JP7138946B2 - 最適化された腫瘍溶解性ウイルスおよびその使用 - Google Patents

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年９月２７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４００，３１０号、および２０１６年１１月２８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４２６，７２４号に基づく優先権を主張しており、これら出願の開示は、それらの全体が参考として援用される。

背景
本出願は、２０１６年９月２６日に創出され、１７，７２０バイトのファイルサイズを有するＳＡＴＯ２０００００２＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして本出願に添えて提出された配列リストを参照により組み込む。

本開示は、がん性細胞増殖および悪性腫瘍進行を阻害または低減するための方法に関する。また、かかる方法における使用のための組成物も開示する。最後に、また、がん性腫瘍の処置における使用のための様々な種類の生体選択ウイルスおよび合成ウイルスを調製するための方法も本明細書で説明する。

がんは、細胞の異常増殖であり、それが、悪性腫瘍または新生物になり得る組織の塊を創出し得る。これらの形成物は、周囲の組織に侵入し、これを破壊する場合があり、身体の他の部分に拡がって、転移を形成し得る。

がん細胞は一般的に、多くのファミリーのウイルスによる感染および死滅の影響を受けやすい。その理由は、（ｉ）無秩序な組織構造、細胞間接触の減損および漏出性血管新生によって、悪性細胞がウイルスにより曝露されやすいこと、（ｉｉ）細胞移入受容体としてウイルスにより使用される多くの細胞表面タンパク質の頻繁な過剰発現、ならびに（ｉｉｉ）抗ウイルス性自然免疫機構の頻繁な減損、易感染性細胞死経路および予め活性化している核酸およびタンパク質合成によって、がん細胞内のウイルス複製にとってより好ましい条件であることであり得る。

いくつかの異なる腫瘍溶解性ウイルスおよびこれらのウイルスの様々な組合せの同時適用を含む、追加のウイルスおよびかかるウイルスを使用する方法を開発すること、個別化処置を提供すること、ならびにそれを必要とする患者における一部のウイルスへのがん性細胞の抵抗性および抗ウイルス性適応性免疫の発達による疾患の再発および不完全な治癒を防ぐことは、有益であり得る。

簡単な説明
腫瘍溶解性ウイルスのパネルの投与による、がん性細胞の選択的殺滅および腫瘍転移の全身性除去のための方法を、本明細書の様々な実施形態で開示する。腫瘍溶解性ウイルスの様々な組合せを、患者に同時に（すなわち、単回投与で多種類のウイルス）または連続的に（すなわち、１種類のウイルスが一度に投与されるが、多種類のウイルスが長期にわたり複数回の投与で与えられる）投与することができる。腫瘍溶解性ウイルスのコンビナトリアル的な使用は、治療アウトカムを改善し得る。また、生体選択ウイルスおよび合成ウイルスならびにかかるウイルスを創出するための方法を説明する。また、患者の腫瘍溶解性ウイルスへの感受性を決定するための方法も開示する。

がん患者を処置する方法であって、患者に、有効量の少なくとも１種の第１の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第１の組成物を第１の期間中投与することと、患者に、有効量の、第１の腫瘍溶解性ウイルスとは異なる少なくとも１種の第２の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第２の組成物を第２の期間中投与することとを含む、方法を、様々な実施形態で開示する。

第２の組成物は、第１の組成物が投与された後２４時間～２４週間の間に投与され得る。より具体的な実施形態では、第２の組成物は、第１の組成物が投与された後１週間～６週間の間に投与される。

第１の組成物は、第１の期間中、複数回投与され得る。第２の組成物は、第１の期間中、複数回投与され得る。

抗ウイルス抗体により交差中和されない異なるウイルスを含有する第１および第２の組成物は、経口で、経鼻で、静脈内に、動脈内に、皮内に、皮下に、筋内に、腹腔内に、胸膜内に、尿道内に、膣内に、腫瘍内に、頭蓋内に、脊髄内に、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、ウイルスを事前感染させた（患者から単離した）細胞担体の全身性投与により投与され得る。

第１および第２（または第３など）の腫瘍溶解性ウイルスは各々、約１０^４（１０^∧４）ＴＣＩＤ５０／ｍＬ～１０^１１（１０^∧１１）ＴＣＩＤ５０／ｍＬの投与量で、それらの各々の組成物中に存在し得る。

これらの処置方法で使用される第１および第２（または第３など）の腫瘍溶解性ウイルスは概して、細胞移入に必要なそれらの宿主細胞表面受容体において異なっているか、または効率的な複製もしくはがん細胞殺滅に影響を及ぼす他のがん細胞特異的もしくは腫瘍環境特異的変形の点で異なっている。細胞移入に必要な宿主細胞表面受容体として、限定されるものではないが、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、インテグリンα２β１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）、ＰＳＬＧ１（ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２、ＤＣ－ＳＩＧＮ、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、ヘパリン硫酸（heparin sulphate）またはシアル酸が挙げられる。効率的な複製またはがん細胞殺滅に影響を及ぼすがん細胞特異的または腫瘍環境特異的変形として、限定されるものではないが、（Ｋ－Ｒａｓ、Ｈ－Ｒａｓ、Ｎ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、ｐ５３、ＨＥＲ２遺伝子およびその他における）特異的発癌性突然変異；細胞増殖または細胞死機構における特異的変更；インターフェロン誘導経路の構成成分における欠損；インターフェロン応答経路の構成成分における欠損；膜結合および分泌プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤または細胞外マトリックスの構成成分の活性における変化；腫瘍内の間質および新生血管ネットワークの発達；ならびにマクロファージ、白血球、樹状細胞などでの腫瘍浸潤が挙げられる。

特定の実施形態では、第１および第２の組成物各々は、複数の腫瘍溶解性ウイルスを含有する。第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の腫瘍溶解性ウイルスは独立して、非限定的に、ヒトエンテロウイルス（例えばエコーウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスのセービン株またはライノウイルス）；レオウイルス（例えばタイプ１、タイプ２およびタイプ３哺乳動物オルトレオウイルスまたはその他）；パラミクソウイルス（例えばヒト麻疹もしくはムンプスウイルス、イヌジステンパーウイルス、マウスセンダイウイルスまたは鳥類ニューカッスル病ウイルス）；ラブドウイルス（例えば水疱性口内炎ウイルス、カラジャス（Ｃａｒａｊａｓ）ウイルス、マラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルスまたはＰｉｒｙウイルス）；トガウイルス；ヘルペスファミリーウイルス；アデノウイルス；ポックスウイルス；ならびに特定のウイルスファミリー内または外の他のウイルスに由来する天然または改変構成成分を含有するハイブリッドウイルスから選択され得る。また、同時に投与されるこれらのウイルスの組合せも、本明細書で企図される。第１および第２の組成物は、様々な実施形態で、全部で２または３または４種類の異なるウイルスを有し得る。所望の場合、追加の組成物もまた、様々な間隔で患者に連続的に投与され得る。

また、（ｉ）合成リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドアナログの存在下、第１の細胞培養物で第１の腫瘍溶解性ウイルスを培養して、突然変異誘発を受けたウイルスを創出することと、（ｉｉ）連続希釈を使用して第２の細胞培養物で突然変異誘発を受けたウイルスを培養して、最適化腫瘍溶解性ウイルスを特定することとを含む、最適化腫瘍溶解性ウイルスを生成する方法を開示する。

合成リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドアナログは、リバビリン；５－アザシチジン；５－フルオロウラシル；５－アザ－５，６－ジヒドロ－２－デオキシシチジン；Ｎ４－アミノシチジン；Ｎ１－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；３，Ｎ４－エテノシチジン；３－メチルシチジン；５－ヒドロキシシチジン；Ｎ４－ジメチルシチジン；５－（２－ヒドロキシエチル）－シチジン；５－クロロシチジン；５－ブロモシチジン；Ｎ４－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；５－アミノシチジン；５－ニトロソシチジン；５－（ヒドロキシアルキル）－シチジン；５－（チオアルキル）－シチジンおよびシチジングリコール；５－ヒドロキシウリジン；３－ヒドロキシエチルウリジン；３－メチルウリジン；Ｏ２－メチルウリジン；Ｏ２－エチルウリジン；５－アミノウリジン；Ｏ４－メチルウリジン；Ｏ４－エチルウリジン；Ｏ４－イソブチルウリジン；Ｏ４－アルキルウリジン；５－ニトロソウリジン；５－（ヒドロキシアルキル）－ウリジン；５－（チオアルキル）－ウリジン；１，Ｎ６－エテノアデノシン；３－メチルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；８－ヒドロキシグアノシン；Ｏ６－メチルグアノシン；Ｏ６－エチルグアノシン；Ｏ６－イソプロピルグアノシン；３，Ｎ２－エテノグアノシン；０６－アルキルグアノシン；８－オキソ－グアノシン；２，Ｎ３－エテノグアノシン；または８－アミノグアノシンであり得る。合成リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドアナログは、約０．１ｍＭ～約０．５ｍＭの量で第１の細胞培養物と共に存在し得る。

特定の実施形態では、第２の細胞培養物は、第１の細胞培養物とは異なり、最適化腫瘍溶解性ウイルスの所望の標的である細胞を含有する。これは、最適化腫瘍溶解性ウイルスが、処置されるべきがん性細胞内で十分に複製することを確実にする。

突然変異誘発を受けたウイルスは、約１２時間～約３６時間の第１の期間後に第１の細胞培養物から収集することができる。第１の腫瘍溶解性ウイルスは、約０．０５ＰＦＵ／細胞～約０．５０ＰＦＵ／細胞の量で第１の細胞培養物に添加することができる。

一部の実施形態では、また、最適化腫瘍溶解性ウイルスが抗体への増大した抵抗性を有するように、第１の腫瘍溶解性ウイルスは、抗体の存在下、第１の細胞培養物で培養される。

ステップ（ｉ）および（ｉｉ）は概して、連続的に繰り返され、ステップ（ｉｉ）の最適化腫瘍溶解性ウイルスは、各後続の繰返しにつきステップ（ｉ）の第１の腫瘍溶解性ウイルスとして使用される。各追加の繰返しは、前の回の最も適合するウイルスに由来する追加の突然変異誘発を受けたウイルス、および所望の特色／特性についての追加の選択をもたらす。これは、特定の標的細胞種において複製し得るウイルスを選択するため、および抗体がより少ない効果しか有しないウイルスを選択するための両方に使用することができる。

また、所与のアミノ酸をコードする参照ウイルスにおける各コドンにつき、所与のアミノ酸をコードする全てのコドンを特定することと、合成標的化ウイルスにおいて（ｉ）参照ウイルスＯＲＦｅｏｍｅと比較してがん細胞のＯＲＦｅｏｍｅ（発現されるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全部の組）において最も類似する利用頻度を有する、かつ／または（ｉｉ）がん細胞におけるウイルスｍＲＮＡの（非形質転換細胞および悪性細胞に存在するｔＲＮＡのレパートリーを与えた）局所翻訳速度論が、非形質転換細胞におけるウイルス翻訳速度論の局所翻訳速度論と同様であることを確実にするために、所与のアミノ酸につき、その頻度／解読速度の点で最も適切であり得るコドンを使用することとを含む、参照ウイルスから合成標的化ウイルスを生成する方法を開示する。これは、（ｉ）ｔＲＮＡの存在量は通常、所与の細胞／組織におけるコドン利用頻度に直接比例し、（ｉｉ）頻繁に使用されるコドンは通例、対応する頻繁な同族ｔＲＮＡの（メッセージ解読中の）より迅速な利用可能性のために稀にしか使用されないコドンより迅速に翻訳され（逆もまた同様）、（ｉｉｉ）最適な／頻繁なコドンおよび非最適な／稀なコドンは、ｔＲＮＡ遺伝子集団における変化と調和して細胞種／組織間で異なり、（ｉｖ）増殖中の（すなわち、がん性）細胞で誘導され、高レベルで発現する選択されたｔＲＮＡ（これらのｔＲＮＡは、がん細胞進行を駆動することが示された）は典型的に、分化中の（すなわち、非がん性）細胞では抑制され、低レベルで発現し、（ｖ）同義コドン利用は、ｍＲＮＡ翻訳速度／タンパク質発現レベルに影響を及ぼすのみでなく、細胞におけるタンパク質フォールディングにも影響を及ぼし、（ｖｉ）コドン利用プロファイルは、細胞におけるタンパク質フォールディングについての速度論的ガイドとして働くという事実を利用する。このように、合成ウイルスからのタンパク質発現は、正常細胞では減衰されるが、がん性細胞では向上され、一方で、がん細胞におけるウイルスタンパク質の正しいフォールディングを保存するが、同時に正常細胞におけるフォールディングに影響を及ぼす。

特定の実施形態では、参照ウイルスは、腫瘍溶解性ウイルスである。合成標的化ウイルスは、参照ウイルスと８５％未満のヌクレオチド同一性を有し得るか、または８０％未満のヌクレオチド同一性もしくは７５％未満のヌクレオチド同一性を有し得る。しかしながら、一般的に、合成標的化ウイルスは、参照ウイルスと少なくとも６７％のヌクレオチド同一性を有する。

また、患者から得た腫瘍細胞を第１の腫瘍溶解性ウイルスに感染させることと；感染した腫瘍細胞を培養して、第１の腫瘍溶解性ウイルスの濃度を決定することと；濃度が閾値より大きい場合、患者が第１の腫瘍溶解性ウイルスに感受性であると特定することとを含む、患者の腫瘍溶解性ウイルスへの感受性を特定するための方法を開示する。

閾値は、試験されるウイルスによって変動し得る。一部の特定の実施形態では、閾値は、１０^６（１０^∧６）ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり得る。腫瘍細胞は、手術または生検のいずれかにより患者から収集することができる。

腫瘍細胞は、感染される前に、細胞培養培地中に懸濁してもよい。感染した腫瘍細胞は、約５％ＣＯ_２を含有する雰囲気における約３５℃～約４５℃の温度でのインキュベーションにより約２４時間～約７２時間の期間培養してもよい。

腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトエンテロウイルス；レオウイルス；パラミクソウイルス；ラブドウイルス；トガウイルス；ヘルペスウイルス；パルボウイルス；アデノウイルス；ポックスウイルス；または特定のウイルスファミリー内もしくは外の他のウイルスに由来する天然もしくは改変構成成分を含有するハイブリッドウイルスであり得る。

本明細書で開示するこれらの方法ならびに組成物およびウイルスにより処置されるがん性腫瘍は、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、肝がん、肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎がん、副腎がん、甲状腺がん、脳がん、軟組織がん、中皮がん、血液のがんまたは骨がん腫瘍を含み得る。

本明細書で説明する腫瘍溶解性ウイルス組成物は、化学療法、免疫療法、放射線療法、薬物療法または細胞移植との組合せで投与することができる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
がん患者を処置する方法であって、
前記患者に、有効量の少なくとも１種の第１の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第１の組成物を第１の期間中投与することと、
前記患者に、有効量の、前記第１の腫瘍溶解性ウイルスとは異なる少なくとも１種の第２の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第２の組成物を第２の期間中投与することと
を含む、方法。
（項目２）
前記第２の組成物が、前記第１の組成物が投与された後２４時間～２４週間の間に投与される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２の組成物が、前記第１の組成物が投与された後１週間～６週間の間に投与される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１の組成物が、前記第１の期間中、複数回投与され、前記第２の組成物が、前記第２の期間中、複数回投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２の組成物が、経口で、経鼻で、静脈内に、動脈内に、皮内に、皮下に、筋内に、腹腔内に、胸膜内に、膣内に、尿道内に、腫瘍内に、頭蓋内に、脊髄内に、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記第１もしくは第２の腫瘍溶解性ウイルスを感染させた細胞担体の手段により投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスが、約１×１０ ^４ ＴＣＩＤ５０～約１×１０ ^１１ ＴＣＩＤ５０の投与量で存在する、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスが、細胞移入に必要なそれらの宿主細胞表面受容体において異なっている、項目１に記載の方法。
（項目８）
細胞移入に必要な前記宿主細胞表面受容体が、ＣＤ１５５、インテグリンα２β１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＣＤ１５０、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、シアル酸、ＰＧＳＬ－１（別名ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２）、アネキシンＩＩ、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３結合ノンインテグリン）、ｈＰＶＲ（ヒトポリオウイルス受容体）、ＣＤ３４＋、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＪＡＭ（接合部接着分子）またはヘパリン硫酸である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記第１および第２の組成物各々が、複数の腫瘍溶解性ウイルスを含有する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび前記第２の腫瘍溶解性ウイルスが独立して、ヒトエンテロウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスおよびハイブリッドウイルスから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
がん患者を処置する方法であって、
前記患者に、有効量の少なくとも１種の第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第１の組成物を第１の期間中投与するステップであって、前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスが、細胞移入に必要なそれらの宿主細胞表面受容体において異なっている、ステップ
を含む、方法。
（項目１２）
前記第１の組成物が、前記第１の期間中、複数回投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第１の組成物が、経口で、経鼻で、静脈内に、動脈内に、皮内に、皮下に、筋内に、腹腔内に、胸膜内に、膣内に、尿道内に、腫瘍内に、頭蓋内に、脊髄内に、またはｉｎ
ｖｉｔｒｏで、前記第１もしくは第２の腫瘍溶解性ウイルスを感染させた細胞担体の手段により投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルス各々が、約１×１０ ^４ ＴＣＩＤ５０～約１×１０ ^１１ ＴＣＩＤ５０の投与量で存在する、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の腫瘍溶解性ウイルスの細胞移入に必要な前記宿主細胞表面受容体が独立して、ＣＤ１５５、インテグリンα２β１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＣＤ１５０、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、シアル酸、ＰＧＳＬ－１（別名ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２）、アネキシンＩＩ、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３結合ノンインテグリン）、ｈＰＶＲ（ヒトポリオウイルス受容体）、ＣＤ３４＋、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＪＡＭ（接合部接着分子）またはヘパリン硫酸から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび前記第２の腫瘍溶解性ウイルスが独立して、ヒトエンテロウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスおよびハイブリッドウイルスから選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
最適化腫瘍溶解性ウイルスを生成する方法であって、
（ｉ）突然変異誘発を受けたウイルスを創出するために、合成リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドアナログの存在下、第１の細胞培養物で第１の腫瘍溶解性ウイルスを培養することと、
（ｉｉ）前記最適化腫瘍溶解性ウイルスを特定するために、連続希釈を使用して第２の細胞培養物で前記突然変異誘発を受けたウイルスを培養することと
を含む、方法。
（項目１８）
前記合成リボヌクレオシドアナログが、リバビリン；５－アザシチジン；５－フルオロウラシル；５－アザ－５，６－ジヒドロ－２－デオキシシチジン；Ｎ４－アミノシチジン；Ｎ１－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；３，Ｎ４－エテノシチジン；３－メチルシチジン；５－ヒドロキシシチジン；Ｎ４－ジメチルシチジン；５－（２－ヒドロキシエチル）－シチジン；５－クロロシチジン；５－ブロモシチジン；Ｎ４－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；５－アミノシチジン；５－ニトロソシチジン；５－（ヒドロキシアルキル）－シチジン；５－（チオアルキル）－シチジンおよびシチジングリコール；５－ヒドロキシウリジン；３－ヒドロキシエチルウリジン；３－メチルウリジン；Ｏ２－メチルウリジン；Ｏ２－エチルウリジン；５－アミノウリジン；Ｏ４－メチルウリジン；Ｏ４－エチルウリジン；Ｏ４－イソブチルウリジン；Ｏ４－アルキルウリジン；５－ニトロソウリジン；５－（ヒドロキシアルキル）－ウリジン；５－（チオアルキル）－ウリジン；１，Ｎ６－エテノアデノシン；３－メチルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；８－ヒドロキシグアノシン；Ｏ６－メチルグアノシン；Ｏ６－エチルグアノシン；Ｏ６－イソプロピルグアノシン；３，Ｎ２－エテノグアノシン；０６－アルキルグアノシン；８－オキソ－グアノシン；２，Ｎ３－エテノグアノシン；または８－アミノグアノシンである、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記合成リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドアナログが、約０．０２ｍＭ～約０．５ｍＭの量で前記第１の細胞培養物と共に存在する、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記第２の細胞培養物が、前記第１の細胞培養物とは異なり、前記最適化腫瘍溶解性ウイルスの所望の標的である細胞を含有する、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
前記突然変異誘発を受けたウイルスが、約１２時間～約３６時間の第１の期間後に前記第１の細胞培養物から収集される、項目１７に記載の方法。
（項目２２）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスが、約０．０５ＰＦＵ／細胞～約０．５０ＰＦＵ／細胞の量で前記第１の細胞培養物に添加される、項目１７に記載の方法。
（項目２３）
前記最適化腫瘍溶解性ウイルスが抗体への抵抗性を有するように、前記第１の腫瘍溶解性ウイルスもまた、前記抗体の存在下、前記第１の細胞培養物で培養される、項目１７に記載の方法。
（項目２４）
ステップ（ｉ）および（ｉｉ）が、連続的に繰り返され、ステップ（ｉｉ）の前記最適化腫瘍溶解性ウイルスが、各後続の繰返しにつきステップ（ｉ）の前記第１の腫瘍溶解性ウイルスとして使用される、項目１７に記載の方法。
（項目２５）
参照細胞に関する参照ウイルスから、標的細胞に関する合成標的化ウイルスを生成する方法であって、
所与のアミノ酸をコードする前記参照ウイルスにおける所与の位置の各コドンにつき、前記標的細胞における前記所与のアミノ酸をコードする各コドンのコドン頻度を特定することと、
前記標的細胞における前記所与のアミノ酸につき、前記参照ウイルスにおける前記コドンに最もよく対応するコドンを選択することと、
前記参照ウイルスにおける前記所与の位置に適合する前記合成標的化ウイルスにおける位置に、前記標的細胞における前記所与のアミノ酸につき選択されたコドンを使用することと
を含む、方法。
（項目２６）
前記参照ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記合成標的化ウイルスが、前記参照ウイルスと８０％未満の同一性を有する、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記参照ウイルスにおける前記コドンに最もよく対応する、前記標的細胞における前記所与のアミノ酸についての前記コドンが、（ａ）前記合成標的化ウイルスにおけるコドン対と前記参照ウイルスにおけるコドン対との間のコドン頻度の差を最小限にすることと；（ｂ）前記選択されたコドンにおけるゆらぎを最小限にすることとにより選択される、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
項目２５から２８のいずれかに記載の方法に従って産生される、合成標的化ウイルス。
（項目３０）
患者の腫瘍溶解性ウイルスへの感受性を特定するための方法であって、
前記患者から得た腫瘍細胞を第１の腫瘍溶解性ウイルスに感染させることと、
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスの濃度を決定するために、感染した前記腫瘍細胞を培養することと、
前記濃度が閾値より大きい場合、前記患者が前記第１の腫瘍溶解性ウイルスに感受性であると特定することと
を含む、方法。
（項目３１）
前記閾値が、１０ ^６ ＴＣＩＤ５０／ｍＬである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記腫瘍細胞が、手術または生検のいずれかにより収集される、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記腫瘍細胞が、感染される前に、細胞培養培地中に懸濁される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記感染した腫瘍細胞が、約５％ＣＯ _２ を含有する雰囲気における約３５℃～約４５℃の温度でのインキュベーションにより約２４時間～約７２時間の期間培養される、項目３０に記載の方法。
（項目３５）
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ヒトエンテロウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスまたはハイブリッドウイルスである、項目３０に記載の方法。
（項目３６）
有効量の少なくとも１種の第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物であって、前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスが、細胞移入に必要なそれらの宿主細胞表面受容体において異なっている、組成物。
（項目３７）
前記第１および第２の腫瘍溶解性ウイルス各々が、約５×１０ ^７ ＴＣＩＤ５０～約２×１０ ^８ ＴＣＩＤ５０の投与量で存在する、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の腫瘍溶解性ウイルスの細胞移入に必要な前記宿主細胞表面受容体が独立して、ＣＤ１５５、インテグリンα２β１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＣＤ１５０、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、シアル酸、ＰＧＳＬ－１（別名ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２）、アネキシンＩＩ、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３結合ノンインテグリン）、ｈＰＶＲ（ヒトポリオウイルス受容体）、ＣＤ３４＋、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＪＡＭ（接合部接着分子）またはヘパリン硫酸から選択される、項目３６に記載の組成物。
（項目３９）
前記第１の腫瘍溶解性ウイルスおよび前記第２の腫瘍溶解性ウイルスが独立して、ヒトエンテロウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルスまたはハイブリッドウイルスから選択される、項目３６に記載の組成物。
（項目４０）
少なくとも前記第１の腫瘍溶解性ウイルスが、項目２５から２８のいずれかに記載の方法に従って産生される合成標的化ウイルスである、項目３６に記載の組成物。

本開示のこれらおよび他の非限定的な特徴は、以下により詳しく開示する。

本特許または出願ファイルは、色を施した少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面が添付された本特許または特許出願公開公報のコピーは、請求と必要な料金の支払いがなされれば庁により提供される。

以下は、本明細書で開示する例示的な実施形態を示す目的のためであって、それを限定する目的のためではなく示される、図面の簡単な説明である。

図１Ａ～１Ｃは、Ｃ３３Ａ、ＡｓＰＣ１およびＭＣＦ７ヒト癌細胞系の異種移植片を有するヌードマウスにおける５０日の期間にわたる腫瘍増殖を示す、１組のグラフである。 同上。

図１Ａは、Ｃ３３Ａ細胞系単独（四角）またはコクサッキーウイルスＢ３（Ｃｏｘ－Ｂ３、丸）もしくはコクサッキーウイルスＡ７（Ｃｏｘ－Ａ７、三角）を感染させたＣ３３Ａ細胞系についての経時的な（日）腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す。ｙ軸は、５００の間隔で０～３０００に及ぶ。ｘ軸は、１０の間隔で０～５０に及ぶ。５０日目で、Ｃ３３Ａが、最も大きな腫瘍体積を有し、続いてＣｏｘ－Ｂ３、次にＣｏｘ－Ａ７である。

図１Ｂは、ＡｓＰＣ１細胞系単独（四角）またはコクサッキーウイルスＢ４（Ｃｏｘ－Ｂ４、丸）もしくはコクサッキーウイルスＡ７（Ｃｏｘ－Ａ７、三角）を感染させたＡｓＰＣ１細胞系についての経時的な（日）腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す。ｙ軸は、５００の間隔で０～３０００に及ぶ。ｘ軸は、１０の間隔で０～５０に及ぶ。５０日目で、ＡｓＰＣ１が、最も大きな腫瘍体積を有し、続いてＣｏｘ－Ａ７、次にＣｏｘ－Ｂ４である。

図１Ｃは、ＭＣＦ７細胞系単独（四角）またはコクサッキーウイルスＢ６（Ｃｏｘ－Ｂ３、丸）もしくはエコーウイルス１（Ｅｃｈｏ１、三角）を感染させたＭＣＦ７細胞系についての経時的な（日）腫瘍体積（ｍｍ^３）を示す。ｙ軸は、５００の間隔で０～３０００に及ぶ。ｘ軸は、１０の間隔で０～５０に及ぶ。５０日目で、ＭＣＦ７が、最も大きな腫瘍体積を有し、続いてＣｏｘ－Ｂ６、次にＥｃｈｏ１である。

図２は、Ａ４３１類表皮癌細胞を皮下注射したマウスに投与した様々な組合せのウイルスの効果を示すグラフである。ｙ軸は、５００の間隔で０から２５００に及ぶ。ｘ軸は、１０の間隔で０～６０に及ぶ。線は、Ａ４３１単独（菱形）；コクサッキーウイルスＢ６（Ｃｏｘ－Ｂ６、赤色四角）；コクサッキーウイルスＢ５（Ｃｏｘ－Ｂ５、緑色三角）；エコーウイルス１２（Ｅｃｈｏ１２、紫色四角）；Ｃｏｘ－Ｂ５＋Ｃｏｘ－Ｂ６（青色丸）；およびＥｃｈｏ１２＋Ｃｏｘ－Ｂ５＋Ｃｏｘ－Ｂ６（橙色丸）である。参考のために、全ての３種類のウイルスＥｃｈｏ１２＋Ｃｏｘ－Ｂ５＋Ｃｏｘ－Ｂ６の組合せ（橙色丸）は常に、２種類のウイルスＣｏｘ－Ｂ５＋Ｃｏｘ－Ｂ６（青色丸）より低い腫瘍体積を有した。Ｃｏｘ－Ｂ６値（赤色四角）は常に、Ｅｃｈｏ１２値（紫色四角）より高い腫瘍体積を有した。

図３は、（ａ）ネイティブポリオウイルス配列（株１セービン）（菱形）；（ｂ）ヒトがん細胞におけるネイティブ株１セービン配列（がん細胞において観察されるｔＲＮＡ集団から推測したコドン利用）（四角）；および（ｃ）ネイティブ配列と同じポリタンパク質をコードするが、がん細胞において観察されるｔＲＮＡレパートリーについて最適化された最適化配列（三角）についての、コドン利用プロファイル、すなわち、コドン頻度（ｙ軸）対コドン位置（ｘ軸）のグラフの一例である。

図４は、（ａ）ヒト細胞におけるネイティブ株１セービン配列（菱形）；（ｂ）がん細胞におけるネイティブ株１セービン配列（四角）；および（ｃ）最適化配列（三角）についての、より大きなコドン利用プロファイルである。このグラフでは、コドン１５０～２１０を示す。

図５は、静止細胞（ＲＤ細胞）および指数関数的に分裂する２９３Ｔ細胞において、非改変ポリオウイルス１をコドン最適化ポリオウイルス株１に対して比較するヒストグラムである。合成／コドン最適化ウイルスは、分裂細胞において優先的な（約３倍高い）複製を示した。ｙ軸は、対照細胞の百分率でのウイルスタイターであり、５０の増分で０～３５０に及ぶ。

図６は、免疫無防備状態（ヌード）マウス異種移植片モデルに関する前臨床実験におけるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖に対するウイルスの効力を示す、４枚１組の写真である。上部の行では、子宮頸癌（Ｃ３３Ａ）細胞を皮下注射し、エコーウイルス１を静脈内注射した。左の写真は、ウイルス注射前であり、右の写真は、ウイルス注射１６日後である。下部の行では、結腸癌（ＲＫＯ）細胞を皮下注射し、次にポリオウイルス株１を静脈内注射した。左の写真は、ウイルス注射前であり、右の写真は、ウイルス注射１８日後である。

図７は、ヒトにおけるウイルスの効力を例示する、６枚１組の断層撮影像である。センダイウイルス（ＳＴＲＳ１）を、４２歳の女性の腹膜に、転移を伴うヒト顆粒膜細胞卵巣癌を処置するために適用した。左の列は、ウイルス処置前の、３枚１組の断層撮影像である。センダイウイルスの毎週の皮内注射は、３ヶ月の期間にわたり腫瘍体積の実質的な低減をもたらした。右の列は、ウイルス処置後の、３枚１組の断層撮影像である。腫瘍塊（様々な転移性結節を含む）を丸で囲んでいる。

図８は、ヒトにおけるウイルスの効力を例示する、２枚１組の磁気共鳴画像（ＭＲＩ）写真である。いくつかのコースのレオウイルス１、筋内１０^９ＩＥ；エコーウイルス１、筋内１０^９ＩＥ；コクサッキーウイルスＢ５、筋内１０^９ＩＥ；コクサッキーウイルスＡ７、筋内１０^８ＩＥ；およびポリオウイルス株１、筋内１０^８ＩＥを、４９歳の女性患者の左前頭葉の大きな脳内腫瘍を伴う脳のびまん性星状細胞腫を処置するために適用した。患者は、左前頭葉の部分切除を受けたが、腫瘍増殖が脳の生命維持部分に近すぎたため、腫瘍は完全には切除できなかった。１コースの放射線療法および数コースの化学療法後、腫瘍のサイズは増大した。腫瘍溶解性ウイルスの毎週の筋内注射は、４ヶ月の期間にわたり腫瘍体積の実質的な低減をもたらした。左の画像は、切除後かつウイルス療法前のＭＲＩである。右の画像は、ウイルス療法が投与された後のＭＲＩである。腫瘍結節を丸で囲んでいる。

詳細な説明
本開示は、以下の所望の実施形態の詳細な説明およびその中に含まれる実施例を参照してより容易に理解することができる。以下の明細書およびそれに続く特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語について、参照がなされる。

具体的な用語は、明確にするために以下の説明で使用されるが、これらの用語は、図面における例示のために選択された実施形態の特定の構造についてのみ言及することが意図され、本開示の範囲を画定または限定するとは意図されない。図面および以下の説明では、同様の数字名称は、同様の機能の構成成分について言及すると理解されるべきである。さらに、図面は、正確な縮尺率ではないことが理解されるべきである。

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のように規定しない限り、複数の指示物を含む。

明細書および特許請求の範囲で使用されるとき、「含む」という用語は、「からなる」および「から本質的になる」という実施形態を含み得る。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「ことができる」、「含有する」およびそれらの変形は、本明細書で使用されるとき、指定された成分／ステップの存在を必要とし、他の成分／ステップの存在を許容する、制限のない遷移性の句、用語または語であると意図される。しかしながら、かかる説明は、指定された成分／ステップのみの存在、およびそれから生じ得る任意の不純物を許容し、他の成分／ステップを除外する、列挙された成分／ステップ「からなる」および「から本質的になる」組成物またはプロセスもまた説明すると解釈されるべきである。

本出願の明細書および特許請求の範囲における数値は、同じ数の有効数字に低減した場合に同じである数値、および値を決定するための本出願で説明する種類の従来型測定技術の実験誤差未満しか示される値と異ならない数値を含むと理解されるべきである。

本明細書で開示する全ての範囲は、列挙される終点を含み、独立して組み合わせることができる（例えば、「２グラム～１０グラム」の範囲は、終点の２グラムおよび１０グラム、ならびに全ての中間値を含む）。

「約」という用語は、その値の基本的機能を変えることなく変動し得る任意の数値を含むために使用することができる。範囲と共に使用されるとき、「約」はまた、２つの終点の絶対値により定義される範囲を開示し、例えば、「約２～約４」はまた、「２～４」の範囲を開示する。「約」という用語は、示される数のプラスまたはマイナス１０％を指し得る。

「腫瘍」という用語は、しこりを形成した新生物およびしこりを形成していない新生物の両方を指すために本明細書で使用される。腫瘍は、悪性もしくは潜在的悪性または続発性腫瘍であり得る。

「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、腫瘍溶解特性を有するウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、天然であってもよく、選択により改善されてもよく、または合成的に創出されてもよい。

「ＣＶ１」という用語は、アフリカミドリザル腎臓に由来する細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ－７０）を指す。ＣＶ－１細胞は、線維芽細胞様形態を示し、ガラスまたはプラスチック表面に付着して増殖し、逆トランスクリプターゼについて陰性である。

「ＴＣＩＤ５０」という用語は、５０％組織培養物感染性用量を指し、感染性ウイルスタイターの尺度である。この終点希釈アッセイは、感染した宿主の５０％を殺滅するため、または接種した組織培養細胞の５０％において細胞変性効果を産生するために必要なウイルスの量を定量する。

「ＰＦＵ」という用語は、ウイルス量の一尺度である、ウイルス試料中のプラーク形成単位を指す。このアッセイは、ペトリ皿またはマルチウェルプレートで行われる微生物学的方法に基づく。具体的には、宿主細胞のコンフルエント単層に、様々な希釈でウイルスを感染させ、半固体培地で覆って無差別な拡がりからのウイルス感染を防ぐ。ウイルスが、固定された細胞単層内の細胞に感染したとき、ウイルスプラークが形成される。ウイルス感染細胞は溶解し、隣接する細胞に感染を拡げ、そこで感染－溶解周期が繰り返される。感染細胞領域は、プラーク（非感染細胞により囲まれた感染領域）を創出し、これは目視または光学顕微鏡で見ることができる。プラークは一般的に手動で計数され、結果は、プレートを調製するために使用した希釈因子との組合せで、試料単位体積当たりのプラーク形成単位の数（ＰＦＵ／細胞）を計算するために使用される。ＰＦＵ／細胞結果は、試料中の感染性粒子の数を表し、形成された各プラークが、１つの感染性ウイルス粒子を表すという仮定に基づく。

「同一性」という用語は、１対の配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）が同じ位置で同じ残基を有する程度を指す。同一性は、同一の残基の数を残基の総数（ギャップは計数されない）で割り、結果を１００倍してパーセンテージを得ることにより測定される。したがって、正確に同じ配列の２つのコピーは１００％同一性を有するが、欠失、付加または置換を有する配列は、より低い程度の同一性を有し得る。当業者は、いくつかのコンピュータプログラム、例えばＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いるプログラムが、配列同一性を決定するために使用可能であることを認識するであろう。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラムで行われ、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラムで行われ、各々のプログラムのデフォルトパラメータを使用する。

本開示は、抗原性構造ならびにウイルス移入および複製に影響を及ぼす宿主細胞特異的機能の必要条件において異なる１パネルの腫瘍溶解性ウイルスのコンビナトリアル的な使用を通して、陽性治療応答の確率を増大させ、抗ウイルス免疫の発達の問題を克服するための方法に関する。

この点で、腫瘍溶解性ウイルスは、それらの溶解性感染中のがん細胞の直接的殺滅、およびウイルスの除去後でさえも長期継続治療効果を提供する全身性抗腫瘍免疫の誘導を伴う、二重機構により作用する。がん開始幹細胞の抵抗性のために再発性腫瘍増殖に対して限定的な有効性しか有しない化学療法薬とは異なり、多くの腫瘍溶解性ウイルスは、がん幹細胞に感染し、これらを殺滅することができ、それによって再発の確率を限定する。また、正常細胞がウイルス妨害を示す（第１のウイルスに感染した細胞は、第２のウイルスによる感染に対して易感染性の低減を示す）一方で、がん細胞は示さない場合があることに留意されたい。別個の作用機構のために、腫瘍溶解性ウイルスは、とりわけ他の薬物に対する療法関連抵抗性の場合に、従来型化学療法手法を補完し得る。

安全かつ効力のある腫瘍溶解性ウイルス株の開発のために、多くの様々なウイルスファミリーを使用することができる。これらのうち、（１）ヒトにおいて病原性を有しないか、または非常に限定的な病原性しか有しない天然動物ウイルス、（２）生予防ワクチンとして通常使用されるヒトウイルスの弱毒株、（３）病原性を伴わないか、または限定的な病原性しか伴わないヒトウイルスの一部の単離物、および（４）（ａ）ウイルスが正常細胞において殺滅するために必要なある特定のウイルス機能の除去による、または（ｂ）がん性細胞への移入もしくはがん性細胞の特異的殺滅のための追加の様式を提供することによる、腫瘍選択性が増大した遺伝子操作ウイルスまたは生体選択ウイルスがある。

多くの様々な種類の腫瘍溶解性ウイルスに関する臨床研究は、腫瘍溶解性ウイルス療法が一般的に安全であり、最大２４時間持続する軽度のインフルエンザ様症状、熱、悪寒、疲労、頭痛、吐き気、低血圧、頻脈、高血圧、食欲不振および筋肉痛を含む最小限の有害効果しか伴わないことを示す。しかしながら、ウイルス腫瘍溶解性の治療効率は、予測可能ではない。一部の患者における一部の顕著な治療効果にもかかわらず、ランダム化臨床試験は通常、むしろ中程度の応答を示す。腫瘍溶解性ウイルスを、競争力のある効率的ながんの治療剤にするために、まだ多くの問題に取り組む必要がある。これらのうち、信頼できる腫瘍溶解性ウイルス送達プロトコールの必要性、腫瘍内でのウイルスの拡がりの改善、腫瘍微小環境の免疫抑制効果の克服、腫瘍の急速な溶解に関連する危険の管理および機能亢進性自然免疫応答などがある。

腫瘍溶解性ウイルス療法に対する１つの主要な障害は、患者間のがん細胞の顕著な個体変動性であり、これは、個別化手法を必要とする。実質的には、がんのどの症例も、遺伝的欠陥の組合せの点で独特である。特定の腫瘍溶解性ウイルス株への治療応答は、患者の腫瘍のいくつかの個別化パラメータに依存する。特に、がん細胞は、ある特定のウイルスの認識が不十分であり得るが、他の種類のウイルスを感知し、含有する能力を保持する。がん細胞は、一部のウイルスにとって重要であるが、その他については用いられない、細胞死、細胞周期制御および代謝性形質転換に関連する、ある特定の特徴の点で異なっている可能性がある。さらに、がん細胞は遺伝的に不安定であるので、ウイルス感染および複製に必要なある特定の宿主細胞因子は、腫瘍溶解性ウイルス療法の過程中に失われ、それによって療法抵抗性がん細胞集団の増殖からの再発を許容し得る。その結果、個々の腫瘍の特定のウイルスへの応答は、予想するのが困難である。

腫瘍溶解性ウイルス療法に対する別の障害は、療法用ウイルス株に対する適応性免疫の不可避な発達である。中和抗体は、ウイルスをその感受性がん細胞への行程中に破壊し、それによって感染の確率を低下させる。より高い用量のウイルスは、ある特定の処置段階でこの抵抗性を克服し得るが、感染効率は、処置過程中に減少する。しかしながら、単一の腫瘍溶解性ウイルスの長期間の使用はとりわけ、（１）ウイルスに抵抗性の細胞の選択または（２）中和抗体の誘導のいずれかのために、再発しやすい。細胞毒性薬および免疫抑制薬との様々な組合せ療法レジメンが、アウトカムを改善するために試験されているが、相克する作用機構に関連する複雑な治療的妥協点の困難がまだ存在する。

本開示は、がん患者を処置するために腫瘍溶解活性を有する非病原性ヒトウイルスを使用するための方法に、および様々な腫瘍溶解性ウイルスの組合せのパネルに関する。共に組合せで使用されるウイルスは、それらが抗体で交差中和しないように、それらの抗原性構造において異なっているべきである。ウイルスは、宿主細胞特異的因子について重複する必要条件を示し得るが、同一であるべきでない。これらの必要条件として、限定されるものではないが、ウイルス移入受容体に使用される宿主細胞表面受容体、抗ウイルス性自然免疫系の構成成分などが挙げられ得る。ウイルスは、２種類、３種類またはそれよりも多い異なるウイルスの組合せで、連続的に、または同時に使用することができる。連続適用および同時適用のための腫瘍溶解性ウイルス組合せの例を開示する。

ウイルスを使用するがん処置のための本明細書で説明する療法用パネルの抗原的多様性および機能的多様性を増大させるために（それらの天然対照物と比較して）より最適化した、新しい腫瘍溶解性ウイルスを製造または選択するための方法を、さらに開示する。かかる合成ウイルスは、選択されたがん細胞／組織における増殖を誘導し（かつそれらの殺滅の向上をもたらし）、一方で正常細胞／組織における発現の減衰を有する、コドン最適化策を使用して製造することができる。

１つの広範な態様では、本開示は、腫瘍溶解性ウイルスを使用してがん患者を処置するための方法に関する。概して、有効量の少なくとも１種の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第１の組成物は、患者に第１の期間中投与される。次に、有効量の少なくとも１種の第２の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第２の組成物は、患者に第２の期間中投与される。組成物は、連続的に投与される。換言すれば、第１の組成物が投与され、次に第１の組成物の投与が停止され、第２の組成物が投与される。言い換えると、１パネルの腫瘍溶解性ウイルス組成物は、患者に連続的に投与される、すなわち、１つの組成物は一度に、多数の組成物は連続的に投与される。

この点では、様々なウイルス血清型株は、細胞に入り込むために様々な宿主細胞表面タンパク質受容体に頼る。例えば、エコーウイルス１はインテグリンα２β１（アルファ－２－ベータ－１）に；エコーウイルス７、１２および２１はＣＤ５５（ＤＡＦとしても公知）に；コクサッキーウイルスＡ７およびＡ９はインテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１およびＣＤ５５に；コクサッキーウイルスＢ１～Ｂ６はＣＸＡＤＲ（コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体またはＣＡＲとしても公知）に；コクサッキーウイルスＢ１、Ｂ３およびＢ５はＣＤ５５に頼り；麻疹ウイルスのエドモンストン株はＣＤ４６に頼り；イヌジステンパーウイルスはネクチン４に頼り；オルトレオウイルスはＪＡＭ－１に頼る。がん細胞がウイルスによる感染に抵抗する１つの方法は、受容体の発現および細胞表面曝露を変えることによると企図される。特定の細胞種に感染するウイルスの効率に影響を及ぼす他の因子があり得る。その結果、連続的ウイルス使用は、特定のウイルスに対する中和抗体の発達または（例えば、特定のウイルスにより必要とされる宿主細胞表面受容体の発現を変えることによる）特定のウイルスに抵抗性であるがん細胞の選択による、単一の腫瘍溶解性ウイルス株の効率の減少を避ける、より延長されたウイルス療法の過程を可能にするべきである。

このように、第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスは、例えば細胞移入に必要な宿主細胞表面受容体において、互いに異なるべきである。より具体的には、腫瘍溶解性ウイルス細胞移入に必要な宿主細胞表面受容体は、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、インテグリンα２β１（アルファ－２－ベータ－１）、インテグリンαＶβ３（アルファ－Ｖ－ベータ－３）、インテグリンαＶβ６（アルファ－Ｖ－ベータ－６）、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５（別名ＤＡＦ）、ＣＸＡＤＲ（別名ＣＡＲ）、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０）、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、シアル酸、ＰＧＳＬ－１（別名ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２：ｓｃａｖｅｎｇｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓ Ｂ，ｍｅｍｂｅｒ ２）、アネキシンＩＩ、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３結合ノンインテグリン：ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ３－ｇｒａｂｂｉｎｇ ｎｏｎ－ｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ｈＰＶＲ（ヒトポリオウイルス受容体：ｈｕｍａｎ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ３４＋、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体：Ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＪＡＭ（接合部接着分子：Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）またはヘパラン硫酸から選択することができる。第１および第２の腫瘍溶解性ウイルスはまた、特定の種類のがん細胞における様々な特異的欠陥、例えば癌原遺伝子もしくは様々な腫瘍抑制遺伝子内の突然変異またはプログラム細胞死経路の様々な変化、病原体感知を担う抗ウイルス性自然免疫機構の様々な構成成分内の変更およびインターフェロンに応答した抗ウイルス抵抗性の発達などを標的化することにより、互いに異なり得る。がん細胞におけるこれらの欠陥は、一部のウイルスに選択的複製および細胞殺滅利点を与え得るが、一方でその他については用いられない。

様々な腫瘍溶解性ウイルスの連続適用は、患者間で陽性治療応答の発生を増大させる。しかしながら、パネル内のウイルス株のうちの一部は、患者の悪性細胞に対して活性でない場合があるので、連続適用は、それらの無効なウイルス株を適用する時間の浪費をもたらし得る。代替として、いくつかの腫瘍溶解性ウイルス株の同時使用を考慮することができる。言い換えると、第１の組成物および／または第２の組成物は、複数の様々な腫瘍溶解性ウイルスを含み得る。２～４種類の様々な腫瘍溶解性ウイルス株が、パネルの各腫瘍溶解性組成物中に存在し得る。各組成物中のウイルス株は、様々な種類の悪性細胞に対するそれらの補完的スペクトルに基づいて選択されるべきである。この手法は、患者にとって以下の利点および利益を有する：（ｉ）患者の腫瘍を破壊することができる活性腫瘍溶解性ウイルスの陽性適合についてのより良い機会；（ｉｉ）特異的な細胞移入および複製機構を使用する特定のウイルスに抵抗性の腫瘍細胞を選択する、より低い確率；ならびに（ｉｉｉ）患者の腫瘍溶解性ウイルスに対する個々の感受性による合併症のより低い確率。腫瘍溶解性組成物中のウイルスは、患者を潜在的ウイルス病原体から保護するインターフェロンの産生を誘導するべきである。がん細胞は一般的に、悪性細胞に対する腫瘍溶解性ウイルス作用の特異性の下にあるインターフェロンにあまり感受性でない。ウイルス混合物の使用はまた、（ａ）条件的病原性ウイルスまたは（ｂ）広範な安全性試験を受けていない腫瘍溶解性ウイルスの慣習的選択バリアントの使用を許容し得る。後者は、腫瘍溶解性ウイルス療法への個別化手法にとって特に重要である。条件的（または潜在的）病原性ウイルスは、不均一な疑似種を形成する急速に発達する非病原性株に由来し、そのうちの一部の変形は、とりわけ免疫無防備状態の個体において、病原性特性を獲得し得る。

腫瘍溶解性ウイルスを含有する組成物は、時間間隔後に連続的に使用／投与することができる。特定の実施形態では、所与の組成物が使用される間隔は、約２４時間～約２４週間である。他の実施形態では、間隔は、約１週間～約６週間である。換言すると、第２の組成物は、第１の組成物がこの期間中に投与された後に投与される。組成物は、この期間中に複数回投与することもでき、患者の身体の多数の位置に投与することもできることに留意されたい。

本明細書で開示する方法および組成物で使用される腫瘍溶解性ウイルスは、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅのファミリーのウイルスであり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは独立して、ヒトエコーウイルス；コクサッキーウイルス；ポリオウイルスのセービン株；ヒトレオウイルスタイプ１、２または３；麻疹ウイルス；ムンプスウイルス；ニューカッスル病ウイルス；センダイウイルス；ワクシニアウイルス；イヌジステンパーウイルス；マラバウイルス；または水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ：ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）から選択することができる。

使用に企図される具体的なウイルスとして、エコーウイルス１～７、９、１１～２７、２９～３３；コクサッキーウイルスＡ１～Ａ２２およびＡ２４；コクサッキーウイルスＢ１～Ｂ６；ポリオウイルスセービン株１～３；麻疹ウイルスワクチン株エドモンストン、Ｍｏｒａｔｅｎ、Ｚａｇｒｅｂ、ＡＩＫ－Ｃ、Ｒｕｂｅｏｖａｘ、Ｓｃｈｗａｒｚ、ＣＡＭ－７０、Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ－４７、Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ－４およびＳｈａｎｇｈａｉ－１９１；ムンプスウイルスワクチン株Ｊｅｒｙｌ－Ｌｙｎｎ、ＲＩＴ４３８５、Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ－３、Ｌｅｎｉｎｇｒａｄ－Ｚａｇｒｅｂ、Ｕｒａｂｅ Ａｍ９およびＳ７９；ニューカッスル病ウイルス株Ｌａ Ｓｏｔａ、Ｂ１、Ｖ４、ＶＧ－ＧＡ、Ｕｌｓｔｅｒ２Ｃ、Ｆｕｌｌｅｒ、Ｒ２Ｂ、ＭｕｋｔｅｓｗａｒおよびＫｏｍａｒｏｖ；センダイウイルス株Ｃａｎｔｅｌｌ、Ｆｕｓｈｉｍｉ、ＺおよびＨａｍａｍａｔｓｕ；ワクシニアウイルス株Ｌｉｓｔｅｒ、Ｄｒｙｖａｘ、ＥＭ６３、ＡＣＡＭ２０００、ＡｎｋａｒａおよびＬＣ１６ｍ８が挙げられる。

腫瘍溶解性組成物中の各ウイルスの投与量は、約１×１０^４（１０^∧４）ＴＣＩＤ５０／ミリリットル（ｍＬ）～約１×１０^１１（１０^∧１１）ＴＣＩＤ５０／ミリリットルである。

一例として、以下の腫瘍溶解性ウイルスパネルは、連続的に投与することができる：
・レオウイルスタイプ１（細胞移入のためにシアル酸を使用する）；
・コクサッキーウイルスＢ５（ＣＤ５５を必要とする）；
・エコーウイルスタイプ１（細胞移入のためにインテグリンα２β１を必要とする）；
・コクサッキーウイルスＡ７（インテグリンαＶβ３およびαＶβ６、ＩＣＡＭ－１およびＣＤ５５を必要とする）；
・麻疹ウイルス、エドモンストン（ＣＤ４６を必要とする）；
・コクサッキーウイルスＢ６（ＣＸＡＤＲおよびＣＤ５５を必要とする）；
・セービンポリオウイルスタイプ１ワクチン株（受容体としてＣＤ１５５を使用する）。

エンテロウイルスの自然感染は、リンパ球系細胞の感染により消化管を通して起こる。しかしながら、個体が以前にウイルスに曝露されている場合、腸経路は遮断され得る（すなわち、腸抵抗性）。腫瘍溶解性組成物／ウイルスは、悪性疾患および使用される特定のウイルス株に応じて、腫瘍内、経口、経鼻、静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋内、腹腔内、胸膜内、膣内、尿道内、脊髄内および頭蓋内経路により投与することができると企図される。組成物／ウイルスはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、組成物／ウイルスに事前感染させた細胞担体の全身性投与により投与することができる。

また、より広いスペクトルのがん細胞を溶解することができるか、または以前に投与された腫瘍溶解性ウイルスに応答して誘導された抗体と交差中和しない、追加の腫瘍溶解性ウイルスの効力のある株を培養し、得ることも有益であり得る。２つのかかる方法を、本明細書で説明する。

第１に、合成リボヌクレオチドまたはリボヌクレオシドアナログを使用して、ウイルスにおいて突然変異誘発を誘導してもよく、これらのアナログは、ウイルスＲＮＡポリメラーゼによりウイルスＲＮＡゲノムに組み込まれ、複製中に異常なヌクレオチド塩基対形成をもたらし、それによって突然変異誘発を受けたウイルス（突然変異ＲＮＡ種）を産生し得る。１つのかかるリボヌクレオシドアナログは、リバビリンであるが、グアノシン、ウリジン、シチジンおよびアデノシンアナログからなる群から選択される他の合成リボヌクレオチドおよびリボヌクレオシドアナログを、この目的のために使用することができる。使用され得る他のアナログとして、限定されるものではないが、ウイルスの致死的突然変異誘発のために開発された抗ウイルス薬、例えば５－アザシチジン；５－フルオロウラシル；５－アザ－５，６－ジヒドロ－２－デオキシシチジン；Ｎ４－アミノシチジン；Ｎ１－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；３，Ｎ４－エテノシチジン；３－メチルシチジン；５－ヒドロキシシチジン；Ｎ４－ジメチルシチジン；５－（２－ヒドロキシエチル）－シチジン；５－クロロシチジン；５－ブロモシチジン；Ｎ４－メチル－Ｎ４－アミノシチジン；５－アミノシチジン；５－ニトロソシチジン；５－（ヒドロキシアルキル）－シチジン；５－（チオアルキル）－シチジンおよびシチジングリコール；５－ヒドロキシウリジン；３－ヒドロキシエチルウリジン；３－メチルウリジン；Ｏ２－メチルウリジン；Ｏ２－エチルウリジン；５－アミノウリジン；Ｏ４－メチルウリジン；Ｏ４－エチルウリジン；Ｏ４－イソブチルウリジン；Ｏ４－アルキルウリジン；５－ニトロソウリジン；５－（ヒドロキシアルキル）－ウリジン；５－（チオアルキル）－ウリジン；１，Ｎ６－エテノアデノシン；３－メチルアデノシン；Ｎ６－メチルアデノシン；８－ヒドロキシグアノシン；Ｏ６－メチルグアノシン；Ｏ６－エチルグアノシン；Ｏ６－イソプロピルグアノシン；３，Ｎ２－エテノグアノシン；０６－アルキルグアノシン；８－オキソ－グアノシン；２，Ｎ３－エテノグアノシン；および８－アミノグアノシンならびに他の誘導体が挙げられる。かかるアナログは、細胞ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成の基質として働くことはできないが、むしろ、多くのウイルスのより乱雑なＲＮＡ複製により使用される。細胞培養物中のこれらのアナログの存在は、ＲＮＡウイルスの突然変異率を実質的に増大させ、それによって生体選択のプロセスを促進および加速する。

広範には、この第１の方法では、腫瘍溶解性ウイルスを、合成リボヌクレオシドアナログの存在下で第１の細胞培養物中にて増殖させる。腫瘍溶解性ウイルスは、約０．０５ＰＦＵ／細胞～約０．５０ＰＦＵ／細胞の量で添加される。合成リボヌクレオシドアナログは、約０．０２ｍＭ～約０．５ｍＭの量で存在する。約１２時間～約３６時間の第１の期間後、突然変異誘発を受けたウイルスを収集する。次に、突然変異誘発を受けたウイルスを、連続希釈を使用して第２の細胞培養物中で増殖させる。細胞変性効果を示す最後の希釈液のウイルスを回収する。所望の通り、突然変異誘発および連続希釈の追加の回を行ってもよく、連続希釈により選択した突然変異誘発を受けたウイルスは、突然変異誘発の次の回では第１の細胞培養物について使用され、合成リボヌクレオシドアナログに曝露される腫瘍溶解性ウイルスになる。第１の細胞培養物は、突然変異誘発に使用され、第２の細胞培養物は、ウイルス選択に使用されることが企図される。理想的には、第２の細胞培養物は、最終生体選択／最適化腫瘍溶解性ウイルスの所望の標的である細胞を含有する。その結果、第２の細胞培養物中で複製し得る腫瘍溶解性ウイルスが得られる。これは、例えば、ウイルスが、以前は感染するのが困難であった細胞種に、より容易に感染することができるようにウイルスを改変する、１つの方法である。

第２の方法は、第１の方法と同様であるが、腫瘍溶解性ウイルスも、抗体の存在下、第１の細胞培養物で培養される。第２の方法では、突然変異誘発／抗体曝露および連続希釈の逐次的な回は、抗体への抵抗性を増大したウイルスを選択するために意図されるので、第１および第２の細胞培養物は、同じ細胞種であってもよい。

本開示はまた、ウイルス増殖を向上させることを目的として変更した同義コドン利用および特にがん細胞におけるウイルスタンパク質の正しいフォールディングで、全ウイルスゲノムの化学合成により新しい合成ウイルスを産生し、正常細胞におけるそれらの増殖（およびウイルスタンパク質のフォールディング）を減衰させるための新規手法を開示する。

この点で、ウイルスゲノム（ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡ中に含有される）は、ウイルス発現および複製に必要な全ての情報を保有する。ウイルスゲノムは、ウイルス複製およびビリオンの組立てに必須のタンパク質をコードする限定的な数の遺伝子を有する。多くのウイルスゲノムはまた、細胞防御機構を抑制するタンパク質をコードする遺伝子を含有する。多くのウイルスゲノム内の個々の遺伝子の順序および位置（開始および停止）は、周知である。

宿主細胞がウイルス感染した場合、細胞のタンパク質合成装置は、ウイルスゲノムによりコードされるウイルスタンパク質を合成する。ウイルスｍＲＮＡの解読または翻訳は、リボソームにより行われ、アミノアシル－ｔＲＮＡは、タンパク質合成中にアミノ酸を付加して、タンパク質鎖を伸長する。ウイルスタンパク質が成熟し、機能的になり、十分な濃度に達したとき、ビリオンは組み合わさって、新しいウイルスを形成する。新しいウイルスは、宿主細胞から出、新しい細胞に感染するために使用可能になる。

遺伝暗号は、ｍＲＮＡ内の所与のヌクレオチド三つ組の配列（すなわち、コドン）と、そのコドンにより特定されるアミノ酸との間の対応を説明する。遺伝暗号は縮重しており、最大６個の同義コドンが所与のアミノ酸をコードする。しかしながら、所与のアミノ酸についての各コドンの利用は均一ではなく、コドン頻度は、コドンバイアスとして公知である。

同義コドン（同じアミノ酸をコードする）は、最初は、完全に同等の機能を有すると仮定されていた。しかしながら、同義コドンが、遺伝子／ゲノムにおいて等しい頻度で存在しないという発見は、コドン選択がアミノ酸コーディングを超えた機能的含意を有し得ることを示唆した。非均一なコドン使用パターンは、生物間で、および異なる組の遺伝子を発現する異なる細胞／組織間で変動する。生物／遺伝子および組織特異的コドン選択は、生物および組織／細胞特異的なｔＲＮＡ集団の差と関連する。ｔＲＮＡの存在量は、コドン利用頻度に直接比例することが公知であり、このようにして、所与の生物および／または細胞／組織において、頻繁に使用されるコドンは概して、稀にしか使用されないコドンより迅速に翻訳され、逆もまた同様である。解読速度は、翻訳中にリボソームを取り囲むｔＲＮＡの濃度に依存する。同義コドンの発生およびそれらの対応するｔＲＮＡの存在量は、ｍＲＮＡ翻訳における示差的効率の主な原因の１つである。

また、同義コドン利用は、ｍＲＮＡ安定性、および最も重要なのは、タンパク質フォールディングに影響を及ぼすことが発見されている。同義コドンは、翻訳速度論を調整することによりタンパク質フォールディングを調節し得る。ｉｎ ｖｉｖｏでは、新生ペプチド鎖がリボソーム出口トンネルから出現するにつれて、タンパク質フォールディングは、同時翻訳的に開始する。所与のコドンについてのｔＲＮＡ存在量の差のための局所翻訳速度における変動は、リボソームから出現する新生ポリペプチド鎖の規則正しい、連続的構造化を可能にすることにより、タンパク質フォールディングを促進し得る。ｍＲＮＡに沿った稀なコドンおよび高頻度のコドンの配置／分布は、細胞におけるタンパク質フォールディングを能動的にガイドし得る。このように、同義コドン利用は、翻訳伸長のみでなく、細胞において同時翻訳的フォールディングおよびタンパク質の質もまた制御する。このように、同義コドンのうちのどれが特定のアミノ酸に使用されるかを制御するためにウイルスＤＮＡ／ＲＮＡ配列を変えることにより、タンパク質発現レベルおよびタンパク質構造特性の両方を調節することが可能である。換言すると、ｍＲＮＡ上でのリボソーム移動は均一ではなく、かかる「翻訳非均一性」は、タンパク質フォールディングに影響を及ぼすと考えられている。

多細胞生物に特異的な２つの特色が、最近発見されている：（ｉ）コドン利用およびｔＲＮＡ存在量における細胞間および組織特異的変動の存在；ならびに（ｉｉ）細胞増殖における翻訳制御および分化協調ｔＲＮＡ需要供給についての二重プログラムの存在。増殖中のがん細胞で誘導されるｔＲＮＡは典型的に、分化／停止中の細胞においては抑制されていることが発見された。逆に、分化中の細胞で誘導されるｔＲＮＡは多くの場合、増殖中の細胞では抑制されており、このようにして分化関連遺伝子の特徴的コドン利用優先性に調整したｔＲＮＡ要求に対するその供給の必要な調整を提供していることが発見されている。このように、ｔＲＮＡ存在量の差が、翻訳速度論を変えるので、がん細胞における多くのウイルスのタンパク質発現は、変更または低減され、それもまた、ウイルスタンパク質のフォールディングに影響を及ぼし得る。

合成標的化ウイルスまたは全身性標的化治療（ＳＴＲ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｒｅｍｅｄｙ）は、上述の２つの観察を考慮に入れる。これらの観察に基づいて、がん細胞でより良く発現され得るが、非悪性／正常細胞では発現されない合成ウイルスを産生する目標を伴って、適切な同義コドン選択により、所与の細胞種における所与のウイルスによるウイルスタンパク質発現レベルおよびウイルスタンパク質フォールディングを変えることが可能である。結果としての翻訳速度論が、がん細胞で微調整され、正常細胞と比較してがん細胞においてｔＲＮＡレパートリーの差を与えられたがん細胞におけるウイルスタンパク質の発現の向上および正しいフォールディングを確実にするようにより最適に適合されるように、ウイルスＯＲＦｅｏｍｅの同義コドンを調整する。これは、各個々のウイルス遺伝子についてのウイルスゲノムに沿った稀な、および高頻度の同義コドンの両方の好適な選択により、がん細胞種内でのｔＲＮＡの存在量を考慮に入れて、行われる。その結果、ウイルスは、より効率的にがん細胞内で複製し、がん細胞を殺滅し得る。所与のがん細胞種内の環境についてのこの最適化のために、ｔＲＮＡの相対的分布が異なり、そのため翻訳速度論が異なるので、ウイルスタンパク質の発現およびそれらのフォールディングはまた、正常細胞において減衰されることも予想される。正常細胞では、代わりに、ウイルスタンパク質の発現の低減に加えて、ウイルスタンパク質ミスフォールディングおよび／または分解の向上が起こり得る。

これらの合成標的化ウイルスまたはＳＴＲは、正常細胞におけるウイルスタンパク質の発現の減衰およびがん細胞におけるそれらの発現の向上を引き起こすような方法で「参照」ウイルスにおけるコドンを調整する、逆遺伝的手法により産生することができる。このようにして、同義コドン利用は、がん細胞におけるウイルスタンパク質の正しいフォールディングを確実にし、これは、成熟かつ完全に機能性のタンパク質状態を得るために重要である。この手法はまた、ウイルス増殖のさらなる調節および減衰ならびに／またはウイルスタンパク質フォールディングの調節、それゆえ特定の遺伝子または１組の遺伝子のみの標的化調節を通してウイルス活性を変えることを目的とした、ある特定の／特定のウイルス遺伝子の標的化最適化を可能にする。上述の通り、必要に応じて、選択されたウイルスタンパク質（例えば細胞溶解を担う）のみの標的化脱最適化／減衰は、例えば、具体的にがん細胞におけるウイルス複製の延長を目的として具体的に行われ得る。さらに、合成標的化ウイルスが、悪性疾患の特定の形態に具体的に標的化され得るように、コドン最適化手法は、ｔＲＮＡ利用／同義コドン頻度におけるがん組織特異的差を考慮し得る。

簡潔に説明すると、以下の表Ａは、天然株１セービンＦＤＡポリオウイルスのＯＲＦｅｏｍｅのコドン利用頻度を特定し、（ｉ）各コドンによりコードされるアミノ酸、（ｉｉ）所与のアミノ酸の同義コドンおよび（ｉｉｉ）１０００個のコドン当たりのコドンの相対的頻度を示す。コドン利用を、カウントコドンプログラムhttp://www.kazusa.or.jp/codon/countcodon.htmlを使用して表にした。このコドン利用は、正常な分化非悪性細胞／組織におけるウイルス複製に最適であると考えられる。セービン株は中枢神経系において顕著に減衰されるが、例えば腸のような他の細胞／組織においては野生型レベルで複製すると考えられている（および示された）ことに留意されたい。これらの株はまた、培養神経芽細胞腫細胞ではあまり増殖しない。

次に、以下の表Ｂは、急速に増殖するがん細胞（結腸／膀胱がん細胞）のｔＲＮＡプールから推測したこれらの細胞におけるコドン利用を示す。かかるｔＲＮＡ分布プロファイルを産生するために本分野でハイスループット法が使用可能である。これは、本開示を例示する目的のためにのみ提供される。

次に、表Ａの参照ウイルスＯＲＦｅｏｍｅ（「正常／所与の」ヒト細胞における発現に「自然に」最適化された）と表Ｂで示されるがん細胞のＯＲＦｅｏｍｅとの間の相対的コドン利用／ｔＲＮＡ分布頻度を、１つの細胞種から別の細胞種まで所与のヌクレオチド配列を最適化／脱最適化するために使用することができる。ネイティブ細胞および標的細胞において最も類似する利用頻度を有する同義コドンを導入することにより、最適化を行うことができる。ネイティブ細胞で観察される速度論を模倣する、標的細胞におけるｍＲＮＡ翻訳速度論を得るために、稀なコドンおよび高頻度のコドンの両方を変更する。ネイティブ細胞および標的細胞の翻訳速度論が可能な限り異なるように、それらにおいて最も類似しない利用頻度を有する同義コドンを導入することにより、脱最適化を行う。

厳密に一例として、表Ｃは、株１セービンＦＤＡポリオウイルスの１０コドン配列についての、「ネイティブの」元のコドン利用頻度、標的／がん細胞コドン利用頻度および得られる最適化頻度を提供する。

ここで表Ｃを参照して、１０コドン配列は、がん細胞で発現されることが所望されるポリオウイルスポリタンパク質の開始をコードする。「元のコドン利用頻度」と題された列では、分化ヒト細胞／組織における発現に「自然に最適化された」と考えられる天然ウイルスにおける「元の」コドンの頻度を列挙する。「元のコドンについての標的細胞コドン利用頻度」と題された列では、標的／急速に増殖するがん細胞における「元の」コドンの頻度を列挙する。これらの２つの列を比較することにより理解できる通り、コドンのうちの一部は、それらの頻度において大いに変動する。例えば、コドン８番および１０番の頻度は、劇的に変動する（それぞれ、６４．００対１９．４６および４０．００対２６．２４）。図３を参照して、これらのコドン頻度の差も明らかである。

第５番目の列は、「得られる／最適化頻度」と題され、同じウイルスタンパク質を、ただし標的／がん細胞において、発現するように最適化された、１０コドン配列におけるコドンの頻度を示す。最適化配列において各位置について「最適化された」コドンは、以下のように決定される。第１に、コドンの各対について、それらの頻度間の差（標的コドン－元のコドン）を決定し、ネイティブ配列に最も近い頻度を有する標的コドン利用表における同義コドンを選択する。第２に、標的細胞におけるいくつかの同義コドンの頻度が同一であり、そのため頻度（単独）に基づく選択がなされ得ない場合、第３の塩基でのゆらぎを最小限にする三つ組組成での同義コドンを選択するべきである。第３に、標的同義コドンが既に、ネイティブ宿主頻度に最も近い頻度を有する場合、それは変えないままである（ときにはこの頻度はそれでも、ネイティブ／元の宿主とはかなり異なり得ることに留意されたい）。

例えば、上述の規則に従って、ネイティブ配列の１０位でＶａｌをコードするＧＴＧコドンは、最適化コドン配列においてＧＴＴで置換されている。Ｖａｌは４つの同義コドンによりコードされ、ＧＴＴコドン利用頻度（２７．００）は、ウイルスＯＲＦｅｏｍｅで観察される元のコドン利用頻度（２６．２４）と（標的がん細胞において）最も近い適合である。

コドン番号９ ＡＡＡ（Ｌｙｓをコードする）の場合、２つのＬｙｓ同義コドンの頻度は、標的がん細胞において同一（５０．００）であるように見える。このように、この場合、ＡＡＧコドンの選択は、（上記に説明する通り）コドン三つ組の第３の塩基でのゆらぎを最小限にするために行われた。このように、ＡＡＡは、ＡＡＧにより置換された。解読プロセスの特異性は、完全なワトソン－クリック塩基対は通常、コドンの最初の２つのヌクレオチドとアンチコドンの最初の２つのヌクレオチドとの間で観察されるが、変更された塩基対形成は３番目、いわゆる「ゆらぎ」位置で可能であるというものである。ゆらぎは、ｔＲＮＡアンチコドンループのコンフォメーションが、アンチコドンの第１の塩基で可動性を許容するために起こる。第３コドン塩基での完全なワトソン－クリック塩基対形成は、解読プロセスの高い厳密性を確実にし、翻訳ミスエラーを最小限にする。また、がん細胞におけるＡＡＡおよびＡＡＧコドンの頻度は、ネイティブウイルスＯＲＦｅｏｍｅのその頻度に適合しないが、Ｌｙｓは、これらの２つの同義コドンによってのみコードされるので、他の選択は可能ではないことに留意されたい。

この最適化の結果として、表Ｃで分かる通り、このウイルスポリタンパク質をコードする「ネイティブ／参照」配列の１０コドンのうちの９個は、がん細胞で発現されるウイルスタンパク質をコードするために最適化された配列では変えられている（この比較は、厳密に一例として示されることに留意されたい）。図３を見ると、「最適化」（三角）の線の形状は望ましく、可能な限り「元の」（菱形）線の形状に近い。図４は、より大きなスケールで行った、この同じ最適化の結果を示す、より大きなプロファイルである。ここでは、ネイティブおよび最適化配列のコドン１５０～２１０を示す。ここでもまた、「最適化」（三角）の線は望ましく、可能な限り「元の」（菱形）線に近い。

同じ様式で、合成標的化ウイルスの全ＯＲＦｅｏｍｅは、「参照」ウイルスに由来し得る。ウイルスのタンパク質をコードする（オープンリーディングフレーム）領域のみが最適化される必要があることに留意されたい。他の領域、例えば５’および’３非翻訳（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域、例えば５’－配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ：Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）エレメントは一般的に、このプロセスに従って最適化される必要はない。しかしながら、ＯＲＦｅｏｍｅ内のある特定のタンパク質コード領域もまた、最適化される必要がない場合があることに留意されたい。これらの領域は、ウイルス複製および機能に重要な、決定的なＲＮＡ構造および／または配列エレメントを含み得る。これらの領域は、これらの領域の構造または決定的な組成を復元する代償的な同義突然変異が導入され得ない限り、インタクトなまま保存されるべきである。

特定の実施形態では、逆遺伝子操作ＳＴＲは、それらの天然アナログと（ヌクレオチドレベルで）８５％未満同一である。特定の実施形態では、ＳＴＲは、それらの天然アナログと８０％未満のヌクレオチド同一性または７５％未満のヌクレオチド同一性を有し得る。しかしながら、一般的に、ＳＴＲまたは合成標的化ウイルスは、参照ウイルスと少なくとも６７％のヌクレオチド同一性を有する。

かかる天然アナログに対する低レベルの同一性の場合、合成ＳＴＲは、新しい属のウイルスと考えることができ、安全であり、かつ天然ウイルスと組換えることができないと推定される。

本開示を、以下の非限定的な実際の実施例でさらに例示し、これらの実施例は、単に例示であると意図され、本開示は、本明細書で列挙する材料、条件、プロセスパラメータなどに限定されるとは意図されないことが理解される。

腫瘍溶解特性を有する１パネルの１２種類の非病原性ヒトウイルス、全身性自律的標的化腫瘍溶解治療（ＳＡＴＯＲ：Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｒｅｍｅｄｙ）または全身性標的化治療（ＳＴＲ）、それらの単離および使用を、以下に説明する。また、がんの処置における医薬としての合成腫瘍溶解性ウイルスの組成物および使用を示し、ここで合成腫瘍溶解性ウイルスは、改変ヌクレオチド組成／同義コドン利用で新規に産生された。

ウイルス株の単離

１パネルの非病原性腫瘍溶解性ウイルスを、健康な２～３歳の小児の糞便からの単離により形成した。ウイルス株を以下のように単離した：ｉ）糞便試料を収集し、４℃で最長４８時間保存した；ｉｉ）糞便をＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液）中でホモジナイズして３０％懸濁液を産生した；ｉｉｉ）懸濁液を５０００ｇで３０分間の遠心分離により透徹し、０．２２μフィルターを通過させ、－７０℃で保存した。

３種類の細胞培養物の単層を、ウイルス単離のために調製した。これらは：アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－７０）；ヒト癌細胞系ＨＥｐ－２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－２３）；およびヒト横紋筋肉腫細胞系ＲＤ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１３６）であった。

新鮮な細胞系の単層を含む１００ｍｌのフラスコを、１ｍｌの種菌と共に３７℃で１時間インキュベートし、次にＨＢＳＳで３回洗浄し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で３日間インキュベートした。次にフラスコを－７０℃に置き、次に融解し、ウイルス含有培地を、上述の通り、新鮮な細胞培養物の接種のために使用した。細胞変性効果が少なくとも１種の細胞培養物中で目に見えるまで、盲検的継代を繰り返した。ウイルスを収集し、－７０℃で保存した。ＣＶ１（サル腎臓）細胞系は、全ての単離されたウイルス株の複製を支持するので、ウイルスの慣例的な増殖のために、これを選択した。また、ＣＶ１細胞において、ウイルスタイターも決定した。それらは、６～９ｌｏｇ ＴＣＤ５０／ｍｌの範囲内であった。

型特異的血清での中和により、株の血清型分類を行った。以下の株を得た：ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１に対応する）；ＳＴＲ６Ｅ７（エコーウイルス７に対応する）；ＳＴＲ７Ｅ１２（エコーウイルス１２に対応する）；ＳＴＲ８ＣＡ７（コクサッキーウイルスＡ７に対応する）；ＳＴＲ９ＣＡ９（コクサッキーウイルスＡ９に対応する）；ＳＴＲ１０ＣＢ１（コクサッキーウイルスＢ１に対応する）；ＳＴＲ１１ＣＢ２（コクサッキーウイルスＢ２に対応する）；ＳＴＲ１２ＣＢ３（コクサッキーウイルスＢ３に対応する）；ＳＴＲ１３ＣＢ４（コクサッキーウイルスＢ４に対応する）；ＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５に対応する）；およびＳＴＲ１５ＣＢ６（コクサッキーウイルスＢ６に対応する）；ＳＴＲ１７Ｅ２１（エコーウイルス２１に対応する）。

単離したウイルス株は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルス属に属する。これらは、７２００～７３００ヌクレオチドのゲノムＲＮＡに共有結合した４つのキャプシドタンパク質および小ＶＰＧタンパク質からなる、小正センス一本鎖ＲＮＡウイルス２０～２５ｎｍ粒子である。

単離後、ウイルスは、細胞培養物中で複数回の継代を受け、適応、高収率のウイルスおよび産生されるウイルスストックのタイターの増大をもたらした。

健康なボランティアについて１０^８ＰＦＵのウイルスの経口または鼻内適用により、株の安全性を試験した。試験は、重度の有害反応を示さず、２４時間未満継続する中程度の熱（３７．０℃～３７．５℃）、悪寒、吐き気を含む軽度のインフルエンザ様症状の稀な発生、および軽度の下痢のより稀でない症例のみを示した。また、それらは季節性ウイルス感染に対する大衆非特異的保護に使用されたので、臨床試験の結果を要約する公開報告により、ウイルスの安全性も確認された。

腫瘍由来細胞における単離されたウイルス株の増殖

個々のプラークからの精製後、１パネルの細胞系を使用して、様々な腫瘍由来ヒト細胞系で複製するウイルス株の能力を試験した。

新鮮な細胞系のサブコンフルエント単層を含む１２ウェルプレート中で試験を行った。細胞に、１００μｌ体積中の０．１ ＴＣＩＤ５０／細胞を１時間感染させ、次にＨＢＳＳで洗浄し、１％ＦＢＳを補充した１ｍｌのＤＭＥＭ中でインキュベートした。４８時間後、様々な程度の細胞変性効果を示す単層を凍結融解し、終点希釈およびＣＶ１細胞の感染によりタイターを決定した。

以下の表１および２は、様々な細胞系：正常ヒト胎児肺線維芽細胞（ＮＨＥＬＦ）；乳癌（ＢＣ）；子宮頸癌（ＣＣ）；類表皮癌（ＥＣ）；前立腺癌（ＰＣ）；黒色腫（Ｍｅｌ）；非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）；膵癌（ＰａｎＣ）；および横紋筋肉腫（ＲＭＳ）について得たウイルスタイターとして示される、パネルからのウイルスの増殖潜在能力を示す。

上記表１および２に示す結果は、パネルからの個々のウイルス株は、異なる腫瘍由来細胞系において重複を示すが、同一の増殖特徴を示さないことを示す。特に、ＭＣＦ７乳癌細胞は、コクサッキーウイルスＢ４およびＢ６／ＳＴＲ１５ＣＢ６の増殖を支持しないが、エコーウイルス１および７を効率的に増殖させる。コクサッキーウイルスＡ９およびＢ３は、ＡｓＰＣ－１膵がん細胞であまり複製しないが、この細胞は、エコーウイルス１２およびコクサッキーウイルスＢ４に非常に感受性である。
（実施例１）

ヌードマウス異種移植片モデルにおけるウイルス株の腫瘍溶解活性

方法および材料

株を、ヒト癌細胞を注射した後に形成した胸腺欠損ヌードマウス異種移植片腫瘍における腫瘍溶解活性についてさらに試験した。マウスに、２～１０×１０^６個の細胞を皮下注射した。腫瘍体積が約０．１～０．１５ｍｌに達したとき、腫瘍に０．０５ｍｌのウイルス（１０^８ＴＣＩＤ５０）を毎日４日間注射し、腫瘍体積を５０日目まで５日毎に測定した。対照マウスに、非感染細胞から収集した培養培地を注射した。図１Ａ～１Ｃは、非処置の場合の経時的な腫瘍増殖を示す線（Ｃ３３Ａ、ＡｓＰＣ１およびＭＣＦ７）を含むグラフである（以下にさらに説明する）。図６は、腫瘍増殖を示す左の２枚の写真を含む。

結果

ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞系において増殖するウイルスの能力とｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍溶解活性との間の優れた相関が観察された。あまり複製しないウイルス（Ｃ３３Ａ細胞におけるコクサッキーウイルスＢ３、ＡｓＰＣ１細胞におけるコクサッキーウイルスＡ７／ＳＴＲ８ＣＡ７、ＭＣＦ７細胞におけるコクサッキーウイルスＢ６／ＳＴＲ１５ＣＢ６）は、同じ細胞に由来する異種移植片腫瘍において腫瘍溶解活性を示さないが、強い複製を示すウイルス（Ｃ３３ＡにおけるコクサッキーウイルスＡ７／ＳＴＲ８ＣＡ７、ＡｓＰＣ１におけるコクサッキーウイルスＢ４およびＭＣＦ７細胞におけるエコーウイルス１）は、異種移植片腫瘍を破壊することができる。

図６は、免疫無防備状態（ヌード）マウス異種移植片モデルに関する前臨床実験におけるｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞増殖に対するウイルス効力を示す、４枚１組の写真である。上部の行では、子宮頸癌（Ｃ３３Ａ）細胞を皮下注射し、エコーウイルス１を静脈内注射した。左の写真はウイルス注射前であり、右の写真はウイルス注射１６日後である。下部の行では、結腸癌（ＲＫＯ）細胞を皮下注射し、次にポリオウイルス株１を静脈内注射した。左の写真はウイルス注射前であり、右の写真はウイルス注射１８日後である。右の写真で分かる通り、ウイルス注射は、顕著に腫瘍縮小をもたらした。
（実施例２）

患者の悪性細胞の様々な腫瘍溶解性ウイルス株への個々の感受性の試験

本実施例は、個々のヒトウイルス株の腫瘍溶解活性が、がん細胞の性質によって大きく変動することを示す。したがって、陽性応答を達成するために、腫瘍溶解効力のあるウイルス株を選択する必要がある。これは、生検または手術により得た、生存悪性細胞の短期培養物の感受性プロファイルを試験することにより直接行うことができる。

材料および方法

腫瘍組織試料を、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充した事前に冷蔵した滅菌培地ＤＭＥＭに収集した。培地からの栄養素の優れたアクセスを提供するために、腫瘍断片の厚さは５ｍｍ未満であった。試料は、＋４℃で最大４８時間保存することができた。次にそれを、滅菌レーザーブレードにより１～２ｍｍのより小さな断片に破壊し、板ガラス乳棒を使用して押し出して、５０～１００ミクロンサイズのナイロンメッシュを通過させた。次に懸濁液を、８００ｇで５分間の遠心分離により培地中で２回洗浄した。懸濁液をトリパンブルーで染色し、細胞を計数した。０．２ｍｌ中の１～５×１０^４個の細胞の均等部分を、滅菌１．５ｍＬプラスチック管に入れ、１～５×１０^４ＴＣＩＤ５０の様々なウイルス株と共に３７℃で３０分間インキュベートした。次に懸濁液を、微量遠心分離機で８００ｇにて３分間、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を補充した１ｍｌのＤＭＥＭにより３回洗浄した。０．２ｍｌ中の各試料を９６ウェルプレートの２つの並行ウェルに入れ、３７℃で５％ＣＯ_２および低酸素の雰囲気にて４８時間インキュベートした。次に試料を－７０℃で凍結し、融解し、４℃で５０００ｇにて１０分間の遠心分離により細胞片から透徹し、ウイルスタイターを連続希釈および感受性ＣＶ１細胞の感染により決定した。特定のヒトウイルスに感受性を示す腫瘍試料は、最大１０^６～１０^７ＴＣＩＤ５０／ｍｌを産生した。

ウイルスへの個々の感受性を試験するための技術は、限定されるものではないが、ヒトエコーウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスのセービン株、血清型１、２および３、ヒトレオウイルスタイプ１、ヒトレオウイルスタイプ、ヒトレオウイルスタイプ３、麻疹ウイルスのエドモンストン株、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス株、センダイウイルス、ワクシニアウイルス株などを含む、多くの様々なウイルス株に適用可能である。
（実施例３）

同時適用のための腫瘍溶解性ウイルスの組合せ

図２で示す通り、ウイルス混合物の同時使用の効率を、Ｃ３３Ａヒト子宮頸癌細胞系に由来する腫瘍を有するヌードマウスにおける異種移植片実験において示した。マウスに、Ａ４３１類表皮癌細胞を皮下注射した。腫瘍が触知可能になった後、腫瘍部位に０．１ｍｌのウイルス（１０^８ＴＣＩＤ５０）を１日間隔で４日間注射した。Ｃｏｘ－Ｂ５はＳＴＲ１４ＣＢ５に対応し、Ｃｏｘ－Ｂ６はＳＴＲ１５ＣＢ６に対応し、Ｅｃｈｏ１２はＳＴＲ７Ｅ１２に対応した。

マウスに、細胞において様々な増殖能を示す１種類のウイルス（Ａ４３１）および２または３種類の腫瘍溶解性ウイルスの混合物を、１日間隔にわたり４日間注射した。次に腫瘍体積を５０日目までモニターした。
（実施例４）

ＭＣＦ７細胞で複製し得るコクサッキーウイルスＢ６の生体選択

材料および方法

ＭＣＦ７乳癌細胞は、コクサッキーウイルスＢ６に抵抗性であり、０．１ＰＦＵ／細胞のウイルス感染４８時間後に１０^２ＰＦＵ／ｍｌ未満しか産生しないことが分かった（上記表１および２を参照のこと）。コクサッキーウイルスＢ６ウイルスの増殖を、ＣＶ１細胞で行った。突然変異誘発のために、ＣＶ１細胞において２～３桁、感染性ウイルスの収率を低減させるリバビリン濃度を決定した。それは、０．１～０．５ｍＭに対応した。新鮮なＣＶ１細胞の単層に、リバビリンの存在下で０．１ＰＦＵ／細胞のコクサッキーウイルスＢ６を感染させた。２４時間後にウイルスを収集し、ＭＣＦ７細胞に、突然変異誘発を受けたウイルスの連続希釈物を感染させた。６０分間の吸収後、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、次に２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートした。試料から収集したウイルスは、細胞変性効果を示す最終希釈物を示した。次にそれをＣＶ１細胞において増殖させ、得たストックを第２回の突然変異誘発およびＭＣＦ７細胞の連続希釈物感染に使用した。

結果

ＭＣＦ７から得、ウイルスの最高希釈物を感染させたウイルスストックは、ＣＶ１細胞でアッセイすると、１０^７～１０^８ＰＦＵ／ｍｌのタイターを示した。プラークアッセイ中のプラークは、外観およびサイズが多形性であった。より大きなプラークを採取し、ウイルスストックの調製に使用し、これはＭＣＦ７細胞で増殖させると２～５×１０^８ＰＦＵ／ｍｌのタイターを示した。最初のウイルスおよび選択した株について配列決定した。生体選択株においてＶＰ１遺伝子内の４つのアミノ酸置換があった：Ａｓｎ－６５５→Ｌｙｓ；Ｔｈｒ－６９８→Ｉｌｅ；Ｐｒｏ－７１５→Ｈｉｓ；およびＬｙｓ－８２５→Ｇｌｕ。
（実施例５）

抗血清で交差中和しないエコーウイルス１の生体選択

材料および方法

エコーウイルス１の濃縮精製ストックでのヒツジの免疫化により、中和のための抗血清を得た。この抗血清を、精製免疫グロブリンの調製に使用した。エコーウイルス１の突然変異誘発を受けたストックを、０．１ｍＭリバビリンの存在下でＣＶ１細胞において得た。抗体希釈物を、突然変異誘発を受けたエコーウイルス１ストックと共に３７℃で６０分間インキュベートし、連続希釈物をＣＶ１細胞の感染に使用した。抗体の最終希釈物を感染させ、細胞変性効果を示す細胞からの試料を、第２回のリバビリンでの突然変異誘発ならびに抗体での中和および滴定に使用した。連続８回の突然変異誘発および選択を後に行った。

結果

次の連続８回の突然変異誘発および選択中、抗血清の中和効果へのウイルスの抵抗性の漸増があった。エコーウイルス１に対する抗体の効果がポリオウイルスタイプ１に対して生じた異種抗体の効果と同様であったとき、選択は成功であると考えられた。
（実施例６）

合成ＳＴＲの生成

材料および方法

ポリオウイルス生弱毒化ワクチン株（セービン株タイプ１；経口ポリオワクチンについてＦＤＡ承認済み）ゲノムを、正常細胞におけるウイルス発現を減衰させ、急速に分裂する／がん細胞におけるその増殖を向上させるために、コドン最適化した。改変ゲノムを化学合成し、組み立て、生ウイルスを産生するためにさらに使用した。配列番号１は、参照野生型株１セービンのヌクレオチド配列である。配列番号２は、コドン最適化合成ウイルスのヌクレオチド配列である。２つのヌクレオチド配列間で８０．１％の同一性がある（ＣＬＵＳＴＡＬ Ｏ ｖ１．２．２を使用して５３１６／６６３０）。

結果

改変ゲノムを有する１組の合成改変ポリオウイルス（ＳＴＲｐ）を産生した。ポリオウイルスは、一本鎖正センスＲＮＡゲノムを有し、それはｍＲＮＡとして（ポリタンパク質をコードする）、ゲノムＲＮＡ複製の鋳型として、またはウイルス粒子に梱包される新生ゲノムとして働くことができる。ウイルスゲノムの発現およびウイルスの複製は、ゲノムの５－非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置するいわゆる配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）－エレメントの機能に非常に依存している。ＩＲＥＳは、リボソーム小サブユニットを開始コドンの付近にリクルートし、ウイルスポリタンパク質の合成を開始する。切断に際して、ポリタンパク質のＮ末端部分は、構造的（キャプシド）タンパク質を生じ、一方で、Ｃ末端部分は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびいくつかのウイルス特異的プロテアーゼを含むいくつかの非構造的タンパク質を生じる。したがって、培地中でのウイルス粒子の滴定によるウイルスキャプシドタンパク質の発現およびアガープラークアッセイにおけるプラークサイズの測定は、様々な細胞種におけるウイルス複製の適合性を比較するために使用することができる。

ネイティブポリオウイルス株１および合成コドン最適化ポリオウイルス株１を、静止（ＲＤ細胞）および指数関数的に分裂する２９３Ｔ細胞において増殖するそれらの能力について比較した。ＲＤ細胞は、対照として作用した。図５で分かる通り、合成／コドン最適化ウイルスは、分裂細胞において優先的（約３倍高い）複製を示した。
（実施例７）
１人の患者における腫瘍溶解性ウイルスのパネルの臨床例

患者Ａ．Ｓ．（３３歳女性）は、Ｔ３Ｎ１Ｍ１軽度卵巣腺癌、腹膜および胸膜癌腫症、悪性腹水および胸膜炎、多発性骨盤、腹部および縦隔転移ならびに多発性リンパ節腫脹と診断された。

患者を、ＳＴＲＳ１（センダイウイルスの腫瘍溶解性株）で１年間処置した（１２回毎週、次に７回毎月のＳＴＲＳ１の皮内注射、１０^８Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）。２１００ユニットから３０～５０ユニットへの３ヶ月の期間にわたるＣＡ－１２５マーカーの下落があり、１１ヶ月間疾患進行の徴候がなかったが、その後、ＣＡ－１２５レベルは上昇し始め、腹水液は蓄積を再開した。がん細胞の１パネルの利用可能な腫瘍溶解性ウイルスへの感受性試験のために、腹水液を採取した。ｅｘ ｖｉｖｏ試験を以下のように行った。

フィブリン血栓を避けるためにヘパリンを補充した２００ｍｌの腹水液を、２０００ｇで１０分間遠心分離し、がん細胞の球状凝集体を含有する沈降物を収集し、細胞を計数した。１ｍｌの液中に約７×１０^５個の細胞があった。細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１ｍｌのＤＭＥＭ中の２×１０^６個の細胞の部分に分け、１．５ｍｌ微細管に入れた。ウイルスを、ポリオウイルスタイプ１のセービン株、エコーウイルスＳＴＲ４Ｅ１およびＳＴＲ７Ｅ１２、コクサッキーウイルスＳＴＲ８ＣＡ７およびＳＴＲ１４ＣＢ５、レオウイルスタイプ１（ＳＴＲＲ１）、麻疹ウイルス、エドモンストン由来株ＳＴＲＭ１ＥＳＣを試験するために使用した。細胞を、０．１ＴＣＩＤ５０／細胞の多重度で感染させ、３７℃で６０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで３回洗浄し、８００ｇで３分間遠心分離し、３７℃で５％ＣＯ_２において１ｍｌのＤＭＥＭ、２％ＦＢＳ中に入れた。４８時間後、偽感染細胞を除く、全ての試料において細胞の完全分解が観察された。ほとんどの株のウイルスタイターを、ＣＶ１細胞を使用して決定した。

センダイウイルス株ＳＴＲＳ１のタイターを、血球凝集反応において、および１０μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下でＭＤＣＫ細胞に感染させることにより決定した。腹水液からの細胞は、５×１０^７～５×１０^８ＴＣＩＤ５０／ｍｌの範囲のウイルスタイターを産生して、試験で使用した全てのウイルスに非常に感受性であると考えられた。細胞はまた、高感受性であると考えられる５×１０^５ＴＣＩＤ５０／ｍｌを産生して、ＳＴＲ－Ｓ１に感受性のままであった。しかしながら、患者から採取した腹水液は、ＳＴＲ－Ｓ１を中和することができる高タイターの抗体（１：１００，０００を超える）を含有しており、これが再発の原因と考えられた。

次に患者に、１×１０^８ＰＦＵのエコーウイルス１株ＳＴＲ４Ｅ１を静脈内注射した。注射９日後、腹水液の分析は、実質的にはがん細胞を示さなかった。次の５週間中に、３５００から３５０ユニットへのＣＡ－１２５の漸落があった。しかしながら、注射後６週目から開始して、腹水液は蓄積を再開し、がん細胞は球状凝集体として再出現した。ｅｘ ｖｉｖｏ試験から、細胞がＳＴＲ７Ｅ１２、ＳＴＲ１０ＣＢ３、ＳＴＲＲ１およびＳＴＲＭＥＳＣ１への完全な感受性を保持したが、ＳＴＲ４Ｅ１に抵抗性であったことが決定された。０．１および１ＴＣＩＤ５０／細胞でのエコーウイルス１の感染後、目に見える細胞変性効果も、ウイルス産生もなかった。再発は、ＳＴＲ４Ｅ１に抵抗性のがん細胞の選択により引き起こされたと結論付けられた。

次に患者に、１０ｍｌの３種類のウイルスのカクテル（各々１×１０^８ＰＦＵのＳＴＲ１０ＣＢ５、ＳＴＲ－Ｒ１およびＳＴＲＭＥＳＣ１（コクサッキーウイルスＢ５、レオウイルスタイプ１およびエドモンストン由来麻疹ウイルス株））を腹腔内注射した。接種４日後の腹水液の細胞学試験は、生存がん細胞を示さなかった。接種２ヶ月後、がん細胞の再出現は検出されなかった。
（実施例８）

患者Ｍ．Ｃ．（７４歳男性）は、尿膜管の腺癌、切除後２年、Ｓ状結腸付近の腫瘍の拡がり、結腸閉塞（５５ｍｍ×３５ｍｍ；閉塞を克服するためにＳ状ステントを導入した）および回盲領域までの閉塞（６０ｍｍ×３０ｍｍ）、腹膜の癌腫症および腹水と診断された。処置時までに、患者は、腹水の急速な蓄積および陰嚢中の液蓄積により危篤状態であった。

５０ｍｌの腹水液を遠心分離し、検査した。それは、１ｍｌ当たり２×１０^６個のがん性細胞を含有していた。細胞を洗浄し、２×１０^５個の細胞／ｍｌの密度でＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に播種した。３日で、細胞は単層を形成し、これを毎週１：３に分割することによりさらに培養した。

１組のウイルスの複製を細胞において試験した。細胞（継代１）を２４ウェルプレートに播種し、翌日１～５ＰＦＵ／細胞のウイルスに感染させ、子孫ウイルスを３日後に収集した。ウイルスを感受性の強い細胞における連続希釈滴定により定量した。細胞は、ＳＴＲＳ１、ＳＴＲＲ１、ＳＴＲＭＥＳＣ１、ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ７Ｅ１２、ＳＴＲ１４ＣＢ５、ＳＴＲ１５ＣＢ６に非常に感受性が強く、ＳＴＲ８ＣＡ７に抵抗性であった。

患者の危篤状態を考慮して、腫瘍溶解性ウイルス調製物を、１０ｍｌのセンダイウイルス株ＳＴＲＳ１、２×１０^８Ｉ．Ｅ．／ｍｌの腹腔内注射を通して腹水液に直接導入した。

３８．７～３９．４℃への体温上昇があった（注射１８時間後）。他の症状は、疲労、吐き気、腹部領域におけるわずかでかすかな痛みを含んだ。体温上昇はパラセタモールにより効率的に遮断され、次の２４時間の間正常および亜正常になるまで３７．２℃に維持された。次の３日間の間、腹水の減少に伴い、排尿の増大もあった。陰嚢液は最初の４８時間の間に消滅し、腹水は注射後４日目までに検出不能になった。患者の全身状態および活動は急速に改善し、優れた食欲および優れた気分を伴った。

注射３５日後、ＰＥＴ－ＣＴは、回盲領域における腫瘍の完全な消散およびＳ状結腸領域の腫瘍の実質的な低減ならびにＳ状ステントに向かう領域における代謝活性の残留の局所増大を示した。

注射６０日後、患者は、食後嘔吐を引き起こす胃と十二指腸との間の部分閉塞を訴え始めた。以前の腹水蓄積エピソードにより開始した癒着プロセスによる液蓄積が、腹部領域上部で検出された。腹腔穿刺は、液中の任意のがん性細胞を示さなかった。状態は、利尿薬およびより活動的なレジメン（例えば毎日の歩行）により処置された。

腹膜癒着プロセスは、次の４ヶ月間進行し続け、排便、痩身および虚弱の問題を引き起こした。悪性プロセスの再発の可能性を防ぐために、患者に２×１０^８ＰＦＵ ＳＴＲＭＥＳＣ１（エドモンストン由来麻疹ウイルス株）を静脈内注射した。注射２４時間後に体温上昇（３７．２～３７．４℃）があり、次の１８～２０時間継続し、次に亜正常体温（３５．５℃）が３日間継続し、疲労を伴った。他の徴候は観察されなかった。また、患者の状態の実質的な改善はなかった。主要な残りの問題は、腹膜の癒着プロセスであった。第１の腫瘍溶解性ウイルス注射８ヶ月後、患者は、腹部問題に加えて心臓発作を経験した。患者の状態は悪化し続け、患者は腫瘍溶解療法の開始１１ヶ月後に死亡した。しかしながら、病理解剖は、Ｓ状結腸および回盲部腫瘍の領域において生存がん細胞を示さず、以前の腫瘍領域において線維症の徴候があった。
（実施例９）

患者Ｍ．Ａ．（８２歳女性）は、Ｓ状結腸腺癌、切除後２年、肝臓への転移、２５×１５ｍｍおよび２０×１０ｍｍ、悪液質ならびにＣＥＡ－５５ｎｇ／ｍｌと診断された。

化学療法は患者に適用されなかった。第１の注射時までに、患者は虚弱で、寝込んでいた。黄疸の徴候があった。

患者に、４日目ニワトリ胚から得た細胞、１０^７個の細胞と混合した１ｍｌの濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）を皮内注射した。患者の脊髄領域において、各々０．０５ｍｌの２０回の皮内注射を行って、ウイルスへの曝露を増大させた。ニワトリ胚細胞は、ＳＴＲＳ１ウイルスの複製を支持し、それによって注射の効果を延長した。注射を、１４日間隔で３ヶ月間繰り返した。

注射に応答した体温上昇または任意の他の副作用はなかった。患者の状態は、第１の注射５～７日後に改善し始めた。肝臓機能（ＡＬＴ／ＡＳＴ）の改善、黄疸の消失、活動力の改善、体重増加（＋７ｋｇで総計５５ｋｇ）があり、患者は寝込まず、活動的生活に戻り、菜園日課を行いながら郊外の家で３ヶ月間夏を過ごした。第１の注射４ヶ月後、ＣＴスキャンでは、ほとんど検出不能になった肝臓転移の実質的な縮小を示した。

第１の注射９ヶ月後、患者の状態は、疲労、貧血症および赤血球数の減少により悪化した。腫瘍部位での特異的検査は行われなかった。患者に、各々１０８ＰＦＵのＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ８ＣＡ７およびＳＴＲ１４ＣＢ５（エコーウイルス１、コクサッキーウイルスＡ７、コクサッキーウイルスＢ５株）を含有する腫瘍溶解性ウイルスカクテルを静脈内注射した。注射１８時間後に体温反応（３７．９℃）があり、１８～２０時間継続した。患者の状態は、注射４８時間後に改善し始めた。血液パラメータ（赤血球カウントおよびヘモグロビン）は、注射２週間後に正常レベルに達した。注射６ヶ月後、患者は、具体的な病訴を伴わず安定であった。ＣＥＡ＝７ｎｇ／ｍｌ。
（実施例１０）

患者Ｎ．Ｓ．（３６歳女性）は、軽度の子宮頸部扁平上皮癌、ダグラス窩への転移および腹水と診断された。主要な腫瘍は、２年前に外科的に除去された。腫瘍溶解性ウイルス療法の４ヶ月前に、転移が検出された。

患者に、脊髄領域の２０個のスポットにおいて１ｍｌの濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）を皮内注射した。注射を２週毎に５ヶ月間繰り返した。第１の注射後、体温反応が観察され（３８．５℃）、１日間継続した。後続の注射中は、体温上昇は観察されなかった。患者の状態の漸進的改善があった。腹水液は最初の１ヶ月中に消失した。３ヶ月で、ＣＴスキャンは、ダグラス窩における腫瘍量の実質的な縮小を示した。患者の状態は、１年間安定なままであった。
（実施例１１）

患者Ｍ．Ｌ．（７３歳男性）は、前立腺腺房腺癌、骨（椎骨、肋骨、骨盤）への転移と診断された。主要な腫瘍は、除去されなかった（２１ｍｍ×２１ｍｍ×１３ｍｍ）。ＰＳＡ＝２３０ｎｇ／ｍｌ。

１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の隔週の皮内注射を、２０ヶ所において６ヶ月の期間にわたり投与した。４ヶ月後、１週間に２回４ヶ月間注射を投与した。体温反応はなかった。患者の骨の痛みは、最初の２ヶ月中に徐々に消失した。６ヶ月後、ＰＥＴ ＣＴスキャンは、疾患の進行を示さず、いくらか減少した転移の代謝シグナルを伴った。状態は、最初の腫瘍溶解性ウイルス注射後１．５年間安定なままであった。ＰＳＡ＝４１ｎｇ／ｍｌ。
（実施例１２）

患者Ａ．Ｓ．（５５歳男性）は、２年前に外科的に除去された前立腺腺癌および骨（骨盤、肋骨、頭蓋）への転移と診断された。ＰＳＡ＝１４００ｎｇ／ｍｌ。

患者に、１ｍｌの濃縮精製調製物（１０^９ＰＦＵ／ｍｌ）エコーウイルス１株ＳＴＲ４Ｅ１を筋内注射した。

３～４日目に体温反応（３９．５℃）および腫瘍部位の痛みがあった。痛みは３日目までに鎮静した。注射を３週間隔で繰り返した。繰返し注射後は、体温反応はなかった。

５１日目に、ＣＴスキャンは、腫瘍サイズの低減および骨閉塞修復の証拠を示した。ＰＳＡは、２１０ｎｇ／ｍｌに下落した。

６５日目に、患者に、濃縮精製コクサッキーウイルスＢ５株ＳＴＲ１４ＣＢ５、１０９ＰＦＵ／ｍｌの筋内注射を３週間隔で４回投与した。第１の注射後に体温反応があったが、後続の注射は無症状であった。

処置開始６ヶ月後、疾患の進行はなく、患者の状態は安定であった。ＰＳＡ＝１０５ｎｇ／ｍｌ。
（実施例１３）

患者Ｆ．Ａ．（６５歳男性）は、外科的に除去された前立腺腺癌と診断された。腫瘍試料を細胞系の生成のために使用した。前立腺癌細胞は、関連する線維芽細胞を含まなかった。この細胞系を、１パネルの腫瘍溶解性ウイルスへの感受性を試験するために使用した。この細胞系は、ＳＴＲＳ１、ＳＴＲＲ１、ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ８ＣＡ７、ＳＴＲ１４ＣＢ５に非常に感受性であったが、ＳＴＲ７Ｅ１２、ＳＴＲ１５ＣＢ６およびＳＴＲＭＥＳＣ１に比較的抵抗性であった。

外科手術８ヶ月後、患者は、骨盤領域における痛みを訴え始めた。ＣＴスキャンは、骨盤および肋骨における骨転移を明らかにした。ＰＳＡ＝１５００ｎｇ／ｍｌ。

患者に、濃縮精製ウイルスカクテル、各々１０^９ＰＦＵ／ｍｌのＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ８ＣＡ７およびＳＴＲ１４ＣＢ１５（エコーウイルス１、コクサッキーウイルスＡ７、コクサッキーウイルスＢ５株）を筋内注射した。１８時間後（３８．３℃）、翌日（３７．５℃）および３日目（３７．２℃）に体温反応があった。次に、亜正常体温反応が３日間起こった。患者は、１週間継続した骨盤および肋骨の痛みを経験し、その後痛みは鎮静した。注射を３週間隔で５回繰り返した。

ＰＳＡ動態は以下の通りであった：１５００ｎｇ／ｍｌ（開始）、１７００ｎｇ／ｍｌ（開始１０日後）、６７０ｎｇ／ｍｌ（開始３５日後）、２０５ｎｇ／ｍｌ（開始３ヶ月後）および８６ｎｇ／ｍｌ（開始５．５ヶ月後）。

患者の現在の状態（処置開始６ヶ月後）は安定である。患者は苦痛を有さず、ＣＴスキャンは、腫瘍部位での骨修復の証拠を示した。
（実施例１４）

患者Ａ．Ａ．（７２歳男性）は、前立腺癌、外科的除去後４年ならびに肺および肝臓への転移と診断された。ホルモン療法は、最初は効率的であったが、転移の進行性の増殖を伴う再発が続いて起こった。ＰＳＡ＝２５００ｎｇ／ｍｌ。

患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の皮内注射を隔週にて５ヶ月の期間にわたり与えた。第１の注射中、体温上昇（３９．２℃）が観察され、１日間継続した。第２の注射は、より低い体温（３７．４℃）をもたらし、１２時間継続した。後続回の注射中は、体温反応はなかった。ＰＳＡ動態は、以下の通りであった：２５００ｎｇ／ｍｌ（開始）；２７００ｎｇ／ｍｌ（開始１０日後）；９３０ｎｇ／ｍｌ（開始３３日後）；および２２０ｎｇ／ｍｌ（開始４ヶ月後）。

開始５ヶ月後に第２のウイルスを適用した。レオウイルスタイプ１株ＳＴＲＲ１を２週間隔で３ヶ月間、筋内注射（２×１０^８ＰＦＵ／ｍｌ、２ｍｌ）した。第１の注射後１日未満継続したわずかな体温上昇（３７．２℃）を除いては、有害反応はなかった。ＰＳＡ：２７０ｎｇ／ｍｌ（１４日目）；１８４ｎｇ／ｍｌ（３１日目）；５６ｎｇ／ｍｌ（１０５日目）。
（実施例１５）

患者Ｅ．Ｂ．（４４歳女性）は、６年前に卵巣癌ならびに臍部領域、腹膜への転移、腹膜領域の固形腫瘍（３２ｍｍ×１６ｍｍ；５２ｍｍ×３５ｍｍ）および胸膜炎と診断された。脳内転移は、ＣｙｂｅｒＫｎｉｆｅにより除去された。次に患者は、１２回の化学療法を受けた。次に患者は、再発を経験し、その間腹部の２つの腫瘍（１４ｍｍ×９ｍｍおよび２３×１６ｍｍ）が発見された。ＣＡ－１２５－２９９。

患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の隔週の皮内注射を２ヶ月の期間にわたり注射した。超音波検査は、負の動態を明らかにしたが、患者の全身状態は改善した。

次に患者に、精製腫瘍溶解性ウイルスカクテル：エコーウイルスタイプ１２株ＳＴＲ７Ｅ１２、コクサッキーウイルスタイプＢ３株ＳＴＲ１２Ｂ３およびレオウイルスタイプ１株ＳＴＲＲ１（各々１０^８ＰＦＵ）の隔週の筋内注射を２ヶ月間注射した。

超音波検査は、正の動態を明らかにした。現在、患者は、エコーウイルス１株ＳＴＲ４Ｅ１、セービンポリオウイルスタイプ１株およびニューカッスルウイルス由来株ＳＴＲＮＨ１を含有する腫瘍溶解性ウイルスカクテルの筋内注射を受容している。患者の状態は、安定化している。
（実施例１６）

患者Ｖ．Ｓ．（４２歳女性）は、４年前に乳癌と診断され、外科的切除を受けた。患者はまた、肝臓、肺および腹膜への転移と診断された。患者は、１４回の化学療法を受け、再発した。肝臓における３つの腫瘍部位（２２ｍｍ×１４ｍｍ；２６ｍｍ×１８ｍｍ；１８ｍｍ×２０ｍｍ）および肺における腫瘍部位（１５ｍｍ×１８ｍｍ）が発見された。

患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の皮内注射を隔週で３ヶ月の期間にわたり注射した。超音波検査は、正の動態を明らかにし、肝臓の腫瘍は、１２ｍｍ×６ｍｍ；７ｍｍ×６ｍｍおよび５ｍｍ×８ｍｍ、肺の腫瘍は４ｍｍ×６ｍｍに減少した。
（実施例１７）

患者Ｌ．Ｐ．（５１歳女性）は、４年前に胃癌と診断され、外科的切除を受けた。右肺の上葉への転移（３２ｍｍ×３７ｍｍ×２８ｍｍ）および左右肺全体を通して散在する多数の小転移が明らかになっている。骨への転移（Ｔｈ９－Ｌ２、Ｌ４）も明らかになった。ＣＥＡ＝３６７．２。

患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の皮内注射を隔週で３ヶ月の期間にわたり注射した。ＣＴスキャンは、プロセスの安定化および限定的な正の動態を示した。つまり、肺の主要な転移は、２８ｍｍ×２５ｍｍ×２０ｍｍに安定化した。

４ヶ月目に開始して、患者に、精製エコーウイルス１株ＳＴＲ４Ｅ１、レオウイルスタイプ１株ＳＴＲＲ１およびニューカッスル病ウイルス株ＳＴＲＮＨ１（各々２×１０^８ＰＦＵ）を含有する２ｍｌの混合物を含む腫瘍溶解性ウイルスカクテルの隔週の筋内注射を注射した。患者の状態は安定化した。
（実施例１８）

患者Ｋ．Ｉ．（５２歳女性）は、卵管の癌、リンパ節および腹膜への転移ならびに腹水と診断された。主要な腫瘍は４年前に外科的に除去され、患者の再発は２年前に開始した。１０回の化学療法は正の動態をもたらしたが、しかしながら、第２の再発は腹水液の急速な蓄積を引き起こした。

２５０ｍｌの腹水液を腹水穿刺により得た。液中の腫瘍細胞カウントは、２×１０^５個の細胞／ｍｌであった。細胞をハンクス塩溶液で洗浄し、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で５×１０^５個の細胞／ｍｌの密度にてプレートに播種した。ほとんどの細胞は結合し、プレートは３日でコンフルエンスに達した。細胞の一部を液体Ｎ_２中で凍結し、残りを培養物中で増殖させ続けた。数個の個々のクローンを単離し、増殖させ、将来の実験的使用および患者の特異的腫瘍抗原の源のために凍結した。加えて、２×１０^６個の腹水回復細胞を、マトリゲルと混合し、ヌードマウスに皮下注射した。ゆっくりと増殖する腫瘍は、接種４週間後に目に見えるようになった。

腹水由来がん細胞を、１パネルの腫瘍溶解性ウイルスへのそれらの感受性を試験するために使用した。細胞を２４ウェルプレートに播種し、サブコンフルエンスに達すると、様々な腫瘍溶解性ウイルスを１～５Ｉ．Ｅ．／細胞で感染させた。感染３日後、細胞を細胞変性効果についてスコア付けし、次に凍結融解し、放出された新しく増殖したウイルスを、感受性細胞（ウイルス株によって、ＣＶ１およびＭＤＣＫ）における連続希釈滴定により定量した。

細胞は、以下のウイルスに非常に感受性であることが分かった：セービンポリオウイルスタイプ１株、ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ１３ＣＢ４、ＳＴＲ１５ＣＢ６、ＳＴＲＲ１、ＳＴＲＮＨ１およびＳＴＲＭＥＳＣ１。細胞は、ＳＴＲ７Ｅ１２、ＳＴＲ８Ａ７、ＳＴＲ１４ＣＢ５およびＳＴＲＲ２に部分的に感受性であることが分かった。細胞は、ＳＴＲＳ１、ＳＴＲ１７Ｅ２１、ＳＴＲＭｕＶＤ１（腫瘍溶解性ムンプスウイルス株）およびＳＴＲＣＤＶ１（腫瘍溶解性イヌジステンパーウイルス株）に抵抗性であることが分かった。

データに基づいて、２つの腫瘍溶解性ウイルスパネルを形成した。パネル１は、ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ１３ＣＢ４およびＳＴＲＲ１からなった。パネル２は、ＳＴＲ１５ＣＢ６、ＡＴＲＮＨ１およびＳＴＲＭＥＳＣ１からなった。パネル１（２ｍｌ）を２×１０^９、隔週間隔で筋内注射した。処置の２ヶ月後、患者の状態の顕著な改善があった。腹水液は蓄積を停止し、超音波検査によりもはや検出されなくなった。患者の全身状態も改善した。
（実施例１９）

患者Ｄ．Ｎ．（５４歳男性）は、ステージ４の膵がんと診断され、化学療法または手術は適用されなかった。腫瘍は、膵体部に位置し（３８ｍｍ×４５ｍｍ×２４ｍｍ）、鋭利な縁を有した。少量の腹水液、左水胸症、総胆管閉塞は、ステントにより軽減された。ＣＡ１９－９＝４５５７Ｕ／ｍｌ、ＣＥＡ＝８．０８ｎｇ／ｍｌ。

患者は、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の皮内注射を隔週で２ヶ月の期間にわたり受容した。２ヶ月目の終わりまでにＣＡ－１９－９は増大し、９８４５Ｕ／ｍｌに達した。

次に腫瘍溶解性ウイルスカクテルを、エコーウイルス１株ＳＴＲ４Ｅ１、レオウイルスタイプ１株ＳＴＲＲ１およびコクサッキーウイルスＡ７株ＳＴＲ８ＣＡ７（各々２×１０^８ＰＦＵ）を含有するカクテルに変えた。腫瘍溶解性ウイルス（２ｍｌ）を隔週で筋内注射した。ＣＡ－１９－９動態は以下の通りであった：９８４５Ｕ／ｍｌ（開始）；９５６７Ｕ／ｍｌ（３２日目）；および５７６４Ｕ／ｍｌ（７５日目）。
（実施例２０）

患者Ｌ．Ｎ．（５８歳女性）は、４年前に卵巣癌と診断された。卵巣および子宮の外科的切除が行われた。患者はまた、腹膜リンパ節への転移および腹水と診断された。

腹水液を収集し、検査した。生存がん細胞は検出されなかった。腹水液の急速な蓄積があったので、ＳＴＲＳ１ウイルスを腹水穿刺により腹腔内注射した（１０^９Ｉ．Ｅ．のウイルスを含有する１０ｍｌ）。体温反応は以下の通りであった：３８．９℃（２日目）；３７．８℃（３日目）；および３７．２℃（４日目）、次に亜正常３日間。腹水蓄積は、４日目までに減速し、２５日目までにはほとんど検出不能になった。患者の全身状態は改善した。１４日目に開始して、患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０個のスポットの皮内注射を隔週で投与した。患者の状態は安定化した。
（実施例２１）

患者Ｋ．Ｓ．（６８歳女性）は、ステージ４の膵がん（膵頭領域に主要な腫瘍を伴う）ならびに膵傍リンパ節、脾臓（１３ヶ月前に切除済み）、腹膜、縦隔リンパ節および左副腎への転移と診断された。処置開始時のＣＡ－１９－９マーカーは、２４３であった。化学療法により、ＣＡ１９－９マーカーは９３Ｕ／ｍｌになった。

患者に、１０^７個の４日目ニワトリ胚細胞と混合した濃縮センダイウイルス株ＳＴＲＳ１（１０^９Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の２０ヶ所の皮内注射を隔週で９ヶ月の期間にわたり投与した。ＣＡ１９－９は、次の３ヶ月の間５８．５Ｕ／ｍｌまで下落し続けた。次にＣＡ１９－９の漸増が、次の３ヶ月において３０８Ｕ／ｍｌまで、その後１ヶ月の間に９４０Ｕ／ｍｌまで観察された。次の３週間にわたり、ＣＡ１９－９は、５９６２Ｕ／ｍｌまで、その後１５８８８Ｕ／ｍｌまで（５週間）増大した。

ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ１１ＣＢ２およびＳＴＲ１４ＣＢ５を含有するウイルスカクテルを、隔週で２ヶ月の期間にわたり筋内注射した。ＣＡ１９－９マーカーの以下の動態が観察された：１６８１３Ｕ／ｍｌ（２週間後）、１２９４４Ｕ／ｍｌ（４週間後）および１３１２１Ｕ／ｍｌ（６週間後）。図は、ＣＡ１９－９の観察された指数関数的上昇が停止し、いくらか減少しさえしたことを示す。しかしながら、後に続く週では、プロセスが再開し、次の２週間は２２８７６、次の２週間、後に続く週、プロセスが再開した：２２８７６Ｕ／ｍｌ（８週間後）、３４５８９Ｕ／ｍｌ（１０週間後）および１００３４５Ｕ／ｍｌ（１２週間後）。縦隔領域の液が、蓄積し始めた。それを収集し、腫瘍細胞について検査した。腫瘍溶解性ウイルスへのそれらの感受性のさらなる検査のために、細胞を細胞培養物に播種し、増殖させた。
（実施例２２）

患者Ｎ．Ｓ．（７６歳女性）は、４年前に結腸癌（Ｓ状結腸）と診断された。腫瘍は、直腸への結腸接続の復元を伴って外科的に除去された。肝臓および回腸への転移が観察された。回腸は２年前に部分的に切除され、患者は、疾患を安定化させる化学療法に供された。１年前、患者は、悪性黒色腫ならびに後腹膜および鼠径部リンパ節への転移と診断された。付随する病理学的状態（大動脈の重度の動脈硬化病変、心臓硬化症および肺気腫）を考慮して、化学療法は示唆されなかった。

患者に、腫瘍溶解性ウイルスカクテル：エコーウイルス７株ＳＴＲ６Ｅ７、レオウイルス１株ＳＴＲＲ１およびニューカッスル病ウイルス株ＳＴＲＮＨ１（各々１０^９Ｉ．Ｅ．の以下の株）の筋内注射を隔週で投与した。強い体温反応があり、３日間継続し、鎮痛剤（イブプロフェンおよびジクロフェナク）により効率的に遮断された。３週間後、超音波検査は、後腹膜および鼠径部リンパ節のわずかな縮小を明らかにした。
（実施例２３）

患者Ｓ．Ｅ．（４２歳女性）は、腹膜への転移を伴う顆粒膜細胞卵巣癌と診断された。腫瘍は、１年半前に外科的に除去された。組織学検査により、顆粒膜細胞癌、成人型、Ｔ１ａＮ×Ｍ０が確認された。腹膜の癌腫症および腹水を含む、手術後疾患進行が観察された。

手術後、患者は、３日間のシスプラチン１００ｍｇ、エトポシド２００ｍｇ、第３番；カルボプラチン４５０ｍｇおよびエトポシド２００ｍｇ、第２番を含む、５コースの化学療法（３ヶ月）を受けた。化学療法後、超音波検査により、さらなる疾患進行が示された。液で満たされ、隔膜で分割された大きな形成物が、小骨盤の左側で最大５１ｍｍ；および右側で最大６５ｍｍ観察された。

化学療法スキームを、４回の１日コースのパクリタキセル、２６０ｍｇに変えた。それにもかかわらず、疾患は悪化した。腸骨血管に沿って、不規則な嚢胞状エコ構造を伴う多量の形成物、８７ｍｍ×５７ｍｍおよび隔膜に沿った血液供給が観察された。右後腹膜空間では、腎臓の下腎杯より下に、５５ｍｍ×３５ｍｍの同様の多量の嚢胞性構造が観察された。

第３線の化学療法を適用した：イホスファミド（ifosfamidum）２グラム、ＭｅＳＮａ ２グラム、シスプラチン３０ｍｇ、エトポシド１５０ｍｇの５コースの３日間適用。化学療法は無効であるようであった。

腫瘍溶解性ウイルス療法を、手術１年後に開始した。患者を、２×１０^６個の５日目ニワトリ胚線維芽細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏで混合したＳＴＲＳ１（センダイウイルスの腫瘍溶解株）（１０^８ＩＥ）の背側（椎骨付近）への毎週の皮内注射に供した。第１の投与への反応は、注射約２０時間後の３７．８℃までの体温上昇であり、１０時間継続した。第２の投与への反応は、軽度の体温上昇（３７．２℃）であり、５～６時間継続した。後続の投与は、反応を有しなかった。患者を、腫瘍溶解性ウイルス療法に３ヶ月の期間供した。

ウイルス療法後、超音波検査は、実質的な改善の徴候を示した。腹腔内の液は目に見えなかった。後続のＭＲ断層撮影は、腫瘍節の数およびそれらの体積の低減を伴う実質的な改善を示した。図７を参照されたい。ガドビスト造影は、もはや蓄積されなかった。
（実施例２４）

患者Ｏ．Ｌ．（４９歳女性）は、脳のびまん性星状細胞腫、ＩＩ等級と診断された（２年前）。左前頭葉の大きな脳内腫瘍が明らかになった。

２年前、患者は、腫瘍の部分的除去のために覚醒下開頭術を受けた。手術中、患者は、限局性の重大な異常発作を経験し、これにより言語機能をモニターする能力は限定された。手術全体を通して、運動誘発電位（ＭＥＰ：Ｍｏｔｏｒ Ｅｖｏｋｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）および運動機能についての電気生理学的モニタリングを行った。ＭＥＰの減少が観察された時点で、かつ手術開始時に重度の圧下にあった浮腫状脳の減圧後、さらなる切除を停止し、手術を完結した。手術後、患者は、右不全片麻痺および運動言語障害を示し、これらは、患者を、マンニトール点滴を伴う高用量ステロイドに供すると、数時間後に改善した。手術後ＣＴは、出血を伴わない部分切除腔および手術前ＭＲＩ画像と同様の重度の浮腫を示した。手術数日後、患者は悪化し、昏迷状態になり、あまり意思疎通できなくなった。ステロイド用量およびナトリウムレベルの制御を伴うマンニトール点滴の頻度を増大した。予後は厳しいようであった。

手術後、患者を、１コースの遠隔原体照射療法（３０セッションの２Ｇｙ；全部で６０Ｇｙ）に供した。状態はわずかに改善した。

患者を続いて、テモゾロミド（２５０ｍｇ）の６コースの化学療法に供した。全体的な動態は、負であることが分かった。ＣＴスキャンは、脳内での、造影された物質の蓄積の増大を示した。１３ヶ月前、テモダールでの化学療法コースを繰り返したが、ここでもまた実質的な改善はなかった。

１年前、腫瘍溶解性ウイルス療法を開始した。レオウイルス１株（ＳＴＲＲ１）を、１０^９ＩＥ筋内注射した。初期反応は、軽度の腸不快感および数時間継続した非常に軽度の体温上昇（３７．２℃～３７．５℃）を含んだ。後続の投与は１ヶ月間継続し、有害反応を伴わなかった。ＭＲＩは、小さな正の動態を示した。

ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１）を毎週（筋内に１０^９ＩＥ）１ヶ月間適用した。有害反応は観察されなかった。

次に、ＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）を毎週（筋内に１０^９ＩＥ）１ヶ月間適用した。第１の適用中、疲労およびめまいがもたらされた。第２の適用中、有害反応はなかった。脳ＭＲＩは、疾患の安定化を示した。中程度の正の動態が観察された。

ＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）１０^９ＩＥの毎週の筋内注射を、さらに２週間継続した。有害反応は観察されなかった。ＭＲＩおよびＰＥＴ／ＣＴは、造影区域のサイズの低減の形態で正の動態を示した。

ＳＴＲ８ＣＡ７（コクサッキーウイルスＡ７）を、毎週筋内に１０^８ＩＥ、３週間適用した。第１の注射後翌日に、軽度の疲労が観察された。第２および第３の注射は、有害反応を引き起こさなかった。

次に、ポリオウイルス１（セービン株）１０^８ＩＥ筋内を、毎週２週間適用した。第１の注射後翌日に、軽度の悪寒が観察された。第２の投与後、有害反応は起こらなかった。ＭＲＩは、造影領域のサイズの低減の形態でさらなる正の動態を示した（図８）。

ポリオウイルス１（セービン株）１０^８ＩＥ筋内注射を継続した。有害反応は起こらなかった。患者の状態は、実質的に改善した。患者は、ほとんど正常に意思疎通でき、より覚醒可能になり、毎日２～３時間歩行している。
（実施例２５）

患者Ｎ．Ｄ．（５９歳男性）は、膵体部に位置する膵管腺癌と診断された（３年前）。超音波検査は、膵体部の腫瘍（４４ｍｍ×３５ｍｍ）、上腸間膜動脈および腹腔動脈の狭窄、脾腫を示した。Ａ１９－９腫瘍マーカーレベルは１２５Ｕ／ｍｌであり、ＣＥＡレベルは５ｎｇ／ｍｌであった。生検のための腫瘍の腹腔鏡補助穿刺は、Ａ１９－９マーカーの５１２Ｕ／ｍｌまでの増大をもたらした。１年後、ＣＡ１９－９腫瘍マーカーは、２３３８Ｕ／ｍｌに、その後（４ヶ月後）４５５７Ｕ／ｍｌに増大した。総胆管の閉塞により、黄疸を発症した。状態を処置するためにステントを導入した。ＣＡ１９－９＝７４１６Ｕ／ｍｌ。

ＳＴＲＳ１（センダイウイルスの腫瘍溶解株）（１０^８ＩＥ）を使用して腫瘍溶解性ウイルス療法を開始した。患者を、背側、椎骨付近でのＳＴＲＳ１の１６回の毎週の皮内注射に供した。第１の投与への反応は、３７．８℃～３８℃への体温上昇（アスピリンで管理可能）であり、４時間継続した。フォローアップ投与は、有害反応を有しなかった。

ウイルス処置４ヶ月後の超音波検査は、４５ｍｍ×３８ｍｍから４２ｍｍ×３２ｍｍへの腫瘍体積の低減および腹部内の遊離液の量の減少ならびに全体的な正の動態を示した。ＣＡ１９－９マーカーレベルは、２８７８Ｕ／ｍｌであった。

３種類のウイルス、ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１（２×１０^８Ｉ．Ｅ．／ｍｌ））、ＳＴＲＲ１（レオウイルス１（５×１０^７Ｉ．Ｅ．／ｍｌ））およびＳＴＲ８ＣＡ７（コクサッキーウイルスＡ７）（１０^８Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）のカクテルを、筋内注射により適用した。注射１４時間後に、発熱した。体温は３８．５℃まで上昇し、４～５時間上昇したままであり（アスピリンは服薬せず）、その後３７．２℃～３７．４℃まで下落し、次の２４時間の間このレベルのままであった。後に続く３日間の間、疲労があった。３種類のウイルスカクテルの注射を繰り返した。反応は軽度の体温（３７．５℃）であり、５時間継続した。状態は安定化し、正の動態が観察された。ＣＡ１９－９マーカーレベルは、１３１６Ｕ／ｍｌであった。
（実施例２６）

患者Ｉ．Ｖ．（３９歳女性）は、三種陰性乳癌（右乳房）、Ｔ２Ｎ０Ｍ０、悪性３等級、浸潤性基底細胞表現型と診断された（６年前）。患者は、右乳房および局部的リンパ節の徹底的区域切除を受けた。患者を、６コースの補助化学療法：ドセタキセル＋ドキソルビシンおよび次に放射線（ガンマ）療法に供した。疾患は進行し、左肺、甲状腺、肝臓（左葉）および左副腎への転移を伴った。患者を、追加の６コースの化学療法：ベバシズマブ８４０ｍｇ、カルボプラチンＡＵＣ６、３週毎に１回＋パクリタキセル（１２０ｍｇ）の毎週の注射に供した。部分寛解が最初に観察され、全体的な負の動態が続いて起こった。

２年前、ＳＴＲＳ１（センダイウイルス）を使用して腫瘍溶解性ウイルス療法を開始した。１６回の皮内注射を背側、椎骨付近に適用した。２ヶ月後、コンピュータ断層撮影は、正の動態を示した。肺の小結節は、１９ｍｍ×２０ｍｍから１０ｍｍ×１５ｍｍまで縮小した。腫瘍の限局性石灰化が観察され、腫瘍付近の空気で満たされた構造（１７ｍｍ）の形成も観察された。

ＳＴＲＳ１処置を継続したが、負の動態が続いて起こった。６０ｍｍ×４６ｍｍ×５５ｍｍへの肺転移のサイズの増大が観察された。また、腹水の蓄積、骨盤領域、卵巣、子宮への転移および膀胱への浸透も示され、後腹膜リンパ節の腫大を伴った。

腹水液（８３０ｍｌ）を検査のために採取した。液は、腫瘍細胞の球状凝集体を含有していた（１～１．５×１０^５個の細胞／ｍｌ）。収集した腹水液の全量を遠心分離して、腫瘍細胞を収集した。細胞をＤＭＥＭで洗浄し、さらなるウイルス感受性試験のために５０％ＦＣＳ、１０％ＤＭＳＯ中で液体窒素中にて凍結した。

がん細胞を、ウイルス感受性について試験した。それらは、ＳＴＲＳ１（センダイウイルス）に感受性であるように見えたが、しかしながら、腹水液は高タイターの抗ＳＴＲＳ１／中和抗体を含有することが分かった。がん細胞をさらに試験すると、ＳＴＲＮＨ１（ニューカッスル病ウイルス、Ｈ－株）、ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１）、ポリオウイルスのセービン株（１、２、３タイプ）およびＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）に感受性であるように見えた。また、これらの細胞は、ＳＴＲ１５ＣＢ６（コクサッキーウイルスＢ６）への中程度の感受性も示し、ＳＴＲ８ＣＡ７（コクサッキーウイルスＡ７）およびＳＴＲ１７Ｅ２１（エコーウイルス１２）に感受性でないように見えた。

患者を、２×１０^８Ｉ．Ｅ．ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１）の腹腔内投与に供した。体温は、投与１６時間後に３８．５℃まで上昇し（アスピリンで管理された）、次の２４時間以内に正常に戻った。腹水液体積は、実質的に減少した。患者の全身状態は、改善した。

２×１０^８Ｉ．Ｅ．ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１）、２００ｍｌ中、４０分間の灌流の静脈内注射で処置を継続した（毎週、７週間）。コンピュータ断層撮影は、実質的な正の動態の徴候を示した。肺転移は２６ｍｍ×１９ｍｍ×２１ｍｍまで縮小し、後腹膜リンパ節は４～５ｍｍまでサイズが減少し、腹腔内の腹水は観察されず、骨盤の腫瘍量は３８ｍｍ×４１ｍｍ×４８ｍｍまで減少した。

ＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）１×１０^８Ｉ．Ｅ．の２コースの筋内注射およびＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）２×１０^８Ｉ．Ｅ．、２００ｍｌ中、４０分間の灌流の２コースの静脈内注射で処置を継続した。コンピュータ断層撮影は、実質的な正の動態を示した。肺転移は１５ｍｍ×１０ｍｍに減少し、後腹膜節はＣＴで目に見えなくなった。骨盤の腫瘍量は、１６ｍｍ×１７ｍｍまで低減した。状態は安定である。
（実施例２７）

患者Ｔ．Ｄ．（３９歳女性）は、左湾曲部領域に位置する結腸腺癌、Ｔ４Ｎ２ｂＭ０と診断された（３年前）。患者は、腹腔鏡補助左側半結腸切除術を受け、続いて８コースの補助化学療法（ＦＯＬＦＯＸスキーム）を受けたが、これらは無効であった。疾患は進行した。主要な腫瘍の領域ならびにさらに膵尾部および左腎において代謝活性腫瘍組織が発見された。転移は左卵巣に拡がり、腹膜の癌腫症および腹水を発症した。

１年前、２００ｍｌの腹水液を収集し（細胞カウント約４×１０^４個の細胞／ｍｌ）、腫瘍細胞を単離し、ウイルスへの感受性について試験した。腫瘍細胞は、ポリオウイルスのセービン株（１、２、３タイプ）、ＳＴＲ６Ｅ７（エコーウイルス７）およびＳＴＲ７Ｅ１２（エコーウイルス１２）、ＳＴＲ１５ＣＢ６（コクサッキーウイルスＢ６）、ＳＴＲＮＨ１（ニューカッスル病ウイルス、株Ｈ）ならびに麻疹ウイルス（エドモンストンワクチン株）に非常に感受性であるように見え；ＳＴＲ１４ＣＢ５（コクサッキーウイルスＢ５）、ＳＴＲＳ１（センダイウイルス）およびＳＴＲ８ＣＡ７（コクサッキーウイルスＡ７）に中程度に感受性であるように見え；ＳＴＲ４Ｅ１（エコーウイルス１）、ＳＴＲＲ１（レオウイルス１）およびＳＴＲＲ２（レオウイルス２）に低い感受性を有した。

同時に（１年前）、患者はフォローアップ手術、すなわち、再発腫瘍の除去、左腎臓および副腎の切除、膵臓の遠位切除、脾臓の切除、卵管および卵巣両方の切除ならびに大網の切除を受けた。手術に続いて、以下の通りに適用された９コースのＸＥＬＯＸ化学療法を受けた：２１日に１回、オキサリプラチン１２０ｍｇ／ｍ^２およびカペシタビン２０００ｍｇ／ｍ^２を経口で１および１４日目に。化学療法は、耐容性が低く、神経障害の徴候および実質的な嘔吐反応を伴った。疾患は進行した。

６ヶ月前、ＳＴＲ７Ｅ１２（エコーウイルス１２）およびＳＴＲ１５ＣＢ６（コクサッキーウイルスＢ６）、各々２×１０^８Ｉ．Ｅ．の混合物の筋内注射で、ウイルス療法を開始した。反応は、注射２２時間後の体温上昇（３７．５℃～３８．０℃）、いくらかの頭痛および悪寒（２～３時間継続し、両方ともアスピリンおよびイブプロフェンにより削減された）であった。次に、ウイルスを１週間に２回、７週間ＳＴＲ７Ｅ１２（エコーウイルス１２）およびＳＴＲ１５ＣＢ６（コクサッキーウイルスＢ６）、２×１０^８Ｉ．Ｅ．ｉ．ｖ．灌流２００ｍｌ中で２０分間の静脈内投与による、より積極的な処置プロトコールを続いて行った。

ウイルス療法の１ヶ月後に、多旋コンピュータ断層撮影検査を行った。胸部：Ｃ２、右肺、７、１０、１２ｍｍの数個の病巣、ウイルス処置前の以前の検査と比較してよりクリアでない輪郭。Ｃ６、右肺－８ｍｍ；左肺、上葉の大動脈周囲（Ｃ３～最大Ｃ１）１４ｍｍ×１５ｍｍ、動態なし。肺組織パターン（以前はそれは増強されていた）の目に見える正常化および以前に見られた病巣（Ｃ２、右）のサイズの４ｍｍから２ｍｍへのいくらかの低減、線維性の区間としてのＣ１０；他の病巣は明白には目に見えない。新しい病巣の形成なし。肺体積は保存され、肺領域は対称的であり、気管および気管支は閉塞しておらず、変形していなかった。胸膜領域で遊離液は見られず、胸膜は正常な厚さであった。心膜腔、心尖付近の少量の液蓄積が、明らかになった。縦隔は、正常構造であった。縦隔および肺根部において、最大８ｍｍの単発性リンパ節が発見された。全ての群のリンパ節は、実質的には正常値まで、サイズが減少した。腹部では、肝臓は、正常なサイズであり、平滑かつ明確な輪郭を伴った。Ｃ２、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６では、液体密度を有する小低密度病巣、明確な輪郭で最大１０ｍｍが位置した。それらは造影される物質を蓄積せず、動態はなく、新しい病巣の形成はなかった。肝臓のＣ７では、動脈相および静脈相で、低密度領域が目に見え、不規則な輪郭を伴い、最大４～６ｍｍ、動態はなく、新しい病巣はなかった。肝内および肝傍胆汁管は、膨張していなかった。胆嚢は、平坦な輪郭および正常な厚さの壁を有した。低密度中心を有する平坦な丸い形状の形成物、１５ｍｍが、膵傍組織の領域で見られ、より明白な低密度中心を除いては、動態を示さなかった。腹部領域で腹水は発見されなかった。胃の小湾曲部領域のリンパ節は最大８ｍｍであり（減少し）、肝臓門は最大１０ｍｍであった（減少した）。ウイルス療法は安定化および正の動態をもたらしたという結論であった。

ウイルス療法を継続した。ポリオウイルス１（セービン株）およびＳＴＲ６Ｅ７（エコーウイルス７）のカクテル、２×１０^８Ｉ．Ｅ．、ｉ．ｍ．注射（毎週）を適用した。このカクテルへの反応は、第１の投与後のいくらかの悪寒、疲労、３７．２℃～３７．６℃への体温上昇であった。状態はさらに改善した。患者は安定である。
ＳＴＲＳの獣医学的使用

悪性疾患は、老齢のイヌおよびネコの主な死亡原因である。試験したパネルからの腫瘍溶解性ウイルスのうちの一部は、イヌおよびネコ起源の細胞に効率的に感染することができる。これらの腫瘍溶解性ウイルスとして、センダイウイルス株ＳＴＲＳ１、ニューカッスル病ウイルス株ＳＴＲＮＨ１、イヌジステンパーウイルス株ＳＴＲＣＤＶ１（生ＣＤＶワクチン株に基づいて開発された）、レオウイルスタイプ１、２および３ ＳＴＲＲ１、ＳＴＲＲ２およびＳＴＲＲ３が挙げられる。これらの株を、飼いネコおよびイヌの処置のために獣医学クリニックにおいて試験した。

マスト細胞癌は、イヌにおいて最も一般的で最も致命的な腫瘍のうちの１つである。腫瘍は、皮下に局在化する場合があり、手術により容易にアクセスすることができる。しかしながら、外科的除去後、それらは、主要な腫瘍の領域および離れた領域の両方において、非常に侵略的に増殖する転移をもたらす傾向がある。

腫瘍溶解性ウイルスが処置に使用され得るかどうかを試験するために、ＳＴＲＳ１およびＳＴＲＲ１腫瘍溶解性ウイルスを利用した。
（実施例２８）

ハーシュ（１３歳のプードル）は、前足領域のマスト細胞腫と診断された。腫瘍は急速に増殖していた（３週間にわたり５ｍｍ×５ｍｍのサイズから２５ｍｍ×３０ｍｍへ）。腫瘍は外科的に除去された。１４日目から、外科縫合領域で、悪性腫瘍増殖が検出された。腫瘍領域に、濃縮ＳＴＲＳ１を５分間隔で皮下注射した。各々０．２ｍｌ（２×１０^８Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）の全部で１５回の注射を投与した。腫瘍増殖は停止し、１４日目までに、腫瘍量の目に見える痕跡はなくなった。縫合は効率的に癒え、次の８ヶ月間にわたり、さらなる腫瘍増殖はなかった。
（実施例２９）

イストラ（１１歳のシャー・ペイ）は、左後部領域のマスト細胞腫と診断された。腫瘍は急速に増殖しており（３４ｍｍ×５６ｍｍ）、手術は考慮されなかった。腫瘍に、２ｍｌのＳＴＲＳ１を１０ヶ所の異なる領域で注射した。周囲の皮膚にも、ＳＴＲＳ１（０．２ｍｌ／注射）を全部で１２回注射した。注射２日後に腫瘍の膨張があった。注射１０日後に膨張は鎮静した。腫瘍サイズの実質的な低減はなかったが、腫瘍はその増殖を停止した。注射４ヶ月後、腫瘍を切除し、検査した。組織は、大部分は線維症領域を含有し、一部の非定型の丸い細胞を伴った。後に続く５ヶ月間、腫瘍増殖の再発は観察されなかった。
（実施例３０）

イヌにおけるマスト細胞癌の２７症例を観察した。イヌにおけるマスト細胞腫瘍の最初の経験後、ＳＴＲＳ１での処置を適用したマスト細胞腫瘍の他の数症例を観察した。全部で２７症例のマスト細胞癌のうち、１５症例は、ＳＴＲＳ１の３回の隔週の注射後１年を超えて、安定な、疾患の再発を伴わない治癒を示した。５匹のイヌは、腫瘍細胞の全身性の拡がりを伴って末期症例を示し、所有者は最後には安楽死を決定した。長期評価のための７症例は、追跡不能であった。
（実施例３１）

ネコにおけるマスト細胞癌の１４症例を観察した。１０症例は、皮下に局在化するマスト細胞腫瘍を示し、４症例は、腫瘍の全身性の拡がりを伴う末期段階であった。局在化腫瘍の症例では、腫瘍および周囲領域に、２週毎に濃縮ＳＴＲＳ１を３回注射した。この群からの８匹のネコは、陽性応答を有し、少なくとも６ヶ月間、疾患のさらなる進行を伴わなかった。２匹のネコは、処置に応答せず、死亡した。マスト細胞腫瘍の全身性の拡がりを有する４症例のうち、２症例は部分応答を有し、後に続く２ヶ月間、再発増殖を有した。これらのうち、１匹のネコ（８歳雌）の全ての６つの目に見える腫瘍に、ＳＴＲＲ１を注射した。腫瘍増殖は、少なくとも１ヶ月間停止した。このネコのその後は不明である。
（実施例３２）

ジャック（１４歳のテリア）は、右後肢の骨肉腫と診断され、それは除去された。手術１ヶ月後に再発増殖が観察された。腫瘍部位に、５ｍｌの濃縮ＳＴＲＳ１を注射した。全部で５回の注射が、腫瘍周囲の部位に浸透した。肢の膨張があり、３日間継続し、体温の明らかな局所的上昇を伴った。注射３週間後の超音波検査は、プロセスの安定化および腫瘍のいくらかの縮小を明らかにした。腫瘍増殖は、注射６４日後に再開した。腫瘍領域に、５ｍｌの濃縮ＳＴＲＲ１（２×１０^８Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）を注射した。再び、肢の膨張があり、３日間継続した。注射２週間後の超音波検査は、プロセスの安定化を明らかにした。次の２ヶ月間再発はなかった。
（実施例３３）

ムーラ（９歳のネコ）は、局所的拡がりを伴う乳癌と診断され、それは外科的に除去された。手術２ヶ月後に、再発増殖が観察された。腫瘍領域に、ＳＴＲＳ１、ＳＴＲＮＨ１およびＳＴＲＲ１を含有する濃縮ウイルスカクテルを注射した。局所的膨張があり、１週間継続した。腫瘍増殖は停止し、少なくとも２ヶ月間再発はなかった。
考察

広範には、コクサッキーウイルスＡ７／ＳＴＲ８ＣＡ７；コクサッキーウイルスＢ５／ＳＴＲ１４ＣＢ５；およびコクサッキーウイルスＢ６／ＳＴＲ１５ＣＢ６は、腫瘍増殖に対して陽性治療効果を示した。

図１Ａ～１Ｃで示す通り、あまり複製しないウイルスは、ヌードマウスで同じ細胞由来の異種移植片腫瘍において腫瘍溶解活性を示さない。対照的に、異種移植片腫瘍において強い複製活性を示すウイルスは、異種移植片腫瘍を破壊することができる。つまり、図１Ａで分かる通り、Ｃ３３Ａ細胞の異種移植片腫瘍へのコクサッキーウイルスＡ７／ＳＴＲ８ＣＡ７の適用は、対照（Ｃ３３Ａ細胞単独）またはＣ３３Ａ細胞に適用されたコクサッキーウイルスＢ３のいずれかより、５０日の期間にわたり顕著により小さい腫瘍体積をもたらした。同様に、図１Ｂで分かる通り、ＡｓＰＣ１細胞の異種移植片腫瘍へのコクサッキーウイルスＢ４の適用は、対照（ＡｓＰＣ１細胞単独）またはＡｓＰＣ１細胞に適用されたコクサッキーウイルスＡ７のいずれかより、５０日の期間にわたり顕著により小さい腫瘍体積をもたらした。さらに、図１Ｃで示す通り、エコーウイルス１は、ＭＣＦ７細胞に適用された場合、対照（ＭＣＦ７細胞単独）またはＭＣＦ７細胞に適用されたコクサッキーウイルスＢ６／ＳＴＲ１５ＣＢ６のいずれかより、大きな有効性を示した。

これらの結果は、特異的ウイルスは、ウイルスが投与される細胞／腫瘍の種類によって特異的効果を有することを示し、これは、どのウイルスを投与するべきかを決定するために、患者特異的感受性を決定する必要があることを示す。

患者特異的感受性は、比較基準で測定される測定であり得る。特定のヒトウイルスへの感受性を示す腫瘍試料は、最大１０^６～１０^７ＴＣＩＤ５０／ｍｌを産生し得る。しかしながら、１種類のウイルスは別のウイルスより大きなＴＣＩＤ５０／ｍｌを示す場合があり、これは１種類のウイルスへのより大きな感受性を示す。かかる比較は、どの種類の単一のウイルスが選択され得るかを選択するのみでなく、それらが１パネルのウイルスにおいて使用され得るかどうかを選択するための手段を提供する。

上記に説明する通り、ウイルスのパネルは、連続的に、または同時に投与することができる。ウイルス混合物の同時使用の効率は、Ｃ３３Ａヒト子宮頸癌細胞系に由来する腫瘍を有し、細胞において様々な増殖能を示す単一のウイルスおよび２または３種類のウイルスの混合物を注射したヌードマウスにおける、異種移植片実験において示される（図２）。示す通り、Ａ４３１細胞に対して最も有効なパネルは、コクサッキーウイルスＢ５およびコクサッキーウイルスＢ６を伴うエコーウイルス１２のパネルであった。実際に、これらの腫瘍溶解性ウイルスは、Ａ４３１細胞に対して付加的効果を示した。エコーウイルス１２は、５０日間にわたり腫瘍体積を遅延させることについて単独の最も高い治療効果をもたらしたが、しかしながら、この効果は、コクサッキーウイルスの付加と複合化され、これはまた、コクサッキーウイルスＢ５およびコクサッキーウイルスＢ６単独と比較して複合化された効果を示した。

上記に開示する実施例はまた、ウイルスの生体選択および突然変異誘発は、抗血清で交差中和しないウイルスをもたらし得ることを示した。かかる技術はまた、ａ）互いに相互作用しない、かつｂ）他のがん療法、例えば化学療法、放射線、薬物療法などと相互作用しない生体選択腫瘍溶解性ウイルスとしても同様に適用され得る。

合成／全身性標的化治療（ＳＴＲ）の製造は、ヒトおよび動物の両方において有効な腫瘍処置をもたらした。ヒトにおける腫瘍溶解性ウイルスの適用について、投与されたウイルスの効果は、腫瘍特異的であった。例えば、尿膜管の腺癌は、ＳＴＲＳ１、ＳＴＲＲ１、ＳＴＲＭＥＳＣ１、ＳＴＲ４Ｅ１、ＳＴＲ７Ｅ１２、ＳＴＲ１４ＣＢ５、ＳＴＲ１５ＣＢ６に非常に感受性であり、ＳＴＲ８ＣＡ７に抵抗性であった。しかしながら、前立腺腺房腺癌は、センダイウイルス株ＳＴＲＳ１のみへの感受性を示し、それによって最も有効な処置のために患者およびがん特異的腫瘍溶解性ウイルスを選択する重要度を示した。

獣医学的適用について、ＳＴＲＳ１およびＳＴＲＲ１は、腫瘍増殖および再発を低減する顕著な有効性を示した。イヌおよびネコの両方における隔週の注射は、著しく低減した腫瘍量および線維症（瘢痕組織）の形成をもたらした。

特定の実施形態が説明された一方で、現在予見し難いか、予見し得ない代替、改変、変形、改善および実質的な均等物は、出願人または当業者に想起し得る。したがって、出願時およびそれらが修正され得るときの付属の特許請求の範囲は、全てのかかる代替、改変、変形、改善および実質的な均等物を包含すると意図される。

Claims (9)

1. がん患者を処置するための組み合わせ物であって、
   少なくとも１種の第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第１の組成物であって、前記患者に第１の期間中投与されることを特徴とする、第１の組成物と、
   前記第１の腫瘍溶解性ウイルスとは異なる株である少なくとも１種の第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスを含有する第２の組成物であって、前記患者に第２の期間中投与されることを特徴とする、第２の組成物と
   を含む、組み合わせ物であって、
   ここで、前記第２の組成物は、前記第１の組成物が投与された後１週間～２４週間の間に投与され；そして、
   ここで、前記第１の組成物および前記第２の組成物が投与された後に、前記がん患者における腫瘍体積が低減し、
   ここで、前記第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、または、ポリオウイルスであり、
   ここで、前記第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、または、ポリオウイルスであり、そして、
   ここで、前記第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスの少なくとも１つが、エコーウイルスである、組み合わせ物。
2. 前記第１の組成物が、前記第１の期間中、複数回投与されることを特徴とし、前記第２の組成物が、前記第２の期間中、複数回投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ物。
3. 前記第１および第２の組成物が、経口で、経鼻で、静脈内に、動脈内に、皮内に、皮下に、筋内に、腹腔内に、胸膜内に、膣内に、尿道内に、腫瘍内に、頭蓋内に、脊髄内に、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、前記第１もしくは第２の腫瘍溶解性ウイルスを感染させた細胞担体の手段により投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組み合わせ物。
4. 前記第１および第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、約１×１０^４ＴＣＩＤ５０～約１×１０^１１ＴＣＩＤ５０の投与量で存在する、請求項１に記載の組み合わせ物。
5. 前記第１および第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、細胞移入に必要なそれらの宿主細胞表面受容体において異なっている、請求項１に記載の組み合わせ物。
6. 細胞移入に必要な前記宿主細胞表面受容体が、ＣＤ１５５、インテグリンα２β１、インテグリンαＶβ３、インテグリンαＶβ６、ＩＣＡＭ－１、ＣＤ５５、ＣＸＡＤＲ、ＣＤ４６、ＪＡＭ－１、ＰＶＲＬ１、ＰＶＲＬ４、ＣＤ１５０、Ｌ－ＳＩＧＮ、ＶＬＤＶＲ、ＮＲＡＭＰ２、シアル酸、ＰＧＳＬ－１（別名ＣＤ１６２）、ＳＣＡＲＢ２（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー２）、アネキシンＩＩ、ＤＣ－ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ３結合ノンインテグリン）、ｈＰＶＲ（ヒトポリオウイルス受容体）、ＣＤ３４＋、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＪＡＭ（接合部接着分子）またはヘパリン硫酸である、請求項５に記載の組み合わせ物。
7. 前記第１および第２の組成物各々が、複数の天然の腫瘍溶解性ウイルスを含有する、請求項１に記載の組み合わせ物。
8. 少なくとも１種の第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスを含む、がん患者を処置するための組成物であって、前記組成物が、前記患者に第１の期間中投与されることを特徴とし、前記組成物が、前記第１の腫瘍溶解性ウイルスとは異なる株である少なくとも１種の第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスと組み合わせて投与されることを特徴とし、前記第２の腫瘍溶解性ウイルスが、前記患者に第２の期間中投与されることを特徴とする、組成物であって、
   ここで、前記第２の組成物は、前記第１の組成物が投与された後１週間～２４週間の間に投与され；そして、
   ここで、前記第１の組成物および前記第２の組成物が投与された後に、前記がん患者における腫瘍体積が低減し、
   ここで、前記第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、または、ポリオウイルスであり、
   ここで、前記第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスが、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、または、ポリオウイルスであり、そして、
   ここで、前記第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスおよび第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスの少なくとも１つが、エコーウイルスである、組成物。
9. 前記第１の天然の腫瘍溶解性ウイルスがエコーウイルスであり、そして、前記第２の天然の腫瘍溶解性ウイルスがコクサッキーウイルスＢ５である、請求項１に記載の組み合わせ物。

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