BR112019005700A2 - uso de vírus oncolíticos otimizados e composição - Google Patents

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Anastasia V. Lipatova
Stepan P. Chumakov
Natalia D. Tararova
Stephen A. Charles
Anton A. Komar
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Abstract

USO DE VÍRUS ONCOLÍTICOS OTIMIZADOS E COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a métodos de inibição ou redução do crescimento tumoral. Uma composição contendo no mínimo um vírus oncolítico selecionado é administrada dentro de um tumor de um paciente. O vírus destrói as células cancerosas e induz uma imunidade antitumoral sistêmica e duradoura que também é compatível com outros tratamentos do câncer. A presente invenção também se refere a métodos de criação de vírus sintéticos para direcionamento para tumores cancerosos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE VÍRUS ONCOLÍTICOS OTIMIZADOS E COMPOSIÇÃO".
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS
[0001] Este requerimento reivindica prioridade para o Requerimento de Patente Provisória US 62/400,310, registrado em 27 de setembro de 2016, e a Requerimento de Patente Provisória US 62/426,724, registrado em 28 de novembro de 2016. As descrições destes requerimentos são incorporadas por meio de referência em sua totalidade.
ANTECEDENTES
[0002] Este requerimento incorpora por meio de referência uma listagem de sequências submetida com este como SATO2000002_ST25.txt, criada em 26 de setembro de 2016, e tendo um tamanho de arquivo de 17.720 bytes.
[0003] A presente invenção se refere a métodos para inibição ou redução da proliferação de células cancerosas e da progressão de tumores malignos. Também são descritas composições para uso nos métodos referidos. Finalmente, também são descritos aqui, neste requerimento de patente, métodos para preparação de vários tipos de vírus biosselecionados e sintéticos para uso no tratamento de tumores cancerosos.
[0004] Câncer é o crescimento anormal de células, o qual pode criar massas de tecido que podem se tornar tumores malignos ou neoplasmas. Estas formações podem invadir e destruir os tecidos em torno, e podem se espalhar para outras partes do corpo formando metástases.
[0005] As células cancerosas são, em geral, suscetíveis a infecção e mortalidade por vírus de muitas famílias. Isto pode ser devido a: (i) melhor exposição das células malignas a vírus devido à arquitetura tecidual desordenada, perda de contatos de célula a célula, e neovasculatura vazando; (ii) frequente superexpressão de muitas proteínas da superfície celular usadas pelos vírus como receptores de entrada na célula; e (iii) condições mais favoráveis para replicação do vírus dentro das células cancerosas devido à perda frequente de mecanismos de imunidade inata antiviral, vias de morte celular comprometidas, e síntese de proteínas e ácidos nucleicos pré-ativada.
[0006] Seria vantajoso desenvolver vírus adicionais e métodos de uso dos vírus referidos, incluindo aplicações simultâneas de vários vírus oncolíticos diferentes e diferentes combinações destes vírus, de modo a proporcionar tratamento personalizado e a prevenir recidivas e cura incompleta de doença devido à resistência das células cancerosas a alguns vírus e ao desenvolvimento de imunidade adaptativa antiviral em pacientes que necessitem dos mesmos.
BREVE DESCRIÇÃO
[0007] Em várias modalidades aqui, neste requerimento de patente, são descritos métodos para uma destruição seletiva de células cancerosas e uma eliminação sistêmica de metástases tumorais pela administração de um painel de vírus oncolíticos. Diferentes combinações de vírus oncolíticos podem ser administradas a um paciente quer simultaneamente (isto é, múltiplos vírus em uma única administração) quer sequencialmente (isto é, um vírus administrado de cada vez, porém múltiplos vírus administrados durante múltiplas administrações ao longo do tempo). A utilização combinatorial de vírus oncolíticos pode melhorar os resultados terapêuticos. Também são descritos vírus biosselecionados e sintéticos e métodos para a criação dos vírus referidos. Também são descritos métodos para determinar a sensibilidade de um paciente a um vírus oncolítico.
[0008] São descritos em várias modalidades métodos de tratamento de um paciente com câncer, compreendendo: administração ao paciente de uma primeira composição contendo uma quantidade eficaz de no mínimo um primeiro vírus oncolítico por um primeiro período de tempo; e administração ao paciente de uma segunda composição contendo uma quantidade eficaz de no mínimo um segundo vírus oncolítico que é diferente do primeiro vírus oncolítico por um segundo período de tempo.
[0009] A segunda composição pode ser administrada entre 24 horas a 24 semanas depois da primeira composição ser administrada. Em modalidades mais específicas, a segunda composição é administrada entre uma semana a seis semanas depois da primeira composição ser administrada.
[0010] A primeira composição pode ser administrada múltiplas vezes durante o primeiro período de tempo. A segunda composição pode ser administrada múltiplas vezes durante o primeiro período de tempo.
[0011] A primeira e a segunda composições contendo diferentes vírus que não possuem neutralização cruzada por anticorpos antivirais podem ser administradas por via oral, por via nasal, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intradérmica, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via intrapleural, por via intrauretral, por via intravaginal, por via intratumoral, por via intracraniana, por via intraespinhal, ou por uma administração sistêmica de um veículo celular (isolado a partir de um paciente) pré-infectado com o vírus in vitro.
[0012] O primeiro e o segundo (ou terceiro, etc) vírus oncolíticos podem estar cada um presente em suas respectivas composições em uma dosagem a partir de cerca de 104 (10^4) TCID50/mL a 1011 (10^11) TCID50/mL.
[0013] O primeiro e o segundo (ou terceiro, etc) vírus oncolíticos usados nestes métodos de tratamento geralmente diferem em seu receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula, ou diferem em outras variações específicas de células cancerosas ou do ambiente tumoral especificado afetando a replicação eficiente ou destruição de células cancerosas. Os receptores da superfície celular do hospedeiro requeridos para entrada na célula incluem, mas não estão limitados a, PVR (CD155), integrina 2β1, integrina Vβ3, integrina Vβ6, ICAM-1, CD55, CXADR, CD46, JAM-1, PVRL1, PVRL4, SLAM (CD150), PSLG1 (CD162), SCARB2, DC-SIGN, L-SIGN, VLDVR, NRAMP2, sulfato de heparina ou ácido siálico. As variações específicas de células cancerosas ou do ambiente tumoral especificado afetando a replicação eficiente ou destruição de células cancerosas incluem, mas não estão limitadas a, mutações oncogênicas específicas (nos genes K-Ras, H-Ras, N-Ras, EGFR, p53, HER2 e outros); alterações específicas na proliferação celular ou nos mecanismos de morte celular; deficiências em componentes das vias de indução do interferon; deficiências em componentes das vias de resposta do interferon; modificações em atividades de proteases ligadas à membrana e secretadas, inibidores de proteases, ou componentes da matriz extracelular; desenvolvimento de estroma e rede neovascular dentro do tumor; e infiltrações tumorais com macrófagos, leucócitos, células dendríticas, etc.
[0014] Em modalidades particulares, a primeira e a segunda composições cada uma contém uma pluralidade de vírus oncolíticos. O primeiro vírus oncolítico e o segundo vírus oncolítico podem ser selecionados de modo independente entre, mas não estão limitados a, um enterovírus humano (tal como um echovírus, um Coxsackievírus, uma cepa de poliovírus Sabin, ou um rinovírus); um reovírus (tal como ortoreovírus de mamíferos, tipo 1, tipo 2 e tipo 3 ou diverso); um paramixovírus (tal como os vírus do sarampo ou da cachumba humanos, o vírus da cinomose canina, o Sendai vírus do macaco, ou o vírus da doença de Newcastle aviária); um rabdovírus (tal como o vírus da estomatite vesicular, o vírus Carajas, o vírus Maraba, ou o Piry vírus); um togavírus; um vírus da família dos Herpes vírus; um adenovírus; um poxvírus; e um vírus híbrido contendo componentes naturais ou modificados derivados a partir de outros vírus dentro ou fora de uma família de vírus particular. Combinações destes vírus sendo administradas simultaneamente também são contempladas aqui, neste requerimento de patente. A primeira e a segunda composições podem ter, em várias modalidades, um total de dois ou três ou quatro vírus diferentes. Conforme desejado, composições adicionais podem ser administradas sequencialmente ao paciente bem como em diferentes intervalos.
[0015] Também são descritos métodos de produção de um vírus oncolítico otimizado, compreendendo: (i) cultivar um primeiro vírus oncolítico sobre uma primeira cultura celular na presença de um análogo de ribonucleosídeo ou ribonucleotídeo sintético para criar vírus mutagenizados; e (ii) cultivar os vírus mutagenizados sobre uma segunda cultura celular usando diluição serial para identificar o vírus oncolítico otimizado.
[0016] O análogo de ribonucleosídeo ou ribonucleotídeo sintético pode ser ribavirina; 5-azacitidina; 5-fluorouracila; 5-Aza-5,6-di-hidro-2- deoxicitidina; N4-aminocitidina; N1-metil-N4-aminocitidina; 3,N4- etenocitidina; 3-metilcitidina; 5-hidroxicitidina; N4-dimetilcitidina; 5-(2- hidroxietil)-citidina; 5-clorocitidina; 5-bromocitidina; N4-metil-N4- aminocitidina; 5-aminocitidina; 5-nitrosocitidina; 5-(hidroxialquil)-citidina; 5-(tioalquil)-citidina e citidina glicol; 5-hidroxiuridina; 3-hidroxietiluridina; 3-metiluridina; O2-metiluridina; O2-etiluridina; 5-aminouridina; O4- metiluridina; O4-etiluridina; O4-isobutiluridina; O4-alquiluridina; 5- nitrosouridina; 5-(hidroxialquil)-uridina; 5-(tioalquil)-uridina; 1,N6- etenoadenosina; 3-metiladenosina; N6-metiladenosina; 8- hidroxiguanosina; O6-metilguanosina; O6-etilguanosina; O6-iso- propilguanosina; 3,N2-etenoguanosina; 06-alquilguanosina; 8-oxo- guanosina; 2,N3-etenoguanosina; ou 8-aminoguanosina. O análogo de ribonucleosídeo ou ribonucleotídeo sintético pode ser present com a primeira cultura celular em uma quantidade de cerca de 0,1 mM até cerca de 0,5 mM.
[0017] Em modalidades específicas, a segunda cultura celular é diferente da primeira cultura celular, e contém células que são o alvo desejado do vírus oncolítico otimizado. Isto confirma que o vírus oncolítico otimizado se replica bem dentro das células cancerosas que devem ser tratadas.
[0018] Os vírus mutagenizados podem ser coletados da primeira cultura celular depois de um primeiro período de tempo de cerca de 12 horas até cerca de 36 horas. O primeiro vírus oncolítico pode ser adicionado à a primeira cultura celular em uma quantidade de cerca de 0,05 PFU/ célula até cerca de 0,50 PFU/ célula.
[0019] Em algumas modalidades, o primeiro vírus oncolítico também é cultivado sobre a primeira cultura celular na presença de anticorpos, tal que o vírus oncolítico otimizado tem resistência aumentada para os anticorpos.
[0020] As etapas (i) e (ii) são geralmente repetidas sequencialmente, com o vírus oncolítico otimizado da etapa (ii) sendo usado como o primeiro vírus oncolítico da etapa (i) para cada repetição subsequente. Cada repetição adicional leva a vírus mutagenizado adicional derivado a partir do vírus mais apto da rodada anterior, e seleção adicional para as características / propriedades desejadas. Isto pode ser usado tanto para selecionar para vírus que podem se replicar em um tipo de célula alvo em particular, quanto para selecionar para vírus contra os quais os anticorpos têm menos efeito.
[0021] Também são descritos métodos de produção de um vírus direcionado sintético a partir de um vírus de referência, compreendendo: para cada códon no vírus de referência que codifica para um determinado aminoácido, identificação de todos os códons que codificam para o determinado aminoácido, e uso, no vírus direcionado sintético, o códon para o determinado aminoácido que (i) tem a frequência de uso mais similar no ORFeoma (grupos inteiros dos quadros de leitura aberta (ORFs) codificando proteína expressos) das células cancerosas em comparação com o vírus de referência ORFeoma e/ou (ii) seria o mais ótimo em termos de sua taxa de frequência / decodificação para assegurar que a cinética de translação local (dado o repertório de tRNAs presentes em células não- transformadas e malignas) do mRNA viral nas células cancerosas são similares à da cinética de translação do vírus nas células não-trans- formadas.
Isto tira proveito do fato de que (i) a abundância de tRNAs geralmente é diretamente proporcional à frequência de uso de códons em uma dada célula / um dado tecido; (ii) códons frequentemente usados são, via de regra, traduzidos mais rapidamente do que códons usados com menos frequência (e vice versa) devido à mais pronta disponibilidade (durante decodificação da mensagem) de tRNAs cognatos frequentes correspondentes; (iii) códons ótimos / frequentes e não-ótimos / raros diferem entre tipos de células / tecidos coordenados com modificação na população de genes de tRNA; (iv) tRNAs selecionados que são induzidos e expressos em altos níveis em células proliferantes (isto é, cancerosas) (foi demonstrado que estes tRNAs conduzem a progressão das células cancerosas) são tipicamente reprimidos e expressos em baixos níveis em células em diferenciação (isto é, não-cancerosas); (v) o uso de códon sinônimo não somente afeta as taxas de translação de mRNA / os níveis de expressão de proteínas, mas também afeta o dobramento de proteínas na célula; e (vi) o perfil de uso de códons serve como um guia cinético para o dobramento de proteínas na célula.
A expressão de proteínas do vírus sintérico, é, portanto atenuada em células normais, porém reforçada em células cancerosas, enquanto preservando o correto dobramento das proteínas virais nas células cancerosas, mas afetando simultaneamente o dobramento nas células normais.
[0022] Em modalidades particulares, o vírus de referência é um vírus oncolítico. O vírus direcionado sintético pode ter menos de 85% de identidade de nucleotídeos com o vírus de referência, ou pode ter menos de 80% de identidade de nucleotídeos, ou menos de 75% de identidade de nucleotídeos. No entanto, de modo geral o vírus direcionado sintético tem no mínimo 67% de identidade de nucleotídeos com o vírus de referência.
[0023] Também são descritos métodos para identificação da sensibilidade de um paciente a um vírus oncolítico, compreendendo: infectar células tumorais obtidas do paciente com um primeiro vírus oncolítico; cultivar as células tumorais infectadas para determinar uma concentração do primeiro vírus oncolítico; e identificação do paciente como sendo sensível ao primeiro vírus oncolítico se a concentração for maior do que um valor de limiar.
[0024] O valor de limiar pode variar dependendo do vírus sendo testado. Em algumas modalidades particulares, o valor de limiar pode ser de 106 (10^6) TCID50 por mL. As células tumorais podem ser coletadas do paciente quer por cirurgia quer por biópsia.
[0025] As células tumorais podem ser suspensas em um meio de cultura celular antes de serem infectadas. As células tumorais infectadas podem ser cultivadas por incubação em uma temperatura a partir de cerca de 35°C até cerca de 45°C em uma atmosfera contendo cerca de 5% de CO2 por um período de cerca de 24 horas até cerca de 72 horas.
[0026] O vírus oncolítico pode ser um enterovírus humano; um reovírus; um paramixovírus; um rabdovírus; um togavírus; um Herpes vírus; um parvovírus; um adenovírus; um poxvírus; ou um vírus híbrido contendo componentes naturais ou modificados derivados a partir de outros vírus dentro ou fora de uma família de vírus particular.
[0027] Os tumores cancerosos tratados por estes métodos e composições e vírus descritos aqui, neste requerimento de patente, podem incluir tumores de câncer de mama, cervical, de cólon, de fígado, de pulmão, de ovário, pancreático, de próstata, renal, de adrenal, de tiroide, cerebral, de tecidos moles, mesotelial, de sangue ou ósseo.
[0028] As composições de vírus oncolíticos descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em combinação com quimioterapia, imunoterapia, terapia de radiação, terapia medicamentosa, ou transplante de células.
[0029] Estas e outras características não limitantes da invenção são mais particularmente descritas abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0030] O registro de patente ou requerimento contém no mínimo um desenho executado a cores. Cópias desta publicação de patente ou de requerimento de patente com desenho(s) a cores serão proporcionadas pelo Escritório a pedido e pagamento da taxa necessária.
[0031] O seguinte é uma breve descrição dos desenhos, os quais são apresentados para os fins de ilustrar as modalidades de exemplo descritas aqui, neste requerimento de patente, e não para os fins de limitação do mesmo.
[0032] As Figuras 1A a 1C são um conjunto de gráficos indicando o crescimento tumoral durante um período de 50 dias em camundongos nude com xenoenxertos das linhagens celulares de carcinoma humano C33A, AsPC1, e MCF7.
[0033] A Figura 1A mostra o volume tumoral (mm3) ao longo do tempo (dias) para a linhagem celular C33A isolada (quadrados) ou infectada com Coxsackievírus B3 (Cox-B3, círculos) ou Coxsackievírus A7 (Cox- A7, triângulos). O eixo y vai de 0 a 3000 em intervalos de 500. O eixo x vai de 0 a 50 em intervalos de 10. No dia 50, a C33A teve o maior volume tumoral, seguida por Cox-B3 e em seguida Cox-A7.
[0034] A Figura 1B mostra o volume tumoral (mm3) ao longo do tempo (dias) para a linhagem celular AsPC1 isolada (quadrados) ou infectada com Coxsackievírus B4 (Cox-B4, círculos) ou Coxsackievírus A7 (Cox- A7, triângulos). O eixo y vai de 0 a 3000 em intervalos de 500. O eixo x vai de 0 a 50 em intervalos de 10. No dia 50, a AsPC1 teve o maior volume tumoral, seguida por Cox-A7 e em seguida Cox-B4.
[0035] A Figura 1C mostra o volume tumoral (mm3) ao longo do tempo (dias) para a linhagem celular MCF7 isolada (quadrados) ou infectada com Coxsackievírus B6 (Cox-B3, círculos) ou Echovírus 1 (Echo1, triângulos). O eixo y vai de 0 a 3000 em intervalos de 500. O eixo x vai de 0 a 50 em intervalos de 10. No dia 50, a MCF7 teve o maior volume tumoral, seguida por Cox-B6 e em seguida Echo1.
[0036] A Figura 2 é um gráfico indicando os efeitos de várias combinações de vírus administrados a camundongos injetados por via subcutânea com células de carcinoma epidermoide A431. O eixo y vai de 0 a 2500 em intervalos de 500. O eixo x vai de 0 a 60 em intervalos de 10. As linhagens são para A431 isolada (losangos); Coxsackievírus B6 (Cox-B6, quadrados vermelhos); Coxsackievírus B5 (Cox-B5, triângulos verdes); Echovírus 12 (Echo12, quadrados roxos); Cox-B5 + Cox-B6 (círculos azuis); e Echo12 + Cox-B5 + Cox-B6 (círculos laranja). Para referência, a combinação de todos os três vírus Echo12 + Cox-B5 + Cox-B6 (círculos laranja) sempre teve um menor volume tumoral do que os dois vírus Cox-B5 + Cox-B6 (círculos azuis). Os valores de Cox- B6 (quadrados vermelhos) sempre tiveram um maior volume tumoral do que os valores de Echo12 (quadrados roxos).
[0037] A Figura 3 é um exemplo de um perfil de uso de códons, isto é, um gráfico da frequência de códon (eixo y) vs. posição de códon (eixo x), para (a) uma sequência de poliovírus nativa (Sabin Cepa 1) (losangos); (b) a sequência de Sabin Cepa 1 nativa em células cancerosas humanas (uso de códons inferido a partir de populações de tRNA observadas em células cancerosas) (quadrados) e (c) uma sequência otimizada que codifica para a mesma poliproteína que a sequência nativa, mas otimizada para o repertório de tRNA observado em células cancerosas (triângulos).
[0038] A Figura 4 é um perfil de uso de códons maior para (a) a sequência de Sabin Cepa 1 nativa em células humanas (losangos); (b) a sequência de Sabin Cepa 1 nativa em células cancerosas (quadrados); e (c) a sequência otimizada (triângulos). Neste gráfico, são mostrados os códons 150 a 210.
[0039] A Figura 5 é um histograma comparando Poliovírus 1 não modificado contra a cepa 1 de Poliovírus otimizado por códon em células Quiescent (células RD) e 293T se dividindo exponencialmente. O vírus sintético / otimizado por códon apresentou replicação preferencial (~3 vezes maior) em células em divisão. O eixo y é o título de vírus em percentagem de células de controle, e vai de 0 a 350 em incrementos de 50.
[0040] A Figura 6 é um conjunto de quatro fotografias mostrando a potência viral contra o crescimento de células tumorais in vivo em experimentos pré-clínicos envolvendo modelo de xenoenxertos em camundongos (nude) imunocomprometidos. Na linha de cima, células de carcinoma cervical (C33A) foram injetadas por via subcutânea, e o Echovírus 1 foi injetado por via intravenosa. A foto da esquerda é antes da injeção do vírus, e a foto da direita é 16 dias depois da injeção do vírus. Na linha de baixo, células de carcinoma de cólon (RKO) foram injetadas por via subcutânea, e a Cepa 1 de Poliovírus foi em seguida injetada por via intravenosa. A foto da esquerda é antes da injeção do vírus, e a foto da direita é 18 dias depois da injeção do vírus.
[0041] A Figura 7 é um conjunto de seis varreduras por tomografia que ilustram a potência viral em seres humanos. Sendai vírus (STRS1)
foi aplicado para tratar carcinoma ovariano de células da granulosa humana com metástases para o peritônio de uma mulher de 42 anos de idade. A coluna da esquerda é um conjunto de três varreduras por tomografia antes do tratamento viral. Injeções intradérmicas semanais de Sendai vírus levaram a uma redução substancial no volume tumoral durante um período de 3 meses. A coluna da direita é um conjunto de três varreduras por tomografia depois dos tratamentos virais. A massa tumoral (incluindo vários nódulos metastáticos) é circulada.
[0042] A Figura 8 é um conjunto de duas fotografias de imagens de ressonância magnética (MRI) que ilustram a potência viral em seres humanos. Vários cursos de Reovírus 1, por via intramuscular 10 9 IE; Echovírus 1, por via intramuscular 109 IE; Coxsackievírus B5 por via intramuscular 109 IE; Coxsackievírus A7 por via intramuscular 108 IE; e a Cepa 1 de Poliovírus por via intramuscular 108 IE foram aplicados para tratar astrocitoma difuso do cérebro com tumor intra-axial massivo do lobo frontal esquerdo de uma mulher de 49 anos de idade. A paciente foi submetida a ressecção subtotal do lobo frontal esquerdo, mas o tumor não pode ser completamente ressecado, uma vez que o crescimento tumoral foi próximo demais das partes vitais do cérebro. Depois de um curso de radioterapia e vários cursos de quimioterapia o tumor aumentou de tamanho. Injeções intramusculares semanais de vírus oncolíticos levaram a uma redução substancial no volume tumoral durante um período de 4 meses. A imagem à esquerda é um MRI pós ressecção e antes de terapia viral. A imagem à direita é um MRI depois de ter sido administrada terapia viral. Os nódulos tumorais são circulados.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0043] A presente invenção pode ser compreendida mais prontamente por meio de referência à descrição detalhada que se segue de modalidades desejadas e aos exemplos incluídos na mesma. Na especificação seguinte e nas reivindicações que se seguem, será feita referência a uma série de termos, os quais vãor ser definidos como tendo os seguintes significados.
[0044] Embora termos específicos sejam usados na descrição que se segue para por uma questão de clareza, estes termos se destinam a referir somente a estrutura particular das modalidades selecionadas para ilustração nos desenhos e não se destinam a definir ou limitar o âmbito da invenção. Nos desenhos e na descrição que se segue abaixo, deve ser entendido que designações numéricas similares se referem a componentes de função semelhante. Além disso, deve ser entendido que os desenhos não estão em escala.
[0045] As formas do singular "um", "uma", e "o", "a" incluem referentes do plural a menos que o contexto dite claramente de modo diverso.
[0046] Conforme usado na especificação e nas reivindicações, o termo "compreendendo" pode incluir as modalidades "consistindo em" e "consistindo essencialmente em." Os termos "compreendem/compreende", "incluem/inclui", "tendo", "tem", "pode", "contém/contêm", e variantes dos mesmos, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se destinam a serem expressões, termos, ou palavras transicionais em aberto que necessitam da presença dos ingredientes / etapas denominados e permitem a presença de outros ingredientes / etapas. No entanto, a descrição referida deve ser considerada como também descrevendo composições ou processos como "consistindo em" e "consistindo essencialmente em" os ingredientes / etapas enumeradas, as quais mostram a presença de somente os ingredientes / etapas denominados, junto com quaisquer impurezas que possam resultar dos mesmos, e exclui outros ingredientes / etapas.
[0047] Valores numéricos na especificação e nas reivindicações deste requerimento deve ser entendidos como incluindo valores numéricos os quais são os mesmos quando reduzidos para o mesmo número de números significativos e valores numéricos os quais diferem do valor declarado por menos do que o erro experimental de técnica de medição convencional do tipo descrito no presente requerimento para determinar o valor.
[0048] Todos os intervalos descritos aqui, neste requerimento de patente, são inclusivos do ponto final mencionado e combináveis de modo independente (por exemplo, a faixa de "a partir de 2 gramas até 10 gramas" é inclusiva dos pontos finais, 2 gramas e 10 gramas, e de todos os valores intermediários).
[0049] O termo "cerca de" pode ser usado para incluir qualquer valor numérico que possa variar sem alterar a função básica daquele valor. Quando usado com um intervalo, "cerca de" também revelado o intervalo definido pelos valores absolutos dos dois pontos finais, por exemplo, "cerca de 2 até cerca de 4" também descreve a faixa de "a partir de 2 até 4." O termo "cerca de" pode se referir a mais ou menos 10% do número indicado.
[0050] O termo "tumor" é usado aqui, neste requerimento de patente, para se referir tanto a um neoplasma que tenha formado um nódulo quanto a um neoplasma que não tenha formado um nódulo. O tumor pode ser maligno, ou potencialmente maligno, ou um tumor secundário.
[0051] O termo "vírus oncolítico" se refere a um vírus tendo propriedades oncolíticas. O vírus oncolítico pode ser natural, aprimorado por seleção, ou criado sinteticamente.
[0052] O termo "CV1" se refere a uma linhagem celular derivada a partir de rins de macaco verde africano (ATCC No. CCL-70). As células CV-1 apresentam morfologia semelhante aos fibroblastos, crescem de modo aderente a superfícies de vidro ou plástico, e são negativas para transcriptase reversa.
[0053] O termo "TCID50" se refere a uma dose infecciosa de 50% da cultura de tecido, a qual é uma medida de título de vírus infeccioso. Este ensaio de diluição final quantifica a quantidade de vírus requerida para matar 50% dos hospedeiros infectados ou para produzir um efeito citopático em 50% das células da cultura de tecido inoculadas.
[0054] O termo "PFU" se refere a unidades formadoras de placa em uma amostra de vírus, a qual é uma medida da quantidade de vírus. Este teste se baseia em um método microbiológico conduzido em placas de petri ou placas multicavidade. Especificamente, uma monocamada confluente de células hospedeiras é infectada com o vírus em diluições variáveis e coberta com um meio semissólido para evitar que a infecção viral se espalhe de maneira indiscriminada. Uma placa viral é formada quando um vírus infecta uma célula dentro da monocamada celular fixada. A célula infectada com vírus vai lisar e disseminar a infecção para as células adjacentes onde o ciclo de infecção-para-lise é repetido. A área celular infectada vai criar uma placa (uma área de infecção circundada por células não infectadas), a qual pode ser vista visualmente ou com um microscópio ótico. Geralmente as placas são contadas manualmente e os resultados, em combinação com o fator de diluição usado para preparar a placa, são usados para calcular o número de unidades formadoras de placa por volume de unidade de amostra (PFU/ célula). O resultado em PFU/ célula representa o número de partículas infecciosas dentro da amostra e se baseia na suposição de que cada placa formada é representativa de uma partícula viral infecciosa.
[0055] O termo "identidade" se refere ao grau no qual um par de sequências (nucleotídeos ou aminoácidos) tem o mesmo resíduo na mesma localização. A identidade é medida dividindo o número de resíduos idênticos pelo número total de resíduos (intervalos não são contados) e multiplicando o produto por 100 de modo a obter uma percentagem. Deste modo, duas cópias de exatamente a mesma sequência têm 100% de identidade, porém sequências que têm deleções, adições, ou substituições podem ter um menor grau de identidade. Os peritos na arte vão reconhecer que vários programas de computação, tais como os que empregam algoritmos tais como BLAST, estão disponíveis para determinar a identidade de sequências. Pesquisas de nucleotídeos BLAST são realizadas com o programa NBLAST, e pesquisas de proteínas BLAST são realizadas com o programa BLASTP, usando os parâmetros padrão dos respectivos programas.
[0056] A presente invenção se refere a métodos para aumentar a probabilidade de respostas terapêuticas positivas e superar o problema de desenvolvimento de imunidade antiviral através do uso combinacional de um painel de vírus oncolíticos que diferem em estrutura antigênica e em requisitos para funções específicas das células hospedeiras que afetam a entrada e a replicação de vírus.
[0057] A este respeito, os vírus oncolíticos agem por um duplo mecanismo envolvendo uma destruição direta de células cancerosas durante sua infecção lítica, e a indução de imunidade antitumoral sistêmica que proporciona um efeito terapêutico de longa duração mesmo depois de limpeza do vírus. Diferentemente de fármacos quimioterápicos que têm eficácia limitada contra o crescimento recorrente de tumores devido à resistência das células tronco iniciadores de câncer, muitos vírus oncolíticos são capazes de infectar e destruir células tronco cancerígenas, deste modo limitando a probabilidade de recidivas. Também deve ser observado que apesar das células normais apresentarem interferência viral (uma célula infectada com um primeiro vírus apresenta reduzida suscetibilidade a ser infectada por um segundo vírus), as células cancerosas não podem. Devido a mecanismos de ação distintos, os vírus oncolíticos podem complementar abordagens de quimioterapia convencionais, especialmente em casos de resistência a outros fármacos associada à terapia.
[0058] Muitas famílias de vírus diferentes podem ser usadas para o desenvolvimento de cepas de vírus oncolíticos seguras e potentes. Entre estes estão (1) vírus animais que ocorrem naturalmente que não têm, ou têm muito limitada, patogenicidade em seres humanos, (2) cepas atenuadas de vírus humanos comumente usadas como vacinas vivas preventivas, (3) alguns isolados de vírus humanos sem nenhuma patogenicidade ou com patogenicidade limitada, e (4) vírus manipulados ou bio-selecionados com aumentada seletividade tumoral devido (a) à eliminação de algumas funções virais requeridas para o vírus destruir em células normais, ou (b) a proporcionar modalidades adicionais para o ingresso dentro de, ou a destruição específica de, células cancerosas.
[0059] Estudos clínicos envolvendo muitos tipos diferentes de vírus oncolíticos indicam que a terapia com vírus oncolíticos em geral é segura e está associada com efeitos adversos mínimos que incluem sintomas similares a gripe branda durando até 24 horas, febre, calafrios, fadiga, cefaleia, náusea, hipotensão, taquicardia, hipertensão, anorexia, e mialgia. No entanto, a eficiência terapêutica da oncólise viral não é previsível. Apesar de alguns efeitos terapêuticos notáveis em alguns pacientes, estudos clínicos randomizados comumente revelam de preferência respostas modestas. Muitos problemas ainda precisam ser tratados para produzir vírus oncolíticos competitivos e curas eficientes para o câncer. Entre estes estão a necessidade de protocolos de liberação de vírus oncolíticos confiáveis, disseminação de vírus aprimorada dentro do tumor, subjugando efeitos imunossupressores do microambiente do tumor, gestão de perigos relacionados com rápida lise do tumor e respostas de imunidade inata hiperactiva, etc.
[0060] Um principal obstáculo para a terapia com vírus oncolíticos é a notável variabilidade individual das células cancerosas entre os pacientes, a qual requer abordagens personalizadas. Virtualmente cada caso de câncer é único em termos das combinações de defeitos genéticos. Respostas terapêuticas para uma cepa de vírus oncolítico particular dependem de uma série de parâmetros personalizados do tumor do paciente. Em particular, as células cancerosas podem ser deficientes no reconhecimento de determinados vírus, mas conservam a capacidade de sentir e conter outros tipos de vírus. Células cancerosas podem diferir em determinadas características que se referem a morte celular, ao controle do ciclo celular, e a transformação metabólica, os quais são importantes para alguns vírus, mas são obsoletos para outros. Além disso, como as células cancerosas são geneticamente instáveis, alguns fatores das células hospedeiras requeridos para infecção pelo vírus e replicação pelo vírus podem ser perdidos durante o curso da terapia com vírus oncolíticos, deste modo permitindo recidivas da proliferação da população de células cancerosas resistentes à terapia. Em consequência, a resposta de um tumor individual a um vírus em particular é difícil de prever.
[0061] Outro obstáculo para a terapia com vírus oncolíticos é o inevitável desenvolvimento de imunidade adaptativa contra a cepa de vírus terapêutico. Anticorpos neutralizantes destroem o vírus durante sua jornada para células cancerosas sensíveis, deste modo reduzindo a probabilidade de infecção. Maiores doses do vírus podem vencer esta resistência em alguns estágios do tratamento, embora a eficiência de infecção diminuía durante o curso do tratamento. No entanto, o uso de um único vírus oncolítico por um período prolongado é especialmente propenso a recidiva devido ou (1) à seleção de células resistentes ao vírus ou (2) à indução de anticorpos neutralizantes. Embora vários regimes de terapia de combinação com fármacos citotóxicos e imunossupressores estejam sendo testados para melhorar os resultados,
ainda existem desafios dos trade-offs terapêuticos complexos relacionados com os mecanismos de ação conflitantes.
[0062] A presente invenção se refere a métodos para utilização de vírus humanos não-patogênicos com atividade oncolítica para tratar pacientes com câncer, e a painéis de combinações de diferentes vírus oncolíticos. Os vírus usados em combinação juntos vão diferir em suas estruturas antigênicas, de modo que não apresentam neutralização cruzada com anticorpos. Os vírus podem apresentar sobreposição de requisitos para fatores específicos das células hospedeiras, mas não devem ser idênticos. Estes requisitos podem incluir, mas não estão limitados a, o receptor da superfície celular do hospedeiro usado para receptores de entrada de vírus, componentes do sistema imune inato antiviral, etc. Os vírus podem ser usados sequencialmente ou simultaneamente, em combinação de dois, três ou mais vírus diferentes. São descritos exemplos de combinações de vírus oncolíticos para aplicações sequenciais e simultâneas.
[0063] Além disso são descritos métodos para produzir ou selecionar novos vírus oncolíticos que são mais otimizados (em relação a seus homólogos naturais) para aumentar a diversidade antigênica e funcional dos painéis terapêuticos descritos aqui, neste requerimento de patente, para tratamento do câncer usando vírus. Os vírus sintéticos referidos podem ser produzidos usando estratégias de otimização de códon que induzem propagação nas células / tecidos cancerosos selecionados (e causam destruição aumentada dos mesmos) enquanto possuindo expressão atenuada em células / tecidos normais.
[0064] Em um amplo aspecto, a presente invenção se refere a métodos para o tratamento de pacientes com câncer usando vírus oncolíticos. Geralmente, uma primeira composição contendo uma quantidade eficaz de no mínimo um primeiro vírus oncolítico é administrada ao paciente por um primeiro período de tempo. Em seguida, uma segunda composição contendo uma quantidade eficaz de no mínimo um segundo vírus oncolítico é administrada ao paciente por um segundo período de tempo. As composições são administradas sequencialmente. Em outras palavras, a primeira composição é administrada, em seguida a administração da primeira composição é interrompida e a segunda composição é administrada. Dito de outro modo, um painel de composições de vírus oncolíticos é administrado sequencialmente ao paciente, isto é, uma composição de cada vez porém múltiplas composições em uma sequência.
[0065] A este respeito, diferentes cepas de sorotipos de vírus dependem de diferentes receptores de proteínas da superfície das células hospedeiras para conseguir ingressar nas células. Por exemplo, o Echovírus 1 depende da integrina α2β1 (alfa-2-beta-1); os Echovírus 7, 12, e 21 da CD55 (também conhecida como DAF); os Coxsackievírus A7 e A9 da Integrina αVβ3, da Integrina αVβ6, da ICAM-1, e da CD55; os Coxsackievírus B1 a B6 da CXADR (também conhecida como receptor de Coxsackievírus e adenovírus ou CAR); os Coxsackievírus B1, B3 e B5 da CD55; cepas Edmonston do vírus do sarampo dependem da CD46; o vírus da cinomose canina depende da nectina 4; e os orthoreovírus dependem da JAM-1. É contemplado que um método por meio do qual as células cancerosas resistem a infecção por vírus é por modificação da expressão e exposição da superfície celular de receptores. Podem haver outros fatores que afetam a eficiência de um vírus para infectar um tipo de célula particular. Em consequência, o uso de vírus sequenciais vai permitir cursos de viroterapia mais prolongados, evitando eficiência diminuída de uma cepa de vírus oncolítico único por causa do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes contra um vírus particular ou seleção de células cancerosas que são resistentes ao vírus particular (por exemplo, modificando a expressão do receptor da superfície celular do hospedeiro necessária pelo vírus particular).
[0066] Portanto, o primeiro e o segundo vírus oncolíticos devem ser diferentes um do outro, por exemplo, no receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula. Mais especificamente, o receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada de vírus oncolíticos na célula pode ser selecionado entre PVR (CD155), integrina 2β1 (alfa-2-beta-1), integrina Vβ3 (alfa-V-beta-3), integrina Vβ6 (alfa-V-beta-6), ICAM-1, CD55 (aka DAF), CXADR (aka CAR), CD46, JAM-1, PVRL1, PVRL4, SLAM (CD150), L-SIGN, VLDVR, NRAMP2, ácido siálico, PGSL-1 (aka CD162), SCARB2 (receptor de varredura classe B, membro 2), anexina II, DC-SIGN (molécula não integrina, captadora da molécula de adesão intercelular 3 (ICAM3) e específica das células dendríticas), hPVR (receptor de poliovírus humano), CD34+, LDLR (Receptor de lipoproteínas de baixa densidade), JAM (Molécula de adesão juncional), ou sulfato de heparano. O primeiro e o segundo vírus oncolíticos também podem ser diferentes um do outro por direcionamento para diferentes defeitos específicos em um tipo em particular de células cancerosas, tais como mutações dentro de proto- oncogenes, ou diferentes genes supressores tumorais, ou diferentes modificações em vias de morte celular programada, alterações dentro de vários componentes de mecanismos de imunidade inata antiviral responsáveis por detecção de patógenos e pelo desenvolvimento de resistência antiviral em resposta ao interferon, etc. Estes defeitos nas células cancerosas podem conferir vantagens de replicação e destruição celular seletivas para alguns vírus, enquanto sendo obsoletas para outros.
[0067] A aplicação sequencial de diferentes vírus oncolíticos aumenta a incidência de respostas terapêuticas positivas entre os pacientes. No entanto, como algumas das cepas dos vírus no painel podem não ser ativas contra células malignas do paciente, a aplicação sequencial pode resultar em uma perda de tempo aplicando essas cepas de vírus ineficazes. Como uma alternativa, pode ser considerado o uso simultâneo de várias cepas de vírus oncolíticos. Dito de outro modo, a primeira composição e/ou a segunda composição podem compreender uma pluralidade de vírus oncolíticos diferentes. Duas a quatro cepas de vírus oncolítico diferentes podem estar presentes em cada composição oncolítica do painel. As cepas de vírus em cada composição devem ser escolhidas com base em seus espectros de complementação para diferentes tipos de células malignas. A abordagem tem as seguintes vantagens e benefícios para o paciente: (i) melhores chances para correspondência positiva de um vírus oncolítico ativo capaz de destruir o tumor do paciente; (ii) menor probabilidade de seleção de células tumorais que sejam resistentes a um vírus em particular que use um mecanismo específico de entrada e replicação na célula; e (iii) menor probabilidade de complicações devido a uma sensibilidade individual do paciente para um vírus oncolítico. Os vírus nas composições oncolíticas vão induzir a produção de interferons que protegem o paciente contra potenciais patógenos do vírus. As células cancerosas geralmente são menos sensíveis ao interferon, o qual constitui a base da especificidade de ação dos vírus oncolíticos contra células malignas. O uso de misturas de vírus também vai permitir o uso de (a) vírus condicionalmente patogênicos ou (b) variantes selecionadas personalizadas de vírus oncolíticos que não tenham sido submetidos a extensivos testes de segurança. O último é particularmente importante para abordagens personalizadas para terapia com vírus oncolíticos. Um vírus condicionalmente (ou potencialmente) patogênico se origina a partir de cepas não-patogênicas de evolução rápida que formam quasi-espécies heterogêneas, das quais algumas variações podem adquirir propriedades patogênicas, especialmente em indivíduos imunocomprometidos.
[0068] As composições contendo os vírus oncolíticos podem ser usadas / administradas sequencialmente depois de um intervalo de tempo. Em modalidades particulares, o intervalo para o qual uma dada composição é usada é entre cerca de 24 horas até cerca de 24 semanas. Em outras modalidades, o intervalo é entre cerca de uma semana e cerca de seis semanas. Em outras palavras, a segunda composição é administrada depois da primeira composição ser administrada por este período de tempo. Deve ser observado que as composições podem ser administradas múltiplas vezes durante este período de tempo, bem como em múltiplas localizações sobre o corpo do paciente.
[0069] Os vírus oncolíticos usados nos métodos e composições descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser da família de Picornaviridae, Reoviridae, Paramyxoviridae, Togaviridae, Rhabdoviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Parvoviridae, Poxviridae. Em modalidades particulares, os vírus oncolíticos podem ser selecionados de modo independente entre um Echovírus humano; Coxsackievírus; uma cepa Sabin de poliovírus; reovírus humano tipo 1, 2, ou 3; um vírus do sarampo; um vírus da caxumba; um vírus da doença de Newcastle; um Sendai vírus; um vírus Vaccinia; um vírus da cinomose canina; vírus Maraba; ou vírus da estomatite vesicular (VSV).
[0070] Vírus específicos contemplados para uso incluem Echovírus 1 a 7, 9, 11 a 27, 29 a 33; Coxsackievírus A1 a A22 e A24; Coxsackievírus B1 a B6; poliovírus Sabin cepas 1 a 3; vacina de vírus do sarampo cepas Edmonston, Moraten, Zagreb, AIK-C, Rubeovax, Schwarz, CAM-70, Changchun-47, Leningrad-4 e Shanghai-191; vacina de vírus da caxumba cepas Jeryl-Lynn, RIT 4385, Leningrad-3, Leningrad-Zagreb, Urabe Am9, e S79; vírus da doença de Newcastle cepas La Sota, B1, V4, VG-GA, Ulster 2C, Fuller, R2B, Mukteswar, e Komarov; Sendai vírus cepas Cantell, Fushimi, Z, e Hamamatsu; vírus Vaccinia cepas Lister, Dryvax, EM63, ACAM2000, Ankara, e LC16m8.
[0071] A dosagem de cada vírus nas composições oncolíticas é a partir de cerca de 1x104 (10^4) TCID50 por mililitro (mL) até cerca de 1 x 1011 (10^11) TCID50 por mililitro.
[0072] Como um exemplo, o seguinte painel de vírus oncolíticos pode ser administrado sequencialmente:  Reovírus tipo 1 (usa ácidos siálicos para entrada na célula);  Coxsackievírus B5 (requer CD55);  Echovírus tipo 1 (requer a integrina α2β1 para entrada na célula);  Coxsackievírus A7 (requer as Integrinas αVβ3 e αVβ6, ICAM-1 e CD55);  Vírus do sarampo, Edmonston (requer CD46);  Coxsackievírus B6 (requer CXADR e CD55);  Cepa de vacina de poliovírus Sabin tipo 1 (usa CD155 como um receptor).
[0073] A infecção natural com enterovírus ocorre através do trato gastrointestinal por infecção das células linfóides. No entanto, a via intestinal pode ser bloqueada se o individual tiver sido exposto previamente ao vírus (isto é, resistência intestinal). É contemplado que as composições oncolíticas / os vírus oncolíticos podem ser administrados através de uma via intratumoral, oral, nasal, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intravaginal, intrauretral, intraespinhal e intracraniana, dependendo da doença maligna e das cepas de vírus em particular usadas. As composições / os vírus também podem ser administrados por administração sistêmica de um veículo celular pré-infectado com a composição / os vírus in vitro.
[0074] Também seria vantajoso cultivar e obter cepas potentes adicionais de vírus oncolíticos que sejam capazes de lisar um espectro mais amplo de células cancerosas ou que não tenham neutralização cruzada com anticorpos induzidos em resposta a vírus oncolíticos previamente administrados. Dois dos métodos referidos são descritos aqui, neste requerimento de patente.
[0075] Primeiro, pode ser induzida mutagênese em um vírus usando análogos de ribonucleotídeos ou ribonucleosídeos sintéticos, os quais podem ser incorporados em genomas de RNA viral por RNA polimerases virais, resultando em pareamentos de bases de nucleotídeos aberrantes durante a replicação, deste modo produzindo vírus mutagenizados (espécies de RNA mutadas). Um análogo de ribonucleosídeo semelhante é ribavirina, embora outros análogos de ribonucleotídeos e ribonucleosídeos sintéticos selecionados entre o grupo consistindo de análogos de guanosina, uridina, citidina, e adenosina possam ser usados para este fim. Outros análogos que podem ser usados incluem mas não estão limitados aos fármacos antivirais desenvolvidos para mutagênese letal de vírus, tais como 5- azacitidina; 5-fluorouracila; 5-Aza-5,6-di-hidro-2-deoxicitidina; N4- aminocitidina; N1-metil-N4-aminocitidina; 3,N4-etenocitidina; 3-metil- citidina; 5-hidroxicitidina; N4-dimetilcitidina; 5-(2-hidroxietil)-citidina; 5- clorocitidina; 5-bromocitidina; N4-metil-N4-aminocitidina; 5- aminocitidina; 5-nitrosocitidina; 5-(hidroxialquil)-citidina; 5-(tioalquil)- citidina e citidina glicol; 5-hidroxiuridina; 3-hidroxietiluridina; 3- metiluridina; O2-metiluridina; O2-etiluridina; 5-aminouridina; O4- metiluridina; O4-etiluridina; O4-isobutiluridina; O4-alquiluridina; 5- nitrosouridina; 5-(hidroxialquil)-uridina; 5-(tioalquil)-uridina; 1,N6- etenoadenosina; 3-metiladenosina; N6-metiladenosina; 8- hidroxiguanosina; O6-metilguanosina; O6-etilguanosina; O6-isso- propilguanosina; 3,N2-etenoguanosina; 06-alquilguanosina; 8-oxo- guanosina; 2;N3-etenoguanosina; e 8-aminoguanosina e outros derivados. Os análogos referidos não podem servir como um substrato para síntese de RNA por RNA polimerases celulares, mas de preferência são usados por RNA replicases mais promíscuas de muitos vírus. A presença destes análogos em uma cultura celular substancialmente aumenta as taxas de mutação de vírus de RNA, deste modo facilitando e acelerando o processo de biosseleção.
[0076] Em geral, neste primeiro método, um vírus oncolítico é propagado em uma primeira cultura celular na presença do análogo de ribonucleosídeo sintético. O vírus oncolítico é adicionado em uma quantidade de cerca de 0,05 PFU/ célula até cerca de 0,50 PFU/ célula. O análogo de ribonucleosídeo sintético está presente em uma quantidade de cerca de 0,02 mM até cerca de 0,5 mM. Depois de um primeiro período de tempo de cerca de 12 horas até cerca de 36 horas, o vírus mutagenizado é coletado. O vírus mutagenizado é em seguida propagado em uma segunda cultura celular usando diluição serial. O vírus da última diluição que apresenta um efeito citopático é colhido. Conforme desejado, podem ser realizadas rodadas adicionais de mutagênese e diluição serial, com o vírus mutagenizado selecionado por diluição serial se tornando o vírus oncolítico usado sobre a primeira cultura celular e exposto ao análogo de ribonucleosídeo sintético na rodada de mutagênese seguinte. É contemplado que a primeira cultura celular é usada para mutagênese, e a segunda cultura celular é usada para seleção de vírus. Idealmente, a segunda cultura celular contém células que são o alvo desejado do vírus oncolítico final biosselecionado / otimizado. Em consequência, são obtidos vírus oncolíticos que podem replicar na segunda cultura celular. Isto é um modo, por exemplo, de modificar um vírus de modo a que possa infectar mais prontamente tipos de células que previamente tivesse dificuldade para infectar.
[0077] O segundo método é similar ao primeiro método, mas o vírus oncolítico também é cultivado sobre a primeira cultura celular na presença de anticorpos. No segundo método, a primeira e a segunda culturas celulares podem ser o mesmo tipo celular, uma vez que as sucessivas rodadas de mutagênese / exposição a anticorpos e diluição serial se destinam a selecionar para vírus que tenham resistência aumentada para os anticorpos.
[0078] A presente invenção também descreve uma nova abordagem para a produção de novos vírus sintéticos por síntese química do genoma viral inteiro com uso de códon sinônimo alterado tendo por objetivo o reforço da proliferação viral e o correto dobramento de proteínas virais especificamente em células cancerosas e a atenuação de sua proliferação (e dobramento de proteínas virais) em células normais.
[0079] A este respeito, o genoma viral (contido no DNA ou no RNA de um vírus) abriga toda a informação necessária para a expressão e a replicação virais. Os genomas dos vírus têm um número limitado de genes que codificam para as proteínas essenciais para replicação viral e montagem de vírions. Muitos genomas virais também contêm genes codificando para proteínas que suprimem os mecanismos de defesa celular. A ordem e a localização (o início e o fim) de genes individuais em muitos genomas virais é de conhecimento geral.
[0080] Quando uma célula hospedeira é infectada por um vírus, o mecanismo de síntese de proteínas da célula sintetiza as proteínas virais codificadas pelo genoma viral. A decodificação, ou translação, do mRNA viral é realizada pelos ribossomas, com aminoacil-tRNAs adicionando aminoácidos para crescer a cadeia de proteínas durante a síntese de proteínas. Quando as proteínas virais amadurecem, se tornam funcionais e atingem uma concentração suficiente, os vírions se juntam para formar um novo vírus. O novo vírus sai da célula hospedeira e fica disponível para infectar novas células.
[0081] O código genético descreve a correspondência entre a sequência de um dado tripleto de nucleotídeo no mRNA (isto é, um códon) e o aminoácido que é identificado por aquele códon. O código genético é degenerado, com até seis códons sinônimos codificando para um determinado aminoácido. No entanto, o uso de cada códon para um determinado aminoácido não é uniforme, e a frequência de códons é conhecida como tendência de códons (codon bias).
[0082] Códons sinônimos (codificando o mesmo aminoácido) inicialmente se presumiu que tivessem funções inteiramente equivalentes. No entanto, a constatação de que códons sinônimos não estão presentes em iguais frequências nos genes / genomas sugeriu que a escolha de códons pode ter implicações funcionais além da codificação de aminoácidos. O padrão de uso de códons não-uniforme varia entre organismos e entre diferentes células / tecidos expressando diferentes conjuntos de genes. A escolha de códons específicos para organismos / genes e tecidos está relacionada com o organismo e diferenças específicas de tecidos / células em populações de tRNA. Sabe-se que a abundância de tRNAs é diretamente proporcional à frequência de uso de códons, e, portanto em um dado organismo e/ou célula / tecido, códons frequentemente usados são geralmente traduzidos mais rapidamente do que códons usados com menos frequência, e vice versa. A taxa de decodificação depende da concentração dos tRNAs em torno dos ribossomas durante a translação. A ocorrência de códons sinônimos e a abundância de seus tRNAs correspondenets é uma das principais causas da eficiência diferencial na translação de mRNA.
[0083] Também foi visto qeu o uso de códons sinônimos afeta a estabilidade do mRNA e, de maneira mais importante, o dobramento de proteínas. Códons sinônimos podem modular o dobramento de proteínas ajustando a cinética de translação. In vivo, o dobramento de proteínas começa co-translacionalmente à medida que cadeias de peptídeos nascentes emergem do túnel de saída de ribossomas. Variações nas taxas de translação locais, devido a diferença na abundância de tRNA para um dado códon, podem facilitar o dobramento de proteínas permitindo a estruturação ordenada e sequencial das cadeias de polipeptídeos nascentes emergentes do ribossoma. A colocação / distribuição de códons raros e códons frequentes ao longo do mRNA pode guiar ativamente o dobramento de proteínas na célula. Deste modo, o uso de códons sinônimos regula não somente o alongamento por translação, mas também o dobramento co- translacional, e a qualidade das proteínas na célula. Deste modo é possível modular tanto os níveis de expressão de proteínas quanto as propriedades estruturais das proteínas modificando a sequência de DNA / RNA viral para controlar quais dos códons sinônimos são usados para um aminoácido em particular. Em outras palavras, o movimento de ribossoma sobre o mRNA não é uniforme, e acredita-se que a "não uniformidade translacional" referida afete o dobramento de proteínas.
[0084] Duas características específicas para os organismos multicelulares foram verificadas recentemente: (i) a existência de variações específicas intercelulares e teciduais no uso de códons e abundância de tRNA; e (ii) a existência de um duplo programa para regulação da translação na proliferação e diferenciação celulares coordenando o suprimento e a demanda de tRNA. Foi visto que os tRNAs que são induzidos em células cancerosas proliferantes são tipicamente reprimidos em células em diferenciação / de captura. Ao contrário, frequentemente se vê que os tRNAs que são induzidos em células em diferenciação são reprimidos em células proliferantes, deste modo proporcionando um ajuste necessário do suprimento de tRNA para sua demanda ajustada à preferência de uso de códons característica dos genes relacionados com diferenciação. Deste modo, a expressão de proteínas de muitos vírus em células cancerosas vai ser alterada ou reduzida, porque a diferença na abundância de tRNA vai modificar a cinética de translação, a qual também pode afetare o dobramento das proteínas virais.
[0085] Vírus direcionados sintéticos, ou medicamentos direcionados sistêmicos (STRs), levam em conta as duas observações acima. Com base nestas observações, é possível modificar o nível de expressão de proteína(s) virai(s) e dobramento de proteínas virais por um dado vírus em um dado tipo celular pela seleção apropriada de códons sinônimos com o objetivo de produção de vírus sintéticos que possam ser melhor expressos em células cancerosas, mas não nas células não-malignas / normais. Os códons sinônimos do ORFeoma viral são ajustados de modo que as cinéticas de translação resultantes são bem ajustadas em células cancerosas e correspondidas mais otimamente para assegurar aumento da expressão e o correto dobramento das proteínas virais nas células cancerosas dadas as diferenças no repertório de tRNAs nas células cancerosas em comparação com as células normais. Isto é feito por seleção adequada tanto de códons sinônimos raros quanto frequentes ao longo do genoma viral para cada gene viral individual, tendo em conta a abundância dos tRNAs dentro do tipo de célula cancerosa. Em consequência, o vírus pode se reproduzir dentro, e destruir, as células cancerosas de modo mais efciaz. Também se espera que, devido a esta otimização para o ambiente dentro de um dado tipo de célula cancerosa, a expressão das proteínas virais e seu dobramento também venham a ser atenuados nas células normais, uma vez que a distribuição relativa de tRNAs é diferente, e, portanto, as cinéticas de translação vão diferir. Na célula normal, além de reduzida expressão de proteínas virais, pode ocorrer ao invés dobramento errado de proteínas virais, e/ou aumento da degradação.
[0086] Estes vírus direcionados sintéticos, ou STRs, podem ser produzidos por uma abordagem genética reversa que ajusta os códons em um vírus de "referência" em um modo que leva a uma expressão de proteínas virais atenuada em células normais e sua expressão em células cancerosas aumentada. O uso de códons sinônimos portanto assegura o correto dobramento para as proteínas virais em células cancerosas, a qual é importante para ganhar um estado de proteína madura e plenamente funcional. A abordagem também permite uma otimização direcionada de alguns genes virais / genes virais específicos tendo por objetivo a modulação e atenuação adicional da propagação viral e/ou modulação do dobramento das proteínas virais, portanto modificando a atividade do vírus através de modulação direcionada de somente um gene específico ou de um conjunto de genes. Conforme mencionado acima, caso necessário, pode ser feita especificamente desotimização / atenuação direcionada de somente proteínas virais selecionadas (por exemplo, responsáveis pela lise celular) com o objetivo de, por exemplo, prolongar a replicação viral, especificamente, em células cancerosas. Além do mais, a abordagem de otimização de códon pode considerar diferenças específicas do tecido canceroso em uso de tRNA / frequências de códons sinônimos, de modo que os vírus direcionados sintéticos possam ser especificamente direcionados para uma forma particular de doença maligna.
[0087] Em resumo, a Tabela A que se segue identifica frequências de uso de códons do ORFeoma da Cepa 1 Sabin FDA de poliovírus natural e mostra (i) o aminoácido codificado por cada códon, (ii) os códons sinônimos do determinado aminoácido e (iii) a frequência relativa do códon por mil códons. O uso de códons foi tabelado usando o programa de contagem de códons http://www.kazusa.ou.jp/codon/countcodon.html. Acredita-se que este uso de códons seja ótimo para replicação viral em células / tecidos normais diferenciados não-malignos. Obsevar que as cepas Sabin são significativamente atenuadas no sistema nervoso central mas acredita- se (e foi demonstrado) que replicam em níveis selvagens em outras células / outros tecidos como, por exemplo, os intestinos. Estas cepas também não crescem bem em células de neuroblastoma cultivadas. Tabela A: Uso de códons da Cepa de Poliovírus 1 Sabin FDA Aminoácido Códon Frequência/1000 Aminoácido Códon Frequência/1000 Gly GGG 14,48 Trp TGG 12,67 Gly GGA 21,72 End TGA 0,00 Gly GGT 17,19 Cys TGT 10,41 Gly GGC 11,31 Cys TGC 8,60 Glu GAG 22,17 End TAG 0,45 Glu GAA 28,96 End TAA 0,00 Asp GAT 24,43 Tyr TAT 18,10 Asp GAC 28,05 Tyr TAC 25,79 Val GTG 26,24 Leu TTG 16,29 Val GTA 12,67 Leu TTA 10,86 Val GTT 10,41 Phe TTT 18,10 Val GTC 13,12 Phe TTC 20,36 Ala GCG 7,69 Ser TCG 4,52 Ala GCA 27,15 Ser TCA 21,72 Ala GCT 22,17 Ser TCT 9,05 Ala GCC 15,84 Ser TCC 15,38 Arg AGG 10,86 Arg CGG 3,17 Arg AGA 21,72 Arg CGA 1,36 Ser AGT 9,05 Arg CGT 3,62 Ser AGC 8,60 Arg CGC 2,71 Lys AAG 28,05 Gln CAG 19,46 Lys AAA 28,51 Gln CAA 17,19 Asn AAT 22,17 His CAT 8,60 Asn AAC 31,22 His CAC 14,93 Met ATG 30,32 Leu CTG 15,38 Ile ATA 15,84 Leu CTA 15,38 Ile ATT 23,98 Leu CTT 9,50 Ile ATC 20,81 Leu CTC 12,22 Thr ACG 6,79 Pro CCG 5,88 Thr ACA 21,72 Pro CCA 24,89 Thr ACT 23,08 Pro CCT 13,57 Thr ACC 24,43 Pro CCC 9,05
[0088] Em seguida, a Tabela B abaixo mostra o uso de códons em células cancerosas em rápida proliferação (células cancerosas do cólon / da bexiga) inferido a partir de pool de tRNA destas células.
Estão disponíveis na arte métodos de alta produtividade para produzir os perfis de distribuição de tRNA referidos.
Isto é proporcionado somente para fins de ilustração da presente invenção.
Tabela B: Frequência de uso de códons de células cancerosas em rápida proliferação Aminoácido Códon Frequência/1000 Aminoácido Códon Frequência/1000 Gly GGG 19,00 Trp TGG 12,67 Gly GGA 35,00 End TGA 0,00 Gly GGT 20,00 Cys TGT 60,00 Gly GGC 25,00 Cys TGC 40,00 Glu GAG 45,00 End TAG 0,45 Glu GAA 55,00 End TAA 0,00 Asp GAT 58,00 Tyr TAT 59,00 Asp GAC 42,00 Tyr TAC 41,00 Val GTG 40,00 Leu TTG 17,00 Val GTA 18,00 Leu TTA 13,00 Val GTT 27,00 Phe TTT 57,00 Val GTC 16,00 Phe TTC 43,00 Ala GCG 6,00 Ser TCG 4,00 Ala GCA 32,00 Ser TCA 19,00 Ala GCT 32,00 Ser TCT 22,00 Ala GCC 30,00 Ser TCC 16,00 Arg AGG 20,00 Arg CGG 15,00 Arg AGA 31,00 Arg CGA 14,00 Ser AGT 20,00 Arg CGT 9,00 Ser AGC 19,00 Arg CGC 11,00 Lys AAG 50,00 Gln CAG 64,00 Lys AAA 50,00 Gln CAA 36,00 Asn AAT 58,00 His CAT 55,00 Asn AAC 42,00 His CAC 45,00 Met ATG 30,32 Leu CTG 28,00
Aminoácido Códon Frequência/1000 Aminoácido Códon Frequência/1000 Ile ATA 23,00 Leu CTA 10,00 Ile ATT 43,00 Leu CTT 17,00 Ile ATC 34,00 Leu CTC 14,00 Thr ACG 8,00 Pro CCG 6,00 Thr ACA 32,00 Pro CCA 35,00 Thr ACT 33,00 Pro CCT 34,00 Thr ACC 27,00 Pro CCC 24,00
[0089] Em seguida, as frequências de distribuição de uso de códons / tRNA relativas entre o ORFeoma do vírus de referência da Tabela A ("naturalmente" otimizado para expressão em células humanas "normais / dadas") e o ORFeoma de células cancerosas mostrado na Tabela B pode ser usada para otimizar / desotimizar uma dada sequência de nucleotídeos de um tipo de célula para outro tipo de célula. Pode ser feita otimização introduzindo códons sinônimos que tenham as frequências de uso mais similares nas células nativas e alvo. Tanto códons raros quanto frequentes são alterados de modo a obter cinética de translação de mRNA na célula alvo que simule a cinética observada na célula nativa. A desotimização é feita introduzindo códons sinônimos que tenham as frequências de uso mais dissimilares nas células nativas e alvo, de modo que suas cinéticas de translação venham a diferir o máximo possível.
[0090] Estritamente como um exemplo, a Tabela C proporciona as frequências de uso de códons originais "nativos", as frequências de uso de códons das células alvo / cancerosas e as frequências otimizadas resultantes para a sequência de 10 códons do poliovírus da Cepa 1 Sabin FDA.
Tabela C.
No. do Códon Códon Original Frequência de Uso Frequência de Uso de Códons das Frequência Resultante/ Códon de Códon Original Células Alvo para Códon Original Otimizada Otimizado 1 ATG 30,32 30,32 30,32 ATG 2 GGT 17,19 20,00 19,00 GGG 3 GCT 22,17 32,00 30,00 GCC 4 CAG 19,46 64,00 36,00 CAA 5 GTT 10,41 27,00 16,00 GTC 6 TCA 21,72 19,00 22,00 TCT
35/80 7 TCA 21,72 19,00 22,00 TCT 8 CAG 19,46 64,00 36,00 CAA 9 AAA 28,51 50,00 50,00 AAG 10 GTG 26,24 40,00 27,00 GTT
[0091] Com referência agora à Tabela C, a sequência de 10 códons codifica para um início de uma poliproteína de poliovírus que se deseja que seja expressa em células cancerosas. Na coluna entitulada "Frequência de Uso de Códon Original", está listada a frequência do códon "original" no vírus natural que se acredita que seja "naturalmente otimizada" para expressão em uma célula / um tecido humano diferenciado. Na coluna entitulada "Frequência de Uso de Códon das Células Alvo para Códon Original", está listada a frequência do códon "original" em células cancerosas alvo / rapidamente proliferando. Conforme pode ser visto comparando estas duas colunas, alguns dos códons variam muito em sua frequência. Por exemplo, as frequências dos códons no. 8 e no. 10 variam dramaticamente (64,00 vs. 19,46, e 40,00 vs. 26,24, respectivamente). Com referência à Figura 3, a diferença nestas frequências de códons também é evidente.
[0092] A quinta coluna é intitulada "Frequência Resultante / Otimizada", e mostra a frequência dos códons em uma sequência de 10 códons que é otimizada para expressar a mesma proteína viral, porém nas células alvo / cancerosas. O códon "otimizado" para cada posição na sequência otimizada é determinado como se segue. Primeiro, para cada par de códons, a diferença entre suas frequências (códon alvo menos códon original) é determinada e o códon sinônimo na tabela de uso de códons alvo é escolhido com uma frequência mais próxima à sequência nativa. Segundo, se as frequências de vários códons sinônimos na célula alvo forem idênticas de modo que não possa ser feita uma seleção com base na frequência (exclusivamente), deve ser escolhido um códon sinônimo com uma composição tripla minimizando a oscilação na terceira base. Terceiro, se o códon sinônimo alvo já tiver a frequência mais próxima à frequência do hospedeiro nativo, permanece inalterado (notar que algumas vezes esta frequência ainda pode ser bastante diferente do hospedeiro nativo / original).
[0093] Por exemplo, seguindo as regras acima, o códon GTG codificando Val na posição 10 na sequência nativa foi substituído com GTT na sequência de códon otimizado. Val é codificado por quatro códons sinônimos, e a frequência de uso de códon GTT (27,00) é a correspondência mais próxima (na célula cancerosa alvo) à frequência de uso de códon original (26.24) observada no ORFeoma viral.
[0094] No caso do códon no. 9 AAA (codificando Lys), as frequências dos dois códons sinônimos Lys parecem ser idênticas (50,00) na célula cancerosa alvo. Portanto, neste caso, foi feita seleção de um códon AAG para minimizar a oscilação na terceira base do tripleto de códon (conforme descrito acima). Portanto, AAA foi substituído por AAG. A especificidade do processo de decodificação é tal que geralmente são observados pares de bases de Watson–Crick perfeitos entre os dois primeiros nucleotídeos no códon e os dois primeiros nucleotídeos no anticódon, porém é possível pareamento de bases alterados na terceira posição, denominado "oscilação". Ocorre oscilação porque a conformação do loop de anticódon de tRNA permite flexibilidade na primeira base do anticódon. Pareamento de bases de Watson–Crick perfeito na terceira base de códon assegura o alto rigor do processo de decodificação e minimiza erros de codificação incorreta. Observar também que, apesar da frequência de códons AAA e AAG em células cancerosas não ser uma correspondência para a do ORFeoma viral nativo não é possível nenhuma outra seleção, uma vez que Lys somente é codificado por estes dois códons sinônimos.
[0095] Em consequência desta otimização, conforme visto na Tabela C, nove dos 10 códons na sequência "nativa / de referência" codificando para esta poliproteína viral são modificados na sequência otimizada para codificar para a proteína viral a ser expressa em células cancerosas (notar que esta comparação é apresentada estritamente como um exemplo). Olhando na Figura 3, a forma da linha para as
"Otimizadas" (triângulos) é desejavelmente tão próxima da forma da "Original" (losangos) quanto possível. A Figura 4 é um perfil maior mostrando os resultados desta mesma otimização realizada em uma escala maior. Aqui, são mostrados os códons 150 a 210 das sequências nativas e otimizadas. Novamente, desejavelmente a linha para as "Otimizadas" (triângulos) é tão próxima da linha da "Original" (losangos) quanto possível.
[0096] Da mesma maneira, todo um ORFeoma do vírus direcionado sintético pode ser derivado a partir de um vírus de "referência". Observa- se que somente regiões do vírus codificando proteínas (frame de leitura aberta) precisam ser otimizadas. Outras regiões, por exemplo, regiões 5’ e ‘3 não traduzidas (UTR), tais como os elementos do 5’ - Sítio de Entrada de Ribossoma Interno (IRES), geralmente não precisam ser otimizadas seguindo este processo. Notar, no entanto, que algumas regiões de codificação de proteínas dentro do ORFeoma podem não precisar ser otimizadas também. Estas regiões podem incluir elementos estruturais e/ou de sequência de RNA cruciais importantes para replicação e função virais. Estas regiões devem ser preservadas intactas, a menos que mutações sinônimas compensatórias restaurando a estrutura ou a composição crítica destas regiões possam ser introduzidas.
[0097] Em modalidades particulares, os STRs manipulados reversos são menos de 85% idênticos (no nível de nucleotídeos) a seus análogos naturais. Em modalidades particulares, os STRs podem ter menos de 80% de identidade de nucleotídeos, ou menos de 75% de identidade de nucleotídeos com seu análogo natural. No entanto, de modo geral o STR ou vírus direcionado sintético tem no mínimo 67% de identidade de nucleotídeos com o vírus de referência.
[0098] Em similares casos de baixo nível de identidade para os análogos naturais, os STRs sintéticos podem ser considerados um novo gênero de vírus e se presume que sejam seguros e não sejam capazes de recombinar com os vírus naturais.
[0099] A presente invenção é adicionalmente ilustrada nos exemplos de trabalho não limitantes que se seguem, devendo ser entendido que estes exemplos se destinam a ser ilustrativos somente e que a invenção não se destina a ser limitada aos materiais, condições, parâmetros do processo e similares mencionados aqui, neste requerimento de patente.
EXEMPLOS
[0100] Um painel de doze (12) vírus humanos não-patogênicos com propriedades oncolíticas, Medicamentos Oncolíticos Direcionados Autônomos Sistêmicos (SATORs, Systemic Autonomous Targeted Oncolytic Remedies) ou Medicamentos Direcionados Sistêmicos (STRs, Systemic Targeted Remedies), seu isolamento, e uso é descrito abaixo. Também é apresentada a composição e uso de vírus oncolíticos sintéticos como um medicamento no tratamento do câncer, em que os vírus oncolíticos sintéticos foram produzidos de novo com uma composição de nucleotídeos modificada / uso de códons sinônimos. Isolamento de cepas de vírus
[0101] Um painel de vírus oncolíticos não pathogênicos foi formado por isolamento a partir de fezes de crianças saudáveis de dois a três anos de idade. As cepas de vírus foram isoladas como se segue: i) amostras de fezes foram coletadas e armazenadas por até 48 horas a 4°C; ii) as fezes foram homogenizadas em HBSS (Solução Salina Balanceada de Hanks) para produzir uma suspensão a 30%; e iii) a suspensão foi clareada por centrifugação a 5000 g por 30 minutos e passadas através de um filtro de 0,22 µm e armazenadas a -70°C.
[0102] Monocamadas de três culturas celulares foram preparadas para isolamento do vírus. Estas foram: linhagem celular de rins de macaco verde africano CV1 (ATCC CCL-70); linhagem celular de carcinoma humano HEp-2 (ATCC CCL-23); e linhagem celular de rabdomiossarcoma humano RD (ATCC CCL-136).
[0103] Frascos de 100 mL com monocamadas frescas das linhagens celulares foram incubados com 1 mL de inóculo por 1 hora a 37°C, em seguida foram lavadas três vezes com HBSS e incubadas em DMEM com 1% de FBS por 3 dias. Em seguida os frascos foram colocados a - 70°C em seguida descongelados, e meio contendo vírus foi usado para inoculação de culturas celulares frescas, conforme acima. Passagens cegas foram repetidas até o efeito citopático ser visível no mínimo em um tipo de cultura celular. Os vírus foram coletados e armazenados a - 70°C. Para propagação de rotina dos vírus a linhagem celular CV1 (rim de macaco) foi escolhida porque suportou a replicação de todas as cepas de vírus isoladas. Os títulos de vírus também foram determinados em células CV1. Estavam em uma faixa de 6 a 9 log TCD 50/mL.
[0104] Foi realizada sorotipagem das cepas por neutralização com soros tipo-específicos. Foram obtidas as seguintes cepas: STR4E1 (correspondente ao Echovírus 1); STR6E7 (correspondente ao Echovírus 7); STR7E12 (correspondente ao Echovírus 12); STR8CA7 (correspondente ao Coxsackievírus A7); STR9CA9 (correspondente ao Coxsackievírus A9); STR10CB1 (correspondente ao Coxsackievírus B1); STR11CB2 (correspondente ao Coxsackievírus B2); STR12CB3 (correspondente ao Coxsackievírus B3); STR13CB4 (correspondente ao Coxsackievírus B4); STR14CB5 (correspondente ao Coxsackievírus B5); e STR15CB6 (correspondente ao Coxsackievírus B6); STR17E21 (correspondente ao Echovírus 21).
[0105] As cepas de vírus isoladas pertencem à família Picornaviridae, gênero de vírus. Existem pequenas partículas de vírus de RNA de sentido positivo, de cadeia única de 20 a 25 nm compostas de quatro proteínas do capsídeo e uma pequena proteína VPG anexada de modo covalente ao RNA genômico de 7200 a 7300 nucleotídeos.
[0106] Depois de isolamento, os vírus sofreram múltiplas passagens em cultura celular resultando em adaptação, maiores produções de vírus e aumento nos títulos de estoques de vírus produzidos.
[0107] A segurança das cepas foi testada em voluntários saudáveis por aplicação oral ou intranasal de 108 PFU dos vírus. Os testes não mostraram reações adversas graves e somente raras incidências de menos sintomas similares à gripe que incluíram febre moderada durando por menos de 24 horas (37,0°C - 37,5°C), calafrios, náusea, e mesmo casos menos raros de diarréia branda. A segurança dos vírus também foi confirmada por relatórios publicados resumindo os resultados de estudos clínicos, uma vez que foram usados para proteção inespecífica da massa contra infecções virais sasonais. Propagação de cepas de vírus isoladas em células derivadas de tumor
[0108] Depois de purificação de placas individuais, a capacidade das cepas de vírus para replicar em diferentes linhagens celulares humanas derivadas de tumor foi testada usando um painel de linhagens celulares.
[0109] Os testes foram realizados em placas de 12 cavidades com monocamadas das linhagens celulares subconfluentes frescas. As células foram infectadas com 0,1 TCID50 por célula em 100 µL de volume por 1 hora, em seguida lavadas com HBSS e incubadas em 1 mL de DMEM suplementado com 1% de FBS. Depois de 48 horas, monocamadas apresentando graus variáveis de efeito citopático foram congeladas-descongeladas e os títulos foram determinados por diluição final e infecção de células CV1.
[0110] As Tabelas 1 e 2 abaixo mostram os potenciais de propagação de vírus dos painéis mostrados como títulos de vírus obtidos sobre diferentes linhagens celulares: fibroblastos pulmonares embrionários humanos normais (NHELF); carcinoma de mama (BC); carcinoma cervical (CC); carcinoma epidermoide (EC); carcinoma de próstata (PC); melanoma (Mel); carcinoma pulmonar de células não-pequenas (NSCLC); carcinoma pancreático (PanC); e rabdomiossarcoma (RMS).
Tabela 1. Cepa de Vírus Títulos de vírus produzidos por diferentes linhagens celulares (PFU/mL) IMR90 HeLa C-33A MB231 MCF7 (NHELF) (CC) (CC) (BC) (BC) STR4E1 2x105 108 109 2x108 2x107 STR6E7 107 5x107 8x107 2x107 8x106 STR7E12 104 2x107 2x108 5x108 2x106 STR8СА7 2X108 5X108 2х109 2x107 5X106 STR9СА9 <102 108 2x107 6x107 2x104 STR10СB1 7Х104 6Х104 2Х108 2Х108 2Х105 STR11СB2 2Х104 9Х105 6Х107 3Х107 6Х106 STR12СB3 2Х104 3Х104 2Х104 2Х104 2Х104 STR13СB4 <102 2x107 2X109 6X107 8x102 STR14СВ5 105 2Х104 107 4Х107 104 STR15СВ6 <102 <102 5х109 5x106 <102 STR17E21 <102 2Х103 4X105 4Х105 106
Tabela 2. Cepa de Títulos de vírus produzidos por diferentes linhagens Vírus celulares (PFU/mL) A431 SK-Mel-28 A549 DU-145 AsPC-1 RD (EC) (Mel) (NSCLC) (PC) (PanC) (RMS) STR4E1 5x105 5x108 107 4x108 2x107 109 STR6E7 4x104 5x108 2x105 2x107 107 5x108 STR7E12 107 2x106 106 5x107 2x108 2x108 STR8СА7 104 2х107 2X106 5x106 2х103 2Х109 STR9СА9 2x104 108 8x107 2x103 4x104 6x107 STR10СB1 107 2Х107 106 3Х107 4Х106 107 STR11СB2 105 106 2Х105 5Х106 2Х106 3Х108 STR12СB3 2Х104 9Х104 2Х104 2Х104 3Х104 4Х108 STR13СB4 4X103 2X108 6X105 107 2x108 4X105 STR14СВ5 2Х105 5Х105 106 107 106 2X107 STR15СВ6 4x103 108 2x105 5x107 5х107 <102 STR17E21 3Х106 7Х105 2X106 2x107 6x106 2X108
[0111] Os resultados apresentados nas Tabelas 1 e 2 acima mostram que cepas de vírus individuais do painel apresentam sobreposição porém não características de propagação idênticas em diferentes linhagens celulares derivadas de tumor. Em particular, células de carcinoma de mama MCF7 não suportam propagação de Coxsackievírus B4 e B6/STR15СВ6 porém propagam de modo eficaz os Ecovírus 1 e 7. Os Coxsackievírus A9 e B3 replicam fracamente em células cancerosas pancreáticas AsPC-1, embora as células sejam altamente sensíveis ao Ecovírus 12 e ao Coxsackievírus B4. EXEMPLO 1 Atividade oncolítica de cepas de vírus em modelos de xenoenxerto em camundongos nude Métodos e Materiais
[0112] As cepas foram adicionalmente testadas para atividade oncolítica em tumores de xenoenxerto em camundongos nude atímicos formados depois de injeção com células de carcinoma humano. Camundongos foram injetados por via subcutânea com 2 a 10 x 10 6 células. Quando o volume tumoral atingiu aproximadamente 0,1 a 0,15 mL, os tumores foram injetados com 0,05 mL de vírus (108 TCID50) diariamente por quatro dias, e o volume tumoral foi medido a cada 5 dias até o dia 50. Camundongos de controle foram injetados com meio de cultura coletado a partir de células não infectadas. As Figuras 1A a 1C são gráficos com linhas mostrando o crescimento de tumores ao longo do tempo (e são adicionalmente discutidas abaixo) quando não tratados (C33A, AsPC1, e MCF7). A Figura 6 inclui duas fotografias à esquerda mostrando o crescimento tumoral. Resultados
[0113] Foi observada uma boa correlação entre as capacidades dos vírus para se propagar nas linhagens celulares in vitro e a atividade oncolítica in vivo. Os vírus que replicam fracamente (Coxsackievírus B3 em células C33A, Coxsackievírus A7/STR8CA7 em células AsPC1, Coxsackievírus B6/STR15СВ6 em células MCF7) não apresentam atividade oncolítica em tumores de xenoenxerto derivados a partir das mesmas células, enquanto que os vírus que apresentam forte replicação (Coxsackievírus A7/STR8СА7 em células C33A, Coxsackievírus B4 em células AsPC1 e Echovírus 1 em células MCF7) são capazes de destruir tumores de xenoenxerto.
[0114] A Figura 6 é um conjunto de quatro fotografias mostrando a potência viral contra o crescimento de células tumorais in vivo em experimentos pré-clínicos envolvendo modelo de xenoenxertos em camundongos (nude) imunocomprometidos. Na linha de cima, células de carcinoma cervical (C33A) foram injetadas por via subcutânea, e o Echovírus 1 foi injetado por via intravenosa. A foto da esquerda é antes da injeção do vírus, e a foto da direita é 16 dias depois da injeção do vírus. Na linha de baixo, células de carcinoma de cólon (RKO) foram injetadas por via subcutânea, e a Cepa 1 de Poliovírus foi em seguida injetada por via intravenosa. A foto da esquerda é antes da injeção do vírus, e a foto da direita é 18 dias depois da injeção do vírus. Conforme visto nas fotos à direita, a injeção do vírus resultou em significativa retração dos tumores. EXEMPLO 2 Testando a sensibilidade individual das células malignas de um paciente para diferentes cepas de vírus oncolíticos
[0115] Os exemplos demonstram que as atividades oncolíticas de cepas individuais de vírus humanos variam bastante dependendo da natureza das células cancerosas. Portanto, de modo a obter uma resposta positiva, precisa ser escolhida uma cepa de vírus oncoliticamente potente. Isto pode ser feito diretamente testando o perfil de sensibilidade de culturas de curto prazo de células malignas vivas obtidas por biópsia ou por cirurgia.
Materiais e Métodos
[0116] Amostras de tecido tumoral foram coletadas dentro de meio DMEM estéril pré-refrigerado suplementado com penicilina e estreptomicina. A espessura dos fragmentos do tumor era de menos de 5 mm para proporcionar um bom acesso para nutrientes a partir do meio. A amostra pode ser armazenada a +4°C por até 48 horas. Em seguida foi quebrada em fragmentos menores de 1 a 2 mm com uma lâmina de preferência estéril e empurrada através de uma malha de nylon de 50 a 100 micron de tamanho usando um pilão de vidro liso. A suspensão foi em seguida lavada duas vezes no meio por centrifugação a 800 g por 5 minutos. A suspensão foi corada com azul de Tripano e as células foram contadas. Porções iguais de 1 a 5 x 104 células em 0,2 mL foram colocadas em tubos de plástico estéreis de 1,5 mL e incubadas com 1 a 5 x 104 TCID50 de diferentes cepas de vírus por 30 min a 37°C. A suspensão foi em seguida lavada três vezes com 1 mL de DMEM suplementado com 2% de soro bovino fetal (FBS) a 800 g por 3 minutos em uma microcentrífuga. Cada amostra em 0,2 mL foi colocada em duas cavidades paralelas de uma placa de 96 cavidades e incubada a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2 e oxigênio reduzido por 48 horas. As amostras foram em seguida congeladas a -70°C, descongeladas, clareadas de debris por centrifugação a 5000 g por 10 minutos a 4°C, e o título de vírus foi determinado por diluições seriais e infecção de células CV1 sensíveis. Amostras tumorais apresentando sensibilidade para um vírus humano particular produziram até 106 a 107 TCID50 por mL.
[0117] A técnica para testar a sensibilidade individual aos vírus é aplicável a muitas cepas de vírus diferentes, incluindo mas não limitadas às cepas de Ecovírus humano, Coxsackievírus, cepas Sabin de poliovírus, sorotipos 1, 2 e 3, reovírus humano tipo 1, reovírus humano tipo, reovírus humano tipo 3, cepa Edmonston do vírus do sarampo, vírus da cachumba, cepas do vírus da doença de Newcastle, Sendai vírus, cepas do vírus Vaccinia, etc. EXEMPLO 3 Combinação de vírus oncolíticos para aplicações simultâneas
[0118] Conforme mostrado na Figura 2, a eficiência de uso simultâneo de misturas de vírus foi demonstrada em experimentos de xenoenxertos em camundongos nude portando tumores derivados da linhagem celular de carcinoma cervical humano C33A. Os camundongos foram injetados por via subcutânea com células de carcinoma epidermoide A431. Depois dos tumores se tornarem palpáveis, os sítios dos tumores foram injetados com 0,1 mL de vírus (108 TCID50) com intervalos de um dia por quatro dias. Cox-B5 correspondeu a STR14СВ5, Cox-B6 correspondeu a STR15СВ6, e Echo12 correspondeu a STR7E12.
[0119] Os camundongos foram injetados com vírus únicos (A431) apresentando diferentes capacidades de propagação nas células e misturas de dois ou três vírus oncolíticos durante intervalos de um dia por quatro dias. Em seguida o volume tumoral foi monitorado até o Dia 50. EXEMPLO 4 Biosseleção de Coxsackievírus B6 que pode replicar em células MCF7 Materiais e Métodos
[0120] Foi visto que células de carcinoma de mama MCF7 são resistentes ao Coxsackievírus B6 produzindo menos de 102 PFU/mL 48 horas depois de infecção com 0,1 PFU/ célula do vírus (vide as Tabelas 1 e 2 acima). A propagação do vírus Coxsackievírus B6 foi realizada em células CV1. Para mutagênese, foi determinada uma concentração de ribavirina que reduz a produção de vírus infeccioso por 2 a 3 ordens de magnitude em células CV1. Correspondeu a 0,1 a 0,5 mM. Uma monocamada recente de células CV1 foi infectada com 0,1 PFU/ célula de Coxsackievírus B6 na presença de ribavirina. O vírus foi coletado depois de 24 horas, e as células MCF7 foram infectadas com diluições seriais do vírus mutagenizado. Depois de absorção por 60 minutos, as células foram lavadas com HBSS e em seguida incubadas por 48 horas em DMEM suplementado com 2% de FBS. O vírus coletado da amostra representou a última diluição que apresentou um efeito citopático. Em seguida foi propagado em células CV1, e o estoque obtido foi usado para a segunda rodada de mutagênese e infecção de células MCF7 com diluições seriais. Resultados
[0121] Os estoques de vírus obtidos a partir de MCF7 e infectados com a maior diluição do vírus apresentaram títulos de 10 7 a 108 PFU/mL quando avaliados em células CV1. As placas no teste de placas foram polimorfas em aspecto e em tamanho. Uma maior placa foi tomada e usada para preparação de estoque de vírus que demonstrou títulos de 2 a 5 x 108 PFU/mL quando propagados em células MCF7. O vírus inicial e a cepa selecionada foram sequenciados. Houve quatro substituições de aminoácidos dentro do gene VP1 na cepa biosselecionada: Asn-655 --> Lys; Thr-698 --> Ile; Pro-715 --> His e Lys-825 -->Glu. EXEMPLO 5 Biosseleção de Echovírus 1 que não apresenta neutralização cruzada com antissoro Materiais e Métodos
[0122] Antissoro para neutralização foi obtido por imunização de carneiro com estoque purificado concentrado de Echovírus 1. O antissoro foi usado para preparação de imunoglobulina purificada. Um estoque de Echovírus 1 mutagenizado foi obtido em células CV1 na presença de 0,1 mM de ribavirina. Diluições de anticorpos foram incubadas com o estoque de Echovírus 1 mutagenizado a 37°C por 60 minutos, e diluições seriais foram usadas para infecção de células CV1. Amostras das células infectadas com a última diluição de anticorpos e apresentando efeito citopático foram usadas para uma segunda rodada de mutagenização com ribavirina e neutralização com anticorpos e titulação. Oito rodadas consecutivas de mutagenização e seleção se seguiram depois disso. Resultados
[0123] Durante as oito rodadas consecutivas seguintes de mutagenização e seleção houve um aumento gradual na resistência dos vírus a efeitos neutralizantes do antissoro. A seleção foi considerada bem-sucedida quando o efeito dos anticorpos contra o Echovírus 1 foi similar ao efeito dos anticorpos heterólogos cultivados contra o poliovírus tipo 1. EXEMPLO 6 Geração de STRs sintéticos Materiais e Métodos
[0124] O genoma da cepa de vacina atenuada viva de Poliovírus (cepa Sabin tipo 1; aprovada pela agência americana FDA para vacina oral contra pólio) foi otimizado por códon para atenuar a expressão viral em células normais e reforçar sua proliferação em células em rápida divisão / cancerosas. O genoma modificado foi sintetizado quimicamente, montado e usado adicionalmente para produzir vírus vivo. A SEQ ID NO: 1 é a sequência de nucleotídeos para a cepa Sabin 1 selvagem de referência. A SEQ ID NO: 2 é a sequência de nucleotídeos para o vírus sintético otimizado por códons. Existe uma identidade de 80,1% entre as duas sequências de nucleotídeos (5316/6630 usando CLUSTAL O v1.2.2). Resultados
[0125] Foi produzido um conjunto de poliovírus modificados sintéticos (STRps) com genomas modificados. O poliovírus tem um genoma de RNA de sentido positivo e de cadeia única, o qual pode agir como mRNA (codificando uma poliproteína), como um modelo para replicação de RNA genômico, ou como um genoma nascente a ser embalado dentro de partículas de vírus. A expressão do genoma viral e a replicação do vírus são crucialmente dependentes da função do chamado elemento IRES (Sítio de Entrada de Ribossoma Interna) localizado na Região Não Traduzida 5 (UTR) dos genomas. O IRES recruta a pequena subunidade ribossômica para a proximidade do códon de iniciação e inicia a síntese de uma poliproteína viral. Depois da clivagem, a parte N-terminal da poliproteína dá origem à proteína estrutural (capsídeo), enquanto a parte C-terminal dá origem a uma série de proteínas não- estruturais, incluindo uma RNA polimerase dependente de RNA e uma série de proteases vírus-específicas. Portanto, a expressão de proteínas do capsídeo viral junto com a titulação de partículas de vírus no meio e medição de placas em teste de placa de agar podem ser usadas para comparar a capacidade de replicação de vírus em diferentes tipos celulares.
[0126] A Cepa 1 de Poliovírus nativo e a cepa de Poliovírus otimizado por códons sintético 1 foram comparadas para sua capacidade para propagar em células Quiescent (células RD) e 293T se dividindo exponencialmente. As células RD atuaram como um controle. Conforme visto na Figura 5, o vírus sintético / otimizado por códons apresentou replicação preferencial (~3 vezes maior) em células em divisão. Exemplos Clínicos de Painéis de Vírus Oncolíticos em Pacientes Únicos EXEMPLO 7
[0127] Paciente A.S., uma mulher de 33 anos de idade, foi diagnosticada com adenocarcinoma ovariano de baixo grau T3N1M1, carcinomatose peritoneal e pleural, ascite e pleurite malignas, múltiplas metástases pélvicas, abdominais e mediastinais, e múltipla linfadenopatia.
[0128] A paciente foi tratada com STRS1 (cepa oncolítica de Sendai vírus) por um ano (12 injeções intradérmicas semanais, em seguida 7 mensais de STRS1, 108 I.U./mL). Houve uma queda no marcador CA- 125 durante um período de 3 meses de 2100 unidades para 30 a 50 unidades, e não houve sinais de progressão da doença por 11 meses, mas em seguida o nível de CA-125 começou a subir e o fluido ascítico voltou a se acumular. O fluido ascítico foi colhido para teste da sensibilidade das células cancerosas para um painel de vírus oncolíticos disponíveis. O teste ex vivo foi realizado como se segue:
[0129] 200 mL de fluido ascítico suplementado com heparina para evitar a coagulação de fibrina foi centrifugado por 10 minutos a 2000 g, o sedimento contendo agregados esferoides de células cancerosas foi coletado e as células foram contadas. Houve aproximadamente 7 x 10 5 células em um mL do fluido. As células foram lavadas com HBSS, divididas em porções de 2 x 106 células em 1 mL de DMEM e colocadas em microtubos de 1,5 mL. Os vírus foram usados para teste: cepa Sabin de poliovírus tipo 1, Ecovírus STR4E1 e STR7E12, Coxsackievírus STR8CA7 e STR14CB5, Reovírus Tipo 1 (STRR1), vírus do sarampo, cepa derivada de Edmonston STRM1ESC. As células foram infectadas em uma multiplicidade de 0,1 TCID50 por célula, incubadas por 60 minutos a 37°C, lavadas três vezes com HBSS, centrifugadas a 800 g por 3 minutos, e colocadas em 1 mL de DMEM, 2% de FBS a 37°C em 5% de CO2. Depois de 48 horas, foi observada completa degradação de células em todas as amostras exceto célula pseudo-infectadas. Os títulos de vírus para a maioria das cepas foram determinados usando células CV1.
[0130] Os títulos de Cepa de Sendai vírus STRS1 foram determinados na reação de hemaglutinação, e infectando células MDCK na presença de 10 µg/mL de tripsina. As células do fluido ascítico foram consideradas como altamente sensíveis a todos os vírus usados no teste produzindo títulos de vírus em uma faixa de 5 x 10 7 a 5 x 108 TCID50 por mL. As células também permaneceram sensíveis a STR-S1 produzindo 5 x 105 TCID50 por mL, o que é considerado com alta sensibilidade. No entanto, o fluido ascítico colhido do paciente continha altos títulos de anticorpos capazes de neutralizar STR-S1 (mais de 1:100.000), o que foi considerado como a causa da recidiva.
[0131] A paciente foi em seguida injetada com 1x10 8 PFU de Echovírus 1 cepa STR4E1 por via intravenosa. Nove dias depois da injeção, análise do fluido ascítico virtualmente não apresentou células cancerosas. Houve um declínio gradual em CA-125 durante as 5 semanas seguintes, de 3500 para 350 unidades. No entanto, iniciando na semana 6 depois da injeção, o fluido ascítico voltou a se acumular, e as células cancerosas reapareceram como agregados esferoides. Testes ex vivo determinaram que as células conservaram plena sensibilidade a STR7E12, STR10CB3, STRR1 e STRMESC1 mas foram resistentes a STR4E1. Não houve nem efeitos citopáticos visíveis nem produção de vírus depois da infecção com Echovírus 1 a 0,1 e 1 TCID50 por célula. Concluiu-se que a recidiva foi causada por uma seleção de células cancerosas resistentes a STR4E1.
[0132] A paciente foi em seguida injetada por via intraperitoneal com 10 mL de um coquetel de três vírus – 1x108 PFU cada de STR10CB5, STR-R1 e STRMESC1 (Coxsackievírus B5, Reovírus Tipo 1, e cepas de vírus do sarampo derivadas de Edmonston). Testes citológicos do fluido ascítico quatro dias depois da inoculação não apresentou células cancerosas vivas. Não foi detectado reaparecimento de células cancerosas dois meses depois da inoculação. EXEMPLO 8
[0133] Paciente M.C., um homem de 74 anos de idade, foi diagnosticado com adenocarcinoma do uraco, 2 anos depois da ressecção, o tumor se espalhou próximo ao cólon sigmóide, obstrução colônica (55 mm x 35 mm; foi introduzido stent sigmoidal para neutralizar a obstrução) e para a região ileocecal (60 mm x 30 mm), carcinomatose do peritônio, e ascite. Por ocasião do tratamento o paciente estava em condição crítica com rápida acumulação de ascite,
e o líquido se acumulou no escroto.
[0134] 50 mL de fluido ascítico foi centrifugado e inspecionado. Continha 2 x 106 células cancerosas por mL. As células foram lavadas e semeadas em DMEM mais 10% de FBS em uma densidade de 2 x 105 células por mL. Em três dias, as células formaram uma monocamada e foram adicionalmente cultivadas por divisão semanal a 1:3.
[0135] A reprodução de um conjunto de vírus foi testada nas células. As células (passagem 1) foram semeadas dentro de placas de 24 cavidades, infectadas com 1 a 5 PFU/ célula de vírus no dia seguinte, e os vírus da progênie foram coletados 3 dias depois. Os vírus foram quantificados por titulação da diluição serial em células suscetíveis. As células foram altamente suscetíveis a STRS1, STRR1, STRMESC1, STR4E1, STR7E12, STR14CB5, STR15CB6, e resistentes a STR8CA7.
[0136] Tendo em conta a condição crítica do paciente, a preparação de vírus oncolíticos foi introduzida diretamente dentro do fluido da ascite através de injeção intraperitoneal de 10 mL de cepa de Sendai vírus STRS1, 2 x 108 I.E. por mL.
[0137] Houve um aumento da temperatura corporal (18 horas depois da injeção) de 38,7 a 39,4°C. Outros sintomas incluíram fadiga, náusea, dores ligeiras e vagas na região abdominal. O aumento da temperatura foi bloqueado de modo eficaz por paracetamol e mantido a 37,2°C até se tornar normal e subnormal durante as próximas 24 horas. Também houve um aumento na micção durante os próximos três dias junto com uma diminuição na ascite. O fluido escrotal desapareceu durante as primeiras 48 horas, e a ascite se tornou indetectável por volta do dia 4 depois da injeção. A condição geral e a atividade do paciente melhoraram rapidamente, com um apetite, e um humor melhor.
[0138] 35 dias depois da injeção, PET-CT apresentou completa resolução do tumor na região ileocecal e substancial redução do tumor na região do cólon sigmoidal, com um aumento local residual na atividade metabólica na região voltada para o stent sigmoidal.
[0139] 60 dias depois da injeção, o paciente começou a se queixar sobre obstrução parcial entre o estômago e o duodeno levando ao vômito depois das refeições. Uma acumulação de líquido foi detectada na região abdominal superior devido ao processo adesivo iniciado pelo episódio anterior de acúmulo de ascite. Uma punção abdominal não revelou quaisquer células cancerosas no fluido. A condição foi tratada por diuréticos e um regime mais ativo (por exemplo, caminhada diária).
[0140] O processo adesivo peritoneal continuou progredindo durante os próximos quatro meses, levando a problemas com a evacuação intestinal, emagrecimento e fraqueza. De modo a prevenir a possível recidiva do processo maligno, o paciente foi injetado por via intravenosa com 2 x 108 PFU STRMESC1 (cepa do vírus do sarampo derivado de Edmonston). Houve um aumento da temperatura 24 horas depois da injeção (37,2 a 37,4°C) persistindo pelas próximas 18 a 20 horas e em seguida temperatura subnormal (35,5°C) persistindo por três dias e associada com fadiga. Não foram observadas outras manifestações. Também não houve nenhuma melhora substancial da condição da paciente. O principal problema remanescente foi o processo adesivo no peritônio. Oito meses depois da primeira injeção de vírus oncolíticos, o paciente experimentou um ataque cardíaco que se somou aos problemas abdominais. A condição do paciente continuou a se deteriorar, e o paciente faleceu 11 meses depois do início da terapia oncolítica. No entanto, autópsia postmortem não revelou células cancerosas vivas na região dos tumores sigmoidais e ileocecais, e houve sinais de fibrose nas regiões de antigos tumores. EXEMPLO 9
[0141] Paciente M.A., uma mulher de 82 anos de idade, foi diagnosticada com adenocarcinoma sigmoidal, dois anos depois da ressecção, metástases para o fígado, 25 x 15 mm e 20 x 10 mm, caquexia, e CEA – 55 ng/mL.
[0142] Não foi aplicada quimioterapia à paciente. Por ocasião da primeira injeção a paciente estava fraca e restrita ao leito. Havia sinais de icterícia.
[0143] A paciente foi injetada por via intradérmica com 1 mL da cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (109 I.E./mL) misturada com células obtidas de um embrião de frango de 4 dias, 107 células. Foram feitas vinte injeções intradérmicas, 0,05 mL cada, na região espinhal da paciente para aumentar a exposição ao vírus. Células embrionárias de frango suportam replicação do vírus STRS1, deste modo prolongando o efeito da injeção. As injeções foram repetidas em intervalos de 14 dias por três meses.
[0144] Não houve aumento da temperatura ou qualquer outro efeito colateral em resposta às injeções. A condição da paciente começou a melhorar 5 a 7 dias depois da primeira injeção. Houve uma melhora da função hepática (ALT/AST), desaparecimento da icterícia, aumento da energia, ganho de peso (mais 7 kg até 55 kg no total), a paciente não ficou acamada, retornou à vida ativa, e passou três meses do verão em uma casa de campo realizando uma rotina de horta. Quatro meses depois da primeira injeção, CT scans apresentaram uma retração substancial das metástases hepáticas para dificilmente detectáveis.
[0145] Nove meses depois da primeira injeção, a condição da paciente piorou com fadiga, anemia, e diminuição da contagem de eritrócitos. Não foi realizado nenhum exame específico nos sítios tumorais. A paciente foi injetada por via intravenosa com um coquetel de vírus oncolíticos contendo 108 PFU cada de STR4E1, STR8CA7 e STR14CB5 (cepas de Echovírus 1, Coxsackievírus A7, Coxsackievírus B5). Houve uma reação da temperatura 18 horas depois da injeção (37.9°C) persistindo por 18 a 20 horas. A condição da paciente começou a melhorar 48 horas depois da injeção. Os parâmetros sanguíneos (contagem de eritrócitos e hemoglobina) atingiram níveis normais duas semanas depois da injeção. Seis meses depois da injeção, a paciente estava estável sem queixas específicas. CEA = 7 ng/mL. EXEMPLO 10
[0146] Paciente N.S., uma mulher de 36 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma cervical escamoso de baixo grau, metástases para o espaço de Douglas e ascite. O tumor primário foi removido cirurgicamente dois anos antes. Foram detectadas metástases quatro meses antes da terapia com vírus oncolíticos.
[0147] O paciente foi injetado por via intradérmica com 1 mL de cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (10 9 I.E./mL) em 20 pontos na região espinhal. As injeções foram repetidas a cada segunda semana por cinco meses. Foi observada uma reação da temperatura depois da primeira injeção (38,5°C), persistindo por um dia. Não foi observado aumento da temperatura durante as injeções subsequentes. Houve uma melhora gradual da condição da paciente. O fluido ascítico desapareceu durante o primeiro mês. Em três meses, um CT scan apresentou uma retração substancial da massa tumoral no espaço de Douglas. A condição da paciente permaneceu estável por um ano. EXEMPLO 11
[0148] Paciente M.L., um homem de 73 anos de idade, foi diagnosticado com adenocarcinoma acinar de próstata, metástases para os ossos (vértebras, costelas, pelve). O tumor primário não foi removido (21 mm x 21 mm x 13 mm). PSA = 230 ng/mL.
[0149] Quinzenalmente injeções intradérmicas com cepa de Sendai vírus concentrada STRS1 (109 I.E./mL) foram administradas através de 20 localizações misturadas com 107 células de embrião de pinto de 4 dias durante um período de 6 meses. Depois de quatro meses, foram administradas injeções duas vezes por semana por quatro meses. Não houve reação da temperatura. As dores nos ossos do paciente desapareceram gradualmente durante os primeiros 2 meses. Depois de 6 meses um PET CT scan não revelou progressão da doença com sinais metabólicos um tanto diminuídos em metástases. A condição permaneceu estável 1 ano e meio depois da primeira injeção de vírus oncolítico. PSA = 41 ng/mL. EXEMPLO 12
[0150] Paciente A.S., um homem de 55 anos de idade, foi diagnosticado com adenocarcinoma de próstata, o qual foi removido cirurgicamente dois anos antes, e metástases para os ossos (pélvicos, costelas, cranianos). PSA = 1400 ng/mL.
[0151] O paciente foi injetado por via intramuscular com 1 mL de preparação purificada concentrada (109 PFU por mL) de Echovírus 1 cepa STR4E1.
[0152] Houve uma reação da temperatura (39,5°C) nos dias 3 a 4 e dor nos sítios tumorais. A dor retrocedeu por volta do 3. As injeções foram repetidas com intervalos de três semana. Não houve reação da temperatura depois das injeções repetidas.
[0153] No Dia 51, um CT scan revelou uma redução no tamanho do tumor, e evidência para reparo de obstrução óssea. O PSA caiu para 210 ng/mL.
[0154] No Dia 65, o paciente foi administrado com uma injeção intramuscular de cepas de Coxsackievírus B5 purificadas concentradas STR14CB5, 109 PFU por mL quatro vezes com intervalos de três semanas. Houve uma reação da temperatura depois da primeira injeção, mas as injeções seguintes foram assintomáticas.
[0155] Seis meses depois do início do tratamento, não houve progressão da doença, e a condição do paciente foi estável. PSA = 105 ng/mL. EXEMPLO 13
[0156] Paciente F.A., um homem de 65 anos de idade, foi diagnosticado com adenocarcinoma de próstata, o qual foi removido cirurgicamente. Uma amostra do tumor foi usada para gerar uma linhagem celular. As células do carcinoma de próstata estavam livres de fibroblastos associados. A linhagem celular foi usada para testar a sensibilidade a um painel de vírus oncolíticos. A linhagem celular foi altamente sensível a STRS1, STRR1, STR4E1, STR8CA7, STR14CB5 porém relativamente resistente a STR7E12, STR15CB6 e STRMESC1.
[0157] Oito meses depois da operação cirúrgica, o paciente começou a se queixar de dores na região da pelve. Um CT scan revelou metástases ósseas na pelve e nas costelas. PSA=1500 ng/mL.
[0158] O paciente foi injetado por via intramuscular com um coquetel de vírus concentrado e purificado, 109 PFU por mL cada de STR4E1, STR8CA7 e STR14CB15 (cepas de Echovírus 1, Coxsackievírus A7, Coxsackievírus B5). Houve uma reação da temperatura depois de 18 horas (38,3°C), no dia seguinte (37,5°C), e no dia 3 (37,2°C). Em seguida ocorreu uma reação da temperatura subnormal por três dias. O paciente experimentou dores em sua pelve e costelas persistentes por uma semana e em seguida as dores retrocederam. A injeção foi repetida cinco vezes com intervalos de três semana.
[0159] As dinâmicas de PSA foram como se segue: 1500 ng/mL (início), 1700 ng/mL (10 dias depois do início), 670 ng/mL (35 dias depois do início), 205 ng/mL (3 meses depois do início), e 86 ng/mL (5,5 meses depois do início).
[0160] A condição presente do paciente (6 meses depois do início do tratamento) está estável. O paciente não tem queixas, e um CT scan proporcionou evidência de restauração óssea nos sítios tumorais. EXEMPLO 14
[0161] Paciente A.A., um homem de 72 anos de idade, foi diagnosticado com carcinoma de próstata, quatro anos depois de remoção cirúrgica, e metástases para pulmão e fígado. Terapia hormonal foi inicialmente eficiente mas foi seguida por uma recidiva com progressivo crescimento de metástases. PSA = 2500 ng/mL.
[0162] O paciente foi administrado com injeções intradérmicas quinzenais com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (109 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 10 7 células embrionárias de frango de 4 dias durante um período de 5 meses. Um aumento da temperatura foi observado durante a primeira injeção (39,2°C) persistindo por um dia. Uma segunda injeção resultou em uma menor temperatura (37,4°C) persistindo por 12 horas. Não houve reação da temperatura durante as rodadas de injeções seguintes. As dinâmicas do PSA foram como se segue: 2500 ng/mL (início); 2700 ng/mL (10 dias depois do início); 930 ng/mL (33 dias depois do início); e 220 ng/mL (4 meses depois do início).
[0163] Um segundo vírus foi aplicado 5 meses depois do início. Reovírus Tipo 1 cepa STRR1 foi injetada por via intramuscular (2 x 10 8 PFU/mL, 2 mL) com intervalos de duas semanas por três meses. Não houve reações adversas exceto um ligeiro aumento da temperatura (37,2°C) e persistiu por menos de um dia depois da primeira injeção. PSA: 270 ng/mL (Dia 14); 184 ng/mL (Dia 31); 56 ng/mL (Dia 105). EXEMPLO 15
[0164] Paciente E.B., uma mulher de 44 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma ovariano seis anos atrás com metástases para a região umbilical, o peritônio, tumores sólidos na região peritoneal (32 mm × 16 mm; 52 mm × 35 mm) e pleurite. Metástases no cérebro foram removidas por CyberKnife. Em seguida a paciente foi submetida a 12 rodadas de quimioterapia. A paciente em seguida experimentou recidiva, durante a qual foram verificados dois tumores no abdômen (14 mm × 9 mm e 23 × 16 mm). СА-125 - 299.
[0165] A paciente foi injetada com injeções intradérmicas quinzenais com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (109 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 10 7 células embrionárias de frango de 4 dias durante um período de 2 meses. Estudo por ultrassom revelou dinâmica negativa, embora a condição geral da paciente tivesse melhorado.
[0166] A paciente foi em seguida injetada com injeções intramusculares quinzenais de coquetel de vírus oncolíticos purificados: Echovírus tipo 12 cepa STR7E12, Coxsackevirus tipo B3 cepas STR12B3, e Reovírus Tipo 1 cepa STRR1 (108 PFU cada) por dois meses.
[0167] Exame por ultrassom revelou dinâmica positiva. Atualmente a paciente está recebendo injeções intramusculares de coquetel de vírus oncolíticos contendo Echovírus 1 cepas STR4E1, cepa de Poliovírus Sabin Tipo strain, e cepa derivada do vírus da doença de Newcastle STRNH1. A condição da paciente se estabilizou. EXEMPLO 16
[0168] Paciente V.S., uma mulher de 42 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma de mama quatro anos atrás e foi submetida a ressecção cirúrgica. A paciente também foi diagnosticada com metástases para o fígado, os pulmões, e o peritônio. A paciente foi submetida a 14 rodadas de quimioterapia e recidivou. Foram verificados três sítios de tumor no fígado (22 mm x 14 mm; 26 mm x 18 mm; 18 mm x 20 mm) e no pulmão (15 mm x 18 mm).
[0169] A paciente foi injetada quinzenalmente com injeções intradérmicas com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (10 9 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 10 7 células embrionárias de frango de 4 dias durante um período de 3 meses. Estudo por ultra-som revelou dinâmica positiva, e os tumores no fígado diminuíram para 12 mm x 6 mm; 7 mm x 6 mm e 5 mm x 8 mm e no pulmão para 4 mm x 6 mm. EXEMPLO 17
[0170] Paciente L.P., uma mulher de 51 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma gástrico quatro anos atrás e foi submetida a ressecção cirúrgica. Foram descritas metástases para o lobo superior do pulmão direito (32 mm x 37 mm x 28 mm) e múltiplas pequenas metástases dispersas por todo o pulmão esquerdo e direito. Também foram descritas metástases para os ossos (Th9-L2, L4). CEA = 367.2.
[0171] A paciente foi injetada quinzenalmente com injeções intradérmicas de cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (109 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 10 7 células embrionárias de frango de 4 dias durante um período de 3 meses. Um CT scan apresentou uma estabilização do processo e dinâmica positiva limitada. A saber, as principais metástases no pulmão se estabilizaram em 28 mm x 25 mm x 20 mm.
[0172] Iniciando no mês 4, a paciente foi injetada com injeções intramusculares quinzenais de um coquetel de vírus oncolíticos, incluindo 2 mL de uma mistura contendo cepa de Echovírus 1 purificada STR4E1, Reovírus Tipo 1 cepa STRR1 e cepa do vírus da doença de Newcastle STRNH1 (2 x 108 PFU cada). A condição da paciente se estabilizou. EXEMPLO 18
[0173] Paciente K.I., uma mulher de 52 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma das trompas de falópio, metástases para linfonodos e peritônio, e ascite. O tumor principal foi removido cirurgicamente quatro anos atrás, e a recidiva da paciente se iniciou dois anos atrás. Dez rodadas de quimioterapia resultaram em dinâmica positiva; no entanto uma segunda recidiva levou a um rápido acúmulo de fluido ascítico.
[0174] 250 mL de fluido ascítico foi obtido por laparocentese. A contagem de células tumorais no fluido foi de 2 x 105 células por mL. As células foram lavadas com solução salina de Hank e semeadas para placas em uma densidade de 5 x 10 5 células por mL em meio DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS. A maioria das células se fixou, e as placas atingiram confluência em três dias. Uma porção das células foi congelada em N2 líquido, e o resto continuou a crescer em cultura. Uns poucos clones individuais foram isolados e propagados congelados para uso experimental no futuro bem como para uma fonte de antígenos tumorais específicos do paciente. Além disso, 2 x 106 das células recuperadas da ascite foram misturadas com Matrigel e injetadas por via subcutânea em camundongos nude. Tumores crescendo lentamente se tornaram visíveis quatro semanas depois da inoculação.
[0175] As células cancerosas derivadas da ascite foram usadas para testar suas sensibilidades para um painel de vírus oncolíticos. As células foram semeadas para placas de 24 cavidades, atingiram a subconfluência, e foram infectadas com 1 a 5 I.E. por célula com diferentes vírus oncolíticos. Três dias depois da infecção, as células foram classificadas para efeito citopático e em seguida foram congeladas - descongeladas e o vírus recém propagado liberado foi quantificado por titulação de diluições seriais em células sensíveis (CV1 e MDCK, dependendo da cepa do vírus).
[0176] Foi visto que as células eram altamente sensíveis aos seguintes vírus: cepa de Poliovírus Sabin Tipo 1, STR4E1, STR13CB4, STR15CB6, STRR1, STRNH1, e STRMESC1. Foi visto que as células eram parcialmente sensíveis a STR7E12, STR8A7, STR14CB5, e STRR2. Foi visto que as células eram resistentes a STRS1, STR17E21, STRMuVD1 (cepa do vírus do sarampo oncolítico), e STRCDV1 (cepa do vírus da cinomose canina oncolítico).
[0177] Com base nos dados, foram formados dois painéis de vírus oncolíticos. O Painel 1 consistiu em STR4E1, STR13CB4, e STRR1. O Painel 2 consistiu em STR15CB6, ATRNH1, e STRMESC1. O Painel 1
(2 mL) foi injetado por via intramuscular em intervalos quinzenais, 2 x
109. Houve uma notável melhora da condição da paciente depois de dois meses do tratamento. O fluido ascítico parou de se acumular e não foi mais detectado por exame por ultrassom. A condição geral da paciente também melhorou. EXEMPLO 19
[0178] Paciente D.N., um homem de 54 anos de idade, foi diagnosticado com câncer pancreático no estágio quatro, e não foi administrada quimioterapia ou cirurgia. O tumor estava localizado no corpo pancreático (38 mm x 45 mm x 24 mm) com margens agudas. Uma pequena quantidade de fluido ascítico, hidrotórax à esquerda, obstrução do colédoco foi aliviado por um stent. CA 19-9 = 4557 U/mL, CEA = 8,08 ng/mL.
[0179] O paciente recebeu quinzenalmente injeções intradérmicas com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (10 9 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 107 células embrionárias de frango de 4 dias, durante um período de 2 meses. Por volta do final do mês 2, CA- 19-9 aumentou e atingiu 9845 U/mL.
[0180] O coquetel de vírus oncolíticos foi em seguida modificado para um contendo Echovírus 1 cepa STR4E1, Reovírus Tipo 1 cepa STRR1, e Coxsackevirus A7 cepa STR8CA7, (2 x 10 8 PFU cada). Os vírus oncolíticos (2 mL) foram injetados quinzenalmente por via intramuscular. As dinâmicas de CA-19-9 foram como se segue: 9845 U/mL (início); 9567 U/mL (dia 32); e 5764 U/mL (dia 75). EXEMPLO 20
[0181] Paciente L.N., uma mulher de 58 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma ovariano quatro anos atrás. Foi realizada uma ressecção cirúrgica do ovário e do útero. A paciente também foi diagnosticada com metástases para os linfonodos peritoneais e ascite.
[0182] Fluido ascítico foi coletado e inspecionado. Não foram detectadas células cancerosas vivas. Como houve um rápido acúmulo de fluido ascítico, o vírus STRS1 foi injetado por via intraperitoneal por laparocentese (10 mL contendo 109 I.E. do vírus). A reação da temperatura foi como se segue: 38,9°C (dia 2); 37,8°C (dia 3); e 37,2°C (dia 4), em seguida subnormal por três dias. O acúmulo de ascite se abrandou por volta do dia 4 e foi dificilmente detectável por volta do dia
25. A condição geral da paciente melhorou. Iniciando no dia 14, a paciente foi administrada quinzenalmente com injeções intradérmicas com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (10 9 I.E./mL) em 20 pontos misturada com 107 células embrionárias de frango de 4 dias. A condição da paciente se estabilizou. EXEMPLO 21
[0183] A paciente K.S., uma mulher de 68 anos de idade, foi diagnosticada com câncer pancreático no estágio quatro (com o tour primário na região da cabeça pancreática), e metástases para os linfonodos para-pancreáticos, o baço (ressecado 13 meses atrás), o peritônio, os linfonodos mediastinais, e a glândula adrenal esquerda. O marcador CA-19-9 no início do tratamento foi 243. Quimioterapia trouxe o marcador CA 19-9 para 93 U/mL.
[0184] A paciente foi administrada quinzenalmente com injeções intradérmicas com cepa de Sendai vírus STRS1 concentrada (10 9 I.E./mL) em 20 localizações misturada com 10 7 células embrionárias de frango de 4 dias durante um período de 9 meses. CA 19-9 continuou a cair durante os próximos três meses até 58,5 U/mL. Em seguida foi observado um aumento gradual em CA 19-9 nos próximos três meses até 308 U/mL em seguida durante um mês até 940 U/mL. Durante as próximas três semanas, CA 19-9 aumentou para 5962 U/mL e em seguida para 15888 U/mL (cinco semanas).
[0185] Um coquetel de vírus contendo STR4E1, STR11CB2, e STR14CB5 foi injetado quinzenalmente por via intramuscular durante um período de dois meses. Foram observadas as dinâmicas seguintes do marcador CA 19-9: 16813 U/mL (depois de duas semanas), 12944 U/mL (depois de quatro semanas), e 13121 U/mL (depois de seis semanas). Os números indicam que o aumento exponencial observado em CA 19-9 parou e mesmo diminuiu um tanto. No entanto, nas semanas seguintes o processo retornou - próximas duas semanas - 22876, próximas duas semanas – semanas seguintes, o processo retornou: 22876 U/mL (depois de oito semanas), 34589 U/mL (depois de dez semanas), e 100345 U/mL (depois de doze semanas). Começou a se acumular fluido na região mediastinal. Foi coletado e inspecionado para células tumorais. As células foram semeadas para cultura celular e foram propagadas para exame adicional de suas sensibilidades aos vírus oncolíticos. EXEMPLO 22
[0186] Paciente N.S., uma mulher de 76 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma de cólon (sigmoidal) quatro anos atrás. O tumor foi removido cirurgicamente com restauração da conexão colônica para o reto. Foram observadas metástases para o fígado e para o íleo. O íleo foi parcialmente ressecado dois anos atrás, e a paciente foi submetida a quimioterapia que estabilizou a doença. Um ano atrás, a paciente foi diagnosticada com melanoma maligno e com metástases para os linfonodos retroperitoneais e inguinais. Tendo em conta das condições patológicas acompanhantes (graves lesões ateroscleróticas na aorta, cardiosclerose, e enfisema pulmonar), não foi sugerida quimioterapia.
[0187] A paciente foi administrada com injeções intramusculares quinzenais de coquetel de vírus oncolíticos: Echovírus 7 cepa STR6E7, Reovírus 1 cepa STRR1, e o vírus da doença de Newcastle cepa STRNH1 (109 I.E. cada uma das cepas seguintes). Houve uma forte reação da temperatura persistindo por três dias que foi bloqueada de modo eficaz por analgésicos (ibuprofeno e diclofenaco). Depois de três semanas exame por ultrassom revelou ligeira retração dos linfonodos retroperitoneais e inguinais. EXEMPLO 23
[0188] Paciente S.E, uma mulher de 42 anos de idade, foi diagnosticada com carcinoma ovariano de células da granulosa com metástases para o peritônio. O tumor foi removido cirurgicamente um ano e meio atrás. Exame histológico confirmou carcinoma de células da granulosa, tipo adulto, T1aNxM0. Foi observada progressão da doença pós cirurgia, a qual incluiu carcinomatose de peritônio e ascite.
[0189] Depois da cirurgia, a paciente foi submetida a 5 cursos de quimioterapia (3 meses) que incluiu 3 dias de cisplatina 100 mg, etoposídeo 200 mg No. 3; carboplatina 450 mg, e etoposídeo 200 mg No. 2. Exame por ultrassom pós quimioterapia apresentou progressão adicional da doença. Foram observadas grandes formações preenchidas com líquido e particionadas com septos no lado esquerdo da pelve pequena até 51 mm; e no lado direito até 65 mm.
[0190] O esquema de quimioterapia foi modificado para: quatro cursos de um dia de paclitaxel, 260 mg. Não obstante, a doença piorou. Ao longo dos vasos ilíacos foi visualizada uma formação volumosa com ecoestrutura cistóide irregular, 87 mm x 57 mm, com suprimento de sangue ao longo dos septos. No espaço retroperitoneal direito, abaixo do polop inferior do rim - foi observada uma estrutura cística volumosa similar de 55 mm x 35 mm.
[0191] Foi aplicada uma terceira linha de quimioterapia: aplicação de cinco cursos de 3 dias de ifosfamidum 2 gramas, MeSNa 2 gramas, cisplatina 30 mg, etoposídeo e 150 mg. Quimioterapia pareceu ineficaz.
[0192] A terapia com vírus oncolítico foi iniciada um ano depois da cirurgia. A paciente foi submetida a injeções intradérmicas semanais no dorso (próximo às vértebras) com STRS1 (cepa oncolítica de Sendai vírus) (108 IE) misturadas in vitro com 2 x 106 fibroblastos embrionários de frango de 5 dias. A reação para a primeira administração foi um aumento da temperatura até 37,8° C cerca de 20 horas depois das injeções, a qual durou por 10 horas. A reação para a segunda administração foi um brando aumento da temperatura (37,2° C) persistindo por 5 a 6 horas. As administrações subsequentes não tiveram nenhuma reação. A paciente foi submetida a terapia com vírus oncolíticos por um período de 3 meses.
[0193] Depois de terapia viral, exame por ultrassom apresentou sinais de melhora substancial. Não foi visível líquido na cavidade peritoneal. Tomografia MR subsequente apresentou melhora substancial com uma redução em um número de nódulos tumorais e seu volume. Vide a Figura 7. Não se acumulou mais o contraste Gadovist. EXEMPLO 24
[0194] Paciente O.L., uma mulher de 49 anos de idade, foi diagnosticada (dois anos atrás) com astrocitoma difuso do cérebro, Grau II. Foi revelado um massivo tumor intra-axial do lobo frontal esquerdo.
[0195] Dois anos atrás, a paciente foi submetida a uma craniotomia acordada para remoção parcial do tumor. Durante a cirurgia, a paciente experimentou crises epilépticas focais e de grande mal as quais limitaram a capacidade para monitorar a função da linguagem. Monitoramento eletrofisiológico para Potenciais Evocados Motores (MEP, Motor Evoked Potentials) e funções motoras foi conduzido por toda a operação. Em algum ponto quando foi observada uma diminuição nos MEP e depois de descompressão do cérebro edematoso, o qual estava sob grave pressão no início da operação, ressecção adicional foi interrompida e a operação foi concluída. Depois da cirurgia a paciente apresentou hemiparesia direita com disfasia motora, a qual melhorou depois de várias horas quando a paciente foi posta em alta dose de esteroides com infusões de manitol. CT no pós-operatório mostrou cavidade de ressecção parcial sem hemorragia e edema grave similar às pre-operative imagens de MRl do pré-operatório. Vários dias depois da cirurgia a paciente deteriorou, e se tornou estuporosa e menos comunicativa. A dose de esteroides foi aumentada bem como a frequência da infusão de manitol com controle dos níveis de sódio. O prognóstico pareceu sombrio.
[0196] Depois da cirurgia, a paciente foi submetida a um curso de terapia de radiação conformada remota (30 sessões de 2 Gy; total 60 Gy). A condição melhorou ligeiramente.
[0197] Em seguida a paciente foi submetida a 6 cursos de quimioterapia com Temozolomida (250 mg). As dinâmicas globais foram consideradas negativas. CT scan mostrou aumento da acumulação de matéria contrastante no cérebro. Treze meses atrás, um curso de quimioterapia com temodal foi repetido, novamente sem melhora substancial.
[0198] Um ano atrás, foi iniciada a terapia com vírus oncolíticos. A cepa de Reovírus 1 (STRR1) foi injetada por via intramuscular 109 IE. A reação inicial incluiu desconforto intestinal menor e um aumento muito brando da temperatura (37,2°C a 37,5°C) persistindo por umas poucas horas. As administrações subsequentes continuaram por um mês sem reações adversas. MRI mostrou pequena dinâmica positiva.
[0199] STR4E1 (Echovírus 1) foi aplicado semanalmente (por via intramuscular 109 IE) por um mês. Não foi observada reação adversa.
[0200] STR14CB5 (Coxsackievírus B5) foi em seguida aplicado semanalmente (por via intramuscular 109 IE) por um mês. Fadiga e tontura resultaram durante a primeira aplicação. Não houve reações adversas durante a segunda aplicação. MRI do cérebro mostrou estabilização da doença. Foram observadas dinâmicas positivas moderadas.
[0201] Injeções intramusculares semanais de STR14CB5 (Coxsackievírus B5) 109 IE continuaram por mais duas semanas. Não foram observadas reações adversas. MRI e PET/CT mostraram dinâmica positiva sob a forma de redução do tamanho das seções de contraste.
[0202] STR8CA7 (Coxsackievírus A7) foi aplicado semanalmente por via intramuscular 108 IE por 3 semanas. Fadiga menor foi observada depois da primeira injeção no dia seguinte. A segunda e a terceira injeções não levaram a reações adversas.
[0203] Poliovírus 1 (cepa Sabin) 108 IE intramuscular foi em seguida aplicado semanalmente por duas semanas. Calafrios menores foram observados no dia seguinte depois da primeira injeção. Não ocorreram reações adversas depois da segunda administração. MRI mostrou dinâmica positiva adicional sob a forma de redução no tamanho das áreas contrastantes (Figura 8).
[0204] As injeções intramusculares de Poliovírus 1 (cepa Sabin) 10 8 IE continuaram. Não ocorreram reações adversas. A condição da paciente melhorou substancialmente. O paciente se comunica quase normalmente, é mais despertável, e caminha 2 a 3 horas todo dia. EXEMPLO 25
[0205] Paciente N.D., um homem de 59 anos de idade, foi diagnosticado (três anos atrás) com adenocarcinoma ductal pancreático localizado no corpo do pâncreas. Exame por ultrassom mostrou um tumor no corpo do pâncreas - 44 mm x 35 mm, estenose da artéria mesentérica superior e do tronco celíaco, e esplenomegalia. Os níveis do marcador tumoral A19-9 foram de 125 U/mL, os níveis de CEA foram de 5 ng/mL. Punção do tumor, assistida por laparoscópio, para biópsia resultou em aumento do marcador A19-9 para 512 U/mL. Um ano depois, o marcador tumoral CA19-9 aumentou para 2338 U/mL e em seguida (quatro meses depois) para 4557 U/mL. O paciente desenvolveu icterícia devido à obstrução do colédoco. Foi introduzido um stent para tratar a condição. CA19-9 = 7416 U/mL.
[0206] A terapia com vírus oncolítico foi iniciada usando STRS1 (cepa oncolítica de Sendai vírus) (108 IE). O paciente foi submetido a 16 injeções intradérmicas semanais com STRS1 no dorso, próximo às vértebras. A reação à primeira administração foi um aumento da temperatura até 37,8°C a 38°C (tratável com aspirina) persistindo por 4 horas. As administrações de seguimento não tiveram reações adversas.
[0207] Exame por ultrassom quatro meses depois do tratamento viral apresentou uma redução no volume tumoral de 45 mm x 38 mm para 42 mm x 32 mm, e uma diminuição na quantidade do fluido livre no abdômen e dinâmica positiva global. Os níveis do marcador CA19-9 foram de 2878 U/mL.
[0208] Um coquetel de três vírus, STR4E1 (Echovírus 1 (2 x 10 8 I.E./mL)), STRR1 (Reovírus 1 (5x107 I.E./mL)), e STR8CA7 (Coxsackievírus A7) (108 I.E./mL), foi aplicado por injeção intramuscular. Desenvolveu-se febre 14 horas depois da injeção. A temperatura aumentou para 38,5°C e permaneceu elevada por 4 a 5 horas (não tomou aspirina), e em seguida caiu para 37,2°C a 37,4°C e permaneceu neste nível durante as próximas 24 horas. Foi experimentada fadiga durante os três dias seguintes. Foi repetida a injeção do coquetel de três vírus. A reação foi uma temperatura branda (37,5°C) persistindo por 5 horas. A condição se estabilizou, foram observadas dinâmicas positivas. Os níveis do marcador CA19-9 foram de 1316 U/mL. EXEMPLO 26
[0209] Paciente I.V., uma mulher de 39 anos de idade, foi diagnosticada (seis anos atrás) com carcinoma de mama triplo negativo (mama direita), T2N0M0, maligno Grau 3, Fenótipo de células basais invasivo. A paciente foi submetida a ressecção setorial radical da mama direita e de linfonodos regionais. A paciente foi submetida a seis cursos de quimioterapia adjuvante: Docetaxel + Doxorrubicina e em seguida radioterapia (gama). A doença progrediu, com metástases para o pulmão esquerdo, a glândula tiroide, o fígado (lobo esquerdo) e a glândula adrenal esquerda. A paciente foi submetida a um adicional de seis cursos de quimioterapia: Bevacizumab 840 mg, Carboplatina AUC 6, uma vez a cada 3 semanas mais injeções semanais de paclitaxel (120 mg). Inicialmente foi observada remissão parcial, seguida por dinâmica negativa global.
[0210] Dois anos atrás, iniciou terapia com vírus oncolíticos usando STRS1 (Sendai vírus). Foram aplicadas 16 injeções intradérmicas no dorso, próximo às vértebras. Dois meses depois, Tomografia Computadorizada mostrou dinâmica positiva. O nódulo no pulmão se retraiu de 19 mm x 20 mm para 10 mm x 15 mm. Foi observada calcificação focal do tumor, e também foi observada formação de uma estrutura cheia de ar (17 mm) próxima ao tumor.
[0211] O tratamento com STRS1 continuou, mas foi seguido por dinâmica negativa. Foi observado um aumento no tamanho da metástase pulmonar para 60 mm х 46 mm х 55 mm. Também foi observada acumulação de ascite, metástases para a região da pelve, para o ovário, o útero e penetração na bexiga, junto com aumento dos linfonodos retroperitoneais.
[0212] Fluido ascítico (830 mL) foi retirado para exame. O líquido continha agregados esferoides de células tumorais (1 a 1,5 x 10 5 células/mL). Todo o volume de fluido ascítico coletado foi centrifugado para coletar células tumorais. As células foram lavadas com DMEM e congeladas em nitrogênio líquido em 50% de FCS, 10% de DMSO para teste adicional para sensibilidade ao vírus.
[0213] As células cancerosas foram testadas para sensibilidade ao vírus. Elas pareceram ser sensíveis a STRS1 (Sendai vírus), no entanto foi visto que o fluido ascítico continha alto título de anticorpos anti-
STRS1 / neutralizantes. As células cancerosas foram testadas adicionalmente e pareceram ser sensíveis a STRNH1 (vírus da doença de Newcastle, cepa H), STR4E1 (Echovírus 1), cepas Sabin de Poliovírus (1,2,3 tipos) e STR14CB5 (Coxsackevírus B5). Estas células também apresentaram moderada sensibilidade a STR15CB6 (Coxsackievírus B6) e pareceram não ser sensíveis a STR8CA7 (Coxsackievírus A7) e STR17E21 (Echovírus 12).
[0214] A paciente foi submetida a administração intraperitoneal de 2x108 I.E. STR4E1 (Echovírus 1). A temperatura corporal aumentou 16 horas depois da administração até 38,5° C (tratada com aspirina), e retornou ao normal dentro das próximas 24 horas. O volume do fluido ascítico diminuiu substancialmente. A condição global da paciente melhorou.
[0215] O tratamento continuou com injeções intravenosas de 2x10 8 I.E. STR4E1 (Echovírus 1) em perfusão de 200 mL, por 40 minutos (semanalmente por 7 semanas). Tomografia Computadorizada apresentou sinais de substancial dinâmica positiva. As metástases pulmonares se retraíram para 26 mm x 19 mm x 21 mm, os linfonodos retroperitoneais diminuíram de tamanho até 4 a 5 mm, não foi observada ascite na cavidade abdominal, e a massa tumoral diminuiu na pelve para 38 mm x 41 mm x 48 mm.
[0216] O tratamento continuou com dois cursos de injeção intramuscular de STR14CB5 (Coxsackievírus B5) 1x10 8 I.E. e dois cursos de injeções intravenosas de STR14CB5 (Coxsackievírus B5) 2x108 I.E. em perfusão de 200 mL, por 40 minutos. Tomografia Computadorizada apresentou substancial dinâmica positiva. As metástases pulmonares diminuíram para 15 mm x 10 mm, os nódulos retroperitoneais não se tornaram visíveis na Tomografia Computadorizada. As massas tumorais na pelve reduziram para 16 mm x 17 mm. A condição está estável.
EXEMPLO 27
[0217] Paciente T.D., uma mulher de 39 anos de idade, foi diagnosticada (três anos atrás) com adenocarcinoma de cólon localizado na região da curvatura esquerda, T4N2bM0. A paciente foi submetida a hemicolectomia lateral esquerda assistida por laparoscopia seguida por oito cursos de quimioterapia adjuvante (esquema FOLFOX), os quais foram ineficazes. A doença progrediu. Tecidos tumorais metabolicamente ativos foram encontrados tanto na região do tumor primário em como adicionalmente na cauda do pâncreas e no rim esquerdo. As metástases se espalharam para o ovário esquerdo, desenvolveu-se carcinomatose do peritônio e ascite.
[0218] Um ano atrás, 200 mL de fluido ascítico foi coletado (contagem celular ~ 4x104 células/mL), células tumorais foram isoladas e testadas para sensibilidade a vírus. As células tumorais pareceram ser altamente sensíveis às cepas Sabin de Poliovírus (tipos 1,2,3), STR6E7 (Echovírus 7) e STR7E12 (Echovírus 12), STR15CB6 (Coxsackievírus B6), STRNH1 (vírus da doença de Newcastle, cepa H), e vírus do sarampo (cepa da vacina Edmonston); moderadamente sensíveis a: STR14CB5 (Coxsackievírus B5), STRS1 (Sendai vírus) e STR8CA7 (Coxsackievírus A7); e tiveram baixa sensibilidade a STR4E1 (Echovírus 1), STRR1 (Reovírus 1) e STRR2 (Reovírus 2).
[0219] Ao mesmo tempo (um ano atrás), a paciente foi submetida a uma cirurgia de seguimento, isto é, remoção do tumor recorrente, ressecção do rim esquerdo e da glândula adrenal, ressecção distal do pâncreas, ressecção do baço, ressecção de ambas as trompas de Falópio e dos ovários, e ressecção do omento maior. A cirurgia foi seguida por nove cursos de quimioterapia XELOX que foi aplicada como se segue: uma vez em 21 dias, oxaliplatina 120 mg/m 2 e capecitabina 2000 mg/m2 por via oral nos dias 1 e 14. A quimioterapia foi mal tolerada, com sinais de neuropatia e reações eméticas substanciais. A doença progrediu.
[0220] Seis meses atrás, a terapia viral se iniciou com injeção intramuscular de uma mistura de STR7E12 (Echovírus 12) e STR15CB6 (Coxsackievírus B6), 2x108 I.E. cada. A reação foi um aumento da temperatura (37,5°C a 38,0°C) 22 horas depois da injeção, alguma cefaleia e calafrios (duraram por 2 a 3 horas, ambos foram reduzidos por aspirina e ibuprofeno). Após isso foi seguido um protocolo de tratamento mais agressivo com administração intravenosa de vírus duas vezes por semana por 7 semanas STR7E12 (Echovírus 12) e STR15CB6 (Coxsackievírus B6), 2x108 I.E. perfusão i.v. em 200 mL por 20 minutos.
[0221] Foi realizado exame por Tomografia computadorizada multi espiral depois de um mês de terapia viral. Tórax: C2, pulmão direito, poucos focos de 7, 10, 12 mm, contornos menos claros comparados com exame anterior antes do tratamento com o vírus. С6, pulmão direito - 8 mm; Pulmão esquerdo, paraortal em lobo superior (C3 - até C1) 14 mm x 15 mm, nenhuma dinâmica. Visível normalização do padrão do tecido pulmonar (anteriormente foi intensificado) e alguma redução no tamanho de focos vistos anteriormente - C2, direita - de 4 mm a 2 mm, C10 - como um trecho fibroso; outros focos não são claramente visíveis. Nenhuma formação de novos focos. O volume do pulmão foi preservado, a área pulmonar foi simétrica, e a traqueia e os brônquios não foram obstruídos e não foram deformados. Não foi encontrado líquido livre na região pleural, e a pleura foi de espessura normal. Foi revelada uma pequena acumulação de líquido no lúmen pericárdico, próximo ao ápex cardíaco. O mediastino foi de estrutura normal. No mediastino e nas raízes dos pulmões, foram vistos linfonodos solitários de até 8 mm. Todos os grupos de linfonodos foram diminuídos de tamanho até valores virtualmente normais. No abdômen, o fígado foi de tamanho normal, com um contorno liso e claro. Em C2, C4, C5, C6, foram localizados pequenos focos hipodensos com densidade de líquido, claro contornado, de até 10 mm. Eles não acumularam uma substância contrastante, nenhuma dinâmica, e nenhuma formação de novos focos. Em C7 no fígado nas fases arterial e venosa foi visível uma zona hipodensa, com contorno irregular de até 4 a 6 mm, nenhuma dinâmica, sem novos focos. Os vasos biliares intra- e para-hepáticos não estavam dilatados. A vesícula biliar tinha um contorno regular e paredes de espessura normal. Foi vista uma formação de formato redondo e regular com um centro hipodenso, de 15 mm, na região do tecido parapancreático, não apresentando nenhuma dinâmica exceto um centro hipodenso mais pronunciado. Não foi vista ascite na região abdominal. Os linfonodos na região da pequena curva do estômago tinham até 8 mm (diminuíram) e nas portas hepáticas tinham até 10 mm (diminuíram). A conclusão foi que a terapia viral resultou em estabilização e dinâmica positiva.
[0222] A terapia viral foi continuada. Foi aplicado um coquetel de Poliovírus 1 (cepa Sabin) e STR6E7 (Echovírus 7), 2x108 I.E, injeções i.m. (semanais). A reação a este coquetel foi alguns califrios, fadiga, um aumento da temperatura até 37,2°C a 37,6°C depois da primeira administração. A condição melhorou mais. O paciente está estável. Uso Veterinário de STRS
[0223] As doenças malignas são as principais causas de mortes de cães e gatos idosos. Alguns dos vírus oncolíticos do painel testado podem infectar de modo eficaz as céluas de origem canina e felina. Estes vírus oncolíticos incluem a cepa de Sendai vírus STRS1, a cepa do vírus da doença de Newcastle STRNH1, a cepa do vírus da cinomose canina STRCDV1 (desenvolvida com base em uma cepa de vacina viva do CDV), os reovírus Tipo 1, 2 e 3 STRR1, STRR2, e STRR3. Estas cepas foram testadas em uma clínica veterinária para o tratamento de cães e gatos domésticos.
[0224] Carcinoma de mastócitos é um dos tumores mais comuns e letais em cães. Os tumores podem ser localizados por via subcutânea e são facilmente acessíveis por cirurgia. No entanto, depois de remoção cirúrgica, tendem a resultar em metástases crescendo muito agressivamente, tanto na região do tumor primário quanto mais distante.
[0225] De modo a testar se vírus oncolíticos podem ser usados para o tratamento, foram utilizados vírus oncolíticos STRS1 e STRR1. EXEMPLO 28
[0226] Hersh, um Poodle de 13 anos de idade, foi diagnosticado com mastocitoma na região da pata dianteira. O tumor estava crescendo rapidamente (da medida de 5 mm x 5 mm até 25 mm x 30 mm durante três semanas). O tumor foi removido cirurgicamente. Iniciando no dia 14, foi detectado crescimento tumoral maligno na região da sutura cirúrgica. A região tumoral foi injetada por via subcutânea com STRS1 concentrado, com intervalos de 5 min. Foi administrado um total de 15 injeções, 0,2 mL cada (2 x 108 I.E. por mL),. O crescimento tumoral foi interrompido, e por volta do dia 14, não houve traços visíveis de massas tumorais. A sutura se curou de maneira eficaz sem crescimento adicional do tumor durante os próximos 8 meses. EXEMPLO 29
[0227] Istra, um Shar Pei de 11 anos de idade, foi diagnosticado com mastocitoma na região traseira esquerda. O tumor estava crescendo rapidamente (34 mm x 56 mm), e não foi considerada cirurgia. O tumor foi injetado em 10 regiões diferentes com 2 mL de STRS1. A pele em torno também foi injetada com STRS1 (0,2 mL por injeção) para um total de 12 injeções. Houve dilatação do tumor dois dias depois das injeções. A dilatação retrocedeu 10 dias depois das injeções. Não houve nenhuma redução substancial do tamanho do tumor, mas o tumor interrompeu seu crescimento. Quatro meses depois da injeção, o tumor foi ressecado e examinado. O tecido continha principalmente regiões de fibrose com algumas células arredondadas atípicas. Não foram observadas recidivas de crescimento tumoral durante os cinco meses seguintes. EXEMPLO 30
[0228] Foram observados vinte e sete casos de carcinoma de mastócitos em cães. Depois da experiência inicial com tumores de mastócitos em cães, foram observados uns poucos outros casos de tumor de mastócitos para os quais foi aplicado tratamento com STRS1. Do total de 27 casos de carcinoma de mastócitoss, 15 casos apresentaram cura da doença estável e livre de recidiva por mais de um ano depois de três injeções quinzenais de STRS1. Cinco cães representaram casos terminais com disseminação sistêmica de células tumorais, nos quais os proprietários eventualmente decidiram pela eutanásia. Sete casos para avaliação de longa duração não foram rastreáveis. EXEMPLO 31
[0229] Foram observados quatorze casos de carcinoma de mastócitos em gatos. Dez casos representaram tumores de mastócitos localizados por via subcutânea, e quatro casos foram estágios terminais com disseminação sistêmica do tumor. Em casos de tumores localizados, os tumores e as regiões em torno foram injetados três vezes com STRS1 concentrado a cada duas semanas. Oito gatos do grupo tiveram uma resposta positiva sem progressão adicional da doença por no mínimo seis meses. Dois gatos não responderam ao tratamento e pereceram. Dos quatro casos com disseminação sistêmica de tumores de mastócitos, dois tiveram respostas parciais com crescimento recorrente durante os seguintes dois meses. Destes, um gato (uma fêmea de 8 anos de idade) foi injetado com STRR1 em todos os seis tumores visíveis. O crescimento tumoral foi interrompido por no mínimo um mês. O destino do gato é desconhecido.
EXEMPLO 32
[0230] Jack, um Terrier de 14 anos de idade, foi diagnosticado com osteossarcoma do membro traseiro direito, o qual foi removido. Foi observado crescimento recorrente um mês depois da cirurgia. O sítio tumoral foi injetado com 5 mL de STRS1 concentrado. No total, cinco injeções infiltraram o sítio em torno do tumor. Houve tumefação do membro persistente por três dias com um aumento local aparente na temperatura. Exame por ultrassom três semanas depois da injeção revelou estabilização do processo e alguma retração do tumor. O crescimento tumoral retornou 64 dias depois da injeção. A região tumoral foi injetada com 5 mL de STRR1 concentrado (2 x 10 8 I.E. por mL). Houve novamente tumefação do membro persistente por três dias. Exame por ultrassom duas semanas depois da injeção revelou uma estabilização do processo. Não houve recidiva pelos próximos dois meses. EXEMPLO 33
[0231] Mura, um gato de 9 anos de idade, foi diagnosticado com carcinoma mamário com disseminação local, o qual foi removido cirurgicamente. Foi observado crescimento recorrente dois meses depois da cirurgia. A região do tumor foi injetada com coquetel de vírus concentrado contendo STRS1, STRNH1 e STRR1. Houve local tumefação persistente por uma semana. O crescimento tumoral foi interrompido, e não houve recidiva por no mínimo dois meses.
DISCUSSÃO
[0232] Em geral, Coxsackievírus A7/STR8СA7; Coxsackievírus B5/STR14СВ5; e Coxsackievírus B6/STR15СВ6 apresentaram um efeito terapêutico positivo sobre o crescimento tumoral.
[0233] Conforme mostrado nas Figuras 1A a 1C, vírus que replicam fracamente não apresentam atividade oncolítica em tumores de xenoenxerto derivados a partir das mesmas células em camundongos nude. Em contraste, vírus que apresentam forte atividade de replicação em tumores de xenoenxerto são capazes de destruir tumores de xenoenxerto. Ou seja, conforme visto na Figura 1A, a aplicação de Coxsackievírus A7/STR8СA7 a tumores de xenoenxerto de células C33A resultou em volumes tumorais significativamente menores durante um período de 50 dias do que ou o controle (células C33A isoladas) ou Coxsackievírus B3 aplicado a células C33A. De modo similar, conforme visto na Figura 1B, a aplicação de Coxsackievírus B4 a tumores de xenoenxerto de células AsPC1 resultou em volumes tumorais significativamente menores durante um período de 50 dias do que ou o controle (células AsPC1 isoladas) ou Coxsackievírus A7 aplicado a células AsPC1. Além disso, conforme mostrado na Figura 1C, Echovírus 1 apresentou maior eficácia quando aplicado a células MCF7 do que ou o controle (células MCF7 isoladas) ou Coxsackievírus B6/STR15СВ6 aplicado a células MCF7.
[0234] Estes resultados indicam que vírus específicos têm efeitos específicos dependendo do tipo de célula / tumor ao qual os vírus são administrados, indicando que existe uma necessidade de determinar a sensibilidade específica do paciente de modo a determinar quais vírus devem ser administrados.
[0235] A sensibilidade específica do paciente pode ser uma medida tomada em uma base de comparação. Amostras de tumor apresentando sensibilidade a um vírus humano em particular podem produzir até 106 a 107 TCID50 por mL. No entanto, um vírus pode apresentar maior TCID50 por mL do que outro vírus, indicando uma maior sensibilidade a um vírus. Uma comparação semelhante proporcionar um meio não somente para selecionar quais tipos de vírus únicos podem ser selecionados mas se estes podem ser usados em um painel de vírus.
[0236] Conforme discutido acima, os painéis de vírus podem ser administrados sequencialmente ou simultaneamente. A eficiência do uso simultâneo de misturas de vírus é demonstrada em experimentos de xenoenxertos em camundongos nude carregando tumores derivados a partir da linhagem celular de carcinoma cervical humano C33A e injetados com vírus únicos apresentando diferentes capacidades de propagação nas células e misturas de dois ou três vírus (Figura 2). Conforme mostrado, o painel mais eficaz sobre células A431 foi o de Echovírus 12 com Coxsackievírus B5 e Coxsackievírus B6. Na verdade, estes vírus oncolíticos demonstraram um efeito adicional sobre células A431. O Echovírus 12 resultou no efeito único mais terapêutico com respeito a retardar o volume tumoral durante 50 dias; no entanto, este efeito foi agravado com a adição do Coxsackievírus, o qual também apresentou um efeito agravado comparado com o Coxsackievírus B5 e o Coxsackievírus B6 isolados.
[0237] Os exemplos descritos acima também indicam que a bio- seleção de vírus e a indução de mutagênese pode resultar em vírus que não apresentam neutralização cruzada com antissoros. Uma técnica semelhante também pode ser aplicada de modo a bio-selecionar vírus oncolíticos que a) não iriam interagir uns com os outros e b) não iriam interagir com outras terapias do câncer, tais como quimioterapia, radiação, terapia medicamentosa, etc.
[0238] A fabricação de medicamentos (direcionados) sintéticos / sistêmicos (STRs) tem resultado eficaz nos tratamentos de tumor tanto em seres humanos quanto em animais. Com relação à aplicação de vírus oncolíticos em seres humanos, os efeitos dos vírus administrados foram específicos dos tumores. Por exemplo, adenocarcinoma de uraco foi altamente suscetível a STRS1, STRR1, STRMESC1, STR4E1, STR7E12, STR14CB5, STR15CB6, e resistente a STR8CA7. No entanto, adenocarcinoma acinar de próstata apresentou suscetibilidade para a cepa de Sendai vírus STRS1 isolada, deste modo indicando a criticidade de selecionar de vírus oncolíticos específicos para o câncer e para o paciente, de modo a obter os tratamentos mais eficazes.
[0239] Com respeito a aplicações veterinárias, STRS1 e STRR1 apresentaram importante eficácia de redução do crescimento tumoral e recidiva. Injeções quinzenais tanto em cães quanto em gatos resultou em massas tumorais severamente reduzidas bem como na formação de fibrose (tecido cicatricial).
[0240] Apesar de terem sido descritas modalidades particulares, alternativas, modificações, variações, aprimoramentos, e equivalentes substanciais que sejam ou possam ser presentemente não previstos podem surgir para os requerentes ou para outros peritos na arte. Por conseguinte, pretende-se que as reivindicações anexadas conforme registrado e conforme possam ser emendadas englobem todas as referidas alternativas, modificações, variações, aprimoramentos, e equivalentes substanciais.

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES
1. Uso de um primeiro vírus oncolítico, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma primeira composição para tratamento de um paciente com câncer em combinação com uma segunda composição contendo um segundo vírus oncolítico que é diferente do primeiro vírus oncolítico.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda composição é administrada entre 24 horas a 24 semanas depois da primeira composição ser administrada, preferencialmente em que a segunda composição é administrada entre uma semana a seis semanas depois da primeira composição ser administrada.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira composição é administrada múltiplas vezes durante o primeiro período de tempo; e em que a segunda composição é administrada múltiplas vezes durante o segundo período de tempo.
4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda composições são administradas por via oral, por via nasal, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intradérmica, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via intrapleural, por via intravaginal, por via intrauretral, por via intratumoral, por via intracraniana, por via intraespinhal, ou por meio de um veículo celular infectado com o primeiro ou o segundo vírus oncolítico in vitro.
5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo vírus oncolíticos estão presentes em uma dosagem de 1 x 104 TCID50 a 1 x 1011 TCID50.
6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo vírus oncolíticos diferem em seu receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula, preferencialmente em que o receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula é CD155, integrina 2β1, integrina Vβ3, integrina Vβ6, ICAM-1, CD55, CXADR, CD46, JAM-1, PVRL1, PVRL4, CD150, L-SIGN, VLDVR, NRAMP2, ácido siálico, PGSL-1 (aka CD162), SCARB2 (receptor de varredura classe B, membro 2), anexina II, DC-SIGN (molécula não integrina, captadora da molécula de adesão intercelular 3 (ICAM3) e específica das células dendríticas), hPVR (receptor de poliovírus humano), CD34+, LDLR (Receptor de lipoproteínas de baixa densidade), JAM (Molécula de adesão juncional), ou sulfato de heparina.
7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda composições cada uma contém uma pluralidade de vírus oncolíticos.
8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro vírus oncolítico e o segundo vírus oncolítico são selecionados de modo independente entre um enterovírus humano; um reovírus; um paramixovírus; um rabdovírus; um togavírus; um Herpes vírus; um parvovírus; um adenovírus; um poxvírus; e um vírus híbrido.
9. Uso de um primeiro vírus oncolítico e um segundo vírus oncolítico, caracterizado pelo fato de que é para preparar uma composição para tratamento de um paciente com câncer, em que o primeiro e o segundo vírus oncolíticos diferem em seu receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que (i) a primeira composição é administrada múltiplas vezes durante o primeiro período de tempo; (ii) a primeira composição é administrada por via oral, por via nasal, por via intravenosa, por via intra-arterial, por via intradérmica, por via subcutânea, por via intramuscular, por via intraperitoneal, por via intrapleural, por via intravaginal, por via intrauretral, por via intratumoral,
por via intracraniana, por via intraespinhal, ou por meio de um veículo celular infectado com o primeiro ou o segundo vírus oncolítico in vitro; (iii) o primeiro e o segundo vírus oncolíticos estão cada um presentes em uma dosagem de 1 x 104 TCID50 a 1 x 1011 TCID50; (iv) o receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula do primeiro vírus oncolítico e um segundo vírus oncolítico é selecionado de modo independente entre CD155, integrina 2β1, integrina Vβ3, integrina Vβ6, ICAM-1, CD55, CXADR, CD46, JAM-1, PVRL1, PVRL4, CD150, L-SIGN, VLDVR, NRAMP2, ácido siálico, PGSL-1 (aka CD162), SCARB2 (receptor de varredura classe B, membro 2), anexina II, DC-SIGN (molécula não integrina, captadora da molécula de adesão intercelular 3 (ICAM3) e específica das células dendríticas), hPVR (receptor de poliovírus humano), CD34+, LDLR (Receptor de lipoproteínas de baixa densidade), JAM (Molécula de adesão juncional), ou sulfato de heparina; e/ou (v) o primeiro vírus oncolítico e o segundo vírus oncolítico são selecionados de modo independente entre um enterovírus humano; um reovírus; um paramixovírus; um rabdovírus; um togavírus; um Herpes vírus; um parvovírus; um adenovírus; um poxvírus; e um vírus híbrido.
11. Composição, caracterizada pelo fato de que contém uma quantidade eficaz de pelo menos um primeiro vírus oncolítico e um segundo vírus oncolítico, sendo que o primeiro e o segundo vírus oncolíticos diferem em seu receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro e o segundo vírus oncolíticos estão cada um presentes em uma dosagem de cerca de 5 x 107 TCID50 até cerca de 2 x 108 TCID50.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 11,
caracterizada pelo fato de que o receptor da superfície celular do hospedeiro requerido para entrada na célula do primeiro vírus oncolítico e um segundo vírus oncolítico é selecionado de modo independente dentre CD155, integrina 2β1, integrina Vβ3, integrina Vβ6, ICAM-1, CD55, CXADR, CD46, JAM-1, PVRL1, PVRL4, CD150, L-SIGN, VLDVR, NRAMP2, ácido siálico, PGSL-1 (aka CD162), SCARB2 (receptor de varredura classe B, membro 2), anexina II, DC-SIGN (molécula não integrina, captadora da molécula de adesão intercelular 3 (ICAM3) e específica das células dendríticas), hPVR (receptor de poliovírus humano), CD34+, LDLR (Receptor de lipoproteínas de baixa densidade), JAM (Molécula de adesão juncional), ou sulfato de heparina.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o primeiro vírus oncolítico e o segundo vírus oncolítico são selecionados de modo independente dentre um enterovírus humano; um reovírus; um paramixovírus; um rabdovírus; um togavírus; um Herpes vírus; um parvovírus; um adenovírus; um poxvírus; ou um vírus híbrido.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos o primeiro vírus oncolítico é um vírus direcionado sintético.
16. Invenção, caracterizada por qualquer uma de suas modalidades ou quaisquer categorias aplicáveis de reivindicação, por exemplo, produto, processo ou uso englobado pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.
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