ES2968042T3 - Uso de DREADD para la modulación neuronal en el tratamiento de enfermedades neuronales - Google Patents
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Abstract
Un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad hipocinética neuronal o una enfermedad hipercinética neuronal mediante la modulación de la actividad neuronal en: el globo pálido interno (GPi), en el tálamo motor anterior y/o en el globo pálido externo (GPe).) y/o en el núcleo subtalámico (STN) mediante la utilización de DREADD supresores y/o potenciadores. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de DREADD para la modulación neuronal en el tratamiento de enfermedades neuronales
Campo de la invención
Se proporciona un DREADD inhibidor y un DREADD excitador para su uso en el tratamiento de una enfermedad hipocinética neuronal.
Antecedentes de la invención
Varias estrategias novedosas que utilizan receptores diseñados activados por ligandos sintéticos o por luz han dado paso a una nueva era de investigación cerebral que permite una manipulación experimental precisa de la actividad neuronal. Estas técnicas se están utilizando actualmente para investigar la participación de circuitos cerebrales discretos en comportamientos complejos (Ferguson y Neumaier, 2012).
Uno de estos enfoques utiliza receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) para modular las funciones celulares (Rogan y Roth, 2011). Se ha demostrado que esta familia de receptores muscarínicos evolucionados aumenta la actividad celular (Gs-DREADD; Gq-DREADD) o disminuye la actividad celular (Gi/o-DREADD) después de la administración de un ligando sintético por lo demás inerte, la clozapina-n-óxido (Armbruster y col., 2007). Cuando se empaquetan en vectores virales o se expresan en modelos transgénicos de ratón, estas herramientas permiten controlar la actividad celular de una forma espacial y temporal definida. Por ejemplo, la activación de las neuronas del hipocampo por los receptores Gq-DREADD amplifica los ritmos<y>y aumenta la actividad locomotora y la estereotipia en ratones (Alexander y col., 2009). La actividad de las células no neuronales también puede ser controlada por los receptores DREADD, ya que la expresión y activación de los receptores Gs-DREADD o Gq-DREADD en las células p pancreáticas aumenta la liberación de insulina, y la activación repetida de estos receptores lleva a la hipertrofia de las células p (Guettier y col., 2009).
Los DREADD son receptores muscarínicos mutantes. A: Los DREADD están formados por mutaciones puntuales en la tercera y quinta regiones transmembrana de receptores muscarínicos (Y149C y A239G en hM3). Además, el DREADD acoplado a Gs contiene el segundo y tercer bucles intracelulares del p1-AR en vez de los del receptor muscarínico M3. B: en las células musculares lisas de arteria pulmonar humana, el receptor hM3Dq (hM3D) se activa de forma selectiva por CNO pero no por ACh, dando lugar a la hidrólisis de PIP2. Por el contrario, el receptor muscarínico M3 de tipo salvaje (hM3) se activa potentemente por ACh pero no por CNO (Armbruster y col, 2007).
La tecnología del receptor DREADD se utilizó de una forma específica de célula para desentrañar el papel de los circuitos estriados en los trastornos neuropsiquiátricos, como la drogadicción y el trastorno obsesivo-compulsivo. Se utilizaron vectores virales que utilizan promotores de neuropéptidos (dinorfina o encefalina) para dirigir la expresión del receptor DREADD a poblaciones celulares específicas en el cuerpo estriado (neuronas estriadonigrales frente a estriadopalidales, respectivamente). Algunos resultados indicaron que la actividad reducida de forma transitoria de las neuronas estriadopalidales en ratas durante la exposición repetida a anfetamina facilitaba el desarrollo de sensibilización conductual, mientras que perturbar la actividad de las neuronas estriadonigrales interfirió en la persistencia de este fenómeno (Ferguson y col., 2011). Por lo tanto, estos resultados demuestran claramente que las neuronas estriadonigrales y estriadopalidales tienen funciones críticas pero opuestas en la regulación de la plasticidad conductual dependiente de la experiencia del fármaco.
Los DREADD también se han utilizado para controlar la actividad de las células gliales para modular el sistema nervioso autónomo (Agulhon y col.., 2013). En la periferia, los DREADD se han utilizado para controlar la señalización de GPCR en células beta pancreáticas (Guettier y col.., 2009), hepatocitos (Li y col.., 2013) y células de cáncer de mama (Yagi y col.., 2011).
Un trastorno hipocinético o hipocinesia se refiere a un movimiento corporal disminuido. La hipocinesia se caracteriza por una pérdida parcial o completa del movimiento muscular debido a una perturbación en los ganglios basales. Los pacientes con trastornos hipocinéticos como la enfermedad de Parkinson (EP) experimentan rigidez muscular e incapacidad para producir movimiento. También se asocia con trastornos de salud mental e inactividad prolongada por enfermedad, entre otras enfermedades.
Un trastorno hipercinético o hipercinesias (o hipercinesis), se refiere a un aumento de la actividad muscular que puede dar lugar a movimientos anormales excesivos, movimientos normales excesivos o una combinación de ambos. La hipercinesia es un estado de agitación excesiva que se caracteriza en una gran variedad de trastornos que afectan la capacidad de controlar el movimiento motor, tal como la enfermedad de Huntington. Muchos movimientos hipercinéticos son el resultado de una regulación inadecuada de los circuitos de los ganglios basales-talamocorticales. En muchos casos, la hipercinesia se presenta acompañada de hipotonía, una disminución del tono muscular. Muchos trastornos hipercinéticos son de naturaleza psicológica y son prominentes de forma típica en la infancia.
En la patente US-6.780.409 se proporcionan métodos y composiciones utilizados para administrar un vector de virus adenoasociado (AAV) que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la ácido glutámico descarboxilasa (GAD) a células en el núcleo subtálmico de los ganglios basales, mesafilia y tálamo. En la solicitud de patente europea n.° EP3349760 se proporcionan composiciones que incluyen el uso de receptores acoplados a proteína G y canales iónicos regulados por ligando para su uso en el tratamiento de indicaciones neurológicas que incluyen dolor, epilepsia y trastornos de saciedad. Vazey EM y Aston-Jones G, 2014 evaluaron el uso de neuronas dopaminérgicas inducidas (iDA) que se generaron mediante reprogramación directa de fibroblastos para trasplante y demostraron que las neuronas iDA postmitóticas se integran de forma estable y funcional en el cuerpo estriado del huésped para producir mejoras motoras en ratas 6-OHDA, un modelo de enfermedad de Parkinson (Vazey EM, Aston-Jones G. Designer receptors: therapeutic adjuncts to cell replacement therapy in Parkinson 's disease. J Clin Invest. 2014 Jul;124(7):2858-60. doi: 10.1172/JCI76833. Epub 2014 Jun 17. PMID: 24937425; PMCID: PMC4071398).
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un receptor de diseño inhibidor activado exclusivamente por un fármaco de diseño (DREADD) y un DREADD excitador para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno hipocinético neuronal, en donde dicho DREADD inhibidor se expresa en el globo pálido interno (GPi); y dicho DREADD excitador se expresa en: el tálamo motor anterior, globo pálido externo (GPe), núcleo subtalámico (STN) o cualquier combinación de los mismos, y en donde dicho DREADD inhibidor expresado y dicho DREADD excitador son activados por un solo ligando. Opcionalmente, dicho ligando puede ser clozapina-N-óxido (CNO).
En otra realización, transfectar neuronas de GPi con un DREADD inhibidor es inyectar un vector viral de AAV que comprende el gen DREAD Gi.
En otra realización, transfectar neuronas en el tálamo motor anterior, en el núcleo subtalámico (STN) o el globo pálido externo (GPe), con un DREADD excitador es inyectar el vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos.
En otra realización, la supresión de la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi) y la mejora de la actividad neuronal en el tálamo motor anterior, en el núcleo subtalámico (STN) o en el globo pálido externo (GPe) se llevan a cabo de forma concomitante.
En otra realización, esta invención establece además que la activación de DREADD inhibidor, la activación de DREADD excitador, o ambas, es poner en contacto las neuronas de GPi, las neuronas del tálamo motor anterior, neurona de STN, el globo pálido externo (GPe) o cualquier combinación de los mismos con CNO. En otra realización, una enfermedad o trastorno hipocinético es la enfermedad de Parkinson (EP).
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se proporciona un método para tratar a un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal, que comprende: mejorar la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi); y suprimir la actividad neuronal en el tálamo motor anterior, en el núcleo subtalámico (STN) o en el globo pálido externo (GPe), en donde mejorar la actividad neuronal comprende transfectar neuronas de GPi con un DREADD excitador y activar el DREADD excitador, en donde suprimir la actividad neuronal comprende transfectar neuronas en el tálamo motor anterior en el núcleo subtalámico (STN) o el globo pálido externo (GPe), con un DREADD inhibidor y activar el DREADD inhibidor, tratando de este modo un sujeto que padece una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal.
En otro ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, transfectar neuronas del GPi con un DREADD excitador es inyectar un vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos. En otro ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, transfectar neuronas en el tálamo motor anterior, en el núcleo subtalámico (STN) o en el globo pálido externo (GPe) con un DREADD inhibidor es inyectar un vector viral de AAV que comprende el gen DREAD Gi o transfectar neuronas en el GPi con un DREADD excitador (Gq) es inyectar un vector viral de AAV.
En otro ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal es corea, distonía, trastorno de tics, síndrome de Tourette, trastorno obsesivo compulsivo o cualquier combinación de los mismos.
Breve descripción de los dibujos
Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente descripción, solo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Con referencia específica ahora a las figuras en detalle, se enfatiza que los detalles que se muestran son a modo de ejemplo y con fines de explicar de forma ilustrativa las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción que se toma con las figuras hace que sea evidente para aquellos expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.
Figura 1. Son gráficos de barras que muestran el efecto de CNO en ratones control normales (Cont) y ratones con EP hemilateral inducida con 6OHDA (6OHDA). El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en tres parámetros de comportamiento: el número y el porcentaje de rotaciones en el sentido horario en una prueba de actividad motora de 5 minutos (A y B); la velocidad media en una prueba de actividad motora (C); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (D). El CNO no tuvo un efecto significativo en ninguno de estos parámetros de comportamiento.
Figura 2. Son gráficos de barras que muestran el efecto de DREADD Gi unilaterales en el GPi (EP) y SNr - efecto de CNO en ratones con EP hemilateral inducida por 6OHDA y que expresan DREADD Gi en los núcleos EP y SNr. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en tres parámetros de comportamiento: el número y el porcentaje de rotaciones en el sentido horario en una prueba de actividad motora de 5 minutos (A y B); la velocidad media en una prueba de actividad motora (C); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (D). El efecto beneficioso del CNO en todos los parámetros de comportamiento examinados. ** p<0,01.
Figura 3. Son gráficos de barras que muestran el efecto de DREADD Gi bilaterales en el GPi (EP) y SNr: el efecto de CNO en 6OHDA indujo EP bilateral que expresa DREADD Gi en los núcleos EP y SNr. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en dos parámetros de comportamiento: La velocidad media en una prueba de actividad motora (A); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (B). El efecto beneficioso del CNO tanto en la velocidad media como en la prueba de rotarod. ** p<0,01.
Figura 4. Son gráficos de barras que muestran el efecto de los DREADD Gq unilaterales en el GPe: el efecto del CNO en la EP hemilateral inducida por 6OHDA que expresa el DREADD Gq en el núcleo del GPe. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en tres parámetros de comportamiento: el número y el porcentaje de rotaciones en el sentido horario en una prueba de actividad motora de 5 minutos (A y B); la velocidad media en la prueba de actividad motora (C); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (D). El efecto beneficioso del CNO en todos los parámetros de comportamiento examinados. ** p<0,01.
Figura 5. Son gráficos de barras que muestran el efecto de los DREADD Gq bilaterales en el GPe: el efecto del CNO en la EP bilateral inducida por 6OHDA que expresa el DREADD Gq en ambos núcleos Gpe. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en dos parámetros de comportamiento: La velocidad media en una prueba de actividad motora (A); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba rotarod (B). El efecto beneficioso del CNO tanto en la velocidad media como en la prueba rotarod. ** p<0,01.
Figura 6. Son gráficos de barras que muestran el efecto de los DREADD Gq unilaterales en el STN: el efecto del CNO en la EP hemilateral inducida por 6OHDA que expresa el DREADD Gq en el núcleo del STN. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en tres parámetros de comportamiento: el número y el porcentaje de rotaciones en el sentido horario en una prueba de actividad motora de 5 minutos (A y B); la velocidad media en la prueba de actividad motora (C); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (D). Obsérvese el efecto beneficioso del CNO en los giros y la velocidad media, pero no en la prueba de rotarod. ** p<0,01.
Figura 7. Son gráficos de barras que muestran el efecto de los DREADD Gq bilaterales en el STN: el efecto del CNO en la EP bilateral inducida por 6OHDA que expresa el DREADD Gq en ambos núcleos del STN. El efecto de la administración ciega de CNO se comparó con NS en dos parámetros de comportamiento: La velocidad media en una prueba de actividad motora (A); y el tiempo medio que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba rotarod (B). El efecto beneficioso del CNO tanto en la velocidad media como en la prueba rotarod. ** p<0,01.
Figura 8. Son gráficos de barras que resumen el efecto de CNO en ratones con EP experimental inducida por 6OHDA que expresan DREADD en diferentes núcleos: Gi en los núcleos EP y SNr, Gq en el núcleo GPe, Gq en el STN, Gq en ambos núcleos STN (2 paneles superiores), Gi en el STN, Gq en el tálamo ventral, ratones control y ratones con EP hemilateral inducida por 6OHDA. El efecto relativo de CNO y NS (CNO/NS) se presenta para tres parámetros de comportamiento: La velocidad media en una prueba de actividad motora (A); el tiempo que los ratones permanecieron sobre la varilla giratoria en la prueba rotarod (B); y la reducción en el porcentaje de rotaciones en el sentido horario en una prueba de actividad motora de 5 minutos (C). ** p<0,01.
Figura 9. Son gráficos de barras que muestran DREADD Gi unilaterales en el GPi (EP) y SNr: Continúa la activación de 5 días: la supresión de la vía indirecta mediante una activación de 5 días de DREAD<d>Gq en el GPe de ratones con EP inducida por 6OHDA. Las pruebas de campo abierto y de Rota-Rod se realizaron durante la aplicación de 5 días de solución salina normal (NS) y CNO en ratones con EP tratados con 6-OHDA que expresan los DREADD Gq en el núcleo GPe de forma unilateral. Promedio (media±SEM) de la velocidad de movimiento (A), puntuación de Rota-Rod (B), número (C) y porcentaje (D) de rotaciones en el sentido horario en ratones con EP unilateral tratados con NS y CNO (n=6). ** p<0,01.
Figura 10. Son gráficos de barras que muestran DREADD Gq unilaterales en el GPe: Continúa la activación de 5 días: una supresión de 5 días de la actividad de los núcleos de los ganglios basales de salida en ratones con EP inducida por 6OHDA. Las pruebas de campo abierto y de Rota-Rod se realizaron durante la aplicación de 5 días de solución salina normal (NS) y CNO en ratones con EP tratados con 6-OHDA que expresan los DREADD Gi en los núcleos GPi y SNR de forma unilateral. Promedio (media±SEM) de la velocidad de movimiento (A), puntuación de Rota-Rod (B), número (C) y porcentaje (D) de rotaciones en el sentido horario en ratones con EP unilateral tratados con NS y CNO (n=6). ** p<0,01.
Figura 11. Son gráficos de barras que muestran un DREADD Gi unilateral combinado en el EP (GPi) y SNr y DREADD Gq en el GPe y SNr: continuo, una manipulación combinada de 5 días 3 dianas dentro de los núcleos de los ganglios basales en ratones con EP inducida por 6OHDA. Las pruebas de campo abierto y de Rota-Rod se realizaron durante DREADD Gi en los núcleos GPi y s Nr , DREADD Gq en el núcleo GPe y una aplicación de 5 días de solución salina normal (NS) y CNO en ratones con EP tratados con 6-OHDA que expresan los DREADD Gq en el núcleo STN de forma unilateral. Promedio (media±SEM) de la velocidad de movimiento (A), puntuación de Rota-Rod (B), número (C) y porcentaje (D) de rotaciones en el sentido horario en ratones con EP unilateral tratados con NS y CNO (n=6). ** p<0,01.
Descripción detallada de la invención y ejemplos
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se proporciona un método para modular el movimiento corporal en un sujeto que lo necesita afectando a la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi), en el globo pálido externo (GPe), en el tálamo motor anterior, en el núcleo subtalámico (STN) o en cualquier combinación de los mismos. En una realización se proporciona un DREADD inhibidor y un DREADD excitador para mejorar el rendimiento y/o la función motora en un sujeto que padece una enfermedad neurológica o del SNC que limita una función motora. En una realización se proporciona un DREADD inhibidor y un DREADD excitador para mejorar el rendimiento y/o la función motora en un sujeto afectado por una enfermedad neurológica o del SNC que limita una función motora teniendo como diana, y modulando anatómicamente la vía indirecta (núcleo GPe).
En una realización, la mejora de la actividad de STN por DREADD Gq da lugar a la restauración y/o mejora significativa del rendimiento motor de las actividades motoras en un sujeto afectado por una enfermedad hipocinética neuronal como se demuestra en la EP experimental hemilateral y bilateral. En una realización, se encontró inesperadamente que la activación de GPe y STN producía el mismo resultado de comportamiento, ya que el GPe inhibe el STN. En una realización, se encontró inesperadamente que la activación tanto de GPe como de STN producía una mejora significativa del rendimiento motor en un sujeto afectado por una enfermedad hipocinética neuronal tal como, aunque no de forma limitativa, EP. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se encontró inesperadamente que la modulación de DREADD de tres dianas dentro del complejo de ganglios basales, el núcleo de la vía indirecta GPe, los núcleos de salida GPi y SNr y el STN daba lugar a una mejora significativa del rendimiento motor en un sujeto afectado por una enfermedad hipocinética neuronal tal como, aunque no de forma limitativa, EP.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, hay un método para mejorar significativamente el rendimiento motor en un sujeto afectado por una enfermedad hipocinética neuronal (como la EP) mediante la modulación DREADD de tres dianas dentro del complejo de ganglios basales, el núcleo de la vía indirecta GPe, los núcleos de salida GPi y SNr y el STN.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es alterar. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es activar, potenciar, restaurar, mejorar o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es inhibir. En otra realización, el término “ modular” es aumentar. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es inducir. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es elevar. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es reducir. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modular” es activar de forma diferencial. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modulación” es disminuir. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el término “ modulación” es inhibir de forma diferencial.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, “ modular el movimiento corporal” es modular la frecuencia de al menos un movimiento. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, “ modular el movimiento corporal” es modular la amplitud de al menos un movimiento.
La presente invención proporciona un receptor de diseño inhibidor activado exclusivamente por un fármaco de diseño (DREADD) y un DREADD excitador para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno hipocinético neuronal, en donde el DREADD inhibidor se expresa en el globo pálido interno (GPi); y el DREADD excitador se expresa en: el tálamo motor anterior, globo pálido externo (GPe), núcleo subtalámico (STN) o cualquier combinación de los mismos, y en donde el DREADD inhibidor expresado y el DREADD excitador son activados por un solo ligando. En una realización, el ligando único es clozapina-N-óxido (CNO).
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, DREADD, DREADD inhibitorio, DREADD excitador o cualquier combinación de los mismos es: hM3Dq acoplado a la señalización de Gaq (Gq) e induce el disparo de neuronas; hM4Di acoplado a la señalización de Gai y media el silenciamiento neuronal y sináptico; y rM3D acoplados a la señalización de Gas y que modula la actividad neuronal. En otra realización, el DREADD inhibidor es hM4Di, que se acopla a la señalización de Gai (Gi) y media el silenciamiento neuronal y sináptico. En otra realización, el DREADD excitador es hM3Dq, acoplado a la señalización de Gaq (Gs). En otra realización, DREADD excitador es rM3Ds, que se acopla a la señalización de Gas.
En otra realización, DREADD como se describe en la presente memoria es transportado por un vector para su expresión en un tejido o células diana neuronales. En otra realización, DREADD como se describe en la presente memoria es transportado por un vector viral para su expresión en un tejido o células diana neuronales. En otra realización, un DREADD transportado por un vector viral se expresa de forma suficiente en un tejido o células diana neuronales en 4 a 31 días. En otra realización, un DREADD transportado por un vector viral se expresa de forma suficiente en un tejido o en células diana neuronales en 7 a 25 días. En otra realización, un DREADD transportado por un vector viral se expresa de forma suficiente en un tejido o células diana neuronales en 10 a 25 días. En otra realización, un DREADD transportado por un vector viral se expresa de forma suficiente en un tejido o células diana neuronales en 7 a 21 días.
En otra realización, cualquier DREADD como se describe en la presente memoria es activado por CNO. En otra realización, cualquier DREADD como se describe en la presente memoria se activa mediante CNO administrado por vía parenteral. En otra realización, cualquier DREADD como se describe en la presente memoria se activa mediante CNO administrado por vía oral.
En otra realización, los DREADD son activados por clozapina-N-óxido (CNO). En otra realización, se activan mediante clozapina-N-óxido (CNO) a una dosificación de entre 0,1 a 20 mg/kg. En otra realización, los DREADD son activados por clozapina-N-óxido (CNO) a una dosificación de entre 1 y 5 mg/kg.
En otra realización, la presente invención establece que transfectar una neurona del GPi con un DREADD inhibidor es poner en contacto un gen DREAD Gi con una neurona del GPi. En otra realización, la presente invención establece que transfectar neuronas del GPi con un DREADD inhibidor es inyectar un vector viral de AAV que comprende el gen DREAD Gi. En otra realización, la presente invención establece que transfectar neuronas en el tálamo motor anterior y/o en el núcleo subtalámico (STN) y/o en el globo pálido externo (GPe) con un DREADD excitador incluye inyectar un vector viral de AAV que comprende: el gen DREA<d>Gq, el gen DREAD Gs, o ambos.
En otra realización, la presente invención establece que transfectar neuronas en el tálamo motor anterior con un DREADD excitador incluye poner en contacto el vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos con neuronas en el tálamo motor anterior. En otra realización, la presente invención establece que transfectar neuronas en el núcleo subtalámico con un DREADD excitador incluye poner en contacto el vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos con neuronas en el núcleo subtalámico. En otra realización, la presente invención establece que transfectar neuronas en el GPe con un DREADD excitador incluye poner en contacto el vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos con neuronas en el Gpe. En otra realización, poner en contacto el vector viral de AAV comprende inyectar el vector viral de AAV en el sitio neuronal como se describe en la presente memoria. En otra realización, poner en contacto el vector viral de AAV comprende inyectar el vector viral de AAV en neuronas como se describe en la presente memoria.
En otra realización, la presente invención establece que la supresión de la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi) y la mejora de la actividad neuronal en el tálamo motor anterior, y/o en el globo pálido externo (GPe), y/o en el núcleo subtalámico (STN) se realizan de forma concomitante. En otra realización, la presente invención establece que la administración de CNO suprime la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi) y mejora la actividad neuronal en el tálamo motor anterior y/o en el núcleo subtalámico (STN), y/o en el globo pálido externo (GPe) a la vez y/o de forma concomitante. En otra realización, la presente invención establece que activar un DREADD inhibidor y activar un DREADD excitador se logra mediante un único ligando tal como, aunque no de forma limitativa, CNO. En otra realización, la presente invención establece que activar un DREADD inhibidor se logra mediante un primer ligando y activar un DREADD excitador se logra mediante un segundo ligando. En otra realización, el primer ligando y el segundo ligando no reaccionan de forma cruzada.
En otra realización, activar el DREADD inhibidor, activar el DREADD excitador, o ambos, es poner en contacto neuronas de GPi que expresan DREADD, neuronas del tálamo motor anterior que expresan DREADD, neuronas de STN que expresan DREADD, neuronas de GPe que expresan DREADD o cualquier combinación de las mismas con CNO.
En una realización, la mejora de la actividad de STN por DREADD Gq da lugar a la restauración y/o mejora significativa del rendimiento motor de la EP experimental tanto hemilateral como bilateral. En una realización, se encontró inesperadamente que la activación de GPe y STN producía el mismo resultado de comportamiento, ya que el GPe inhibe el STN. En una realización, se encontró inesperadamente que la activación de GPe y STN producía una mejora significativa del rendimiento motor en la EP. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se encontró inesperadamente que la modulación de DREADD de tres dianas dentro del complejo de ganglios basales, el núcleo de la vía indirecta GPe, los núcleos de salida GPi y SNr y el STN daba lugar a una mejora significativa del rendimiento motor de los ratones con EP.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, la modulación de DREADD de: el núcleo de la vía indirecta GPe, los núcleos de salida GPi y SNr y el STN mejora y/o restaura la función motora en un sujeto afectado por una enfermedad como la descrita
En otra realización, un sujeto que padece una enfermedad hipocinética padece hipocinesia o disminución del movimiento corporal. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece daños en los ganglios basales.
En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece una pérdida parcial del movimiento muscular debido a una alteración en los ganglios basales. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece una pérdida completa del movimiento muscular debido a una alteración en los ganglios basales. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece la enfermedad de Parkinson (EP). En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética experimenta rigidez muscular y una incapacidad para producir movimiento.
En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece de acinesia o un caso severo de enfermedad de Parkinson. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece bradicinesia o “ cara de piedra” (cara sin expresión). En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece disartria. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece discinesia. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece distonía. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece congelación, caracterizada por una incapacidad para mover los músculos en cualquier dirección deseada. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece el síndrome maligno neuroléptico. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece parálisis supranuclear. En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece un aumento en el tono muscular. En otra realización, un sujeto que padece una enfermedad hipocinética padece rigidez de tipo “ rueda dentada” . En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece rigidez de tipo “ tubo” . En otra realización, un sujeto que padece enfermedad hipocinética padece inestabilidad postural.
En otra realización, “tratar” es reducir la rigidez muscular. En otra realización, “tratar” es reducir la rigidez muscular. En otra realización, “ tratar” es aumentar el intervalo de movimiento de al menos una extremidad. En otra realización, “ tratar” es aumentar el intervalo de movimiento de al menos un órgano. En otra realización, “ tratar” es aliviar los síntomas asociados con una enfermedad o trastorno hipocinético.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, DREADD se utiliza para modular la actividad de un núcleo dentro del circuito de ganglios corticobasales. En una realización, DREADD se utiliza para contrarrestar las anomalías de red causadas por una enfermedad como se describe en la presente memoria (tal como, aunque no de forma limitativa, EP). En una realización, DREADD se utiliza para aumentar la actividad motora en sujetos que padecen una enfermedad como se describe en la presente memoria. En una realización, DREADD se utiliza para reducir la actividad de salida de los ganglios basales.
En una realización, DREADD es un DREADD Gq. En una realización, DREADD es un DREADD Gi. En una realización, un núcleo es el núcleo del globo pálido externo (GPe). En una realización, un núcleo es el núcleo subtalámico (STN). En una realización, un núcleo es el globo pálido interno (GPi).
En otra realización, “tratar” es reducir las alteraciones de la circulación cerebral. En otra realización, “ tratar” es reducir el flujo sanguíneo en el giro supramarginal y el giro angular del lóbulo parietal. En otra realización, “tratar” es reducir la actividad cardíaca y cambios en el tono de los vasos cardíacos. En otra realización, “tratar” es aliviar los síntomas no motores asociados con la enfermedad de Parkinson.
En otra realización, “tratar” es aliviar las alteraciones neuropsiquiátricas. En otra realización, “tratar” es aliviar las alteraciones cognitivas. En otra realización, “tratar” es mejorar las dificultades visuoespaciales. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de demencia. En otra realización, “ tratar” es reducir la frecuencia y/o gravedad del comportamiento y alteraciones del estado de ánimo. En otra realización, “ tratar” es aliviar la depresión. En otra realización, “ tratar” es aliviar la apatía. En otra realización, “tratar” es aliviar la ansiedad. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de síntomas psicóticos. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de alucinaciones o delirios. En otra realización, “ tratar” es aliviar el trastorno del sueño. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de hipotensión ortostática. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de piel aceitosa. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de sudoración excesiva. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de incontinencia urinaria. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de disfunción sexual. En otra realización, “tratar” es reducir el riesgo de la dismotilidad gástrica. En otra realización, “tratar” es reducir el riesgo de anormalidades oculares y visuales tales como una menor velocidad de parpadeo, ojos secos, seguimiento ocular deficiente (seguimiento ocular) y movimientos sacádicos (movimientos automáticos rápidos de ambos ojos en la misma dirección). En otra realización, “tratar” es reducir las dificultades para dirigir la mirada hacia arriba. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de visión borrosa o doble. [En otra realización, “tratar” es reducir el riesgo de aparición de un sentido del olfato alterado. En otra realización, “tratar” es reducir el riesgo de sensación de dolor. En otra realización, “ tratar” es reducir el riesgo de parestesia (hormigueo de la piel y entumecimiento). En otra realización, “tratar” es reducir los efectos secundarios asociados con el daño permanente al cerebro. En otra realización, “tratar” es no causar daño permanente al cerebro por el tratamiento de la invención.
En otra realización, mejorar la actividad neuronal es aumentar la frecuencia neuronal. En otra realización, mejorar la actividad neuronal es aumentar la entrada neuronal, la salida o ambos. En otra realización, mejorar la actividad neuronal es aumentar un potencial de acción. En otra realización, mejorar la actividad neuronal es mejorar la velocidad a la que se disparan las neuronas. En otra realización, mejorar la actividad neuronal es aumentar la actividad de una neurona. En otra realización, mejorar la actividad neuronal es inducir la actividad de una neurona. En otra realización, la mejora de la actividad neuronal es generar actividad oscilatoria. En otra realización, la actividad neuronal se mide mediante cualquier método o medio conocido por un experto en la técnica.
En otra realización, la supresión de la actividad neuronal es reducir la frecuencia neuronal. En otra realización, la supresión de la actividad neuronal es reducir la entrada neuronal, la salida neuronal o ambas. En otra realización, la supresión de la actividad neuronal es reducir un potencial de acción. En otra realización, suprimir la actividad neuronal es reducir la velocidad a la que se disparan las neuronas. En otra realización, la supresión de la actividad neuronal es reducir la actividad de una neurona. En otra realización, la supresión de la actividad neuronal es inhibir la actividad oscilatoria.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, hay un método para tratar a un sujeto afectado por una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal, que comprende: a. mejorar la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi); y b. suprimir la actividad neuronal en el tálamo motor anterior o el globo pálido externo (GPe) o en el núcleo subtalámico (STN), en donde mejorar la actividad neuronal comprende transfectar neuronas del GPi con un DREADD excitador y activar el DREADD excitador, en donde suprimir la actividad neuronal comprende transfectar neuronas en el tálamo motor anterior o en el núcleo subtalámico (STN), o en el globo pálido externo (GPe) con un DREADD inhibidor y activar el DREADD inhibidor, tratando de este modo a un sujeto afectado con una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, transfectar neuronas del GPi con un DREADD excitador es inyectar un vector viral de AAV que comprende: el gen DREAD Gq, el gen DREAD Gs, o ambos. En otra realización, transfectar neuronas en el tálamo motor anterior o el globo pálido externo (GPe) o en el núcleo subtalámico (STN) con un DREADD inhibidor es inyectar un vector viral de AAV que comprende el gen DREAD Gi. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, la mejora de la actividad neuronal en el globo pálido interno (GPi) y la supresión de la actividad neuronal en el tálamo motor anterior o en el globo pálido externo (GPe) o en el núcleo subtalámico (STN) se realizan de una vez y/o de forma concomitante. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, la activación de DREADD inhibidor y la activación de DREADD excitador se logra mediante un único ligando tal como, aunque no de forma limitativa, CNO.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, tratar a un sujeto afectado por una enfermedad o por un trastorno hipercinético neuronal o por una enfermedad o trastorno hipocinético neuronal mejora las actividades motoras en el sujeto. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, tratar a un sujeto que padece una enfermedad o trastorno hipercinético neuronal se hace sin inducir daño permanente al cerebro.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético son las hipercinesias o hipercinesis. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad hipercinética es la enfermedad de Huntington. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad hipercinética comprende además hipotonía. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es la corea, distonía, trastorno de tics, síndrome de Tourette, hemibalismo o cualquier combinación de los mismos. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es la atetosis. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es una ataxia. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es el hemibalismo.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es discinesia tardía. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye estereotipias. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye mioclono. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye espasmo hemifacial. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye distonía tardía. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético es la enfermedad de Wilson. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye hipercinesia voluntaria. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye temblor. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye síndrome de piernas inquietas.
En un ejemplo que no se encuentra dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye repercusiones posteriores a un accidente cerebrovascular.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, una enfermedad o trastorno hipercinético incluye atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana.
En una realización, un sujeto que padece una enfermedad hipocinética neuronal tal como la EP se beneficia de la presente tecnología DREADD relacionada con la modificación de la actividad de distintos núcleos en el circuito de ganglios basales. En una realización, la alteración de la actividad de distintos núcleos en el circuito de ganglios basales se logra utilizando receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) (ejemplo 2). En una realización, la presente tecnología de DREADD es para reducir la salida de los núcleos inhibidores GPi y SNr al tálamo ventral. En una realización, la presente tecnología de DREADD es para aumentar el impulso excitador al neocórtex.
En una realización, se establece en la presente memoria que la presente tecnología DREADD sea para mejorar los síntomas motores de la EP apuntando a tres núcleos distintos en el circuito de ganglios basales: los núcleos GPi y SNr, que sirven como núcleos de salida del circuito de ganglios basales; el GPe, que participa exclusivamente en la vía indirecta; y el STN, que sirve como la diana principal para la estimulación cerebral profunda (DBS) en pacientes con EP. En una realización, la invención proporciona la inhibición de la activación neuronal en núcleos de salida inhibidores (los núcleos GPi y SNr). En una realización, la invención proporciona la inhibición de la activación neuronal en los núcleos de salida inhibidores (los núcleos GPi y SNr) a través de DREADDS Gi. En una realización, la invención proporciona la activación de Gi expresada en el STN. En una realización, el tratamiento de la EP o la inhibición de un efecto secundario asociado con la EP comprende la activación de DREADDS Gq expresado en el STN. En una realización, el tratamiento de la EP o la inhibición de un efecto secundario asociado con la EP comprende la activación bilateral de Gq. En una realización, tratar es aumentar, restaurar o mejorar una actividad motora.
En una realización, un “vehículo fisiológicamente aceptable” y/o un “vehículo farmacéuticamente aceptable” se combinan con un activador de DREADD tal como CNO. En una realización, las frases “vehículo fisiológicamente aceptable” y “vehículo farmacéuticamente aceptable” que se utilizan indistintamente se refieren a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica. Bajo estas frases se incluye un adyuvante. En una realización, uno de los ingredientes incluidos en el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad tanto en medios orgánicos como acuosos [Mutter y col. (1979)].
En un ejemplo, “ excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una realización, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas de formulación y administración de fármacos se encuentran en “ Remington's Pharmaceutical Sciences” , Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
En una realización, las vías de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, administración oral, rectal, transmucosal, transnasal, intestinal o parenteral, que incluyen inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como también inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
La administración oral, en una realización, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar, comprimidos masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Los portadores aceptables farmacéuticamente adecuados para la preparación de formas de dosificación unitarias para administración oral se conocen bien en la técnica.
En algunas realizaciones, los comprimidos comprenden normalmente adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes tales como almidón, gelatina y sacarosa; disgregantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una realización, pueden usarse agentes de deslizamiento tal como dióxido de silicio para mejorar las características de flujo de la mezcla de polvo. En una realización, pueden añadirse agentes colorantes, tal como los tintes FD&C, para mejorar la apariencia. Los edulcorantes y saborizantes, tal como aspartamo, sacarina, mentol, menta y aromas de frutas, son adyuvantes útiles para comprimidos masticables. Las cápsulas comprenden típicamente uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas realizaciones, la selección de los componentes del portador depende de consideraciones secundarias como el sabor, el costo y la estabilidad en almacenamiento, que no son críticas para los propósitos de esta invención y puede que se realicen fácilmente por una persona experta en la técnica.
En una realización, la forma de dosificación oral comprende un perfil de liberación predefinido. En una realización, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende comprimidos, cápsulas, grageas o comprimidos masticables de liberación prolongada.
En algunas realizaciones, las composiciones que incluyen los presentes DREADD comprenden soluciones o emulsiones.
En otra realización, las composiciones farmacéuticas se administran mediante inyección intravenosa, intraarterial o intramuscular de una preparación líquida. En algunas realizaciones, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una realización, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra realización, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra realización, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
En una realización, las composiciones farmacéuticas para su uso según la presente invención se fabrican mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se administra un modulador en una vesícula, en particular un liposoma [véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y col., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berstein, ibid., págs. 317-327; véase en general ibíd.].
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, las composiciones se presentan en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitaria que contienen el modulador. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el envase comprende por ejemplo una lámina de metal o de plástico, tal como un envase tipo blíster. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el paquete o dispositivo dispensador va acompañado de instrucciones para la administración. En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, el paquete o dispensador es adaptado por una FDA de los Estados Unidos para medicamentos por receta o de una nota de producto aprobado asociada con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, cuya nota refleja la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones de administración en humanos o veterinaria. Dicha nota en un ejemplo, es un etiquetado aprobado por el inserto.
En un ejemplo que no cae dentro del ámbito de las reivindicaciones, se apreciará que el modulador puede proporcionarse al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por separado. En otra realización, se toman medidas (por ejemplo, dosificación y selección del agente complementario) para los efectos secundarios adversos que están asociados con las terapias de combinación.
Ejemplos
Materiales y métodos
Animales
Se utilizan ratones negros C57 adultos en los experimentos actuales.
Vector
Los DREADD se proporcionan dentro de partículas virales. Partículas virales inyectadas in situ.
Se utilizan dos vectores virales AAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry y el AAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry. Los virus se inyectan con un aparato estereotáctico en la región cerebral diana (GPi, tálamo, GPe o núcleo subtalámico).
Modelo de Parkinson
Se utilizó el modelo 6OHDA.
Prueba de comportamiento
Para monitorizar el trastorno motor y la capacidad de la terapia DREADD para revertir estos trastornos, se realizan las siguientes pruebas de comportamiento. Prueba de campo abierto: para medir la disfunción de la actividad motora. En esta prueba se registra y cuantifica el movimiento espontáneo de los ratones en un recinto cuadrado. Prueba de Rotarod: Los ratones se pusieron sobre una varilla giratoria con una velocidad de rotación que aumentaba gradualmente de 4 a 40 RPM utilizando un programa de aceleración preestablecido. Se midió el tiempo en que los ratones caían de la varilla giratoria, siendo 300 segundos el tiempo máximo medido sobre la varilla.
Ejemplo 1: Impacto de los DREADD en la hipercinesia y la hipocinesia
Se inyecta a ratones negros C57 el vector viral (ya sea AAV-hSyn-hM3D(Gq)-mCherry que contiene el gen para el DREADD excitador Gq o AAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry que contiene el gen para el inhibidor DREAd D (Gi), inyectándose en las regiones cerebrales diana (ya sea GPi, GPe, STN o tálamo anterior solo o en combinación). Las inyecciones se llevan a cabo utilizando un microinyector montado en un aparato estereotáctico. Después de las inyecciones intraperitoneales virales, se administra 6OHDA (inyecciones estreotácticas) para generar los ratones con Parkinson experimental.
Aproximadamente 3 semanas después de la inducción de la enfermedad de Parkinson experimental por 6OHDA, se llevan a cabo los experimentos de comportamiento. La molécula de DREADD (Gq, Gi o ambas) se activa por inyección IP de CNO. En estos experimentos, se comparan los comportamientos de ratones con Parkinson en condiciones de control (sin inyecciones), inyección de CNO e inyección simulada de solución salina.
El rendimiento motor de los ratones se monitoriza en la prueba de campo abierto, prueba de Rotarod.
Se llevan a cabo las siguientes inyecciones de vectores virales que contienen DREADD:
1) El DREADD Gi se inyecta en el GPi de forma bilateral. 2) Los DREADD Gq se inyectan en el tálamo de forma bilateral. 3) El Gi o el DREADD Gq se inyectan en el STN de forma bilateral. 4). El DREADD Gq se inyecta en el GPe de forma bilateral.
Además, los vectores virales que contienen DREADD se inyectan simultáneamente en dos regiones del cerebro separadas para obtener efectos sinérgicos: 1) El DREADD Gi se inyecta tanto en el GPi como en el STN de forma bilateral. 2) El DREADD Gi se inyecta en el GPi y el DREADD Gq se inyectan en el STN de forma bilateral. 3) El DREADD Gi se inyecta en el GPi y el DREADD Gq se inyectan en el tálamo de forma bilateral. 4). El DREADD Gq se inyecta en el GPe de forma bilateral.
Ejemplo 2: Tratamiento quimiogenético de la enfermedad de Parkinson
Este conjunto de experimentos proporciona evidencia de que las anormalidades de la red asociadas con la EP pueden corregirse modificando la actividad de distintos núcleos en el circuito de ganglios basales utilizando receptores de diseño activados exclusivamente por fármacos de diseño (DREADD) como se describe en la presente memoria.
Los experimentos se hicieron en ratones negros C57 de tipo salvaje de 2-4 meses de edad. Para inducir la EP experimental, se inyectó 1 microlitro de una solución que contenía 6 hidroxi dopamina (6-OHDA) (3 mg/1 ml) en el haz medial del prosencéfalo a través de una pequeña craneotomía perforada en el cráneo. La cabeza del ratón se fijó en un marco estereotáxico, y la solución que contenía 6OHDA se inyectó utilizando una pipeta de vidrio sostenida por un micromanipulador y un microinyector.
Los ratones fueron anestesiados durante todo el procedimiento con isoflurano. El 6OHDA se inyectó en el MFB de forma unilateral o bilateral para inducir una EP experimental bilateral.
Poco después de inyectar 6OHDA, después de la recuperación de la anestesia, los ratones comenzaron a girar en el sentido horario (ipsilateral al lado de la inyección). Los ratones se trataron con glucosa IP y solución salina normal en los primeros días después de inyectar 6OHDA. Además, los ratones tuvieron acceso libre a una solución de sacarosa durante la primera semana después de la inyección. Los experimentos de comportamiento se realizaron al menos 3 semanas después de la inducción de la EP experimental.
Expresión de DREADD:
Para expresar DREADD (sea el inhibidor DREADD Gi o el DREADD excitador Gq) se inyectaron vectores virales (bien AAV8-hSyn-hM3D (Gq)-mCherry o AAV8-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry). Los vectores virales se inyectaron a través de una craneotomía con una pipeta de vidrio mantenida por un micromanipulador y un microinyector. Durante las inyecciones, la cabeza se fijó en un marco estereotáxico para inyecciones precisas. Los ratones fueron anestesiados durante todo el procedimiento con isoflurano.
Los vectores virales (200-500 pl) se inyectaron en varias dianas en el circuito de los ganglios basales, incluidos los núcleos STN (Gi y Gq), EP y SNr (Gi), GPe (Gq) y el tálamo ventral (Gq). Las inyecciones fueron normalmente unilaterales en el lado de las inyecciones de 6OHDA. Sin embargo, en los casos de inyecciones bilaterales de 6OHDA, los vectores virales se inyectaron en los núcleos diana de forma bilateral. Normalmente, los vectores virales y 6OHDA se inyectaron en la misma sesión.
Para confirmar la localización de la expresión de DREADD, al final de todos los experimentos se extrajo el cerebro y se fijó en paraformaldehído (4 %). Pocos días después, se seccionó el cerebro (secciones axiales de 100 |jm) con un vibrótomo y se obtuvieron imágenes de la expresión de DREADD mediante imágenes fluorescentes de la proteína fluorescente mCherry. La localización anatómica de la expresión de DREADD se determinó mediante imágenes de campo brillante concomitantes de secciones cerebrales.
Administración de clozapina-N-óxido (CNO) y solución salina normal
Para investigar el efecto de la activación de DREADD, se administraron 500 j l de CNO IP (5 mg/kg) o solución salina normal (NS-0,9 % NaCl). La administración de CNO o solución salina fue ciega. Los viales que contenían el CNO y el NS fueron etiquetados con un código numérico por un segundo investigador que no administró la dosis IP ni analizó el comportamiento. Los experimentos de comportamiento se realizaron aproximadamente 20-30 minutos después de la administración IP del fármaco.
Pruebas de comportamiento
Se utilizaron dos pruebas de conducta para monitorizar el comportamiento de los ratones: (1) Prueba de campo abierto: Los ratones se pusieron en una caja abierta por la parte superior de 30 cm x 30 cm x 30 cm durante 5 minutos y se grabaron continuamente en un vídeo. Los resultados se analizaron fuera de línea después de finalizar los experimentos. Utilizando el software EthoVision, la velocidad media y la distancia recorrida por los ratones se monitorizó durante los 5 minutos de la prueba de campo abierto. Además, el número y la dirección de los giros de 180° se monitorizaron con el software EthoVision. Las pruebas de campo abierto se realizaron en dos días consecutivos (20-30 minutos después de que los ratones recibieran el fármaco ciego [NS o CNO)]. (2) Prueba de Rotarod: Los ratones se pusieron sobre una varilla giratoria con una velocidad de rotación que aumentaba gradualmente de 4 a 40 RPM utilizando un programa de aceleración preestablecido. Se midió el tiempo en que los ratones caían de la varilla giratoria, siendo 300 segundos el tiempo máximo medido sobre la varilla. Para cada sesión de prueba, la prueba de rotarod se realizó en 3 días consecutivos. Durante los primeros días, los ratones se sometieron a 4 sesiones de entrenamiento. En los 2 días restantes, los ratones se sometieron a ensayo una vez al día (20-30 minutos después de recibir el fármaco IP [CNO o NS ciego)].
Los resultados proporcionados a continuación muestran una mejora de los síntomas motores de la EP obtenidos tomando como diana tres núcleos distintos en el circuito de ganglios basales: los núcleos EP (equivalente de GPi en primates) y SNr, que sirven como núcleos de salida del circuito de ganglios basales; el GPe, que participa exclusivamente en la vía indirecta; y el STN, que sirve como el diana principal para la estimulación cerebral profunda (DBS) en pacientes con EP.
El núcleo entopeduncular (EP-GPi de roedor) y la parte reticulada de la sustancia negra
Los núcleos EP y SNr sirven como núcleos de salida del circuito de ganglios basales, donde convergen las rutas directa, indirecta e hiperdirecta. El objetivo de este experimento era tratar la EP o los síntomas de la EP mediante la inhibición de la activación en los núcleos SNr y EP (el equivalente de roedor del GPi de primate) utilizando el DREADDS Gi.
Específicamente, se comparó la administración IP ciega de solución salina normal (NS) y CNO tanto en ratones hemiparkinsonianos (6-OHDA inyectado al MFB) como en ratones control. Los parámetros de conducta que se examinaron incluyeron giro ipsilateral y velocidad de movimiento en la prueba de campo abierto y el tiempo hasta caerse de la varilla giratoria en la prueba de rotarod.
En el control normal y en ratones con EP hemilateral con EP inducida por 6OHDA experimental, no se observaron diferencias significativas entre la administración IP ciega de CNO y NS en ninguno de los tres parámetros de comportamiento que se examinaron (Figura 1).
Por el contrario, en ratones con ratones EP hemilateral inducidos por 6OHDA y que expresan DREADDS Gi en los núcleos EP y SNr, la aplicación ciega de CNO dio lugar a rendimientos de conducta significativa y sorprendentemente mejores en comparación con NS en todos los parámetros de conducta examinados. En comparación con NS, CNO causó una mejora del 36±9 % en la velocidad media en la prueba de campo abierto; una reducción del 68,9±10,8 % en el número y una reducción del 46±8,6 % en el porcentaje de rotaciones en el sentido horario; y un aumento del 30,5±7,1 % en el tiempo transcurrido sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (Figura 2).
Dirigido al núcleo del globo pálido externo (GPe)
En este conjunto de experimentos, el objetivo fue el núcleo GPe, que sirve como un núcleo de transmisión principal que pertenece exclusivamente a la ruta indirecta. Más específicamente, las neuronas de GPe se activaron utilizando los DREADD Gq excitadores, y se monitorizó el efecto sobre el comportamiento en ratones hemi-parkinsonianos inducidos por 6-OHDA.
Estos experimentos mostraron que la administración ciega de CNO dio lugar a una mejora significativa de todos los parámetros de comportamiento en comparación con la solución salina normal (NS) administrada por vía interperitoneal (IP). La administración de CNO dio lugar a un aumento de 77,2±24,7 % en la velocidad media en la prueba de campo abierto; una reducción del 37,7±20 % en el número y una reducción del 40±7,8 % en el porcentaje de rotaciones en el sentido horario; y un aumento del 25,6±6,1 % en el tiempo transcurrido sobre la varilla giratoria en la prueba de rotarod (Figura 4). Por lo tanto, la supresión de la actividad de la ruta indirecta mediante la activación mediada por DREADD del núcleo GPe mejoró significativamente el rendimiento de todos los parámetros motores examinados en ratones con EP inducida por 6-OHDA tanto unilateral como bilateral. Los efectos de la activación mediada por DREADD del GPe sobre el rendimiento y/o la función motora fueron más pronunciados en el caso de la EP inducida por 6-OHDA bilateral (los DREADD Gq se expresaron de forma unilateral y bilateral en el GPe de ratones con Parkinson hemilateral y bilateral, respectivamente).
El núcleo subtalámico (STN)
A diferencia del núcleo GPe, las neuronas de STN participan en las rutas indirecta e hiperdirecta. Se analizó el efecto de los DREADD tanto inhibidores como excitadores expresados en el STN sobre el comportamiento de la EP inducida por 6OHDA experimental.
Cuando se comparó el efecto de la administración IP ciega de CNO a NS en las pruebas de campo abierto y de rotarod, se encontró que la activación de Gi expresada en el STN no afectó significativamente a la velocidad media ni a los rendimientos en la prueba de rotarod. La activación de DREADD Gi expresada en el núcleo STN mostró un efecto beneficioso pequeño pero significativo en los giros.
Por el contrario, la activación de DREADDS Gq expresada en el STN tuvo efectos beneficiosos grandes, inesperados y significativos sobre la EP experimental de 6-OHDA. La administración de CNO dio lugar a un aumento de 117,6±26,9 % en la velocidad media en la prueba de campo abierto; una reducción de 37,2±17 % en el número y una reducción de 47,6±11,1 % en el porcentaje de rotaciones en el sentido horario. Los rendimientos en la prueba de rotarod no mostraron diferencias significativas entre la aplicación ciega de CNO y NS en este grupo (Figura 6).
Además, se analizó el efecto de la activación bilateral de Gq en EP experimental bilateral (6OHDA inyectado al MFB de forma bilateral). Se encontró que la activación de Gq en estos ratones tuvo un efecto dramático e inesperado. La administración de CNO dio lugar a un aumento de 294,4±70,9 % en la velocidad media en la prueba de campo abierto y a un aumento de 81±15,8% en el tiempo antes de caer del rotarod (Figura 7). En este caso, los giros no se analizaron, ya que comenzar con ratones con EP experimental bilateral mostró poca tendencia a rotar hacia ambos lados (0,1±0,06 giros por minuto).
La Figura 8 presenta una comparación entre las distintas manipulaciones mediadas por DREADD que se hicieron en estos experimentos.
Supresión combinada de los núcleos de salida y la ruta indirecta
Los resultados obtenidos de esta sección apoyan adicionalmente los hallazgos proporcionados anteriormente. En este conjunto de experimentos, el NS y el CNO se aplicaron por vía intraperitoneal diariamente durante 5 días consecutivos. La prueba de campo abierto se realizó el día 2 y 4 (para los grupos CNO y NS). La prueba de Rota-Rod se realizó los días 3 y 5. Se compararon los resultados de la velocidad motora, las rotaciones y las puntuaciones de Rota-Rod entre la solución salina normal y la aplicación de CNO.
Se examinaron las siguientes condiciones. En la Figura 9 se proporciona apoyo adicional para el impacto de la supresión de los núcleos de salida: activación de Gi a través de DREADD en los núcleos GPi y SNR en ratones hemiparkinsonianos. En la Figura 10 se proporciona apoyo adicional para el impacto de la supresión de la vía indirecta en la actividad motora mediante la activación de DREADD Gq en el núcleo GPe en ratones hemi-parkinsonianos. En la Figura 11 se proporciona evidencia del impacto de la supresión combinada de los núcleos de salida y la ruta indirecta y la activación del STN a través de la activación simultánea de DREADD Gi en los núcleos GPi y s Nr , de DREADD Gq en el núcleo GPe y DREADD Gq en el STN.
Estos conjuntos de experimentos demuestran que tomando como diana distintos núcleos y rutas dentro del complejo de ganglios basales en la enfermedad de Parkinson experimental se obtiene un rendimiento motor y/o función mejorados inesperados de la EP experimental. Específicamente, suprimir la actividad de la ruta indirecta teniendo como diana el núcleo GPe; activando el STN; y suprimiendo la actividad de salida de los ganglios basales tomando como diana los núcleos de salida, los GPi y SNr dio lugar a una restauración y/o mejora sin precedentes del rendimiento y/o función motora en ratones afectados por EP.
Claims (5)
1. Un receptor de diseño inhibidor activado exclusivamente por un fármaco de diseño (DREADD) y un DREADD excitador para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno hipocinético neuronal, en donde dicho DREADD inhibidor se expresa en el globo pálido interno (GPi); y dicho DREADD excitador se expresa en: el tálamo motor anterior, el globo pálido externo (GPe), el núcleo subtalámico (STN) o cualquier combinación de los mismos, y en donde dicho DREADD inhibidor expresado y dicho DREADD excitador son activados por un solo ligando.
2. El DREADD inhibidor y el DREADD excitador para su uso según la reivindicación 1, en donde el DREADD inhibidor y el DREADD excitador se activan de forma concomitante.
3. El DREADD inhibidor y el DREADD excitador para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho ligando único es clozapina-N-óxido (CNO).
4. El DREADD inhibidor y el DREADD excitador para su uso según la reivindicación 3, en donde el DREADD inhibidor y el DREADD excitador son activados por CNO a una dosis de entre 0,1 y 20 mg/kg.
5. El DREADD inhibidor y el DREADD excitador para su uso según la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad o trastorno hipocinético neuronal es la enfermedad de Parkinson.
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