指示に従って、ゲル精製キット(Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.から購入、カタログ番号:DP219)によって回収した。
3. プラスミドpBrNDV(NEBから購入)を、製造業者の指示に従って、制限エンドヌクレアーゼPmeI及びSacIIによって切断し、プラスミドベクターを、製造業者の指示に従って、ゲル精製キット(Tiangen Biotech (Beijing) Co., Ltd.から購入、カタログ番号:DP219)によって回収した。
4. 工程2の酵素切断産物を、製造業者の指示に従って、T4 DNAリガーゼ(NEBから購入)を使用することによって工程3のベクターにライゲーションして、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドpBrNDV-VEGF-Trapを得、ここでVEGF-Trap遺伝子は、プラスミドのP遺伝子とM遺伝子との間に挿入された。PCRを、製造業者の指示に従って、上記の組換えプラスミド(上流プライマー:5'
Figure 2024516370000004
3'(配列番号3);下流プライマー:5'
Figure 2024516370000005
3'(配列番号4))を用いて、Takara Bio taq酵素(Takara Bioから購入)を使用して行い、二重酵素消化の同定をPmeI及びSacII(37℃、1時間)を用いて行い、正しいプラスミド試料を、パッケージングし、シークエンシングのためにSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.に送った。シークエンシング結果を、配列分析ソフトウェアDNAMANを使用して整列させた。シークエンシング後、配列決定された配列は標的配列と一致した。
外因性アンジオスタチン遺伝子(NG_016200.1)が挿入された以下の組換えプラスミドpBrNDV-アンジオスタチンを、上記と同じ方法を使用して、構築及び同定した(PCR増幅のためのプライマーは上記と同じであった)。
II. 組換えニューカッスル病ウイルスの調製
組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapを、上記の組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを使用して、以下の方法によって調製した。
1. リポソームトランスフェクション技術を使用して、成功裏に構築された組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドpBrNDV-VEGF-Trapを、3つのヘルパープラスミドpBL-NP、pBL-P及びpBL-L(Jinying GE、Basic and applied research on reverse genetic operation of Newcastle disease virus、2006に記載された方法に従って構築)と共に、T7 RNAポリメラーゼを安定に発現する単層BHK-21細胞に共トランスフェクトした。操作工程は、Lipofectamine 3000トランスフェクション試薬(Invitrogenから購入)の指示に従って行った。72時間のインキュベーション後、-80℃での凍結及び解凍を3回繰り返し、4℃で12000rpmで遠心分離して、上清を収集し、それに0.001％トリプシンを添加した。
2. 工程1において得られた上清の200μLを取り、9日齢のSPFグレードニワトリ胚の尿膜腔に接種し、次いで37℃、5％CO2のインキュベーターにおいて72時間培養して、尿膜腔液を得た。赤血球凝集力価試験を行った(例えば、Ling ZHOU、Yanfang LI、Xiali MA、Isolation and Identification of a chicken-derived Newcastle disease virus [J]、Zhejiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine、2015、40(03):8～10頁に記載される方法)。陽性の尿膜腔液を、-80℃の冷却装置で凍結及び保管し、成功裏にレスキューされた組換えニューカッスル病ウイルスをrNDV-VEGF-Trapと名付けた。
3. 組換えウイルスRNAを、QIAamp Viral RNA Mini Kit(50)の指示に従って、工程2において得られた組換えニューカッスル病ウイルスから抽出し、cDNA試料をランダムプライマーによって得た。RT-PCR増幅(Thermo Fisher RT-PCRキット、cDNAの第1の鎖を合成し、PCRをキットの指示に従って行った)を、挿入されたVEGF-Trap遺伝子について、P/M部位プライマーのP/M-F(その配列は配列番号3と同じであった)及びP/M-R(その配列は配列番号4と同じであった)を使用して行った。増幅されたPCR産物をシークエンシングのためにSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.に送った。シークエンシング結果を、配列分析ソフトウェアDNAMANを使用して整列させた。シークエンシング後、配列決定された配列は標的配列と一致した。
4. 工程3において正しいと配列決定された外因性遺伝子を有するウイルスを取り、9～11日齢のSPFグレードニワトリ胚の尿膜腔に接種し、37℃で72時間培養した。ニワトリ胚尿膜腔液を、HA検出のために収集した(例えば、Ling ZHOU、Yanfang LI、Xiali MA、Isolation and Identification of a chicken-derived Newcastle disease virus [J]、Zhejiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine、2015、40(03):8～10頁に記録された関連する方法を参照することによって行った)。29よりも高いHA力価を有する尿膜腔液を混合のために選択し、次いで使用のためにパッケージングした。
5. それぞれの群の尿膜腔液を、ウエスタンブロットのために収集及び使用して(例えば、An Yら、Recombinant Newcastle disease virus expressing P53 demonstrates promising antitumor efficiency in hepatoma model [J]. Journal of Biomedical Science、2016 23(1):55頁に記録された関連する方法を参照することができる)、それぞれの外因性遺伝子の発現を検出した。結果は、組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapが外因性遺伝子VEGF-Trapを安定に発現することができることを示した(図1を参照されたい)。
同じく、組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-アンジオスタチンを、上記の方法に従って調製した。
以下の記載において、他に規定されない限り、rNDV-VEGF-Trap及びrNDV-アンジオスタチンは、組換えプラスミドpBrNDV-VEGF-Trap及びpBrNDV-アンジオスタチンをそれぞれ使用して上記の方法によって調製された組換えウイルスを指す。
以下の実施例2～3における親ウイルスは、以下の改変を介して得られたウイルスを指す:ニューカッスル病ウイルスLaSota(Harbin Veterinary Epidemic Prevention Stationから購入)から出発し、Yong WANGら(Evaluation of Newcastle disease virus with derivated Hemagglutinin-Neuraminidase gene of mesogenic strain、Acta Microbiologica Sinica、2008、48(5): 638～643頁)に記載される「遺伝子置き換え」の操作方法に従って、LaSota株のF遺伝子をニューカッスル病ウイルスの高病原性株F48E9(GenBankアクセッション番号:AY508514.1)のF遺伝子で置き換える。本明細書において親株をrNDVと名付けた。
[実施例2]
組換えウイルスの増殖安定性の検出
TCID50の検出を以下の方法に従って行った。
1. 10,000個のDF-1細胞を、10％FBS及び1％抗生物質が補充されたDMEM培地で、96ウェルマイクロプレートに接種し、37℃、5％CO2のインキュベーターにおいて終夜培養した。
2. それぞれの組換えニューカッスル病ウイルス(rNDV-VEGF-Trap及びrNDV-アンジオスタチン)及び親ウイルスを接種する前に、工程1のプレート中の元の細胞培養培地を廃棄し、そこに180μLの10％尿膜腔液及び1％抗生物質が補充された新鮮なDMEM培養培地を添加した。
3. 20μLの各組換えニューカッスル病ウイルス及び親ウイルスをそれぞれ、ウェルの上2列に接種した。ピペッティングによって混合した後、20μLのそれぞれの混合溶液を、連続10倍グラジエント希釈のために、下のウェルに分注した。それぞれのウイルスを三反復で構成した。
4. 接種された組換えニューカッスル病ウイルス及び親ウイルスを37℃、5％CO2のインキュベーターにおいて1時間インキュベートした後、培養培地を廃棄し、0.2mLの1×PBS緩衝液で1回洗浄し、そこに200μLの10％尿膜腔液及び1％抗生物質が補充された新鮮なDMEM培養培地を添加した。
5. 培養を37℃、5％CO2のインキュベーターにおいて継続し、細胞病変孔を12時間、24時間、36時間、48時間、60時間及び72時間後に光学倒立顕微鏡下で観察し、病変孔の数をそれぞれ記録した。ウイルスの力価をReed及びMuench法を使用して算出し、増殖曲線を描いた。
結果を図2に示した。組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trap及びrNDV-アンジオスタチンの増殖傾向は、親ウイルスと有意に異ならず、外因性遺伝子の挿入はウイルス増殖に影響を及ぼさなかったことを示した。
[実施例3]
腫瘍に対する組換えニューカッスル病ウイルスの治療効果
1 Balb/cマウス結腸がん腫瘍担持動物モデルの確立
マウス結腸がん細胞CT26を取り、トリパンブルーで染色して、細胞生存率が95％以上であったことを決定し、これを生理的食塩水で1×106/mLの細胞懸濁液に希釈し、細胞懸濁液を、Balb/cマウスあたり0.1mLの用量で右腹部に皮下注射した。8～12日後、固形腫瘍の直径が5～8mmに達し、これはモデルが成功裏に構築され、その後の実験を行うことができることを示す。腫瘍の形状及びサイズの大きな相違を有する個体を排除し、5～8mmの直径の腫瘍を有するマウスをモデルマウスとして選択した。
2 腫瘍に対する組換えウイルスの治療効果
モデルマウスを、群あたり10頭のマウスで4群に無作為に分け、以下の通り処置した:
rNDV-VEGF-Trap群:実施例1において調製されたrNDV-VEGF-Trapウイルスの0.2mLのPBS懸濁液(1×PBS緩衝液を用いて調製;107pfuのウイルスを含有)を14日間毎日モデルマウスの腫瘍に注射した;
rNDV-アンジオスタチン群:実施例1において調製されたrNDV-アンジオスタチンウイルスの0.2mLのPBS懸濁液(1×PBS緩衝液を用いて調製;107pfuのウイルスを含有)を14日間毎日モデルマウスの腫瘍に注射した;
rNDV群:親ウイルスの0.2mLのPBS懸濁液(1×PBS緩衝液を用いて調製;107pfuのウイルスを含有)を14日間毎日モデルマウスの腫瘍に注射した;
陰性対照群(モデル群):0.2mLのSPFニワトリ胚尿膜腔液を14日間毎日モデルマウスの腫瘍に注射した。
処置の日から、腫瘍体積を1日置きに測定し、腫瘍成長曲線を測定結果に基づいて作成した(図3)。処置後、マウスを安楽死させ、腫瘍を取り出し、腫瘍の重量及びサイズを測定した(その結果を図4及び図5に示した)。陰性対照群の平均腫瘍体積は1889.17mm3であり、親NDV(rNDV)処置群の平均腫瘍体積は728.49mm3であり、rNDV-アンジオスタチン処置群の平均腫瘍体積は774.37mm3であり、rNDV-VEGF-Trap処置群の平均腫瘍体積は350.36mm3であった。結果は、陰性対照群と比較して、親ウイルス及び組換えニューカッスル病ウイルスの両方が腫瘍成長に対して有意な阻害効果を有していたことを示し、ここで、rNDV-アンジオスタチンの抗腫瘍効果はrNDV群と有意差はなかったが、rNDV-VEGF-Trapの抗腫瘍効果はrNDV群よりも有意に高かった。
3 腫瘍の病理学的切片の観察
結腸がん及び関連する血管に対する組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapの阻害効果を観察するために、マウスのそれぞれの群からの腫瘍組織を取り、4％パラホルムアルデヒドで固定した。腫瘍組織のパラフィン切片を、以下の通り、4μm厚で調製した。それぞれの群の腫瘍組織の形態をHE染色後に顕微鏡下で観察し、それぞれの群の腫瘍組織におけるCD34タンパク質の発現を免疫組織化学的染色によって検出した。具体的な操作は以下の通りであった。
3.1 パラフィン切片の調製
(1)パラフィンを1Lのビーカーに入れ、そこにミツロウを添加し、それを60℃のワックスボックスに入れた。ワックスが完全に溶融したら、ろ紙でろ過し、取り出し、室温に冷却し、次いでワックスボックスに戻して溶融させ、2～3回繰り返した。
(2)スライドを、調製した洗浄溶液(濃重クロム酸カリウム溶液:25gの重クロム酸カリウム、75mLの水、400mLの濃硫酸)に1つずつ入れ、24時間浸漬し、水道水で十分にすすぎ、95体積％アルコールに24時間更に浸漬し、次いでスライドをレンズ紙で乾燥させ、180℃で6時間の乾式加熱によって滅菌した。滅菌後、スライドを、APES処理薬剤(APES:アセトン=1:50)を含有する染色バットに1つずつ5分間浸漬した。取り出した後、スライドを蒸留水で2回すすぎ、スライスボックスに入れ、その後の使用のために60℃で乾燥させた。
(3)上記の処理後、それぞれの群のマウスの肺組織を取り、事前調製された4％中性ホルムアルデヒド固定溶液中で48時間固定した。組織を取り出し、組織ブロックを、ブレードで約1cmのサイズにトリミングした。
(4)脱水及び透明化:30体積％エタノール-30分、50体積％エタノール-30分、70体積％エタノールを4℃で終夜、翌日、80体積％エタノール-30分、90体積％エタノール-30分、100体積％エタノール-30分(2回)。ドラフトチャンバーにおいて、脱水した組織を、キシレン:無水エタノール=1:1を有する染色バットに浸漬し、20分間すすぎ、次いで純キシレン中で20分間すすぎ、2回繰り返した。この後、組織ブロックの色が濃く透明になり、キシレン溶液が透き通る。
(5)ワックスディッピング:透明な組織を(1)において完全に溶融したパラフィンに移し、60℃のインキュベーターに120分間入れた。
(6)包埋:ワックスボックス中のパラフィンをペーパーボックスに注ぎ、小さなピンセットを使用して、組織ブロックを順番に配置し、切断面が下を向くのを確実にした。
(7)パラフィンブロックトリミング:ペーパーボックス中のパラフィンが固化した後、パラフィンブロックを取り出し、ブレードを使用して台形にトリミングした。組織の端とパラフィンブロックの端との距離は2mm未満であってはならない。
(8)切片化:切片化を約4μm厚で連続して行った。切片を、約40℃のWater Bath-Slide Drierの水浴に広げた。(2)において処理されたスライドを使用して、水浴から切片を取り出し、それをWater Bath-Slide Drierのフレームに置いた。わずかに乾燥した後、それらを直ぐに37℃のオーブンに終夜入れて、切片をスライドに近づけ、透明にした。終夜そのままにした後、スライドをスライドボックスに入れ、使用の準備をした。
3.2 HE染色
(1)脱ワックス:ワックスボックスを60℃の温度に予熱したら、調製した腫瘍組織切片を60℃のオーブンに1時間入れ、切片上のパラフィンが溶融した後、キシレンに5分間浸漬した(3回)。無水エタノール-2分;90体積％エタノール-5分;80体積％エタノール-5分;70体積％エタノール-5分;50体積％エタノール-5分;水-5分(3回)。
(2)染色:切片をヘマトキシリンで30秒間染色し、次いで蒸留水で1分間すすぎ、切片をエオシン染色バットに挿入し、直ぐに取り出し、蒸留水に1分間浸漬した(3回)。
(3)脱水:50体積l％エタノール-1分;70体積l％エタノール-1分;80体積l％エタノール-1分;90体積l％エタノール-1分;100体積l％エタノール-5分(2回);キシレン1～5分(2回)。
(4)中性ガムシーリング:カバーガラスを乾燥後の平面に置き、その中央に1～2滴の中性ガムを添加し、スライドの組織側をカバーガラスで穏やかに覆い、中性ガムをカバーガラスに沿って完全に広げ、次いで、スライドを傾け、ろ紙を使用して、気泡の発生を回避するために注意深く過剰のキシレンを吸収した。スライドを乾燥させ、スライドボックス中で保管し、マウスのそれぞれの群における腫瘍組織の病理学的な変化を顕微鏡下で観察及び比較した。
3.3 免疫組織化学的染色
1. 脱ワックス及び水和:調製されたパラフィン切片を、脱ワックスのためにキシレンに2回、毎回5分間浸漬した。次いで、それを100体積％、95体積％、90体積％、80体積％及び70体積％様々なレベルのアルコール溶液にそれぞれ5分間入れ、次いで蒸留水で2回、毎回3分間すすいだ。
2. 抗原回復:0.01Mクエン酸ナトリウム緩衝液(pH=6.0)を水浴中で95℃に加熱し、次いでスライドをそこに入れ、10分間加熱した。それを1×PBS緩衝液で3回、毎回5分間すすいだ。
3. 内因性ペルオキシダーゼの不活性化:適切な量の内因性ペルオキシダーゼブロッキング緩衝液(Beyotimeから購入、カタログ番号P0100A)を試料を完全に覆うように滴下し、それを室温で10分間インキュベートした。それを1×PBS緩衝液で3回、毎回3分間洗浄した。
4. ブロッキング:ブロッキング緩衝液(Beyotimeから購入、カタログ番号P0260 QuickBlock)を組織切片をブロックするように10分間滴下した。
5. 一次抗体のインキュベーション:ブロッキング緩衝液を使用して、抗体の指示における希釈比に従って、CD34一次抗体使用液(Abcamから購入)を調製した。一次抗体使用液を、それぞれの組織切片に滴下し、4℃で終夜インキュベートした。一次抗体(抗CD34抗体、Abcamから購入)とのインキュベーション後、組織切片を1×PBST緩衝液で3回、毎回5分間洗浄した。
6. 二次抗体のインキュベーション:ブロッキング緩衝液を使用して、抗体の指示における希釈比に従って、ヤギ抗ウサギ二次抗体(Abcamから購入)の使用液を調製した。二次抗体使用液を、それぞれの組織切片に滴下し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、組織切片を1×PBST緩衝液で3回、毎回5分間洗浄した。
7. 発色:100μLのDAB発色使用液(Beyotimeから購入)を、試料を完全に覆うように滴下した。インキュベーションを、室温で、暗所で15分間行った。発色後、DAB発色使用液を除去し、それを蒸留水で1～2回洗浄して、発色反応を停止させた。
結果は、処置後、陰性対照群(モデル群)のマウスの腫瘍組織構造は、密で、無傷の細胞形態及び活発な増殖を伴い;rNDV群のマウスの腫瘍病変は崩壊し、腫瘍細胞の構造は比較的緩く;rNDV-アンジオスタチン群のマウスの腫瘍構造は、rNDV群の腫瘍構造と有意に異ならなかったが、rNDV-VEGF-Trap群のマウスの腫瘍組織病変は広く崩壊し、腫瘍細胞構造は非常に緩く、免疫細胞は多くの場所において浸潤し、腫瘍細胞は個々に散らばっていたことを示した(図6を参照されたい)。免疫組織化学的染色結果は、モデル群のマウスにおけるCD34の発現は豊富であり、rNDV群は陰性対照群に類似したが、rNDV-VEGF-Trap群のマウスにおけるCD34の発現は有意に低減されたことを示した。rNDV-VEGF-Trapが血管内皮細胞の増殖の阻害に対する治療効果を有していたことを示した(図7を参照されたい)。
[実施例4]
組換えニューカッスル病ウイルスの安全性試験
健康な6週齢のSPFグレードのBalb/cマウスを選択し、群あたり10頭のマウスに群分けした。対照群のマウスは普通に給餌した。試験群のそれぞれのマウスに、5×108pfu(治療用量の10倍)の組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapを腹腔内注射し、次いで30日間観察した。明らかな有害反応、例えば、気力低下、逆立った毛皮及び死亡を有するマウスを陽性と見なした。
結果は、注射の2日目に、試験群の3頭のマウスの毛皮が立ち、その食餌及び水摂取は影響を受けなかったことを示した。組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapの1週間の継続的な注射後、試験群のマウスの毛皮は正常に戻った。1か月間の継続的な観察後、試験群のマウスは任意の明らかな有害な反応(気力低下及び逆立った毛皮を含む)を示さず、マウスは死亡しなかった。
したがって、本出願において調製された組換えニューカッスル病ウイルスrNDV-VEGF-Trapは良好な安全性を有していた。
[実施例5]
以下の実施例において提供される親株としての腫瘍溶解性ウイルスrClone30-Anh-(F)は以下の改変を介して得た:ニューカッスル病ウイルスLaSota株(Harbin Veterinary Epidemic Prevention Stationから購入)から出発し、Yong WANGら(Acta Microbiologica Sinica、2008、48(5): 638～643頁、上記)に記載される「遺伝子置き換え」の操作方法に従って、LaSota株のF遺伝子をニューカッスル病ウイルスの中病原性株Anhinga(GenBankアクセッション番号:EF065682.1)のF遺伝子で置き換える。この実施例においてVEGF-Trapを発現する組換えニューカッスル病ウイルスのゲノムは配列番号5に示し(図10を参照されたい)、VEGF-Trapの核酸配列は配列番号1に示した。
最初に、実施例1に記載された方法に従って、VEGF-Trap遺伝子(配列番号1)及びアンジオスタチン遺伝子(NG_016200.1)を使用して、対応する組換えニューカッスル病ウイルスプラスミド及び組換えニューカッスル病ウイルスをそれぞれ構築し、組換えニューカッスル病ウイルスを成功裏にレスキューした。成功裏にレスキュー及び同定された正しい組換えニューカッスル病ウイルスをそれぞれrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap及びrClone30-Anh-(F)-アンジオスタチンと名付けた。
次いで、H22皮下腫瘍担持モデル(即ちマウス肝臓がんモデル)を、実施例4に記載された方法に従って、H22細胞(Nanjing CoBioerから購入)を使用して確立した。腫瘍が約100mm3に成長したら、上記で述べた腫瘍溶解性ウイルス(rClone30-Anh-(F)-アンジオスタチン及びrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap)及び親株rClone30-Anh-(F)のそれぞれの100μLのPBS懸濁液(1×PBS緩衝液を使用して調製)を腫瘍に注射した。それぞれの処置群において、群あたり6頭の動物で、それぞれの腫瘍溶解性ウイルス(rClone30-Anh-(F)-アンジオスタチン、rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap及びrClone30-Anh-(F))を、合計で14日間1日1回、毎回1×107PFU注射で腫瘍に注射し、1×PBS緩衝液(腫瘍溶解性ウイルスなし)を陰性対照群としてマウス肝臓がんモデルの腫瘍に注射し(「PBS処置群」とも名付けられる)、腫瘍組織を解剖して、それぞれの組換えウイルスの治療効果を観察した。
図8に示されるように、処置後、陰性対照群の平均腫瘍体積は1421.77mm3であり、親rClone30-Anh-(F)処置群の平均腫瘍体積は807.30mm3であり、rClone30-Anh-(F)-アンジオスタチン処置群の平均腫瘍体積は668.60mm3であり、rClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap処置群の平均腫瘍体積は326.05mm3であった。結果は、陰性対照群と比較して、親株rClone30-Anh-(F)処置群、rClone30-Anh-(F)-アンジオスタチン処置群及びrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap処置群が全て腫瘍成長を阻害することができ、特にrClone30-Anh-(F)-VEGF-Trap処置群は最も小さい平均腫瘍体積を有していたことを示した。
上記の記載は、単に本発明の好ましい例であり、本発明を限定することを意図するものではない。当業者にとって、本発明は様々な改変及び変更を行うことができる。本発明の精神及び原理内で行われる任意の改変、等価な置換、改善等は、本発明の保護範囲に含まれるものとする。
記載及び開示の目的で、全ての特許、特許出願及び他の刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示について単に提供するものである。これらの文書の日付又はこれらの文書の内容の表現に関する全ての言及は、本出願人が利用可能な情報に基づいており、これらの文書の日付又はこれらの文書の内容の正確性に関する任意の自白を構成するものではない。それに加えて、任意の国において、本明細書におけるこれらの刊行物への任意の参照は、その刊行物が当該技術分野における一般知識の一部を形成するという自白を構成するものではない。

Claims (15)

  1. 組換えニューカッスル病ウイルスゲノムであって、ゲノムがVEGF-Trapコード遺伝子を含み、VEGF-Trapコード遺伝子がニューカッスル病ウイルスゲノムのP遺伝子とM遺伝子との間に位置する、組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
  2. VEGF-Trapコード遺伝子がDNA又はRNAの形態である、請求項1に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
  3. VEGF-Trapコード遺伝子が配列番号1に示される配列又はそれと少なくとも80％の同一性を有する配列を有する、請求項1又は2に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
  4. 組換えニューカッスル病ウイルスゲノムの配列が配列番号2又は配列番号5に示される、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム。
  5. 組換えニューカッスル病ウイルスであって、ウイルスが請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノムを含む、組換えニューカッスル病ウイルス。
  6. ニューカッスル病ウイルスの出発株が、低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJ;及び出発株に基づいて遺伝子操作手段によって構築された任意のキメラ株から選択される、請求項5に記載の組換えニューカッスル病ウイルス。
  7. 請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノムをコードするDNA分子。
  8. 請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、請求項5若しくは6に記載の組換えニューカッスル病ウイルス、及び/又は請求項7に記載のDNA分子を含む、医薬組成物。
  9. 医薬組成物が薬学的に許容される賦形剤を更に含み、好ましくは薬学的に許容される賦形剤が溶媒、噴霧剤、可溶化剤、共溶媒、乳化剤、着色剤、崩壊剤、フィラー、滑沢剤、湿潤剤、浸透圧調節剤、安定剤、流動促進剤、香味剤、保存剤、懸濁化剤、抗酸化剤、浸透増強剤、pH調整剤、界面活性剤又は希釈剤から選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
  10. 請求項5又は6に記載の組換えニューカッスル病ウイルスを調製するための方法であって、
    (1)VEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列を含むクローニングベクター及びNDVウイルスベクターに対してそれぞれ酵素切断を行い、酵素切断から生じたVEGF-Trapコード遺伝子のDNA配列とNDVウイルスベクターとの間のライゲーションを実施して、組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを得ること、
    (2)組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドを細胞にトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を培養して、組換えニューカッスル病ウイルスを得ること
    を含む、方法。
  11. クローニングベクターがPUC57ベクター、pMD18-Tベクター、pMD19-Tベクター、pBlueScript SK(+/-)ベクター、pBluescript II KS(+/-)から選択されるベクターを使用して構築される、請求項10に記載の方法。
  12. NDVウイルスベクターが低病原性株LaSota、Hitchner B1又はV4;中病原性株Mukteswar又はAnhinga;高病原性株F48E9、JS/7/05/Ch、Italien、Herts/33又はNDV-BJから選択されるNDVウイルスのゲノムの全長cDNA配列であり、
    好ましくはNDVウイルスベクターがpBluescript II KS(+/-)-NDV(pBrNDV)、pCI-neo-NDV又はpOLTV5-NDVベクターである、
    請求項10又は11に記載の方法。
  13. 組換えニューカッスル病ウイルスプラスミドが、pTM-NP、pTM-P及びpTM-L;pCI-neo-NP、pCI-neo-P及びpCI-neo-L;又はpBluescript II KS(+/-)-NP、pBluescript II KS(+/-)-P及びpBluescript II KS(+/-)-Lから選択されるヘルパープラスミドと共に細胞に共トランスフェクトされる、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 細胞がBHK-21細胞、BSR-T7/5細胞、VERO細胞、DF-1細胞、293細胞又はMDCK細胞から選択される、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. がんの処置又は改善における使用のための、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、請求項5若しくは6に記載の組換えニューカッスル病ウイルス、請求項7に記載のDNA分子及び/又は請求項8若しくは9に記載の医薬組成物であって、
    好ましくはがんが結腸がん、肝臓がん、肺がん、胃がん、直腸がん、白血病、リンパ腫、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、膀胱がん、尿路上皮癌、気管支癌、骨がん、前立腺がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、食道がん、腎細胞癌、甲状腺がん、頭頸部がん、精巣がん、内分泌腺癌、副腎がん、下垂体がん、皮膚がん、軟部組織がん、血管腫、脳がん、神経癌、眼がん、髄膜腫、中咽頭がん、下咽頭がん、子宮頸がん、筋肉腫、子宮がん、神経膠芽腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、腎臓がん、星状細胞腫、神経膠腫、髄膜腫、ガストリノーマ、神経芽腫、黒色腫、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群又は肉腫から選択される、
    組換えニューカッスル病ウイルスゲノム、組換えニューカッスル病ウイルス、DNA分子及び/又は医薬組成物。
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