BR112019015514A2 - mutantes de tata-box e caat-box seletivos de tumor - Google Patents

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R Reid Tony
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Abstract

a presente invenção refere-se, por exemplo, a um vírus re-combinante compreendendo (i) um promotor à base de tata box modificado e/ou (ii) um promotor à base de caat box modificado operacionalmente ligado a um gene, em que o promotor à base de tata box modificado e/ou promotor à base de caat box modificado não possui um tata box funcional e/ou caat box e permitem expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa. os vírus recombinantes podem ser usados para tratar doenças e distúrbios proliferativos celulares, incluindo determinadas formas de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MUTANTES DE TATA-BOX E CAAT-BOX SELETIVOS DE TUMOR. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001 ] O presente pedido reivindica o benefício de e prioridade para Pedido de Patente Provisório dos EUA número de série 62/452.075, depositado em 30 de janeiro de 2017, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] O campo da invenção é virologia e biologia molecular, especificamente vírus modificados que preferencialmente infectam células de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativas.
Antecedentes [0003] Apesar de amplo conhecimento sobre os mecanismos moleculares subjacentes que causam o câncer, os cânceres mais avançados permanecem incuráveis com os protocolos de quimioterapia e radiação atuais. Os vírus oncolíticos surgiram como uma tecnologia de plataforma que tem o potencial de aumentar significativamente o tratamento padrão atual para uma variedade de malignidades (Kumar,
S. et al. (2008) CURRENT OPINION IN MOLECULAR TERAPEUTICS 10(4):371-379; Kim, D. 2001, EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY 1 (3):525-538; Kim D. (2000) ONCOGENE 19(56):66606669). Esses vírus se mostraram promissores como agentes oncolíticos que não apenas destroem diretamente as células malignas por meio de uma reação em cadeia de infecção-reprodução-lise, mas também indiretamente induzem a imunidade antitumoral. Essas propriedades imunoestimuladoras foram aumentadas com a inserção de transgenes terapêuticos que são copiados e expressos a cada vez que o vírus se replica.
[0004] Os vírus oncolíticos previamente desenvolvidos incluem o adenovirus de serótipo 5 oncolítico (Ad5), referido como TAV-255, que
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2/62 é atenuado transcricionalmente em células normais, mas é transcricionalmente ativo em células de câncer (ver, Publicação PCT NQ W02010/101921). Acredita-se que o mecanismo pelo qual o vetor TAV255 atinge essa seletividade tumoral seja através da deleção direcionada de três sítios de ligação ao fator transcricional (TF) para os fatores de transcrição Pea3 e E2F, proteínas que regulam a expressão de adenovirus de E1a, o primeiro gene a ser transcrito após a entrada do vírus na hospedeira de célula, através da ligação a sequências de DNA específicas.
[0005] Apesar dos esforços até o momento, existe uma necessidade de vírus oncolíticos melhorados que, em particular, apresentem replicação seletiva de tumores, lise mediada por vírus e/ou expressão transgênica para o tratamento de cânceres e distúrbios hiperproliferativos em pacientes humanos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que, para determinados promotores virais, o TATA e/ou CAAT box, embora necessários para conduzir a transcrição em células saudáveis normais, são dispensáveis para transcrição ativa em células cancerosas.
[0007] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo:
[0008] (i) um promotor à base de TATA box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa; e/ou (ii) um promotor à base de CAAT box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
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3/62 [0009] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo um promotor à base de TATA box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0010] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo um promotor à base de CAAT box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0011] Em determinadas modalidades de quaisquer dos vírus recombinantes acima, o vírus recombinante é selecionado de um vírus vaccinia recombinante, adenovirus, vírus adenoassociado (AAV), herpes vírus simples 1 (HSV1), vírus do mioxoma, reovírus, poliovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus do sarampo (MV), e vírus da doença de Newcastle (NDV). Em determinadas modalidades, o vírus recombinante é um adenovirus, por exemplo, um adenovirus tipo 5 (Ad5) ou um adenovirus tipo 35 (Ad35), por exemplo, um adenovirus tipo 5. Em determinadas modalidades, o promotor à base de TATA box modificado e/ou o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor de gene da fase precoce, por exemplo, um promotor E1a, promotor E1b ou promotor E4, por exemplo, um promotor E1a.
[0012] Em determinadas modalidades de quaisquer dos vírus recombinantes acima, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de todo o TATA box. Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -27 a -24, -31 a -24, -44 a +54, ou -146 a +54 do promotor E1a do adenovirus tipo 5, que correspondem,
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4/62 respectivamente, aos nucleotídeos 471 a 474, 467 a 474, 454 a 551, e 352 a 551 da SEQ ID NQ: 2, e aos nucleotídeos 472 a 475, 468 a 475, 455 a 552, e 353 a 552 da SEQ ID NQ: 8.
[0013] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -29 a -26, -33 a -26, -44 a +52, ou -148 a +52 do promotor E1a do adenovirus tipo 5. Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente aos nucleotídeos 471 a 475, 467 a 475, 446 a 551 e 352 a 551 da SEQ ID NQ: 2.
[0014] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, e o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -27 a -24, -31 a -24, -44 a +54, ou -146 a +54 do promotor E1a do adenovirus tipo 5, que correspondem, respectivamente, aos nucleotídeos 471 a 474, 467 a
474, 454 a 551 e 352 a 551 da SEQ ID NQ: 2, e aos nucleotídeos 472 a
475, 468 a 475, 455 a 552, e 353 a 552 da SEQ ID NQ: 8.
[0015] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, e o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -29 a -26, -33 a -26, -44 a +52, ou -148 a +52 do promotor E1a do adenovirus tipo 5 ou uma deleção de nucleotídeos correspondente aos nucleotídeos 471 a 475, 467 a 475, 446 a 551 e 352 a 551 da SEQ ID NQ: 2.
[0016] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, e o vírus compreende uma deleção de polinucleotídeos que resulta em um adenovirus tipo 5 recombinante compreendendo a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12) ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13), que resultam da junção das duas sequências de polinucleotídeos que de outra forma flanqueariam a sequência de polinucleotídeos excluída.
[0017] Em determinadas modalidades de quaisquer dos vírus
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5/62 recombinantes acima, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de todo o CAAT box. Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -76 a -68 do promotor E1a do adenovirus tipo 5, que corresponde aos nucleotídeos 422 a 430 da SEQ ID NQ: 2 e aos nucleotídeos 423 a 431 da SEQ ID NQ: 8.
[0018] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, e o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a -76 a -68 do promotor E1a do adenovirus tipo 5, que corresponde aos nucleotídeos 422 a 430 da SEQ ID NQ: 2 e aos nucleotídeos 423 a 431 da SEQ ID NQ: 8.
[0019] Em determinadas modalidades de quaisquer dos vírus recombinantes acima, o vírus compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NQ: 3, SEQ ID NQ: 15, SEQ ID NQ: 16, SEQ ID NQ: 17, SEQ ID NQ: 20, SEQ ID NQ: 21, SEQ ID NQ: 22, ou SEQ ID NQ: 23, ou uma sequência tendo 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à SEQ ID NQ: 3, SEQ ID NQ: 15, SEQ ID NQ: 16, SEQ ID NQ: 17, SEQ ID NQ: 20, SEQ ID NQ: 21, SEQ ID NQ: 22 ou SEQ ID NQ: 23.
[0020] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, e o vírus compreende uma deleção de polinucleotídeos que resulta em um adenovirus tipo 5 recombinante compreendendo a sequência TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14), que resulta da junção das duas sequências de polinucleotídeos que de outra forma flanqueariam a sequência de polinucleotídeos excluída.
[0021] Em determinadas modalidades de quaisquer dos vírus recombinantes acima, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a 477 a 484 do genoma Ad35.
[0022] Em determinadas modalidades, quaisquer dos vírus
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6/62 recombinantes acima podem ainda compreender uma sequência de nucleotídeos codificando um transgene terapêutico. O transgene terapêutico pode codificar um polipeptídeo terapêutico, por exemplo, um agente apoptótico, anticorpo, peptídeo responsive a CTL, citocina, agente citolítico, agente citotóxico, enzima, antígeno heterólogo expresso na superfície de uma célula tumoral para gerar uma resposta imune, agente imunoestimulador ou imunomodulador, interferon, peptídeo lítico, oncoproteína, polipeptídeo que catalisa processos que levam à morte celular, polipeptídeo que complementa defeitos genéticos em células somáticas, proteína de supressão tumoral, antígeno de vacina, e quaisquer combinações dos mesmos. O transgene terapêutico pode codificar um ácido nucleico terapêutico, por exemplo, um RNA antissenso ou uma ribozima. Em determinadas modalidades, o transgene terapêutico é selecionado de acetilcolina, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-1, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-L1, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, interferon-gama, TGF-β, um TGF-β trap, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53, e timidina quinase. Em determinadas modalidades, o transgene terapêutico é um TGF-β trap. Em determinadas modalidades, o vírus recombinante compreende um sítio de iniciação de E1 b-19K e E1 b-55K, e a sequência de nucleotídeos codificando o transgene terapêutico é inserida entre o sítio de iniciação de E1b-19K e o sítio de iniciação de E1b-55K.
[0023] Em determinadas modalidades, quaisquer dos vírus recombinantes acima podem compreender uma deleção de pelo menos um sítio de ligação de Pea3, ou uma porção funcional desta.
[0024] Em determinadas modalidades, quaisquer dos vírus recombinantes acima podem seletivamente replicar em uma célula hiperproliferativa e/ou uma célula de paragem de não crescimento. Em
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7/62 determinadas modalidades, quaisquer dos vírus recombinantes acima podem seletivamente expressar E1a, E1b e/ou um transgene terapêutico em uma célula hiperproliferativa e/ou uma célula de paragem de não crescimento. Em determinadas modalidades, quaisquer dos vírus recombinantes acima podem seletivamente ter atividade citolítica em uma célula hiperproliferativa e/ou uma célula de paragem de não crescimento.
[0025] A célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa pode ser uma célula cancerosa, célula endotelial, célula epidérmica, fibroblasto e/ou célula imune. A célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa pode ser uma célula cancerosa, por exemplo, uma célula de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer testicular ou câncer de tireoide.
[0026] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo qualquer sequência reguladora viral excluída ou modificada que permite a expressão seletiva do vírus em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0027] Em outro aspecto, a invenção provê uma composição
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8/62 farmacêutica compreendendo qualquer um ou uma combinação dos vírus recombinantes acima e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0028] Em outro aspecto, a invenção provê um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa em um indivíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um vírus recombinante descrito neste documento para tratar a doença hiperproliferativa no indivíduo. Em determinadas modalidades, a doença hiperproliferativa é selecionada de câncer, aterosclerose, artrite reumatoide, psoríase, lúpus, fibrose pulmonar idiopática, hipertensão pulmonar por esclerodermia, asma, fibrose renal, COPD, fibrose cística, DIP, UIP, degeneração macular, restenose, retinopatias, distúrbios de fibroblastos hiperproliferativos, esclerodermia, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrosclerose maligna, síndromes de microangiopatia trombótica, rejeição a transplante, glomerulopatias e cirrose.
[0029] Em determinadas modalidades, a doença hiperproliferativa é câncer. Em determinadas modalidades, o câncer é selecionado de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer
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9/62 testicular e câncer de tireoide.
[0030] Em outro aspecto, a invenção provê um método de inibição de crescimento tumoral em um indivíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um vírus recombinante descrito neste documento para inibir proliferação da célula tumoral.
[0031] Em outro aspecto, a invenção provê um método de inibição de proliferação de uma célula tumoral. O método compreende a exposição da célula a uma quantidade eficaz de um vírus recombinante descrito neste documento para inibir a proliferação da célula tumoral.
[0032] Em cada um dos métodos acima, o vírus recombinante pode, por exemplo, ser administrado em combinação com uma ou mais terapias selecionadas de cirurgia, radiação, quimioterapia, imunoterapia, terapia hormonal e viroterapia. Em cada um dos métodos acima, a quantidade eficaz do vírus recombinante pode compreender, por exemplo, 102-1015 unidades de formação de placa (pfus). Em cada um dos métodos acima, o indivíduo pode, por exemplo, ser um ser humano, por exemplo, um ser humano pediátrico, ou um animal.
[0033] Em cada um dos métodos acima, a quantidade eficaz do vírus recombinante pode, por exemplo, ser identificada pela medição de uma resposta imune a um antígeno no indivíduo. Em determinadas modalidades, a resposta imune ao antígeno é medida injetando no indivíduo o antígeno em um sítio de injeção na pele do indivíduo e medindo o tamanho de uma induração no sítio de injeção.
[0034] Em outro aspecto, a invenção provê um método de expressão de um transgene terapêutico em uma célula-alvo. O método compreende a exposição da célula-alvo a uma quantidade eficaz do vírus recombinante descrito neste documento para expressar o transgene-alvo.
[0035] Em outro aspecto, a invenção provê um método de
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10/62 desenvolvimento de um vírus oncolítico. O método compreende modificar um promotor à base de TATA box viral operativamente ligado a um gene, tal que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. [0036] Em outro aspecto, a invenção provê um método de desenvolvimento de um vírus oncolítico. O método compreende modificar um promotor à base de CAAT box viral operativamente ligado a um gene, tal que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. [0037] Em outro aspecto, a invenção provê um método de desenvolvimento de um vírus oncolítico. O método compreende modificar um promotor à base de TATA box viral operativamente ligado a um gene, tal que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa, e/ou modificar um promotor à base de CAAT box viral operativamente ligado a um gene, tal que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0038] Em outro aspecto, a invenção provê um ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NQ: 3, SEQ ID NQ: 15, SEQ ID NQ: 16, SEQ ID NQ: 17, SEQ ID NQ: 20, SEQ ID NQ: 21, SEQ ID NQ: 22 ou SEQ ID NQ: 23, ou uma sequência tendo 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à SEQ ID NQ: 3, SEQ ID NQ: 15, SEQ ID NQ: 16, SEQ ID NQ: 17, SEQ ID NQ: 20, SEQ ID NQ: 21, SEQ ID NQ: 22 ou SEQ ID NQ: 23. Em determinadas modalidades,
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11/62 o ácido nucleico isolado compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NQ: 4. A invenção provê células hospedeiras compreendendo um ou mais dos ácidos nucleicos acima.
[0039] Em outro aspecto, a invenção provê um método de produção de um vírus recombinante. O método compreende: (a) cultivar uma ou mais das células hospedeiras acima sob condições de modo que a célula hospedeira produza o vírus recombinante; e (b) purificar o vírus recombinante.
[0040] Esses e outros aspectos e vantagens da invenção são ilustrados pelas figuras, descrição detalhada e reivindicações que seguem.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0041] A invenção pode ser mais completamente compreendida com referência aos seguintes desenhos.
[0042] A Figura 1A apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-A350 (que inclui deleções de ambos o TATA box e o CAAT box) até o códon inicial do gene E1a. O sítio da deleção de 200 nucleotídeos da sequência adenoviral de tipo selvagem é representado com um hífen. A Figura 1B apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-TATA até o códon inicial do gene E1a. O sítio da deleção de 8 nucleotídeos da sequência adenoviral de tipo selvagem é representado com um hífen. A Figura 1C apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-CAAT até o códon inicial do gene E1a. O sítio da deleção de 9 nucleotídeos da sequência adenoviral de tipo selvagem é representado com um hífen. A Figura 1D apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-CAAT-TATA até o códon inicial do gene E1a. O sítio das deleções de 8 nucleotídeos e 9 nucleotídeos da sequência adenoviral de tipo selvagem são representados com hífens. A Figura 1E apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-CAAT-mTATA até o códon inicial
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12/62 do gene E1a. O sítio das deleções de 4 nucleotideos e 9 nucleotideos da sequência adenoviral de tipo selvagem são representados com hífens. A Figura 1F apresenta a sequência de nucleotideos da terminação 5’ de Ad5 de tipo selvagem até o códon inicial do gene E1a. O CAAT box (GGTCAAAGT) e TATA box (TATTTATA) são indicados com caixas.
[0043] A Figura 2A apresenta um Western blot mostrando níveis de expressão de E1 a em células Panc-1 cancerosas nos horários indicados após a infecção com Ad-A350 ou Ad-TAV-255. A Figura 2B apresenta um Western blot mostrando níveis de expressão de E1 a em células Wl38 não cancerosas nos horários indicados após a infecção com AdΔ350 ou Ad-TAV-255. L representa ladder e CN representa controle não infectado.
[0044] A Figura 3A apresenta um Western blot mostrando níveis de expressão de E1a em células Panc-1 cancerosas 72 horas após a infecção com Ad-A350 ou Ad-TAV-255 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 ou 5. A Figura 3B apresenta um Western blot mostrando níveis de expressão de E1 a em células A549 cancerosas 72 horas após a infecção com Ad-A350 ou Ad-TAV-255 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 ou 5. L representa progressão e CN representa controle não infectado.
[0045] A Figura 4A apresenta coloração com violeta cristal de células HCT116 cancerosas, células Panc-1 e células A549 nos pontos de tempo indicados após a infecção com Ad-A350 na MOI indicada. A Figura 4B apresenta coloração com violeta cristal de células WI38 e células MRC5 não cancerosas 10 dias após a infecção com Ad-A350 ou Ad-TAV-255 na MOI indicada. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0046] A Figura 5 apresenta coloração com violeta cristal de células A549, Panel, HCT116 e Hep3b cancerosas como controles não
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13/62 infectados e três dias após infecção com Ad-CAAT ou Ad-CAAT-mTATA a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0047] A Figura 6 apresenta coloração com violeta cristal de células ADS-12, ASPC1, HT-29 e Hep3b cancerosas como controles não infectados e três dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, AdCAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0048] A Figura 7 apresenta coloração com violeta cristal de células ADS-12, ASPC1, HT-29 e Hep3b cancerosas como controles não infectados e quatro dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, AdCAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0049] A Figura 8 apresenta coloração com violeta cristal de células Panel, A549, MeWo e HCT-116 cancerosas como controles não infectados e três dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, AdCAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0050] A Figura 9 apresenta coloração com violeta cristal de células Panel, A549, MeWo e HCT-116 cancerosas como controles não infectados e quatro dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, AdCAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0051] A Figura 10 apresenta coloração com violeta cristal de células A549, HCT116, Hep3b e Pand cancerosas como controles não infectados e cinco dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, AdCAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0052] A Figura 11 apresenta coloração com violeta cristal de células MeWo, HT29, ADS12 e ASPC cancerosas como controles não infectados e cinco dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad
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CAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0053] A Figura 12 apresenta coloração com violeta cristal de células WI38 não cancerosas como controles não infectados e quatro dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k na MOI indicada. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0054] A Figura 13 apresenta coloração com violeta cristal de células WI38 não cancerosas como controles não infectados e seis dias após infecção com Ad-TATA, Ad-CAAT, Ad-CAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k na MOI indicada. Violeta cristal colore células viáveis de azul.
[0055] A Figura 14 apresenta coloração com violeta cristal de células Panc-1, células A549 e células e células ADS12 cancerosas cinco dias após infecção com Ad-A350-A19k na MOI indicada. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0056] A Figura 15 apresenta coloração com violeta cristal de células Panc-1, células A549 e células e células ADS12 cancerosas cinco dias após infecção com Ad-A350-GM-CSF na MOI indicada. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0057] A Figura 16 apresenta coloração com violeta cristal de células A549 cancerosas três dias após infecção com Ad-A350-A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0058] A Figura 17 apresenta coloração com violeta cristal de células A549 cancerosas cinco dias após infecção com Ad-A350-A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
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15/62 [0059] A Figura 18 apresenta coloração com violeta cristal de células HCT116 cancerosas três dias após infecção com Ad-A350A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0060] A Figura 19 apresenta coloração com violeta cristal de células HCT116 cancerosas cinco dias após infecção com Ad-A350A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0061] A Figura 20 apresenta coloração com violeta cristal de células Hep3b cancerosas três dias após infecção com Ad-A350-A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0062] A Figura 21 apresenta coloração com violeta cristal de células MeWo cancerosas cinco dias após infecção com Ad-A350-A19k, Ad-A350-mGM-CSF e Ad-TAV-A19k a 5 MOI. Violeta cristal colore células viáveis de azul. CN representa controle não infectado.
[0063] A Figura 22 apresenta um gráfico de barras mostrando a expressão de mGM-CSF conforme analisada por ELISA após a infecção de células A549 com Ad-A350-A19k ou Ad-A350-mGM-CSF a 10 MOI. [0064] A Figura 23 apresenta um gráfico de barras mostrando a expressão de mGM-CSF conforme analisada por ELISA após a infecção de células ADS12 com Ad-A350-A19k ou Ad-A350-mGM-CSF na MOI indicada.
[0065] A Figura 24 apresenta volumes tumorais de camundongos portando tumores ADS-12 subcutâneos que foram tratados com três injeções intratumorais de tampão, Ad-A350-A19k (denotado 350-19k) ou Ad-TAV-A19k (denotado TAV-19k). Cada linha na figura representa o volume tumoral de um camundongo individual.
[0066] A Figura 25 é uma imagem representando o efeito citopático viral decorrente de células HEK-293 transfectadas com um genoma de
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16/62 adenovirus tipo 35 humano incluindo uma deleção do TATA box no promotor E1a.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0067] A transcrição requer o posicionamento correto de RNA polimerase II (RNA pol II) em uma sequência curta de DNA denominada promotor. Uma sequência promotora geralmente inclui uma sequência rica em A/T altamente conservada denominada TATA box, frequentemente flanqueada por sequências ricas em G/C, localizada aproximadamente 30 pares de bases a montante do sítio de iniciação de transcrição. Os genes que não possuem um TATA box identificável são tipicamente genes de manutenção, e dependem do fator de transcrição Sp1 para a transcrição, enquanto os genes que contêm um TATA box são tipicamente genes altamente regulados que respondem às vias de resposta biológica. O TATA box é reconhecido pelo Fator de Transcrição IIB (TFIIB) e pela proteína de ligação a TATA (TBP), que são necessários para o recrutamento de RNA pol II. O papel central do TATA box na transcrição é suportado por observações experimentais de transcrição deficiente ou inativada após a mutação ou remoção de um TATA box, por exemplo, a remoção do TATA box no promotor do gene adenoviral E1a (Wu et al. (1987) Nature 326(6112):512-5).
[0068] Uma sequência adicional presente em muitos promotores é um CAAT box. Um CAAT box é tipicamente localizado aproximadamente 60-100 bases a montante do sítio de iniciação da transcrição do gene e tem a sequência consenso GG(T/C)CAATCT. O CAAT box é reconhecido por fatores de ligação ao núcleo (também chamados de fator nuclear Y ou NF-Y) e por proteínas de ligação a CCAAT/potenciadores (C/EBPs).
[0069] A invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que, para determinados promotores virais, por exemplo, o promotor E1a de adenovirus tipo 5 (Ad5), o TATA e/ou CAAT box, embora necessários
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17/62 para conduzir a transcrição em células saudáveis normais, são dispensáveis para transcrição ativa em células cancerosas. Por conseguinte, em um aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo: (i) um promotor à base de TATA box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa; e/ou (ii) um promotor à base de CAAT box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa e/ou de paragem de não crescimento. O promotor à base de TATA box e o promotor à base de CAAT box podem ser o mesmo promotor (por exemplo, o promotor E1a de Ad5), ou podem ser promotores diferentes.
[0070] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo um promotor à base de TATA box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0071] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo um promotor à base de CAAT box modificado operativamente ligado a um gene, em que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
[0072] Em outro aspecto, a invenção provê um vírus recombinante compreendendo qualquer sequência reguladora viral excluída ou modificada que permite a expressão seletiva do vírus em uma célula de
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18/62 paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. Sequências reguladoras virais exemplificativas além de TATA e CAAT boxes incluem a sequência de iniciador E1 a de Ad5 e o elemento de promotor E1 a de Ad5 a jusante do TATA box.
[0073] Como usado neste documento, TATA box refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é capaz de se ligar a uma proteína de ligação a TATA (TBP). Um TATA box tipicamente compreende um segmento de 8 nucleotídeos rico em A/T contendo uma sequência núcleo de TATAAA (SEQ ID NQ: 1), em que o segmento de 8 nucleotídeos é flanqueado por sequências ricas em G/C, no entanto, um TATA box pode ter pouca semelhança com a sequência de TATA típica. [0074] Como usado neste documento, um TATA box modificado refere-se a um TATA box que tem uma deleção, substituição ou adição de um ou mais nucleotídeos em relação a uma sequência de TATA box de tipo selvagem.
[0075] Como usado neste documento, um TATA box funcional refere-se a um TATA box que é capaz de se ligar a uma TBP, por exemplo, um TATA box que tem pelo menos 100%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, ou pelo menos 40% da atividade de ligação a TBP de uma sequência de TATA box de tipo selvagem correspondente. Como usado neste documento, um TATA box não funcional refere-se a um TATA box que, por exemplo, tem menos de 30%, menos de 20%, menos de 10% ou 0% da atividade de ligação a TBP de uma sequência de TATA box de tipo selvagem correspondente. Ensaios para determinar se uma TBP se liga a um TATA box são conhecidos na técnica. Ensaios de ligação exemplificativos incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética, ensaios de imunoprecipitação de cromatina, e ensaios de presença de DNAse.
[0076] Como usado neste documento, promotor à base de TATA
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19/62 box refere-se a qualquer promotor de gene que contém um TATA box. [0077] Como usado neste documento, um promotor à base de TATA box modificado refere-se a um promotor à base de TATA box que foi modificado por uma deleção, substituição ou adição de um ou mais nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de um ou mais nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado consiste em uma deleção de um ou mais nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de todo o TATA box da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado consiste em uma deleção de todo o TATA box da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de todo o promotor à base de TATA box. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado consiste em uma deleção de todo o promotor à base de TATA box. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado não compreende uma adição ou uma substituição com uma sequência promotora funcional separada.
[0078] Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de 1 a 300, de 1 a 200, de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 50, de 1 a 25, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 4 nucleotídeos, de 4 a 300, de 4 a 200, de 4 a 150, de 4 a 100, de 4 a 75, de 4 a 50, de 4 a 25, de 4 a 10, de 4 a 8, de 8 a
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300, de 8 a 200, de 8 a 150, de 8 a 100, de 8 a 75, de 8 a 50, de 8 a 25, de 8 a 10, de 10 a 300, de 10 a 200, de 10 a 150, de 10 a 100, de 10 a 75, de 10 a 50, de 10 a 25, de 25 a 300, de 25 a 200, de 25 a 150, de 25 a 100, de 25 a 75, de 25 a 50, de 50 a 300, de 50 a 200, de 50 a 150, de 50 a 100, de 50 a 75, de 75 a 300, de 75 a 200, de 75 a 150, de 75 a 100, de 100 a 300, de 100 a 200, de 100 a 150, de 150 a 300, de 150 a 200 ou de 200 a 300 nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200 ou cerca de 300 nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de cerca de 200 nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 10 nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma deleção de 4 ou 8 nucleotídeos da sequência promotora à base de TATA box de tipo selvagem.
[0079] Como usado neste documento, CAAT box refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é capaz de se ligar a uma proteína C/EBP ou NF-Y. Um CAAT box tipicamente compreende uma sequência consenso de GG(T/C)CAATCT.
[0080] Como usado neste documento, um CAAT box modificado refere-se a um CAAT box que tem uma deleção, substituição ou adição de um ou mais nucleotídeos em relação a uma sequência de CAAT box de tipo selvagem.
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21/62 [0081] Como usado neste documento, um CAAT box funcional refere-se a um CAAT box que é capaz de se ligar a uma proteína C/EBP ou NF-Y, por exemplo, um CAAT box que tem pelo menos 100%, pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, pelo menos 50%, ou pelo menos 40% da atividade de ligação a C/EBP ou NF-Y de uma sequência de CAAT box de tipo selvagem correspondente. Como usado neste documento, um CAAT box não funcional refere-se a um CAAT box que, por exemplo, tem menos de 30%, menos de 20%, menos de 10% ou 0% da atividade de ligação a C/EBP ou NF-Y de uma sequência de CAAT box de tipo selvagem correspondente. Ensaios para determinar se uma proteína C/EBP ou NF-Y se liga a um CAAT box são conhecidos na técnica. Ensaios de ligação exemplificativos incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética, ensaios de imunoprecipitação de cromatina, e ensaios de presença de DNAse.
[0082] Como usado neste documento, promotor à base de CAAT box refere-se a qualquer promotor de gene que contém um CAAT box. [0083] Como usado neste documento, um promotor à base de CAAT box modificado refere-se a um promotor à base de CAAT box que foi modificado por uma deleção, substituição ou adição de um ou mais nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de um ou mais nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado consiste em uma deleção de um ou mais nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de todo o CAAT box da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas
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22/62 modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado consiste em uma deleção de todo o CAAT box da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de todo o promotor à base de CAAT box. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado consiste em uma deleção de todo o promotor à base de CAAT box. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado não compreende uma adição ou uma substituição com uma sequência promotora funcional separada.
[0084] Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de 1 a 300, de 1 a 200, de 1 a 100, de 1 a 75, de 1 a 50, de 1 a 25, de 1 a 10, de 1 a 8, de 1 a 4 nucleotídeos, de 4 a 300, de 4 a 200, de 4 a 150, de 4 a 100, de 4 a 75, de 4 a 50, de 4 a 25, de 4 a 10, de 4 a 8, de 8 a 300, de 8 a 200, de 8 a 150, de 8 a 100, de 8 a 75, de 8 a 50, de 8 a 25, de 8 a 10, de 10 a 300, de 10 a 200, de 10 a 150, de 10 a 100, de 10 a 75, de 10 a 50, de 10 a 25, de 25 a 300, de 25 a 200, de 25 a 150, de 25 a 100, de 25 a 75, de 25 a 50, de 50 a 300, de 50 a 200, de 50 a 150, de 50 a 100, de 50 a 75, de 75 a 300, de 75 a 200, de 75 a 150, de 75 a 100, de 100 a 300, de 100 a 200, de 100 a 150, de 150 a 300, de 150 a 200 ou de 200 a 300 nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de cerca de 10, cerca de 25, cerca de 50, cerca de 75, cerca de 100, cerca de 150, cerca de 200, ou cerca de 300 nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de
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23/62 cerca de 200 nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 10 nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma deleção de 9 nucleotídeos da sequência promotora à base de CAAT box de tipo selvagem.
[0085] O termo operativamente ligado refere-se a uma ligação de elemento de polinucleotídeo em uma relação funcional. Uma sequência de ácido nucleico é operativamente ligada quando é colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou potenciador é operativamente ligado a um gene se ele afeta a transcrição do gene. As sequências de nucleotídeos operativamente ligadas são tipicamente contíguas. No entanto, como potenciadores geralmente funcionam quando separados do promotor por vários quilobases e as sequências intrônicas podem ser de comprimentos variáveis, alguns elementos de polinucleotídeos podem ser operativamente ligados, mas não diretamente flanqueados e podem até funcionar em trans de um alelo ou cromossomo diferente. Em determinadas modalidades, um gene (região de codificação) é operativamente ligado a um promotor à base de CAAT box modificado e/ou TATA box modificado.
[0086] O termo transgene refere-se a um gene exógeno ou sequência de polinucleotídeos. O termo transgene terapêutico referese a um transgene, que, quando replicado e/ou expresso em ou pelo vírus prejudica um efeito terapêutico em uma célula-alvo, fluido corporal, tecido, órgão, sistema fisiológico ou indivíduo.
[0087] Em determinadas modalidades, o vírus recombinante apresenta expressão seletiva de um gene operativamente ligado a um
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24/62 promotor à base de CAAT box modificado e/ou TATA box modificado em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa, por exemplo, uma célula cancerosa, em relação a uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a expressão do gene na célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da expressão do gene na célula hiperproliferativa e/ou célula de paragem de não crescimento. Em determinadas modalidades, o vírus não apresenta expressão detectável do gene em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a expressão de um gene operativamente ligado a um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado pelo vírus recombinante em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da expressão do gene por um vírus correspondente sem o promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado. Em determinadas modalidades, o vírus recombinante apresenta expressão seletiva de um gene de fase precoce, por exemplo, E1a ou E1b adenoviral. A expressão de gene pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, Western blot, conforme descrito no Exemplo 2 neste documento.
[0088] Em determinadas modalidades, a expressão seletiva de um gene operativamente ligado a um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado, por exemplo, um gene de fase precoce, pelo vírus recombinante em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa, por exemplo, uma célula cancerosa, resulta em replicação seletiva do vírus na célula de paragem de não crescimento
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25/62 e/ou hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a replicação do vírus em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da replicação do vírus em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a replicação do vírus em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da replicação de urn vírus correspondente sem um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado. A replicação viral pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por análise da expressão de proteínas virais, por exemplo, por Western blot conforme descrito no Exemplo 2 neste documento, por análise da lise mediada por vírus, por exemplo, por coloração com violeta cristal conforme descrito no Exemplo 3 neste documento, ou por reação de cadeia de polimerase quantitativa (qPCR).
[0089] Em determinadas modalidades, a expressão seletiva de um gene operativamente ligado a um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado, por exemplo, um gene de fase precoce, pelo vírus recombinante em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa, por exemplo, uma célula cancerosa, resulta em lise seletiva mediada por vírus (isto é, atividade citolítica) da célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a lise mediada por vírus de uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da lise mediada por vírus da célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa.
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Em determinadas modalidades, o vírus não apresenta lise mediada por vírus detectável de uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a lise mediada por vírus de uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da lise mediada por vírus da célula por um vírus correspondente sem um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado. A lise mediada por vírus pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, coloração com violeta cristal conforme descrito no Exemplo 3 neste documento.
[0090] Em determinadas modalidades, a expressão seletiva de um gene operativamente ligado a um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado, por exemplo, um gene de fase precoce, pelo vírus recombinante em uma célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa, por exemplo, uma célula cancerosa, resulta em expressão seletiva de um transgene terapêutico pelo vírus recombinante. Em determinadas modalidades, a expressão de um transgene terapêutico em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10%, ou cerca de 5% da expressão do transgene terapêutico na célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, o vírus não apresenta expressão detectável do transgene terapêutico em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa. Em determinadas modalidades, a expressão de um transgene terapêutico em uma célula de paragem de crescimento e/ou não hiperproliferativa é cerca de 90%, cerca de 80%, cerca de 70%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de
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40%, cerca de 30%, cerca de 20%, cerca de 10% ou cerca de 5% da expressão do transgene terapêutico na célula por um vírus correspondente sem um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado. A expressão do transgene terapêutico pode ser determinada por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, ELISA conforme descrito no Exemplo 4 neste documento.
[0091] A célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa pode ser uma célula cancerosa, célula endotelial, célula epidérmica, fibroblasto e/ou célula imune. A célula de paragem de não crescimento e/ou hiperproliferativa pode ser uma célula cancerosa, por exemplo, uma célula de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer testicular ou câncer de tireoide. Em outras modalidades, a célula hiperproliferativa é derivada de um distúrbio hiperproliferativo. Distúrbios hiperproliferativos exemplificativos incluem distúrbios de proliferação de vaso sanguíneo (por exemplo, restenose, retinopatias e aterosclerose), distúrbios fibróticos (por exemplo, cirrose, por exemplo, cirrose hepática (que podem ser secundários a uma infecção viral, tal como hepatite)), distúrbios mesangiais (por exemplo, doenças renais humanas, por
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28/62 exemplo, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrosclerose maligna, síndromes de microangiopatia trombótica, rejeição a transplante e glomerulopatias), distúrbios pré-cancerosos (por exemplo, hiperplasia ou displasia), distúrbios autoimunes, artrite reumatoide, psoríase, lúpus, fibrose pulmonar idiopática, hipertensão pulmonar por esclerodermia, asma, fibrose renal, COPD, fibrose cística, DIP, UIP, degeneração macular, distúrbios de fibroblastos hiperproliferativos e esclerodermia. [0092] A identidade de sequência pode ser determinada de várias formas que estão dentro da habilidade da técnica, por exemplo, uso de software de computador disponível publicamente, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Análise BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico) usando o algoritmo empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx (Karlin et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. Mol. Evol. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, incorporado por referência) personalizados para pesquisa de similaridade de sequência. Para uma discussão de questões básicas na pesquisa de bancos de dados de sequências, ver Altschul et al., (1994) Nature Genetics 6:119-129, que é totalmente incorporada por referência. Os versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de medição, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. Os parâmetros de pesquisa para histograma, descrições, alinhamentos, expectativa (isto é, o limite de significância estatística para as correspondências de relatório em relação às sequências de banco de dados), corte, matriz e filtro estão nas configurações padrão. A matriz de pontuação padrão utilizada por blastp, blastx, tblastn e tblastx é a matriz BLOSUM62 (Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-10919, totalmente incorporado por referência). Quatro
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29/62 parâmetros de blastn podem ser ajustados da seguinte forma: Q=10 (penalidade de criação de gap); R=10 (penalidade de extensão de intervalo); wink=1 (gera hits de palavra a cada posição de wink.sup.th ao longo da consulta); e gapw=16 (define a largura da janela dentro da qual os alinhamentos com gaps são gerados). As configurações de parâmetro de Blastp equivalentes podem ser Q=9; R=2; wink=1; e gapw=32. As buscas também podem ser realizadas utilizando o parâmetro BLAST Advanced Option da NCBI (National Center for Biotechnology Information) (por exemplo: -G, Custo para abrir gap [Inteiro]: padrão = 5 para nucleotideos/11 para proteínas; -E, Custo para estender gap [Inteiro]: padrão = 2 para nucleotídeos/1 para proteínas; q, Penalidade para incompatibilidade de nucleotídeo [Inteiro]: padrão = -3; -r, recompensa para compatibilidade de nucleotídeo [Inteiro]: padrão = 1; -e, valor esperado [Real]: padrão = 10; -W, tamanho de palavra [Inteiro]: padrão = 11 para nucleotídeos/28 para megablast/3 para proteínas; -y, Corte(X) para extensões de blast em bits: padrão = 20 para blastn/7 para outros; -X, X valor de corte para alinhamento com gaps (em bits): padrão = 15 para todos os programas, não aplicável para blastn; e -Z, valor de corte X final para alinhamento com gaps (em bits): 50 para blastn, 25 para os outros). ClustalW para alinhamentos de proteína em pares também pode ser usados (os parâmetros padrão podem incluir, por exemplo, matriz de Blosum62 e Penalidade de Abertura de Gap = 10 e Penalidade de Extensão de Gap = 0,1). Uma comparação entre sequências Bestfit, disponível no pacote GCG versão 10.0, utiliza parâmetros de DNA GAP=50 (penalidade de criação de gap) e LEN=3 (penalidade de extensão de gap) e os ajustes equivalentes em comparações de proteína são GAP=8 e LEN=2.
I. Vírus [0093] O termo vírus é aqui utilizado para se referir a qualquer um dos parasitas intracelulares obrigatórios que não possuem mecanismo
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30/62 de síntese de proteína ou de geração de energia. O genoma viral pode ser RNA ou DNA. Os vírus úteis na prática da presente invenção incluem vírus de DNA e RNA envelopados ou não envelopados, recombinantemente modificados, preferencialmente selecionados de baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesviridiae, poxyiridae ou adenoviridiae. Um vírus recombinantemente modificado é aqui referido como um vírus recombinante. Um vírus recombinante pode, por exemplo, ser modificado por técnicas de DNA recombinante para ser deficiente para replicação, condicionalmente replicante ou competente para replicação e/ou ser modificado por técnicas de DNA recombinante para incluir a expressão de transgenes exógenos. Os vetores virais quiméricos que exploram elementos vantajosos de cada uma das propriedades do vetor de origem (ver, por exemplo, Feng etal. (1997) Nature Biotechnology 15:866-870) podem também ser úteis na prática da presente invenção. Embora seja geralmente preferido empregar um vírus da espécie a ser tratada, em certos casos, pode ser vantajoso utilizar vetores derivados de diferentes espécies que possuam características patogênicas favoráveis. Por exemplo, os vetores de herpes vírus de equinos para terapia genética humana são descritos na Publicação PCT NQ WO 98/27216. Os vetores são descritos como úteis para o tratamento de seres humanos, pois o vírus de equinos não é patogênico para seres humanos. Da mesma forma, os vetores adenovirais de ovinos podem ser utilizados em terapia genética humana, pois são reivindicados por evitarem os anticorpos contra os vetores adenovirais humanos. Tais vetores são descritos na Publicação PCT NQ WO 97/06826.
[0094] Vírus úteis para a prática da invenção contêm um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box. Em determinadas modalidades, o promotor à base de CAAT box e/ou TATA box é o promotor para um gene de fase precoce, por exemplo, um gene codificando uma proteína
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31/62 que é produzida após a entrada na célula hospedeira, mas antes da replicação, que tipicamente inicia a replicação do genoma e a expressão de genes de fase tardia.
[0095] Exemplos de vírus com promotores à base de CAAT box e/ou TATA box de gene de fase precoce incluem vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1), herpes vírus simples tipo 1, vírus adeno-associado, vírus Influenza, reovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus de newcastle, vírus vaccinia, poliovirus, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus Sindbis (SIN) e vírus Sendai (SV).
[0096] Preferencialmente, o vírus recombinante é um adenovirus. Adenovirus são de tamanho médio (90-100 nm), não envelopados (naked), vírus icosaedro composto por um nucleocapsídeo e um genoma de DNA linear de fita dupla. Os adenovirus se replicam no núcleo de células de mamíferos utilizando o mecanismo de replicação do hospedeiro. O termo adenovirus se refere a qualquer vírus do gênero Adenoviridia incluindo, mas sem limitação, subgêneros de adenovirus humano, bovino, ovino, equino, canino, porcino, murino e simiano. Em particular, os adenovirus humanos incluem os subgêneros A-F, bem como os serótipos individuais dos mesmos, os serótipos individuais e subgêneros A-F incluindo, mas sem limitação, os tipos de adenovirus humanos 1,2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11 a e Ad11 p), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 e 91. São preferidos os vírus recombinantes derivados de adenovirus humanos tipos 2, 5 e 35. Salvo indicação em contrário, todos os números de nucleotídeos do adenovirus tipo 5 são em relação à sequência de referência do NCBI AC_000008.1, que é apresentada neste documento na SEQ ID NQ: 8, e todos os números de nucleotídeos de adenovirus tipo 35 são em relação à sequência de referência do NCBI AC_000019.1, que é apresentada neste documento na SEQ ID
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NQ: 24. A sequência de um plasmideo vetorial exemplificative que codifica a terminação 5’ do genoma do adenovirus tipo 5 (pXC1) é apresentada neste documento na SEQ ID NQ: 2.
[0097] O ciclo de replicação do adenovirus tem duas fases: uma fase inicial, durante a qual quatro unidades de transcrição E1, E2, E3 e E4 são expressas, e uma fase tardia, que ocorre após o início da síntese de DNA viral quando os transcritos de fase tardia são expressos primariamente a partir do principal promotor de fase tardia (MLP). As mensagens tardias codificam a maioria das proteínas estruturais do vírus. Os produtos genéticos de E1, E2 e E4 são responsáveis pela ativação transcricional, transformação celular, replicação viral do DNA viral, além de outras funções virais, e são necessários para o crescimento viral.
[0098] Em determinadas modalidades, o promotor à base de TATA box modificado é um promotor E1a, E1b ou E4 adenoviral. Em determinadas modalidades, o promotor à base de TATA box modificado é um promotor E1a adenoviral, por exemplo, o promotor E1a de Ad5. A modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado pode, por exemplo, compreender uma deleção de todo o TATA box do promotor E1a, por exemplo, compreender uma deleção correspondente aos nucleotideos -27 a -24 do promotor E1a de Ad5. Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotideos correspondente aos -27 a -24, -31 a -24, -44 a +54 ou -146 a +54 do promotor E1a de Ad5, que correspondem, respectivamente, aos nucleotideos 471 a 474, 467 a 474, 454 a 551 e 352 a 551 da SEQ ID NQ: 2, e aos nucleotideos 472 a 475, 468 a 475, 455 a 552 e 353 a 552 da SEQ ID NQ: 8. Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotideos correspondente a -29 a -26, -33 a -26, -44 a +52 ou -148 a +52 do promotor E1a de Ad5.
[0099] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma
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33/62 deleção de nucleotídeos correspondente a cerca de -50 a cerca de -10, cerca de -50 a cerca de -20, cerca de -50 a cerca de -30, cerca de -50 a cerca de -40, cerca de -40 a cerca de -10, cerca de -40 a cerca de 20, cerca de -40 a cerca de -30, cerca de -30 a cerca de -10, cerca de 30 a cerca de -20, ou cerca de -20 a cerca de -10 do promotor E1a de Ad5.
[0100] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de polinucleotídeos que resulta em vírus compreendendo a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12) ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13), que resultam da junção das duas sequências de polinucleotídeos que de outra forma flanqueariam a sequência de polinucleotídeos excluída. Em determinadas modalidades, o vírus compreende a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12) ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13) ou uma sequência tendo 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12) ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13) [0101] Em determinadas modalidades, o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor E1a, E1b ou E4 adenoviral. Em determinadas modalidades, o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor E1a adenoviral, por exemplo, o promotor E1a de Ad5. A modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado pode, por exemplo, compreender uma deleção de todo o CAAT box do promotor E1a, por exemplo, compreender uma deleção correspondente aos nucleotídeos -76 a -68 do promotor E1a do adenovirus tipo 5, que corresponde aos nucleotídeos 422 a 430 da SEQ ID NQ: 2, e aos nucleotídeos 423 a 431 da SEQ ID NQ: 8.
[0102] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a cerca de -90 a cerca de -50,
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34/62 cerca de -90 a cerca de -60, cerca de -90 a cerca de -70, cerca de -90 a cerca de -80, cerca de -80 a cerca de -50, cerca de -80 a cerca de 60, cerca de -80 a cerca de -70, cerca de -70 a cerca de -50, cerca de 70 a cerca de -60, ou cerca de -60 a cerca de -50 do promotor E1a de Ad5.
[0103] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de polinucleotídeos que resulta no vírus compreendendo a sequência TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14), que resulta da junção das duas sequências de polinucleotídeos que de outra forma flanqueariam a sequência de polinucleotídeos excluída. Em determinadas modalidades, o vírus compreende a sequência TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14) ou uma sequência tendo 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência à TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14).
[0104] Em determinadas modalidades, o vírus compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente a cerca de -200 a cerca de +50, cerca de -175 a cerca de +50, cerca de -150 a cerca de +50, cerca de -125 cerca de +50, cerca de -100 a cerca de +50, cerca de -75 a cerca de +50, cerca de -50 a cerca de +50, cerca de -25 a cerca de +50, cerca de +1 a cerca de +50, cerca de +25 a cerca de +50, cerca de -200 a cerca de +25, cerca de -175 a cerca de +25, cerca de -150 a cerca de +25, cerca de -125 cerca de +25, cerca de -100 a cerca de +25, cerca de -75 a cerca de +25, cerca de -50 a cerca de +25, cerca de -25 a cerca de +25, cerca de +1 a cerca de +25, cerca de -200 a cerca de +1, cerca de -175 a cerca de +1, cerca de -150 a cerca de +1, cerca de -125 cerca de +1, cerca de -100 a cerca de +1, cerca de -75 a cerca de +1, cerca de -50 a cerca de +1, cerca de -25 a cerca de +1, cerca de -200 a cerca de -25, cerca de -175 a cerca de -25, cerca de -150 a cerca de -25, cerca de -125 cerca de -25, cerca de -100 a cerca de -25, cerca de -75 a cerca de -25, cerca de -50 a cerca de -25, cerca de -200 a cerca de -50, cerca
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35/62 de -175 a cerca de -50, cerca de -150 a cerca de -50, cerca de -125 cerca de -50, cerca de -100 a cerca de -50, cerca de -75 a cerca de -50, cerca de -200 a cerca de -75, cerca de -175 a cerca de -75, cerca de 150 a cerca de -75, cerca de -125 cerca de -75, cerca de -100 a cerca de -75, cerca de -200 a cerca de -100, cerca de -175 a cerca de -100, cerca de -150 a cerca de -100, cerca de -125 cerca de -100, cerca de 200 a cerca de -125, cerca de -175 a cerca de -125, cerca de -150 a cerca de -125, cerca de -200 a cerca de -150, cerca de -175 a cerca de -150, ou cerca de -200 a cerca de -175 do promotor E1a de Ad5.
[0105] Em determinadas modalidades, além de um promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado, o vírus tem uma ou mais modificações adicionais a um promotor ou sequência reguladora. Uma modificação adicional a um promotor ou sequência reguladora compreende uma deleção, substituição ou adição de um ou mais nucleotídeos em comparação com a sequência de tipo selvagem do promotor ou sequência reguladora. A modificação adicional pode ser adjacente ou distai ao promotor à base de CAAT box e/ou TATA box modificado.
[0106] Em determinadas modalidades, a modificação adicional de um promotor ou sequência reguladora compreende uma modificação de sequência de um sítio de ligação a fator de transcrição para reduzir a afinidade para o fator de transcrição, por exemplo, pela deleção de uma porção do mesmo, ou pela inserção de um único ponto de mutação no sítio de ligação. Em determinadas modalidades, a sequência reguladora modificada adicional potencializa a expressão em células cancerosas, mas atenua a expressão em células normais.
[0107] Em determinadas modalidades, a modificação adicional de um promotor ou sequência reguladora compreende uma modificação adicional a uma sequência reguladora E1 a. A sequência reguladora E1 a contém cinco sítios de ligação para o fator de transcrição Pea3,
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36/62 designado Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV e Pea3 V, em que Pea3 I é o sítio de ligação a Pea3 mais proximal ao sítio de iniciação de E1a, e Pea3 V é mais distal. A sequência reguladora E1 a também contém sítios de ligação para o fator de transcrição E2F, então designado E2F I e E2F II, em que E2F I é o sítio de ligação a E2F mais proximal ao sítio de iniciação de E1a, e E2F II é mais distal. A partir do sítio de iniciação de E1a, os sítios de ligação são dispostos: Pea3 I, E2F I, Pea3 II, E2F II, Pea3 III, Pea3 IV e Pea3 V.
[0108] Em determinadas modalidades, pelo menos um desses sete sítios de ligação, ou uma porção funcional destes, é deletado. Uma porção funcional é uma porção do sítio de ligação que, quando deletada, reduz ou até elimina a funcionalidade, por exemplo, afinidade de ligação, do sítio de ligação a seu respectivo fator de transcrição (Pea3 ou E2F) em, por exemplo, pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% em relação à sequência completa. Em determinadas modalidades, um ou mais sítios de ligação inteiros são deletados. Em determinadas modalidades, uma porção funcional de um ou mais sítios de ligação é deletada. Um sítio de ligação deletado engloba ambas a deleção de todo um sítio de ligação e a deleção de uma porção funcional. Quando dois ou mais sítios de ligação são deletados, qualquer combinação de deleção de todo o sítio de ligação e deleção de porção funcional pode ser usada.
[0109] Em determinadas modalidades, pelo menos um sítio de ligação a Pea3, ou uma porção funcional deste, é deletado. O sítio de ligação a Pea3 deletado pode ser Pea3 I, Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV e/ou Pea3 V. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a Pea3 deletado é Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV e/ou Pea3 V. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a Pea3 deletado é Pea3 IV e/ou Pea3 V. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a Pea3 deletado é Pea3 II e/ou Pea3 III. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação
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37/62 a Pea3 deletado são ambos Pea3 II e Pea3 III. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a Pea3 I, ou uma porção funcional deste, é mantido.
[0110] Em determinadas modalidades, pelo menos um sítio de ligação a E2F, ou uma porção funcional deste, é deletado. Em determinadas modalidades, pelo menos um sítio de ligação a E2F, ou uma porção funcional deste, é mantido. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a E2F mantido é E2F I e/ou E2F II. Em determinadas modalidades, o sítio de ligação a E2F mantido é E2F II. Em determinadas modalidades, a deleção total consiste essencialmente em um ou mais de Pea3 II, Pea3 III, Pea3 IV e/ou Pea3 V, ou porções funcionais destes. Em determinadas modalidades, o vírus tem uma deleção de uma região de 50 pares de base localizada a partir de -305 a -255 a montante do sítio de iniciação de E1 a, doravante referida como a deleção de TAV-255. Em determinadas modalidades, o vírus tem uma deleção de uma região de 50 pares de base localizada a partir de -304 a -255 a montante do sítio de iniciação de E1a, por exemplo, correspondente a 195-244 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8), doravante referida como a deleção de TAV-255. Em determinadas modalidades, a deleção de TAV-255 resulta em um promotor E1a que compreende a sequência GGTGTTTTGG (SEQ ID NQ: 11).
[0111] Um vírus recombinante descrito pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um transgene terapêutico. O transgene terapêutico pode codificar um ácido nucleico terapêutico, por exemplo, um RNA antissenso ou RNA ribozima. O transgene terapêutico pode codificar um peptídeo ou polipeptídeo terapêutico, por exemplo, um agente apoptótico, anticorpo, peptídeo responsive a CTL, citocina, agente citolítico, agente citotóxico, enzima, antígeno heterólogo expresso na superfície de uma célula tumoral para gerar uma resposta imune, agente imunoestimulador ou imunomodulador,
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38/62 interferon, peptídeo lítico, oncoproteína, polipeptídeo que catalisa processos que levam à morte celular, polipeptídeo que complementa defeitos genéticos em células somáticas, proteína de supressão tumoral, antígeno de vacina, ou quaisquer combinações dos mesmos. [0112] Em determinadas modalidades, o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico selecionado de acetilcolina, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-1, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-L1, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, interferon-gama, TGFβ, um TGF-β trap, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53, e timidina quinase. Em determinadas modalidades, o transgene terapêutico é um TGF-β trap. Proteínas de TGF-β trap adequadas para uso na invenção são descritas no Pedido de Patente dos EUA NQ. 15/717.199, depositado em 27 de setembro de 2017.
[0113] O gene E1b-19k adenoviral funciona primariamente como um gene antiapoptótico e é um homólogo do gene antiapoptótico celular, BCL-2. Uma vez que morte da célula hospedeira antes da maturação das partículas virais de progenia restringiría a replicação viral, E1b-19k é expresso como parte do cassete El para evitar a morte celular prematura, permitindo assim que a infecção prossiga e gere virions maduros. Por conseguinte, em determinadas modalidades, um vírus recombinante é provido que inclui um sítio de inserção de E1 b-19K, por exemplo, o adenovirus tem uma sequência de nucleotídeos codificando um transgene terapêutico inserido em um sítio de inserção de E1 b-19K. [0114] Em determinadas modalidades, o sítio de inserção de E1b19K é localizado entre o sítio de iniciação de E1b-19K (isto é, a sequência de nucleotídeos codificando o códon inicial de E1 b-19k, por exemplo, correspondente aos nucleotídeos 1714-1716 da SEQ ID NQ: 8) e o sítio de iniciação de E1 b-55K (isto é, a sequência de nucleotídeos
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39/62 codificando o códon inicial de E1b-55k, por exemplo, correspondente aos nucleotídeos 2019-2021 da SEQ ID NQ: 8). Ao longo da descrição e reivindicações, uma inserção entre dois sítios, por exemplo, uma inserção entre (i) um sítio inicial de um primeiro gene (por exemplo, E1 b19k) e um sítio inicial de um segundo gene, (por exemplo, E1 b-55K), (ii) um sítio inicial de um primeiro gene e um sítio de parada de um segundo gene, (iii) um sítio de parada de um primeiro gene e sítio de iniciação de um segundo gene, ou (iv) um sítio de parada de um primeiro gene e um sítio de parada de um segundo gene, significa que todos ou uma porção dos nucleotídeos que constituem um determinado sítio de iniciação ou um sítio de parada em torno da inserção podem estar presentes ou ausentes no vírus final. Da mesma forma, uma inserção entre dois nucleotídeos significa que os nucleotídeos em torno da inserção podem estar presentes ou ausentes no vírus final.
[0115] Em determinadas modalidades, o sítio de inserção de E1b19K é localizado entre o sítio de iniciação de E1b-19K (isto é, a sequência de nucleotídeos codificando o códon inicial de E1 b-19k, por exemplo, correspondente aos nucleotídeos 1714-1716 da SEQ ID NQ: 8) e o sítio de parada de E1b-19K (isto é, a sequência de nucleotídeos codificando o códon de parada de E1b-19k, por exemplo, correspondente aos nucleotídeos 2242-2244 da SEQ ID NQ: 8). Em determinadas modalidades, o sítio de inserção de E1 b-19K compreende uma deleção de cerca de 100 a cerca de 305, cerca de 100 a cerca de 300, cerca de 100 a cerca de 250, cerca de 100 a cerca de 200, cerca de 100 a cerca de 150, cerca de 150 a cerca de 305, cerca de 150 a cerca de 300, cerca de 150 a cerca de 250 ou cerca de 150 a cerca de 200 nucleotídeos adjacentes ao sítio de iniciação de E1b-19K. Em determinadas modalidades, o sítio de inserção de E1 b-19K compreende uma deleção de cerca de 200 nucleotídeos, por exemplo, 203 nucleotídeos adjacentes ao sítio de iniciação de E1b-19K. Em
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40/62 determinadas modalidades, o sítio de inserção de E1 b-19K compreende uma deleção correspondente aos nucleotídeos 1714-1916 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8), ou a sequência de nucleotídeos codificando o transgene terapêutico é inserida entre nucleotídeos correspondentes a 1714 e 1916 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8). Em determinadas modalidades, a sequência de nucleotídeos codificando o transgene terapêutico é inserida entre CTGACCTC (SEQ ID NQ: 9) e TCACCAGG (SEQ ID NQ: 10), por exemplo, o adenovirus recombinante compreende, em uma orientação 5’ a 3’, CTGACCTC (SEQ ID NQ: 9), a sequência de nucleotídeos codificando o transgene terapêutico, e TCACCAGG (SEQ ID NQ: 10). CTGACCTC (SEQ ID NQ: 9) e TCACCAGG (SEQ ID NQ: 10) definem sequências limítrofes únicas para o sítio de inserção de E1b19K dentro do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8). Ao longo da descrição e reivindicações, uma deleção adjacente a um sítio, por exemplo, uma deleção adjacente a um sítio inicial de um gene ou uma deleção adjacente a um sítio de parada de um gene, significa que a deleção pode incluir uma deleção de todos, uma porção ou nenhum dos nucleotídeos que constituem um determinado sítio de iniciação ou um sítio de parada.
[0116] Em determinadas modalidades, em qualquer um dos vírus acima, o adenovirus recombinante ainda compreende uma deleção de E4. Em determinadas modalidades, a deleção de E4 está localizada entre o sítio de iniciação de E4-ORF6/7 (isto é, a sequência de nucleotídeos codificando o códon inicial de E4-ORF6/7, por exemplo, correspondente aos nucleotídeos 34075-34077 da SEQ ID NQ: 23) e a repetição de terminal invertido direita (ITR; por exemplo, correspondentes aos nucleotídeos 35836-35938 da SEQ ID NQ: 23). Em determinadas modalidades, a deleção de E4 está localizada entre o sítio de iniciação de E4-ORF6/7 e o sítio de iniciação de E4-ORF1 (isto é, a sequência de nucleotídeos codificando o códon inicial de E4-ORF1, por
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41/62 exemplo, correspondente aos nucleotídeos 35524-35526 da SEQ ID NQ: 23). Em determinadas modalidades, a deleção de E4 compreende uma deleção de uma sequência de nucleotídeos entre o sítio de iniciação de E4-ORF6/7 e o sítio de iniciação de E4-ORF1. Em determinadas modalidades, a deleção de E4 compreende uma deleção de cerca de 500 a cerca de 2500, de cerca de 500 a cerca de 2000, de cerca de 500 a cerca de 1500, de cerca de 500 a cerca de 1000, de cerca de 1000 a cerca de 2500, de cerca de 1000 a cerca de 2000, de cerca de 1000 a cerca de 1500, de cerca de 1500 a cerca de 2500, de cerca de 1500 a cerca de 2000, ou de cerca de 2000 a cerca de 2500 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, a deleção de E4 compreende uma deleção de cerca de 250 a cerca de 1500, de cerca de 250 a cerca de 1250, de cerca de 250 a cerca de 1000, de cerca de 250 a cerca de 750, de cerca de 250 a cerca de 500, de 500 a cerca de 1500, de cerca de 500 a cerca de 1250, de cerca de 500 a cerca de 1000, de cerca de 500 a cerca de 750, de 750 a cerca de 1500, de cerca de 750 a cerca de 1250, de cerca de 750 a cerca de 1000, de cerca de 1000 a cerca de 1500, ou de cerca de 1000 a cerca de 1250 nucleotídeos adjacentes ao sítio de iniciação de E4-ORF6/7. Em determinadas modalidades, a deleção de E4 compreende uma deleção de cerca de 1450 nucleotídeos adjacentes ao sítio de iniciação de E4-ORF6/7, por exemplo, a deleção de E4 compreende uma deleção de cerca de 1449 nucleotídeos adjacentes ao sítio de iniciação de E4-ORF6/7. Em determinadas modalidades, a deleção de E4 compreende uma deleção correspondente aos nucleotídeos 34078-35526 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 23).
II. Métodos de Produção Viral [0117] Métodos para produzir vírus recombinantes da invenção são conhecidos na técnica. Tipicamente, um vírus divulgado é produzido em uma linhagem de célula hospedeira adequada utilizando técnicas convencionais incluindo a cultura de uma célula hospedeira
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42/62 transfectada ou infectada sob condições adequadas, de modo a permitir a produção de partículas virais infecciosas. Ácidos nucléicos codificando genes virais podem ser incorporados em plasmídeos e introduzidos em células hospedeiras através de técnicas de transfecção ou transformação convencionais. Exemplos de células hospedeiras adequadas para a produção dos vírus divulgados incluem linhagens celulares humanas, tais como células HeLa, Hela-S3, HEK293, 911, A549, HER96 ou PER-C6. As condições de produção e purificação específicas irão variar dependendo do vírus e do sistema de produção empregado. Para o adenovirus, o método tradicional para a geração de partículas virais é a cotransfecção seguida por recombinação in vivo subsequente de um plasmídeo bifuncional (shuttle) (geralmente contendo um pequeno subconjunto do genoma adenoviral e opcionalmente contendo um potencial transgene em cassete de expressão) e um plasmídeo auxiliar adenoviral (contendo quase todo o genoma adenoviral).
[0118] Tecnologias alternativas para a geração de adenovirus incluem a utilização do sistema de cromossomos artificiais bacterianos (BAC), recombinação bacteriana in vivo em uma cepa bacteriana recA-:· utilizando dois plasmídeos contendo sequências adenovirais complementares, e o sistema de cromossomos artificiais de levedura (YAC).
[0119] Após a produção, as partículas virais infecciosas são recuperadas da cultura e opcionalmente purificadas. Etapas típicas de purificação podem incluir purificação de placa, centrifugação, por exemplo, centrifugação em gradiente de cloreto de césio, clarificação, tratamento enzimático, por exemplo, tratamento com benzonase ou protease, etapas cromatográficas, por exemplo, cromatografia de troca iônica ou etapas de filtração.
III. Composições Terapêuticas de Métodos de Tratamento
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43/62 [0120] Para uso terapêutico, um vírus recombinante é preferencialmente combinado com um veículo farmaceuticamente aceitável. Como usado neste documento, veículo farmaceuticamente aceitável significa tampões, portadores e excipientes adequados para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, comensuráveis com uma razão benefício/risco razoável. O(s) veículo(s) deve(m) ser aceitável(is) no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes das formulações e não prejudiciais para o receptor. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem tampões, solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes retardadores da absorção e isotônicos, e semelhantes, que são compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecida na técnica.
[0121] As composições farmacêuticas que contêm os vírus recombinantes aqui divulgados podem ser apresentadas em uma forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por qualquer método adequado. Uma composição farmacêutica deve ser formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração são administração intravenosa (IV), intradérmica, inalação, transdérmica, tópica, transmucosa e retal. Uma via de administração preferida para proteínas de fusão é infusão IV. Formulações úteis podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica farmacêutica. Por exemplo, consulte Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18- ed. (Mack Publishing Company, 1990). Componentes de formulação adequados para administração parenteral incluem um diluente estéril, tal como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como álcool benzílico
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44/62 ou metilparabenos; antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como EDTA; tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose.
[0122] Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS). O veículo deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser conservado contra microrganismos. O portador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquido), e suas misturas adequadas.
[0123] Formulações farmacêuticas são preferencialmente estéreis. A esterilização pode ser realizada por qualquer método adequado, por exemplo, filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização por filtração pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição.
[0124] O termo quantidade eficaz, como usado neste documento, refere-se à quantidade de um componente ativo (por exemplo, a quantidade de um vírus recombinante da presente invenção) suficiente para obter resultados benéficos ou desejados. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se limita a uma formulação ou via de administração particular.
[0125] Em determinadas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de componente ativo é na faixa de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg, por exemplo, 1 mg/kg a 100 mg/kg, 1 mg/kg a 10 mg/kg. Em determinadas modalidades, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus recombinante é na faixa de 102 a 1015 unidades de formação de placa (pfus), por exemplo, 102 a 1010, 102 a 105, 105 a 1015, 105 a 1010
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45/62 ou 1010 a 1015 unidades de formação de placa. A quantidade administrada dependerá de variáveis como o tipo e extensão da doença ou indicação a ser tratada, a saúde geral do paciente, a potência in vivo do anticorpo, a formulação farmacêutica e a via de administração. A dosagem inicial pode ser elevada além do nível superior, a fim de atingir rapidamente o nível desejado no sangue ou tecidos. Alternativamente, a dosagem inicial pode ser menor que a ideal, e a dosagem diária pode ser aumentada progressivamente durante o curso do tratamento. A dosagem humana pode ser otimizada, por exemplo, em um estudo convencional de escalonamento de dose de Fase I concebido para ir de 0,5 mg/kg a 20 mg/kg. A frequência de dosagem pode variar dependendo de fatores como a via de administração, a quantidade de dosagem, a meia-vida sérica do vírus e a doença a ser tratada. Frequências de dosagem exemplificativas são uma vez por dia, uma vez por semana e uma vez a cada duas semanas. Uma via de administração preferida é parenteral, por exemplo, infusão intravenosa. A formulação de drogas baseadas em vírus é de competência comum na técnica. Em determinadas modalidades, um vírus recombinante é liofilizado e, depois, reconstituído em solução salina tamponada, no momento da administração.
[0126] Os vírus recombinantes divulgados neste documento podem ser usados para tratar várias indicações médicas. Por exemplo, os vírus recombinantes podem ser usados para tratar várias doenças hiperproliferativas, por exemplo, cânceres. As células hiperproliferativas, por exemplo, células cancerosas, são expostas a uma quantidade terapeuticamente eficaz do vírus recombinante, de modo a inibir ou reduzir a proliferação da célula cancerosas. A invenção provê um método de tratamento de um câncer em um indivíduo. O método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um vírus recombinante da invenção sozinho ou em combinação com
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46/62 outro agente terapêutico para tratar o câncer no indivíduo. Em determinadas modalidades, administrar uma quantidade eficaz de um vírus recombinante a um indivíduo reduz a carga tumoral naquele indivíduo em pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%.
[0127] Como usado neste documento, tratar, tratando e tratamento significam o tratamento de uma doença em um indivíduo, por exemplo, em um ser humano. Isso inclui: (a) inibir a doença, ou seja, impedir seu desenvolvimento; e (b) aliviar a doença, isto é, causar a regressão do estado da doença. Como usado neste documento, os termos indivíduo e paciente referem-se a um organismo a ser tratado pelos métodos e composições descritos deste documento. Tais organismos incluem, preferencialmente, mas sem limitação, mamíferos (por exemplo, murinos, símios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos e semelhantes) e, mais preferencialmente, incluem seres humanos.
[0128] Exemplos de cânceres incluem tumores sólidos, tumores de tecidos moles, tumores hematopoiéticos e lesões metastáticas. Exemplos de tumores hematopoiéticos incluem leucemia, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL), células B, células T ou FAB ALL, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielocítica crônica (CML), leucemia linfocítica crônica (CLL) por exemplo, CLL transformada, linfomas difusos de células B grandes (DLBCL), linfoma folicular, leucemia de células pilosas, síndrome mielodoplásica (MDS), um linfoma, doença de Hodgkin, um linfoma maligno, linfoma nãoHodgkin, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo ou Síndrome de Richter (Transformação de Richter). Exemplos de tumores sólidos incluem malignidades, por exemplo, sarcomas, adenocarcinomas e carcinomas dos vários sistemas de órgãos, tais como os que afetam cabeça e pescoço (incluindo faringe), tireoide, pulmão (carcinoma pulmonar de
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47/62 células pequenas ou de células não pequenas (NSCLC)), mama, linfoide, gastrointestinal (por exemplo, oral, esofágico, estômago, fígado, pâncreas, intestino delgado, cólon e reto, canal anal), genitais e trato geniturinário (por exemplo, renal, urotelial, vesical, uterino, cervical, endometrial, próstata, testicular), CNS (por exemplo, células neurais ou gliais, por exemplo, neuroblastoma ou glioma) ou pele (por exemplo, melanoma).
[0129] Em determinadas modalidades, o câncer é selecionado de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer testicular e câncer de tireoide.
[0130] Doenças hiperproliferativas exemplificativas adicionais incluem distúrbios de proliferação de vaso sanguíneo (por exemplo, restenose, retinopatias e aterosclerose), distúrbios fibróticos (por exemplo, cirrose, por exemplo, cirrose hepática (que pode ser secundária a uma infecção viral, tal como hepatite)), distúrbios mesangiais (por exemplo, doenças renais humanas, por exemplo, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrosclerose maligna, síndromes de microangiopatia trombótica, rejeição a transplante, e glomerulopatias), distúrbios pré-cancerosos (por exemplo, hiperplasia
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48/62 ou displasia), distúrbios autoimunes, artrite reumatoide, psoríase, lúpus, fibrose pulmonar idiopática, hipertensão pulmonar por esclerodermia, asma, fibrose renal, COPD, fibrose cística, DIP, UIP, degeneração macular, distúrbios de fibroblastos hiperproliferativos e esclerodermia.
[0131] Em determinadas modalidades, um vírus recombinante é administrado ao indivíduo em combinação com uma ou mais terapias, por exemplo, cirurgia, radiação, quimioterapia, imunoterapia, terapia hormonal ou viroterapia.
[0132] Em determinadas modalidades, um vírus recombinante da invenção é administrado em combinação com um inibidor de tirosina quinase, por exemplo, erlotinib.
[0133] Em determinadas modalidades, um vírus recombinante da invenção é administrado em combinação com um inibidor de ponto de controle, por exemplo, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD1 ou um anticorpo anti-PD-L1. Anticorpos anti-PD-1 exemplificativos incluem, por exemplo, nivolumab (Opdivo®, Bristol-Myers Squibb Co.), pembrolizumab (Keytruda®, Merck Sharp & Dohme Corp.), PDR001 (Novartis Pharmaceuticals) e pidilizumab (CT-011, Cure Tech). Anticorpos anti-PD-L1 exemplificativos incluem, por exemplo, atezolizumab (Tecentriq®, Genentech), duvalumab (AstraZeneca), MEDI4736, avelumab, e BMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.).
[0134] O termo administrado em combinação, como usado neste documento, significa que dois (ou mais) tratamentos diferentes são administrados ao indivíduo durante o curso da aflição do indivíduo com os distúrbios, tal que os efeitos dos tratamentos no paciente se sobreponham em um ponto no tempo. Em determinadas modalidades, a administração de um tratamento ainda está ocorrendo quando a administração do segundo começa, de modo que haja sobreposição em termos de administração. Isto é, às vezes, referido aqui como administração concorrente ou simultânea. Em outras modalidades, a
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49/62 administração de um tratamento termina antes da administração do outro tratamento começar. Em algumas modalidades de qualquer um dos casos, o tratamento é mais eficaz por causa da administração combinada. Por exemplo, o segundo tratamento é mais eficaz, por exemplo, um efeito equivalente é visto com menos do segundo tratamento, ou o segundo tratamento reduz sintomas em maior extensão, do que se verificaria se o segundo tratamento fosse administrado na ausência do primeiro tratamento, ou situação análoga é vista com o primeiro tratamento. Em determinadas modalidades, a administração é tal que a redução de um sintoma, ou outro parâmetro relacionado ao distúrbio, é maior do que o que seria observado com um tratamento realizado na ausência do outro. O efeito dos dois tratamentos pode ser parcialmente aditivo, totalmente aditivo ou mais do que aditivo. A administração pode ser tal que um efeito do primeiro tratamento administrado seja ainda detectável quando o segundo é administrado.
[0135] Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz do vírus recombinante é identificada pela medição de uma resposta imune a um antígeno no indivíduo e/ou o método de tratamento do indivíduo ainda compreende medir uma resposta imune a um antígeno no indivíduo. Doença hiperproliferativas, por exemplo, cânceres, podem ser caracterizados por imunossupressão, e medir uma resposta imune a um antígeno no indivíduo pode ser indicativo do nível de imunossupressão no indivíduo. Por conseguinte, medir uma resposta imune a um antígeno no indivíduo pode ser indicativo da eficácia do tratamento e/ou da quantidade eficaz do vírus recombinante. A resposta imune ao antígeno no indivíduo pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, a resposta imune ao antígeno é medida injetando no indivíduo o antígeno em um sítio de injeção na pele do indivíduo e medindo o tamanho de uma induração ou
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50/62 quantidade de inflamação no sítio de injeção. Em determinadas modalidades, a resposta imune ao antígeno é medida por liberação de uma citocina de uma célula do indivíduo (por exemplo, interferon gama, IL-4 e/ou IL-5) quando da exposição ao antígeno.
[0136] Ao longo da descrição, onde vírus, composições e sistemas são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo componentes específicos, ou onde processos e métodos são descritos como tendo, incluindo ou compreendendo etapas específicas, contempla-se que, adicionalmente, existem composições, dispositivos e sistemas da presente invenção que consistem essencialmente ou consistem nos componentes citados, e que existem processos e métodos de acordo com a presente invenção que consistem essencialmente ou consistem nas etapas de processamento citadas.
[0137] No pedido, onde um elemento ou componente é dito estar incluído em e/ou ser selecionado de uma lista de elementos ou componentes citados, deve-se compreender que o elemento ou componente pode ser qualquer um dos elementos ou componentes citados, ou que o elemento ou componente pode ser selecionado de um grupo que consiste em dois ou mais dos elementos ou componentes citados.
[0138] Além disso, deve-se entender que os elementos e/ou características de um vírus, uma composição, um sistema, um método ou um processo descrito neste documento podem ser combinados de várias maneiras sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção, sejam explícitas ou implícitas aqui. Por exemplo, quando referência é feita a um composto particular, esse composto também pode ser usado em várias modalidades de composições da presente invenção e/ou em métodos da presente invenção, a menos que seja de outro modo entendido a partir do contexto. Em outras palavras, dentro deste pedido, as modalidades foram descritas e apresentadas de modo
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51/62 a permitir que um pedido claro e conciso seja escrito e desenhado, mas pretende-se e será apreciado que as modalidades podem ser combinadas ou separadas de várias maneiras sem se afastar dos presentes ensinamentos e invenção(ões). Por exemplo, será apreciado que todas as características descritas e apresentadas neste documento podem ser aplicáveis a todos os aspectos da(s) invenção(ões) descrita(s) e apresentada(s) aqui.
[0139] Deve ser entendido que a expressão pelo menos um inclui individualmente cada um dos objetos citados após a expressão e as várias combinações de dois ou mais dos objetos citados, a menos de outra forma entendido pelo contexto e uso. A expressão e/ou em conexão com três ou mais objetos citados deve ser entendida como tendo o mesmo significado, a menos que seja de outra forma entendido pelo contexto.
[0140] O uso do termo incluir, inclui, incluindo, ter, tem, tendo, conter, contém ou contendo, incluindo seus equivalentes gramaticais, deve ser entendido geralmente como aberto e nãolimitante, por exemplo, não excluindo elementos ou etapas adicionais não citadas, a menos que de outra forma especificado ou entendido pelo contexto.
[0141] Em vários locais do presente relatório descritivo, vírus, composições, sistemas, processos e métodos, ou características dos mesmos, são divulgados em grupos ou em intervalos. Pretende-se especificamente que a descrição inclua cada subcombinação individual dos membros de tais grupos e intervalos. Por meio de outros exemplos, um número inteiro na faixa de 1 a 20 é especificamente destinado a divulgar individualmente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 16, 17, 18, 19e20.
[0142] Quando o uso do termo cerca de é anterior a um valor quantitativo, a presente invenção também inclui o próprio valor
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52/62 quantitativo específico, a menos que especificamente indicado de outra forma. Como usado neste documento, o termo cerca de refere-se a uma variação de ± 10% do valor nominal, a menos que indicado ou inferido de outra forma.
[0143] Deve-se compreender que a ordem de etapas ou a ordem de execução de determinadas ações é imaterial, desde que a presente invenção permaneça operável. Além disso, duas ou mais etapas ou ações podem ser realizadas simultaneamente.
[0144] O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa neste documento, por exemplo, tal como ou incluindo, destina-se apenas a melhor ilustrar a presente invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da presente invenção.
EXEMPLOS [0145] Os seguintes Exemplos são meramente ilustrativos e não pretendem limitar o escopo ou conteúdo da invenção de qualquer forma. Exemplo 1: Construção de Plasmídeo e Adenovirus [0146] Este Exemplo descreve a produção de adenovirus tipo 5 recombinantes (Ad5) com deleções na região promotora E1a que incluem um TATA e/ou um CAAT box.
[0147] O plasmídeo de vetor adenoviral pXC1, que porta a porção 5’ do genoma Ad5, foi adquirido de Microbix Biosystem (Toronto, Canada). A sequência de nucleotídeos do plasmídeo de vetor pXC1 é representada neste documento na SEQ ID NQ: 2. A sequência de referência do NCBI de genoma Ad5 AC_000008.1 é representada neste documento na SEQ ID NQ: 8. A Figura 1F apresenta a sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad5 de tipo selvagem até o códon inicial do gene E1a indicando a localização do CAAT box e TATA box.
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53/62 [0148] O plasmídeo de vetor pXC1 modificado foi gerado, o qual tinha uma deleção de 200 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 352-551 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 353-552 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o CAAT box e o TATA box no promotor E1a. O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1-A350, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-A350. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de pXC1-A350, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na SEQ ID NQ: 20. A sequência de nucleotídeos de comprimento total de pXC1-A350 é mostrada na SEQ ID NQ: 4. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de AdΔ350, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na Figura 1A e SEQ ID NQ: 3. Os vinte e um nucleotídeos no terminal 5’ do plasmídeo de vetor pXC1 (e qualquer plasmídeo de vetor pXC1 modificado) diferem da sequência adenoviral de tipo selvagem, no entanto, esses nucleotídeos são convertidos na sequência adenoviral de tipo selvagem durante o processo de geração de um adenovirus recombinante.
[0149] Onde indicado, pXC1-A350 foi ainda modificado para portar um sítio Sall no sítio de iniciação da região E1 b-19k e um sítio Xhol 200 pares de base 3’ do sítio Sail para facilitar a inserção de transgene terapêuticos. A sequência de nucleotídeos da região E1b-19k modificada é dada na SEQ ID NQ: 5. O plasmídeo de vetor resultante é doravante referido como pXC1-A350-A19k, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-A350-A19k.
[0150] Onde indicado, o gene para GM-CSF de murino foi clonado em pXC1-A350-A19k na região E1b-19k modificada entre os sítios Sail e Xhol. A sequência de aminoácidos para GM-CSF de camundongo é dada na SEQ ID NQ: 6. O plasmídeo de vetor resultante é doravante referido como pXC1-A350-mGM-CSF, e quaisquer partículas virais
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54/62 resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-A350-mGM-CSF.
[0151] Um plasmídeo de vetor pXC1 modificado adicional foi gerado, o qual tinha uma deleção de 8 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 467-474 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 468-475 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o TATA box no promotor E1a. O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1 -TATA, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-TATA. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de pXC1-TATA, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na SEQ ID NQ: 21. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-TATA, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na Figura 1B e SEQ ID NQ: 15.
[0152] Um plasmídeo de vetor pXC1 modificado adicional foi gerado, o qual tinha uma deleção de 9 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 422-430 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 423-431 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o CAAT box no promotor E1a. O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1-CAAT, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-CAAT. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de pXC1-CAAT, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na SEQ ID NQ: 22. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad- CAAT, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na Figura 1C e SEQ ID NQ: 16.
[0153] Um plasmídeo de vetor pXC1 modificado adicional foi gerado, o qual tinha uma deleção de 9 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 422-430 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 423-431 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o CAAT box no promotor E1a, e uma deleção de 8 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 467-474 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos
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55/62 nucleotídeos 468-475 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o TATA box no promotor E1a. O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1-CAAT-TATA, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-CAAT-TATA. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de pXC1-CAAT-TATA, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na SEQ ID NQ: 23. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-CAAT-TATA, até o códon inicial do gene E1 a, é mostrada na Figura 1D e SEQ ID NQ: 17.
[0154] Um plasmídeo de vetor pXC1 modificado adicional foi gerado, o qual tinha uma deleção de 9 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 422-430 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 423-431 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram o CAAT box no promotor E1a, e uma deleção de 4 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 471-474 da SEQ ID NQ: 2 (que correspondem aos nucleotídeos 472-475 da SEQ ID NQ: 8), que incluíram a sequência de TATA de quatro nucleotídeos do TATA box no promotor E1 a (doravante referida como a deleção de mTATA ou TATA mínima). O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1-CAAT-mTATA, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-CAAT-mTATA. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de pXC1-CAAT-mTATA, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na SEQ ID NQ: 25. A sequência de nucleotídeos da terminação 5’ de Ad-CAAT-TATA, até o códon inicial do gene E1a, é mostrada na Figura 1E e SEQ ID NQ: 26.
[0155] Um plasmídeo de vetor pXC1 modificado adicional foi gerado, o qual tinha uma deleção de 50 nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 194-243 da SEQ ID NQ: 2 (que corresponde aos nucleotídeos 195-244 da SEQ ID NQ: 8 e nucleotídeos -304 a -255 a montante do sítio de iniciação de E1a) que torna a expressão de E1a seletiva de câncer (conforme previamente descrito na Patente dos EUA
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NQ. 9.073.980). O plasmídeo de vetor mutado é doravante referido como pXC1- TAV-255, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad- TAV-255. Onde indicado, pXC1- TAV-255 foi ainda modificado para portar um sítio Sail no sítio de iniciação da região E1b-19k e um sítio Xhol 200 pares de base 3’ do sítio Sail para facilitar a inserção de transgene terapêuticos, conforme descrito acima. O plasmídeo de vetor resultante é doravante referido como pXC1-TAV -A19k, e quaisquer partículas virais resultantes produzidas a partir dos mesmos são doravante referidas como Ad-TAV-ΔΙ 9k.
[0156] Os vários plasmídeos pXC1 modificados foram cotransfectados com o plasmídeo pJM17 em células HEK-293- para permitir a recombinação homóloga para resgatar vírus recombinantes. O vírus foi coletado e submetidos a dois rounds de purificação de placa e sequenciamento para testar a presença da deleção correspondente conforme necessário.
Exemplo 2: Expressão de E1a a partir de Ad-A350 em Células Normais e Cancerosas [0157] Este Exemplo descreve uma comparação entre expressão de proteína viral de adenovirus Ad-A350 modificado em células normais e cancerosas.
[0158] Células Pand (células de câncer pancreático humanas) e células WI-38 (fibroblastos de pulmão humanos não cancerosos) foram infectadas com vírus Ad-A350 ou Ad-TAV-255, preparados conforme descrito no Exemplo 1. A expressão de E1a foi avaliada por Western blot nos horários indicados após a infecção.
[0159] Como representado nas Figuras 2A e 2B, após a infecção com o vírus Ad-A350, as células WI-38 expressaram a proteína adenoviral E1a em níveis mais baixos e pontos no tempo mais tardios do que células Pand.
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57/62 [0160] Células Panel e células A549 (células de câncer de pulmão humanas) foram infectadas com Ad-TAV-255 ou Ad-A350 em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 3 ou 5 e a expressão de E1a foi avaliada por Western blot 72 horas após a infecção. Como representado na Figura 3A (células Pand) e na Figura 3B (células A549), ambas as linhagens de células cancerosas suportam altos níveis de expressão de E1a dos vírus Ad-A350 ou Ad-TAV-255.
[0161] Juntos, esses resultados mostram que uma região de 200 nucleotídeos em Ad5, incluindo o TATA box de E1a, é necessária para a expressão de E1a em células não cancerosas, embora esta região seja dispensável para a expressão de E1a em células tumorais.
Exemplo 3: Citotoxicidade de Ad-A350, Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAATTATA e Ad-CAAT-mTATA em células normais e cancerosas [0162] Este Exemplo descreve uma comparação entre a citotoxicidade resultante dos adenovirus modificados Ad-A350, AdCAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA e Ad-CAAT-mTATA em células normais e cancerosas.
[0163] Células HCT116 (células de câncer de cólon humanas), células Pand e células A549 foram infectadas com Ad-A350, preparado conforme descrito no Exemplo 1. As células foram infectadas na MOI indicada ou mantidas como controles não infectados e coloridas com violeta cristal, que colore células viáveis de azul nos tempos indicados após a infecção. Como representado na Figura 4A, cada uma das linhagens de células cancerosas apresentou grande morte celular de quatro a cinco dias após a infecção.
[0164] Um painel de linhagens de células cancerosas foi infectado com Ad-CAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA ou Ad-CAAT-mTATA, preparado conforme descrito no Exemplo 1. O painel incluiu células A549, Pand, HCT116, Hep3b, ADS-12m ASPC 1, HT-29 e MeWo. As células foram infectadas em uma MOI de 5 e coloridas com violeta cristal
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3-4 dias após a infecção. Como um controle, as linhagens celulares foram cultivadas sem infecção ou infectadas com o vírus oncolítico AdTAV-A19k previamente descrito. Os resultados são mostrados nas Figuras 5-11. Todas as linhagens de células cancerosas humanas apresentaram grande morte celular após a infecção, particularmente cinco dias após a infecção, enquanto a linhagem celular de camundongo ADS-12 apresentou morte celular variável após a infecção com cada um do vírus.
[0165] Células MRC5 não cancerosas (fibroblastos de pulmão humanos) e células WI38 foram infectadas com Ad-A350 ou Ad-TAV preparados conforme descrito no Exemplo 1. As células foram infectadas na MOI indicada e coloridas com violeta cristal dez dias após a infecção. Como representado na Figura 4B, em oposição às células cancerosas que foram exterminadas em 4-5 dias pós-infecção, as células não cancerosas permaneceram viáveis até 10 dias após a infecção.
[0166] Células WI38 não cancerosas foram infectadas com AdCAAT, Ad-TATA, Ad-CAAT-TATA, Ad-A350 e Ad-TAV-A19k, preparados conforme descrito no Exemplo 1, em 3 e 5 MOI e coloridas com violeta cristal quatro dias (Figura 12) ou seis dias (Figura 13) após a infecção. Os resultados demonstram que houve mínima citotoxicidade após infecção para cada vírus.
[0167] Juntos, esses resultados mostram que uma região de 200 nucleotídeos em Ad5, incluindo o E1a TATA box, é necessária para citotoxicidade mediada por Ad5 em células não cancerosas, embora esta região seja dispensável para citotoxicidade mediada por Ad5 em células tumorais. Da mesma forma, vírus Ad5 com deleções no promotor E1 a do TATA box sozinho, do CAAT box sozinho ou de ambos o TATA e CAAT boxes apresentaram citotoxicidade seletiva de câncer. Exemplo 4: Expressão de Transgene Terapêutico a partir de Ad-A350
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59/62 em Células Normais e Cancerosas [0168] Adenovirus portando a deleção de Δ350 foram ainda investigados quanto ao seu potencial de serem armados com um transgene terapêutico no lugar do gene E1b-19k viral. Os seguintes vírus foram gerados conforme descrito no Exemplo 1: o vírus Ad-A350A19k, que porta a deleção de Δ350 e tem a região 19k deletada sem a subsequente inserção de qualquer transgene; o vírus Ad-A350-mGMCSF, que porta a deleção de Δ350 e porta o gene para GM-CSF de camundongo clonado na região E1 b-19k entre Sail e Xhol; e o vírus AdTAV- Δ19k, que porta a deleção de TAV-255 e tem a região 19k deletada sem a subsequente inserção de qualquer transgene.
[0169] Células Pand cancerosas, células A549 e células ADS12 (carcinoma de pulmão de camundongo) foram infectadas com Ad-A350A19k na MOI indicada e coloridas com violeta cristal cinco dias após a infecção. Como representado na Figura 14, as linhagens de células cancerosas foram exterminadas de maneira dependente de dose.
[0170] Células Pand cancerosas, células A549 e células ADS12 foram infectadas com Ad-A350-mGM-CSF na MOI indicada e coloridas com violeta cristal cinco dias após a infecção. Como mostrado na Figura 15, o vírus portando o gene para GM-CSF de camundongo manteve a atividade oncolítica.
[0171] Células A549, HCT116, Hep3b e MeWo foram infectadas com Ad-A350-mGM-CSF, Ad-A350-A19k e Ad-TAV-A19k em uma MOI de 5 e coloridas com violeta cristal 3 a 5 dias após a infecção. Como mostrado nas Figuras 16-21, Ad-A350-mGM-CSF manteve a atividade citolítica comparável a Ad-A350-A19k e Ad-TAV-A19k.
[0172] As células A549 foram infectadas com Ad-A350-A19k, ou vírus Ad-A350-mGM-CSF a 10 MOI. Meio condicionado quatro dias após a infecção foi usado em um ELISA para mGM-CSF. Como mostrado na Figura 22, Ad-A350-mGM-CSF induziu a expressão de
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60/62 mGM-CSF.
[0173] Células ADS12 foram infectadas com Ad-A350-A19k ou AdA350-mGM-CSF na MOI indicada, e meio condicionado quatro dias após a infecção foi usado em um ELISA para mGM-CSF. Como mostrado na Figura 23, Ad-A350-mGM-CSF induziu a expressão de mGM-CSF nesta linhagem celular de câncer de camundongo.
[0174] Juntos, esses resultados mostram que uma região de 200 nucleotídeos em Ad5, incluindo o TATA e CAAT boxes de E1a, é necessária para a expressão do transgene terapêutico a partir de um sítio de expressão de E1 b-19k em células não cancerosas, embora esta região seja dispensável para a expressão do transgene terapêutico a partir do sítio de expressão de E1 b-19k em células tumorais.
Exemplo 5: Atividade Anticâncer de Ad-A350 [0175] Este Exemplo descreve a atividade anticâncer de adenovirus recombinantes com deleções de TATA box e/ou CAAT box produzidas conforme descrito no Exemplo 1.
[0176] Camundongos (cepa 129S4) foram injetados por via subcutânea com células ADS-12 (câncer de pulmão de camundongo) e foi permitida a formação de tumores. Após os tumores atingirem um volume de aproximadamente 50-100 mm3, os camundongos foram randomizados para o tratamento com Ad-A350-A19k, Ad-TAV-A19k (como controle positivo para um vírus oncolítico efetivo) ou tampão (como controle negativo). Os camundongos foram dosados com injeções intratumorais do tratamento indicado dadas a cada quatro dias para três doses. Como mostrado na Figura 24, os camundongos tratados com o tampão tiveram rápido crescimento do tumor enquanto os camundongos tratados com Ad-A350-A19k ou Ad-TAV-ΔΙ 9k tiveram reduções no tamanho do tumor e, em muitos casos, nenhum tumor remanescente detectável.
[0177] Estes resultados sugerem que Ad-A350-A19k, portando uma
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61/62 deleção que remove tanto o CAAT box quanto o TATA box do promotor para o gene viral E1A, é um tratamento de câncer eficaz.
Exemplo 6: Deleção de TATA box em Ad35 [0178] Este Exemplo descreve a produção de adenovirus tipo 35 recombinantes (Ad35) com deleções na região promotora E1a que incluem um TATA box.
[0179] O promotor E1a de adenovirus tipo 35 (Ad35) contém um TATA box nos nucleotídeos correspondentes aos nucleotídeos 477 a 484 da SEQ ID NQ: 24. Um adenovirus recombinante Ad35 foi gerado com o TATA box deletado por conversão da sequência natural de TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGTATTTATACCTCAGG GTTTGTGTCAAGAGGCCACTCTT (SEQ ID NQ: 18; TATA box sublinhado) em TTTTACGTAGGTGTCAGCTGATCGCTAGGGCCTCAGGGTTTGTGT CAAGAGGCCACTCTT (SEQ ID NQ: 19).
[0180] Células HEK-293 foram transfectadas com genomas para o vírus Ad35 deletado em TATA e, como mostrado na Figura 25, desenvolveram um efeito citopático indicativo de crescimento viral. Os resultados sugerem que um adenovirus recombinante Ad35 gerado com o TATA box deletado pode ser adequado como um vírus oncolítico.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA [0181] A divulgação completa de todos os documentos de patentes e artigos científicos referidos neste documento é incorporada por referência para todos os propósitos.
EQUIVALENTES [0182] Uma invenção pode ser incorporada em outras formas específicas sem se afastar do espírito ou características essenciais da mesma. As modalidades acima são, portanto, consideradas, em todos os aspectos, ilustrativas e não limitativas na invenção descrita no presente neste documento. O escopo da invenção é assim indicado
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62/62 pelas reivindicações anexas e não pela descrição anterior, e todas as alterações que se enquadram no significado e no intervalo de equivalência das reivindicações devem ser neles incluídas.

Claims (87)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) um promotor à base de TATA box modificado operacionalmente ligado a um gene, em que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa; e/ou (ii) um promotor à base de CAAT box modificado operacionalmente ligado a um gene, em que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  2. 2. Vírus recombinante compreendendo um promotor à base de TATA box modificado operacionalmente ligado a um gene, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  3. 3. Vírus recombinante compreendendo um promotor à base de CAAT box modificado operacionalmente ligado a um gene, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  4. 4. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é selecionado de um vírus vaccinia recombinante, adenovirus, vírus adenoassociado (AAV), herpes vírus simples 1 (HSV1), vírus do mioxoma, reovírus, poliovirus, vírus da estomatite vesicular (VSV), vírus do sarampo (MV), e vírus da doença de Newcastle (NDV).
  5. 5. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é um adenovirus recombinante.
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    2/14
  6. 6. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é selecionado de um adenovirus tipo 5 e um adenovirus tipo 35.
  7. 7. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o adenovirus é um adenovirus tipo 5.
  8. 8. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4 a 7, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de TATA box modificado é um promotor de gene da fase precoce.
  9. 9. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de TATA box modificado é um promotor E1a, promotor E1b ou promotor E4.
  10. 10. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de TATA box modificado é um promotor E1a.
  11. 11. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 ou 4 a 10, caracterizado pelo fato de que a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado compreende uma exclusão de todo o TATA box.
  12. 12. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -27 a 24 do promotor E1a.
  13. 13. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -31 a -24 do promotor E1a.
  14. 14. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -44 a +54 do promotor E1a.
  15. 15. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 14,
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    3/14 caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -146 a +54 do promotor E1a.
  16. 16. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 472 a 475 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  17. 17. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 468 a 475 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  18. 18. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 455 a 552 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  19. 19. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 353 a 552 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  20. 20. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de polinucleotídeos que resulta em um vírus compreendendo a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12) e/ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13).
  21. 21. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus tipo 5 compreendendo uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -27 a -24 da região do promotor E1a.
  22. 22. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -31 a -24 da região do promotor E1a.
  23. 23. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 22,
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    4/14 caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -44 a +54 da região do promotor E1a.
  24. 24. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a -146 a +54 da região do promotor E1a.
  25. 25. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus tipo 5 compreendendo uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 472 a 475 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  26. 26. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 468 a 475 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  27. 27. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 455 a 552 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  28. 28. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 353 a 552 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  29. 29. Vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de polinucleotídeos que resulta em um adenovirus tipo 5 compreendendo a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7), AGTGCCCG (SEQ ID NQ: 12), ou TATTCCCG (SEQ ID NQ: 13).
  30. 30. Vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de polinucleotídeos que resulta em um adenovirus tipo 5 compreendendo a sequência CTAGGACTG (SEQ ID NQ: 7).
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    5/14
  31. 31. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 3 a 20, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor de gene da fase precoce.
  32. 32. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor E1a, promotor E1b ou promotor E4.
  33. 33. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o promotor à base de CAAT box modificado é um promotor E1a.
  34. 34. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 a 20 ou 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a modificação incluída no promotor à base de CAAT box modificado compreende uma exclusão de todo o CAAT box.
  35. 35. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotideos correspondentes a -76 a 68 do promotor E1a.
  36. 36. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotideos correspondentes a 423 a 431 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  37. 37. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de polinucleotídeos que resulta em um vírus compreendendo a sequência TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14).
  38. 38. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus tipo 5 compreendendo uma exclusão de nucleotideos correspondentes a -76 a -68 da região do promotor E1a.
  39. 39. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus tipo 5 compreendendo uma exclusão de
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    6/14 nucleotídeos correspondentes a 423 a 431 do genoma Ad5 (SEQ ID NQ: 8).
  40. 40. Vírus recombinante, em que o vírus é um adenovirus tipo 5, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de polinucleotídeos que resulta em um adenovirus tipo 5 compreendendo a sequência TTCCGTGGCG (SEQ ID NQ: 14).
  41. 41. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o vírus compreende uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 477 a 484 do genoma Ad35 (SEQ ID NQ: 24).
  42. 42. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que o vírus é um adenovirus tipo 35 compreendendo uma exclusão de nucleotídeos correspondentes a 477 a 484 do genoma Ad35 (SEQ ID NQ: 24).
  43. 43. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que a modificação incluída no promotor à base de TATA box modificado ou promotor à base de CAAT box não compreende uma adição ou uma substituição com uma sequência de promotor funcional separada.
  44. 44. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um transgene terapêutico.
  45. 45. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico selecionado de uma oncoproteína, polipeptídeo supressor de tumor, enzima, citocina, polipeptídeo de modulação imune, anticorpo, peptídeo lítico, antígeno de vacina, polipeptídeo que complementa defeitos genéticos em células somáticas, e um polipeptídeo que catalisa processos que levam à morte celular.
  46. 46. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 44,
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    7/14 caracterizado pelo fato de que o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico selecionado de um agente apoptótico, anticorpo, peptídeo responsive a CTL, citocina, agente citolítico, agente citotóxico, enzima, antígeno heterólogo expresso na superfície de uma célula tumoral para gerar uma resposta imune, agente imunoestimulador ou imunomodulador, interferon, peptídeo lítico, oncoproteína, polipeptídeo que catalisa processos que levam à morte celular, polipeptídeo que complementa defeitos genéticos em células somáticas, proteína de supressão tumoral, antígeno de vacina, e quaisquer combinações dos mesmos.
  47. 47. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico selecionado de acetilcolina, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-1, uma cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo anti-PD-L1, BORIS/CTCFL, CD19, CD20, CD80, CD86, CD137L, CD154, DKK1/Wnt, ICAM-1, IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-17, IL-23, IL-23A/p19, interferon-gama, TGF-β, um TGF-β trap, FGF, IL-24, IL-27, IL-35, MAGE, NY-ESO-1, p53 e timidina quinase.
  48. 48. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o transgene terapêutico codifica um TGFβ trap.
  49. 49. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o transgene terapêutico codifica um ácido nucleico terapêutico selecionado de um RNA antissenso e uma ribozima.
  50. 50. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 49, caracterizado pelo fato de que o adenovirus compreende um sítio de iniciação de E1b-19K e E1b-55K, e em que a sequência de nucleotídeos codificando o transgene terapêutico é
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    8/14 inserida entre o sítio de iniciação de E1b-19K e o sítio de iniciação de E1b-55K.
  51. 51. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente se replica em uma célula hiperproliferativa.
  52. 52. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente se replica em uma célula de paragem de não crescimento.
  53. 53. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 52, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente tem atividade citolítica em uma célula hiperproliferativa.
  54. 54. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente tem atividade citolítica em uma célula de paragem de não crescimento.
  55. 55. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 54, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente expressa E1a e/ou E1b em uma célula hiperproliferativa.
  56. 56. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 55, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente expressa E1a e/ou E1b em uma célula de paragem de não crescimento.
  57. 57. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 44 a 56, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente expressa o transgene terapêutico em uma célula hiperproliferativa.
  58. 58. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das
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    9/14 reivindicações 44 a 57, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante seletivamente expressa o transgene terapêutico em uma célula de paragem de não crescimento.
  59. 59. Vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que a célula hiperproliferativa é uma célula cancerosa, célula endotelial, célula epidérmica, fibroblasto e/ou célula imune.
  60. 60. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a célula hiperproliferativa é uma célula cancerosa.
  61. 61. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a célula cancerosa é selecionada do grupo que consiste em uma célula de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer testicular e câncer de tireoide.
  62. 62. Vírus recombinante, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que a célula cancerosa é selecionada de uma célula de câncer de pulmão, uma célula de câncer de cólon e uma célula de câncer pancreático.
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  63. 63. Vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência reguladora viral modificada ou excluída que permite a expressão seletiva do vírus em uma célula hiperproliferativa.
  64. 64. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o vírus recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63, e pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
  65. 65. Método de expressão de um transgene terapêutico em uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende a exposição da célula alvo a uma quantidade eficaz do vírus recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 44 a 63, para expressar o transgene alvo.
  66. 66. Método de inibição de proliferação de uma célula tumoral, caracterizado pelo fato de que compreende a exposição da célula alvo a uma quantidade eficaz de vírus recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63, para inibir a proliferação da célula tumoral.
  67. 67. Método de inibição de crescimento tumoral em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do vírus recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63, para inibir proliferação do tumor.
  68. 68. Método de tratamento de câncer em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do vírus recombinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 63, para tratar o câncer no indivíduo.
  69. 69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de melanoma, carcinoma de
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    11/14 células escamosas da pele, carcinoma de célula basal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer anal, câncer cervical, câncer de pulmão de células não pequenas, mesotelioma, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células renais, câncer de próstata, câncer gastroesofágico, câncer colorretal, câncer testicular, câncer de bexiga, câncer de ovário, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, câncer cerebral, câncer endometrial, câncer neuroendocrine, carcinoma de células de Merkel, tumores estromais gastrointestinais, um sarcoma e câncer pancreático.
  70. 70. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de câncer anal, carcinoma de célula basal, câncer de bexiga, câncer ósseo, câncer cerebral, câncer de mama, carcinoma, colangiocarcinoma, câncer cervical, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer gastroesofágico, câncer gastrointestinal (Gl), tumor estromal gastrointestinal, carcinoma hepatocelular, câncer ginecológico, câncer de cabeça e pescoço, câncer hematológico, câncer de rim, leucemia, câncer de fígado, câncer de pulmão, linfoma, melanoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, câncer neuroendocrine, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de ovário, câncer pancreático, câncer pediátrico, câncer de próstata, carcinoma de células renais, sarcoma, câncer de pele, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de células escamosas da pele, câncer de estômago, câncer testicular e câncer de tireoide.
  71. 71. Método, de acordo com as reivindicações 67 a 70, caracterizado pelo fato de que o vírus recombinante é administrado em combinação com uma ou mais terapias selecionadas de cirurgia, radiação, quimioterapia, imunoterapia, terapia hormonal e viroterapia.
  72. 72. Método de tratamento de uma doença hiperproliferativa em um indivíduo em necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de
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    12/14 que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do vírus recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, para tratar a doença hiperproliferativa no indivíduo.
  73. 73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a doença hiperproliferativa é selecionada de aterosclerose, artrite reumatoide, psoríase, lúpus, fibrose pulmonar idiopática, hipertensão pulmonar por esclerodermia, asma, fibrose renal, COPD, fibrose cística, DIP, UIP, degeneração macular, restenose, retinopatias, distúrbios de fibroblastos hiperproliferativos, esclerodermia, glomerulonefrite, nefropatia diabética, nefrosclerose maligna, síndromes de microangiopatia trombótica, rejeição a transplante, glomerulopatias e cirrose.
  74. 74. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a doença hiperproliferativa é selecionada de aterosclerose, artrite reumatoide, psoríase, lúpus, fibrose pulmonar idiopática, esclerodermia e cirrose.
  75. 75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 74, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz do vírus recombinante é de 102-1015 unidades de formação de placa (pfus).
  76. 76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67-75, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
  77. 77. Método de desenvolvimento de um vírus oncolítico, caracterizado pelo fato de que compreende modificar um promotor à base de TATA box viral operacionalmente ligado a um gene, tal que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  78. 78. Método de desenvolvimento de um vírus oncolítico, caracterizado pelo fato de que compreende modificar um promotor à base de CAAT box viral operacionalmente ligado a um gene, tal que o
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    13/14 promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  79. 79. Método de desenvolvimento de um vírus oncolítico, caracterizado pelo fato de que compreende modificar um promotor à base de TATA box viral operacionalmente ligado a um gene, tal que o promotor à base de TATA box modificado não possui um TATA box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa e/ou modificar um promotor à base de CAAT box viral operacionalmente ligado a um gene tal que o promotor à base de CAAT box modificado não possui um CAAT box funcional e permite a expressão seletiva do gene em uma célula hiperproliferativa.
  80. 80. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada da SEQ ID NQ: 3, SEQ ID NQ: 15, SEQ ID NQ: 16, SEQ ID NQ: 17, SEQ ID NQ: 20, SEQ ID NQ: 21, SEQ ID NQ: 22 e SEQ ID NQ: 23.
  81. 81. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NQ: 3.
  82. 82. Ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico isolado compreende a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NQ: 4.
  83. 83. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o ácido nucleico isolado, como definido em qualquer uma das reivindicações 80 a 82.
  84. 84. Método de produção de um vírus recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) cultivar a célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 83, sob condições para produzir o vírus recombinante; e (b) purificar o vírus recombinante.
  85. 85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
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    14/14
    65 a 76, caracterizado pelo fato de que o método ainda compreende medir uma resposta imune a um antígeno no indivíduo.
  86. 86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 76 ou 85, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz do vírus recombinante é identificada pela medição de uma resposta imune a um antígeno no indivíduo.
  87. 87. Método, de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizado pelo fato de que a resposta imune ao antígeno é medida injetando no indivíduo o antígeno em um sítio de injeção na pele do indivíduo e medindo o tamanho de uma induração no sítio de injeção.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6576326B2 (ja) 2013-03-14 2019-09-18 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 腫瘍溶解性アデノウイルス組成物
AU2017223589B2 (en) 2016-02-23 2023-08-03 Salk Institute For Biological Studies Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics
CA3013637A1 (en) 2016-02-23 2017-08-31 Salk Institute For Biological Studies High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
CN111133102B (zh) * 2017-04-10 2024-08-16 埃皮辛特瑞柯斯公司 生产重组病毒的方法
WO2024015876A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Epicentrx, Inc. Adenoviral vectors encapsulated in cationic liposomes, and preparation and use thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001023004A1 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Replication selective adenoviruses for use in cancer therapy
CA2442670A1 (en) * 2001-04-13 2002-10-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of treating or retarding the development of blindness
CN1597939A (zh) * 2001-11-15 2005-03-23 杭州中肽生化有限公司 多功能抗癌重组腺病毒
CN101319215B (zh) * 2008-07-01 2010-12-22 郑骏年 人肿瘤特异性Ki67基因启动子
FI20090030A0 (fi) * 2009-02-02 2009-02-02 Akseli Eetu Hemminki Onkolyyttiset virukset
US9073980B2 (en) 2009-03-02 2015-07-07 The Regents Of The University Of California Tumor selective E1a and E1b mutants
JP5969044B2 (ja) * 2011-11-24 2016-08-10 バイロメッド カンパニー リミテッド アデノウイルス生産新規細胞株及びその用途
FI123955B (en) 2011-11-25 2014-01-15 Oncos Therapeutics Ltd Oncolytic adenovirus
US20140350087A9 (en) * 2012-03-22 2014-11-27 Halozyme, Inc. Oncovector Nucleic Acid Molecules and Methods of Use
EP3552615B8 (en) 2014-07-16 2022-03-02 Transgene Oncolytic virus for expression of immune checkpoint modulators
KR102702230B1 (ko) * 2017-05-26 2024-09-03 에피센트알엑스, 인코포레이티드 트랜스진을 보유하는 재조합 아데노바이러스

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