KR20180009383A - 이상혈색소증 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈과 같은 이상혈색소증 치료를 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 조성물 및 방법이, 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 귀소성 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) 및/또는 CRISPR 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 CRISPR 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들)을 포함하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들) 또는 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들)을 포함하여: (a) Bcl11a 코딩 영역의 교란; (b) Bcl11a 유전자 조절 영역의 교란; (c) 성인 인간 β-글로빈 좌의 개질; (d) HbF 침묵화 DNA 조절 엘리먼트 또는 경로, 예컨대 Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역의 교란; (e) 하나 이상의 γ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화에 의한 γ-글로빈 유전자의 발현 증대 달성; (f) 하나 이상의 δ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화에 의한 δ-글로빈 유전자의 발현 증대; 및/또는 (g) 하나 이상의 β-글로빈 유전자 돌연변이(들)의 정정을 제공하게 된다.

Description

이상혈색소증 치료를 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 PCT 국제 특허 출원으로 2013 년 2 월 22 일자로 출원되고, 미국 2012 년 2 월 24 일자로 출원된 미국 가출원 번호 61/603,231 에 대해 우선권을 주장하며, 그 개시내용은 전적으로 본원에 참고문헌으로 포함된다.

서열 목록

본 발명은 2013 년 2 월 22 일자로 만들어 크기가 174 킬로바이트 (KB) 인, "sequence listing 54428.0006WOU1 ST25" 로 파일명을 정한 txt 파일로서의 전자적 포맷으로 서열 목록을 포함하고 있다. txt 파일인 "sequence listing 54428.0006WOU1_ST25" 의 내용은 본원에 참고자료로서 포함된다.

기술분야

본 발명은 포괄적으로 유전자 질환 치료에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 발명의 개시내용은 글로빈 유전자의 발현을 변경시키기 위한 귀소성 엔도뉴클레아제- 및 Cas9 엔도뉴클레아제-기반의 조성물을 포함하는 엔도뉴클레아제-기반의 조성물 및 방법을 개시하는데, 상기 조성물 및 방법은 지중해성 빈혈, 겸형 적혈구 빈혈, 및 여타 이상혈색소증의 치료에 유용하다.

지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈과 같은 이상혈색소증은 전세계적으로 심각한 보건적 부담을 주는 매우 보편적인 유전성 적혈구 장애이다. 매년 심각한 헤모글로빈 장애를 가진 이가 1,300,000 명 넘게 출생한다. 전세계 인구 중 5% 는 보균자이며, 지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈 (SCD) 의 임상적으로 심각한 형태에 대해서는 천명 당 각각 0.44 및 1.96 의 출생율을 나타내고 있다.

정상적인 상태에서는, 헤모글로빈은 2 개의 α-형 사슬 (폴리펩티드) 및 2 개의 β-형 사슬의 이종사량체로 주로 이루어진 포유류 적혈구 세포에서 발견된다. β-글로빈 좌의 5 개의 유전자는 11 번 염색체 상의 클러스터에 자리잡고 있다. 유전자는 적혈구에서 발현되며, 발생단계별로 특이적 양상을 보여주는데 (ε, Aγ 및 Gγ), δ 및 β 유전자가 각각 배아, 태아 및 신생아 기간 동안에만 주로 발현된다. 출생시 β-형 사슬의 95% 는 γ 이고, 나머지는 β 이다. 생후 1 년 동안 그 비율은 점차 역전되며, 이는 생후 몇개월간은 겸형 세포와 같은 β-글로빈 유전자에 제한되는 표현형 및 대부분의 β-지중해성 빈혈이 드러나게 되지 않는 이유를 설명해 준다. 16 번 염색체 기반의 α-형 유전자의 발현은 상이하다; 배아의 ζ-유전자는 ε 의 발현과 병행되나, 쌍동이 α-유전자는 태아기부터 계속하여 발현된다. 따라서, α 비정상은 자궁 내에서부터 생겨나며, 잠재적으로는 파국적 결말 (예를 들어, 태아 수종) 을 동반하게 된다. 결과로서 수득되는 α-, β- 이종사량체는 발생단계별로 발현하게 된다: 배아기: Hb Gowerl (ζ₂, ε₂), Hb Gower2 (α₂,ε₂) 및 Hb Portland (ζ₂,γ₂); 태아: HbF (태아) (α₂,γ₂) 및 성인: HbA2 (α₂,δ₂) 및 HbA (성인) (α₂,β₂).

β-지중해성 빈혈은 성체 β-글로빈 좌에서의 비정상에 의해 유발되는데, 이는 β-형 글로빈 사슬 대 α-형 사슬의 비정상적인 화학량을 제공하게 되어, 짝지어지지 않은 α-형 사슬들의 석출을 야기하게 된다. 지중해성 빈혈의 중증도는 그러한 글로빈 사슬 불균형과 직접적으로 관련있다. 세포 및 멤브레인 단백질들의 산화를 포함하는 여러 경로를 통해 중재되는 후속하는 손상은 결국 효과적이지 못한 적혈구생성 (erythropoiesis), 아폽토시스 (apoptosis) 및 감소되는 적혈구 생존을 제공하게 된다. β-지중해성 빈혈에 원인을 제공하는 200 개를 초과하는 돌연변이들이 기재된 바 있다.

겸형 적혈구 빈혈은 β-글로빈 유전자 내 단일 뉴클레오티드 치환에 의해 유발되는데, 이는 펩티드의 아미노산 위치 6 에서 글루탐산이 발린으로 치환되는 결과를 가져와, β^S 를 제공하게 된다. 헤모글로빈 S (α₂,β^S ₂) 는 그러한 돌연변이를 보유하고 있어, 정상적인 성인 헤모글로빈 (HbA) 와 대비하여 HbS 로 언급한다. 낮은 산소 농도 조건 하에서는, HbS 가 중합할 수 있는 지점에서 알로스테릭 변화를 겪게 된다. 헤모글로빈의 데옥시-형태는 E 및 F 나선 사이의 단백질에 소수성 팻치를 노출하게 된다. 헤모글로빈 β-사슬의 위치 6 의 소수성 발린은 타 헤모글로빈 S 분자의 소수성 팻치와 회합할 수 있는 소수성 팻치를 형성하며, 헤모글로빈 S 가 응집해 섬유상 침전을 형성하게 되고, 이어서 적혈구 세포가 겸형-형상을 채택하도록 하여, 혈관폐색 및 용혈을 통해 조직 손상을 가져오는 수많은 경로에서 변화를 유도하게 된다.

β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈 (SCD) 은 각각 β-글로빈 좌의 정량적이고 정성적인 장애이나, 정상적인 β-형 글로빈 유전자의 발현은 두 질병을 모두 개선시킨다. 지중해성 빈혈에서, 글로빈 사슬 불균형에서의 임의의 개선은 각 세포에 대해 선택적인 장점을 제공하며, 그 결과 임상적 유익을 제공하게 된다. 겸형 적혈구 빈혈에서, 정상 또는 특정 돌연변이 β-형 사슬들의 존재로 인해 돌연변이 겸형 세포 사슬보다 α-형 사슬과 더욱 유효하게 경쟁함으로써 HbS 의 양을 줄이게 되고, HbS 의 중합을 차단하는 헤모글로빈 (예를 들어, HbF) 을 형성하고, 세포마다 비-겸형 헤모글로빈의 양을 증가시킴으로써 임상적 표현형을 완화시킬 수 있다. 예를 들어, 겸형 적혈구 빈혈에서, 오직 8% 의 태아 헤모글로빈 (HbF) 수준이 HbS 의 중합을 억제하게 되며, 그 결과 20% 의 HbF 수준이 거의 완결된 표현형 정정을 제공하면서 생존을 증대시키게 된다. 중요한 점은, 정상적인 HbA 를 포함하는 공여자 적혈구형성 세포의 후손들이 HbS 를 포함하는 내생적으로 유도된 세포 상에서 조혈모세포 이식 (HSCT) 후 강력한 선택적 장점을 갖는다는 점이다. 골수에 11% 공여자 세포를 지닌 환자는 35% 공여자 BFUe 및 73% 공여자 적혈구를 지니게 되는데, 그 결과 수혈 독립성이 제공된다. 따라서, 이식된 HSC 의 상대적으로 적은 분율에서의 정정은 임상적 유익을 제공한다.

심각한 형태의 지중해성 빈혈은 만성적인 수혈을 필요로 하며, 그 결과 철분 과다가 야기된다. 킬레이트화의 효능이 생존에 직결되나, 비용, 부작용 및 합병증이 효능을 심히 제한한다. SCD 에 대해 FDA 에서 승인한 유일한 약물은 하이드로우레아인데, 이는 유병율 및 사망율을 감소시킬 수 있다. 그러나, 그 치료법은 처방전이 있어야만 하며, 합병증이 심각하고, 건강을 적절히 보호해 주지 않는다.

조혈 세포 이식 (HCT) 은 매년 수천명의 환자들이 발생하는 혈액학적 종양 및 관련 장애에 대한 중요한 치료 선택사항이다. Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR) 에 따르면, 2009 년도에는 약 60,000 건의 이식이 실시되었으며, 지난 10 년간에 비해 매년 15,000 건 넘게 이식이 증가하고 있다. 이식의 유효성이 또한 늘어나고 있어서, 가장 최근의 결과로는 재발 위험의 현저한 감소, 무-재발 생존 및 전반적인 생존이 증명된 바 있다. 문헌 [Gooley et al, N. Engl. J. Med 363:2091-101 (2011)].

HLA-적합성의 동기간 또는 무관한 공여자 유래의 동종이계 조혈 세포 이식 (HCT) 은 이상혈색소증이 있는 환자에 치유를 제공하나, 적합하게 맞는 인척 또는 비-인척 공여자가 필요하기 때문에 제한성이 있고, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD) 및 감염에 의해 번잡하고 까다롭다. 추가로, 주된 장벽은 높은 이식 실패율이며, 이는 암에 대한 HCT 에서 관찰되는 것보다 더 높다. 제대혈 공여자는 거의 모든 환자에 대해 동일할 수 있기 때문에, 대안적인 접근법에는 공여자 제대혈 세포를 이용한 HCT 실시가 포함된다. 추가적인 실험적인 접근법이 환자 자신의 조혈모세포 (HSC) 를 이용하고, 내생성 글로빈 유전자의 발현을 유도하거나 또는 외인성의 β-형 글로빈 유전자를 첨가하는 것에 집중하고 있다.

공여자를 찾기 어려운 수많은 환자들, 특히 소수민족 집단 또는 혼혈 민족 배경의 환자들에 대해, 배꼽 제대혈 (CB) 이식은 치료를 위한 최선의 희망을 제공할 수 있다. 공여자 줄기 세포, CB (산모 또는 신생아에게 위험을 주지 않고 출생시 용이하게 수집됨) 의 공급원은 또한 쉽게 구할 수 있고, GVHD 의 위험 증대없이 HLA-부적합 설정에서도 안전하게 이용될 수 있다.

불행하게도, 수많은 제대혈 단위체에서 세포의 이용가능한 용량이 낮다는 점을 포함한 여러가지 요인들이 성인 및 더 자란 어린이에서의 접종 및 이식 관련 생존율 증가를 둔화시키고 있다. 호중구 및 혈소판의 두가지 모두에서 유의하게 지연되는 조혈 회복은 제대혈 이식 (CBT) 수용체에 대한 공지된 위험 요인이며, 이는 단일 또는 이중 CB 이식에서 제공되는 전체 유핵 세포 (total nucleated cell (TNC)) 및 CD34+ 투여량과 관련되어 있다. 유사하게, 그러한 적은 세포 수는 더 높은 비율의 이식 실패와 비례하며, 따라서, 이식 실패의 위험이 이미 높은 이상혈색소증에 있어 특별한 고려사항이 된다. 사실, 성인의 단독 CBT 수용자의 최근 분석은 주입된 CD34+ 세포 투여량은 척수 접종의 가장 중요한 예측인자임을 증명했다.

비재발 사망율 (NRM) 은 적합 및 비적합 비인척 공여자 수용자와 비교했을 때 이중 CBT (dCBT) 수용자에서 최대였다 [Brunstein et al, Blood 116: 4693-9 (2010)]. NRM 의 대부분은 이식 후 처음 100 일 내 일어났으며, 가장 일반적인 사망 원인은 감염이다. 중요한 점은, dCBT 수용자들 중에서도 NRM 에 대한 위험 요인의 분석은, dCBT 수용자에서 접종으로부터 평균 26 일 초과하여 회복이 존재하는 경우, 골수 회복 (절대값 중성구 계수값 (ANC) 이 500/ml 를 초과하는데 걸리는 시간) 이 지연된 환자에서 더 큰 위험이 있는 것으로 나타난 점이다. 그러나, NRM 에 대한 위험 요인의 분석은 26 일 이전에 접종받은 cCBT 수용자들만 포함했다는 제한점이 있어서, 공여자 공급원들 사이에서는 차이가 발견되지 않아, NRM 의 위험 증가에는 접종 지연이 중요한 원인을 제공하게 된다는 점을 강조한다.

나아가, 줄기 세포 이식 후 임의의 제공된 날짜에 100 을 초과하는 ANC 는 선행기술에서 이식 후 100 일 경과 전에 사망 위험을 줄이는 중요한 한계치이다 (Offner et al, Blood 88: 4058-62 (1996)). 따라서, CBT 수용자에서 관찰되는 적혈구형성 회본에서의 현저한 지연은 CBT 설정에서 성공적인 결과에 대한 중대한 장벽으로 남아있게 된다. 이식에 이용가능한 CB 간세포 (CB progenitor cell; CB 幹細胞) 뿐만 아니라 이식 후 더욱 신속한 골수 회복을 신뢰성있게 제공할 수 있는 세포의 절대적인 갯수를 증가시키는 능력은 CBT 를 제공받은 환자에서 전반적인 생존을 개선시키게 된다. 제대혈 줄기세포/간세포의 생체외 증식을 이용하는 전략은 CBT 에서 조혈 회복 및 전반적인 생존을 강화하는 목적으로 제대혈 이식에 이용가능한 낮은 세포 투여량을 극복하고자 개발되었다.

배꼽 제대혈 (CB) 이식 후 발생하는 중성구 회복에서의 현저한 지연을 극복하기 위한 목적으로, 조혈 줄기세포/간세포의 생체외 증식 조절에서의 Notch 신호전달 경로의 역할을 조사하여 시험관내 신속한 골수증식이 가능한 증가된 갯수의 간세포를 생성하게 되었다. 조작된 Notch 리간드 (Delta 1) 이용하는 임상적으로 실현가능한 방법론이 개발되었는데, 이는 CD34+ 세포의 절대적인 갯수의 멀티-로드 (multi-log) 증가 및 시험관내 신속한 골수증식이 가능한 세포 치료요법을 제공하게 되었다.

증량된, 부분적으로 HLA-적합성인 세포의 주입은, 500/ml 의 초기 절대값 중성구 계수 (ANC) 를 달성하는 평균시간을, 2 회의 비-취급 CB 단위를 제공받은 것 외에는 동일한 치료를 받은 29 명 환자가 공존하는 코호트에서는 평균 25 일 걸린 것에 비해, 11 일로 현저히 줄이는 결과를 제공했다. 치료한 환자의 수가 적지만 (n = 14), 그러한 접근법에서 안전하고 임상적으로 실행가능하면서 골수 회복 시간에 대한 유의한 효과는 증명되었다.

30 년에 걸친 수많은 연구에 엄청난 투자가 이루어졌음에도, 이상혈색소증에 대한 치료 요법 개발에 있어서는 진전이 거의 없었는데, 이는 대부분 삽입 돌연변이유발을 유도하지 않으면서도, 극히 높은 수준으로 영구히 발현하는 유전자 치료용 벡터가 필요하고, 동정되어진 약으로 쓸만한 표적이 부재하기 때문이다. 태아 헤모글로빈 (HbF) 의 발현 증대는 두 이상혈색소증을 완화하지만, 집중적인 연구개발도 그러한 관찰사실을 바탕으로 할 눈에 보이는 신규한 약제를 아직 제공하지는 못했다. 렌티바이러스 벡터를 통합하는 조혈모세포 (HSC) 유전자 치료요법이 여러 연구에서 추종되고 있다. 그러나, HSC 유전자 치료요법은 높은 수준의 영구적인 발현을 필요로 하며, 삽입 돌연변이 유발 및 백혈병의 위험을 안고 있다.

당해 분야에서 진정 필요한 것은 지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증의 치료에 대해 개선된 효능을 나타내면서도, 기존 치료 양상에서의 안전성 우려를 극복하는 조성물 및 방법이다.

본 발명 개시내용의 특정 국면은 하기 도면을 통해 더욱 잘 이해될 수 있을 것이다:
도 1 은 성인 적혈구형성 조직에서 β-글로빈-형 유전자의 발현 증가를 위한 표적을 보여준다. 태아 발현 패턴 (2 개의 γ 유전자) 에서 성인 프로그램 (δ 및 β) 으로의 전환 조절에 소용되는 인자들을 제시했다. (문헌 Wilber et al, Blood 117 (15)):3945-3953 (2011) 로부터 채택).
도 2 는 세가지 예시 희귀 절단 뉴클레아제 기법을 도시한다.
도 3 은 비재발 사망율의 위험이 이중 CBT 수용자들에서 최고라는 점을 보여주는 그래프이다. 이중 CBT (DUCB), 적합성 비인척 공여자 (MUD), 비적합성 비인척 공여자 (MMUD) 및 적합성 인척 공여자 (SIB) 이식 후 비재발 사망율.
도 4 는 Delta1^ext_IgG 를 이용한 CB 간세포의 배양이 골수제거성 이중 CBT 설정에서 더욱 신속한 중성구 회복을 제공하는 결과를 보여준다. 2 개의 미취급 유닛 ("통상적") 이 있는 이중 유닛 CBT 를 제공받은 환자 대 생체외 증량된 유닛을 제공받은 환자 및 미취급 유닛 ("증량됨") 을 제공받은 환자에 대해 개인 및 ANC 가 500/㎕ 이상이 될 때까지의 평균 시간 (실선) 을 제시한다.
도 5 는 질환 적응증에 의해 매년 실시된 제대혈 이식 횟수를 보여주는 막대 그래프이다.
도 6 (SEQ ID NO: 1) 는 HG18 에서 chrl 1:5212342-5215944 에 걸쳐 있는 HbF 침묵화 영역에 해당하는 3.6 kb 영역의 서열이다.
도 7 (SEQ ID NO: 2) 는 HbF 침묵화 영역 내 Bcl11a 점유 영역을 교란하는 것으로 공지된 업스트림 French HPFH 파괴지점을 통해 반복 엘리먼트 (HG18 에서 chrl 1:5,213,912-5,214,261) 로부터 펼쳐지는 350 염기쌍 영역으로, GATA-1 결합 모티프를 포함하며, 그로부터 본 발명의 개시내용의 예시 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 가 고안되었다.
도 8 (SEQ ID NO: 13) 는 HG18 (역방향 가닥) 에서 chrl 1:5203272-5205877 로부터 펼쳐지는, polyA 부위를 통해 캡의 1 kb 업스트림으로부터의 인간 베타-글로빈 유전자이다.
도 9 (SEQ ID NO: 14) 는 프로모터로부터 Intron 2 (H18 에서 chrl 1:5204380-5204985) 에 걸쳐있는 인간 베타글로빈의 606 bp 영역이다. 그러한 상대적으로 작은 영역은 중증의 지중해성 빈혈을 유발하는 대부분의 돌연변이 및 겸형 적혈구 빈혈을 유발하는 돌연변이를 포함한다. 그러한 작은 영역은 유전자 정정을 결과로서 제공하는 상동 재조합을 쉽게 받아들인다.
도 10 (SEQ ID NO: 24) 는 인간 Bel 11 a cDNA (CCDS 1862.1) 에 대한 cDNA 서열이다.
도 11 은 플라스미드 pET-21a(+) 에 대한 제한효소 부위 지도이다.
도 12 는 플라스미드 pEndo 에 대한 제한효소 부위 지도이다 (Doyon et al, J. Am. Chem. Soc. 128(7): 2477-2484 (2006).
도 13 은 BCL11a 유전자-표적화 엔도뉴클레아제를 만들기 위한 인위적 진화의 도식적 다이어그램이다. 구축된 라이브러리는 BCL11 A 유전자 표적으로 치환되어 있는 부분인 표적 부위에 대한 IVC 에서의 선별에 적용했다.
도 14 (SEQ ID NO: 28) 는 대장균에서의 발현에 최적화된 코돈인 I-HjeMI (BCL11a 유전자 표적화 뉴클레아제에 대한 부모 효소) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 15 (SEQ ID NO: 29) 는 포유류 발현에 최적화된 코돈인 I-HjeMI (BCL11a 유전자 표적화 뉴클레아제에 대한 부모 효소) 에 대한 뉴클레오티드 서열이다.
도 16 (SEQ ID NO: 30) 은 귀소성 엔도뉴클레아제 I-HjeMI 의 아미노산 서열이다.
도 17 (SEQ ID NO: 31) 은 대장균에서의 발현에 최적화된 코돈인 귀소성 엔도뉴클레아제 I-HjeMI (IVC 및 박테리아에서의 인위적 진화를 통해 수득됨) 을 기반으로 하는 BCL11 A 유전자 표적화 뉴클레아제 (Bel11a hje) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 18 (SEQ ID NO: 32) 은 포유류 발현에 최적화된 코돈인 귀소성 엔도뉴클레아제 I-HjeMI (IVC 및 박테리아에서의 인위적 진화를 통해 수득됨) 를 기반으로 하는 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열이다.
도 19 (SEQ ID NO: 33) 는 귀소성 엔도뉴클레아제 I-HjeMI (IVC 및 박테리아에서의 인위적 진화를 통해 수득됨) 를 기반으로 하는 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제의 아미노산 서열이다.
도 20 은 BCL11 A 유전자-표적화 엔도뉴클레아제 및 그의 부모 LHE I-HjeMI 사이에서 상이한 아미노산 잔기의 분포를 보여주는 단백질 모델이다. BCL11A 유전자-표적화 엔도뉴클레아제의 치환된 잔기들은 그의 표적 부위 (PDB ID: 3UVF) 에 결합되어 있는 I-HjeMI 의 결정 구조 상에 맵핑되어 있다. D161 는 변이체 엔도뉴클레아제에서 결실되어 있다.
도 21 은 2-플라스미드 절단 검정에서의 BCL11A 유전자-표적화 엔도뉴클레아제의 활성을 보여주는 막대 그래프이다.
도 22A (SEQ ID NO: 34) 는 대장균에서의 발현에 최적화된 코돈인 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제 (HbF 침묵화 영역을 표적으로 하는 귀소성 엔도뉴클레아제 표적화에 대한 부모 효소) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 22B (SEQ ID NO: 15) 는 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열이다.
도 23 은 HbF 침묵화 영역을 표적으로 하는 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제의 활성을 보여주는 아가로스 겔이다.
도 24 (SEQ ID NO: 35) 는 MegaTAL:5.5 RVD + Y2 I-Anil 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 25 (SEQ ID NO: 36) 는 MegaTAL:5.5 RVD + Y2 I-Anil 의 아미노산 서열이다.
도 26 (SEQ ID NO: 37) 는 Cas9 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열 (출처는 Mali et al, Science (2013)) 이다.
도 27 (SEQ ID NO: 38) 은 Cas9 엔도뉴클레아제와 함께 사용하기 위한 RNA 가이드 스트랜드의 뉴클레오티드 서열 (출처는 Mali et al, Science (2013)) 이다.
도 28 (SEQ ID NO: 62) 은 I-CpaMI 귀소성 엔도뉴클레아제 (ORF, 포유류 발현에 최적화된 코돈) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 29 (SEQ ID NO: 63) 은 I-CpaMI 귀소성 엔도뉴클레아제의 아미노산 서열이다.
도 30 은 실시예 4 에 기재되어 있는 내생성 인간 BCL11 A 유전자에서 표적화된 돌연변이유발의 검출을 보여주는 아가로스 겔이다.
도 31 는 플라스미드 pCcdB wt6 에 대한 제한효소 부위 지도이다 (Doyon et al, J. Am. Chem. Soc. 128(7): 2477-2484 (2006).
도 32 (SEQ ID NO: 64) 는 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제-인코딩 플라스미드 (pExodusBCL11Ahje) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 33 (SEQ ID NO: 65) 는 TREX2-인코딩 플라스미드 (pExodus CMV.Trex2) 의 뉴클레오티드 서열이다.
도 34 는 플라스미드 pExodusBCL11Ahje 에 대한 제한효소 부위 지도이다.
도 35 는 플라스미드 pExodus CMV.Trex2 에 대한 제한효소 부위 지도이다.

발명의 개요

*본 개시내용은 특히 이상혈색소증의 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공함으로써 상기 언급한 문제 및 당 분야의 여타 관련된 수요를 해결한다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 다음과 같은 목적으로 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 귀소성 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) 및/또는 하나 이상의 CRISPR 엔도뉴클레아제 (즉, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 Cas9 엔도뉴클레아제) 및/또는 CRISPR 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) (즉, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드가 병용되는 Cas9 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들))을 포함하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들) 또는 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) 을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 채용한다: (a) Bcl11a 코딩 영역 또는 Bcl11a 유전자 조절 영역을 교란함; (b) HbF 침묵화 DNA 조절 엘리먼트 또는 경로, 예컨대 Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역을 교란함; (c) 하나 이상의 γ-글로빈 유전자 프로모터(들)을 돌연변이화하여 γ-글로빈 유전자의 증가된 발현을 달성함; (d) 하나 이상의 δ-글로빈 유전자 프로모터(들)을 돌연변이화하여 δ-글로빈 유전자의 증가된 발현을 달성함; 및/또는 (e) 하나 이상의 β-글로빈 유전자 돌연변이(들)을 정정함.

제 1 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 Bcl11a 코딩 영역 또는 Bcl11a 유전자 조절 영역 내 서열의 표적화된 교란을 달성함으로써, 내생성 유전자, 예컨대 γ- 또는 ε- 글로빈 유전자의 발현을 치료 수준으로 증가시키기 위해, 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들), 예컨대 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 및/또는 CRISPR 엔도뉴클레아제 (즉, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용된 Cas9 엔도뉴클레아제) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 관련 국면에서, 그러한 구현예의 조성물은 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질, 및/또는 하나 이상의 TREX2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

제 2 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 β-글로빈 유전자 좌 내 중요 조절 서열의 표적화된 교란을 달성함으로써 내생성 유전자, 예컨대 γ- 또는 δ- 글로빈 유전자의 발현을 치료 수준으로 증가시키기 위해, 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들), 예컨대 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 또는 CRISPR 엔도뉴클레아제 (즉, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 Cas9 엔도뉴클레아제) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 관련 국면에서, 그러한 구현예의 조성물은 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질 및/또는 하나 이상의 TREX2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명의 구현예의 특정 국면에서는, 조절 단백질 Bcl11a 에 대한 결합 부위를 포함하는 β-글로빈 유전자 좌 (chrl 1: HG18 중의 5212342-5215944) 내의 3.6 kb 영역 (SEQ ID NO: 1) 을 표적으로 하는 HE 및 CRISPR 엔도뉴클레아제가 제공된다.

본원에 기재된 귀소성 엔도뉴클레아제 및 CRISPR 엔도뉴클레아제는 통상적인 유전자 표적 뉴클레아제을 능가하는 독특한 장점을 나타낸다. 이들이 유전자형과 무관하게 광범위한 효능을 갖고 있기 때문에, 본원에 기재된 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 귀소성 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 환자 특이적인 것이 아니며, 이들이 이형접합체 상태에서 임상적 유익을 제공하며, 벡터 서열의 삽입을 회피하게 된다.

세번째 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 게놈 편집을 통해 환자의 게놈 내에서 하나 이상의 자연-발생 돌연변이(들)을 재현 (recapitulation) 시킴으로써, 예를 들어 태아 헤모글로빈 (HPFH) 의 유전적 지속성의 결실 또는 무-결실 형태를 포함하는 임상적 유익을 제공하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 더 구체적으로, 본 발명의 개시내용은 게놈 편집을 통한 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈 (SCD) 돌연변이의 직접적인 정정을 달성하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명의 구현예의 특정 국면에서, 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 은 하나 이상의 유전자 서열, 예컨대 β-형 글로빈 유전자(들)의 편집 및/또는 수리를 허용하는 정상 또는 야생형 폴리뉴클레오티드 서열 (정정 템플레이트) 과 병용하여 채용된다. 그러한 귀소성 엔도뉴클레아제는 인간 β-글로빈 유전자 좌, 하나 이상의 자연 발생 돌연변이(들)을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일시적 발현을 통해 인간 인간 β-글로빈 유전자 좌에 의해 본원에 예시된 유전자 좌 내 중요 조절 및/또는 코딩 서열의 개질을 허용한다. 관련 국면에서, 그러한 구현예들의 조성물은 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질 및/또는 하나 이상의 TREX2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

더 구체적으로는, 본 발명의 개시내용은 각각 HE 및 정정 템플레이트를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 게놈 편집 방법을 제공하는데, 이는 예를 들어 조혈모세포 (HSC), 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 를 포함하는 줄기 세포 내 자연-발생 돌연변이 생성에 채용될 수 있다. 자가유래 HSC 및 iPSC 를 포함하는 게놈 편집된 (genome edited) HSC, ES 및 iPSC 는, 하나 이상의 이상혈색소증, 예컨대 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈의 치료를 위해 환자에 이식될 수 있다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은, 성숙형 적혈구형성 세포 및 환자 세포에서 생체내 이상혈색소증의 경감을 달성하기 위한, 외인성 유전자의 영구적 발현 또는 삽입을 필요로 하지 않는, 표적 템플레이트, Cas9 엔도뉴클레아제 및/또는 RNA 가이드 스트랜드의 존재 또는 부재 하에 HE 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일시적 발현을 통해, HSC, ES 및 iPSC 의 효율적인 개질을 허용한다. 그런 치료 방법은 트랜스진의 통합 및/또는 영구적 발현을 필요로 하지 않기 때문에, 현재 이용가능한 치료요법 기술과 연관된 안전성에 대한 염려는 없다.

네번째 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는, 각각 인간에서 임상적 유익을 제공하도록 표적화된 영역에서 일시적으로 발현될 수 있는 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제(들)의 전달을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 코딩 서열은 TAL 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 코딩 서열과 병용되거나 또는 그와 융합되어 발현될 수 있다. 본원에는 TAL 효과기-HE (TALE-HE) 융합 단백질 및 태아 헤모글로빈 생산에 영향을 주는 중요 게놈 영역을 표적으로 하는, 그러한 TALE-HE 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 예시된다.

그러한 구현예의 특정 국면에서, 표적 템플레이트, 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드, 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질, 및/또는 하나 이상의 TREX2 단백질의 존재 또는 부재 하에 하나 이상의 HE 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 벡터 내 프로모터 서열에 작동적으로 연결되어 HE, Cas9, RNA 가이드 스트랜드, TALEN, TALE-HE 융합 단백질 및/또는 TREX2 단백질의 전달 및 일시적 발현을 달성하게 된다. HE, TALEN, TALE-HE 융합 단백질 및/또는 TREX2 단백질의 전달에 만족스럽게 채용될 수 있는 적합한 바이러스 벡터는 구균을 모사한 유형의 (cocal pseudotyped) 렌티바이러스 벡터, 포오미 (foamy) 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-회합된 바이러스 (AAV) 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

다섯번째 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 생체외 증량된 개질된 조혈모세포 (HSC) 를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하는데, 이는 정정된 세포의 효율적 접종 및 스크리닝 및 임상 적용을 위한 유도된 만능 줄기 세포의 이용을 가능케 한다. 그러한 구현예의 특정 국면에서, 자가유래 HSC, 자가유래 유전자-개질된 HSC, iPSC-유도된 HSC 및 ES 세포의 효율적 증량을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 정상 공여자로부터 수득된 동원된 (mobilized) 말초혈 CD34+ 세포를 이용해 조혈 성장 인자를 보충한 무혈청 배지 중에 Delta1 를 이용하는 제대혈 증량 방법론이 채용될 수 있다. 그러한 조성물 및 방법은 조혈 줄기세포/간세포의 생존 및 증식을 강화하는 하나 이상의 추가적인 시약과 병용하여 이용될 수 있다. 여타 국면에서, 그러한 조성물 및 방법은 정정된 iPSC-유도된 HSC 를 포함하여 장기간 재생 세포 (long-term repopulation cell) 의 강화된 증량을 위해 내피 세포 공동배양을 채용할 수 있다.

여섯번째 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 이식 후 호중성 백혈구 감소증을 없애고, 유전자-정정된 자가유래 HSC 의 이식에 후속하는 결과를 개선하는 규격화된 세포 치료요법을 포함하는 지원 케어 제공을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 예를 들어, 생체외 증량된 냉동보관 제대혈 (CB) 줄기세포/간세포는 자가유래 CD34+ 유전자 정정된 세포로 골수제거성 HCT (myeloablative HCT) 를 진행 중인 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈 환자에 대한 지원 케어 수단으로 투여될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 개시내용은 일반적으로, 다음과 같은 목적으로 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용하는 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 귀소성 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 Cas9 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들) 을 포함하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들) 또는 엔도뉴클레아제 융합 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의의 일시적 또는 영구적 발현에 의해 이상혈색소증과 같은 유전적 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다: (a) Bcl11a 코딩 영역의 교란; (b) HbF 침묵화 DNA 조절 엘리먼트 또는 경로, 예컨대 Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역의 교란; (c) γ-글로빈 유전자의 증가된 발현을 달성하기 위한 하나 이상의 γ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화; (d) 하나 이상의 δ-글로빈 유전자 프로모터(들) δ-글로빈 유전자의 증가된 발현의 달성; 및/또는 (e) 하나 이상의 β-글로빈 유전자 돌연변이(들)의 정정. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증의 치료에 이용될 수 있는 것으로 나타났다. 본원에 기재된 조성물 및 방법은 임의로는 하나 이상의 TALEN, 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질 및/또는 하나 이상의 TREX2 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 개시내용은 하기 정의를 고려하면 더욱 이해하기 쉬울 것이다:

정의

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이상혈색소증" 은 헤모글로빈 분자의 하나 이상의 글로빈 사슬의 비정상적 구조, 비정상적 기능 또는 변경된 발현을 초래하는 유전자 결함의 계열을 지칭한다. 이상혈색소증은 유전되는 단일-유전자 장애이다. 보통 이상혈색소증은 지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈증을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지중해성 빈혈" 은 α-형 대 β-형 글로빈 폴리펩티드 사슬의 비율 변경으로 초래되어, 정상적 헤모글로빈 사량체 단백질의 생산부족 및 유리되어 있거나 또는 짝지어지지 않은 α- 또는 β-사슬의 발생을 제공하게 되는 이상혈색소증을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "겸형 적혈구 빈혈증" 은 글로빈 유전자에서의 돌연변이로 인한 결과이며, 비정상적인 뻣뻣한 겸형 형태를 한 적혈구 세포를 특징으로 하는 상염색체 열성 유전자 혈액 장애의 한 군을 지칭한다. 펩티드의 아미노산 위치 위치 6 에서 글루탐산이 발린으로 치환되어 있는 β-글로빈을 코딩하는 β^s-유전자 및 임상적 표현형을 유도하는 HbS 의 결정형성을 가능케 하는 돌연변이를 지닌 제 2 의 β-유전자의 존재로써 정의된다. 용어 "겸형-세포 빈혈" 은 HbS 를 유발하는 돌연변이에 대해 동형접합성인 환자에서의 겸형 적혈구 빈혈증의 특정 형태를 지칭한다. 겸형 적혈구 빈혈의 여타 통상적인 형태에는, HbS/β-지중해성 빈혈, HbS/HbC 및 HbS/HbD 이 포함된다. 표 1 은 야생형 및 겸형 세포 β-글로빈 사슬의 최초 아미노산을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 개시한다.

표 1

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "태아 헤모글로빈의 유전적 지속성" 또는 "HPFH" 는 유의할 태아 헤모글로빈 (헤모글로빈 F) 생산이 정상적인 정지 시점과 무관하게 성년에까지 계속하여 지속되는 양성의 상태를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글로빈" 은 산소의 결합 및 수송에 관여되어 있는 헴-포함 단백질들의 계열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "귀소성 엔도뉴클레아제" 또는 "HE" 는 게놈에서 오직 한번 나타날 정도로 길고, 무작위로 매우 낮은 비율 (예를 들어, 매 7x10¹⁰ bp 당 1 회) 로 존재하는 것을 특징으로 하는 제한효소 엔도뉴클레아제의 계열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전사 활성화제형 효과기 (Transcription Activator-Like Effector) 뉴클레아제" 또는 "TAL 효과기 뉴클레아제" 또는 "TALEN" 은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시켜 생성되는 인공적인 제한효소 엔도뉴클레아제의 계열을 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "3 프라이머 수리 (three prime repair) 엑소뉴클레아제 2" 또는 "TREX2" 는 전형적으로는 DNA 복제, 수리 및 재조합에 관여되어 있는 3' 엑소뉴클레아제 활성이 있는 뉴클레아제를 지칭한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "Cas9 엔도뉴클레아제" 는 엔도뉴클레아제 절단 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드 스트랜드를 이용하는 RNA 가이드 스트랜드를 지칭한다. 용어 "CRISPR 엔도뉴클레아제" 는 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 Cas9 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 참고문헌은, [Jinek et al, Science 337:816-821 (2013); Cong et al, Science (Jan. 3, 2013) (인쇄판에 앞서 전자출판됨); 및 Mali et al, Science (Jan. 3, 2013) (인쇄판에 앞서 전자출판됨)].

달리 언급되지 않는 한, 용어들은 "개방형" 인 것을 의도로 한다 (예를 들어, 용어 "포함함" 는 "이에 제한되지 않고 포함함" 을, "지니고 있음" 은 "적어도 그것을 지니고 있음" 으로, 용어 "포함하다" 는 "이에 제한되지 않고 포함하다" 로 해석되어야 함). "적어도 하나" 및 "하나 이상의" 와 같은 어구 및 대표단수는 단수 및 복수를 모두 포함하는 것이다.

추가로, 개시내용의 특징 또는 국면이 Markush 그룹으로 기재되어 있는 곳에서, 해당 개시내용은 된 개시내용의 Markush 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원들의 하위 그룹까지도 기재하는 의도의 것임을 이해해야 한다. 것으로 의도한다. 유사하게, 본원에 개시된 모든 범위들은 또한 모든 가능한 하위 범위들 및 하위 범위들의 조합을 포함하며, "사이", "가지", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 용어들은 범위 내 언급되는 수치 및 각각의 개별 구성원들을 포함한다.

미국, PCT 또는 미국 외 외국의 특허, 특허 출원 및 특허 공보, 및 모든 과학 기술문헌들을 포함하여 이에 제한됨없이 상기 및 하기에 인용된 모든 참고문헌들은 전부 본원에 참고문헌으로 포함된다.

다양한 구현예들이 본원에 개시되어 있지만, 그외 여타 구현예들도 당업자에게 자명할 것이다. 본원에 개시된 다양한 구현예들은 설명을 목적으로 존재하는 것이며, 본원의 진정한 범위 및 진의는 특허청구범위에 의해 제시되어 있다.

고효율, 다중 유전자 교란 및 유전자 편집 기능을 달성하기 위한

귀소성 엔도뉴클레아제

본원에 논의되고 하기 예시된 바와 같이, 본 발명의 개시내용은, 하나 이상의 I-HjeMI 귀소성 엔도뉴클레아제(들), I-CpaMI 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제와 같은 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) (HE(들) 을 포함하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 인간에서 임상적 유익을 제시하도록 표적화된 세포에서 일시적으로 또는 지속적으로 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용하여 포함하는 조성물 및 방법을 제공한다. 예시 엔도뉴클레아제는 하기와 같이 태아 헤모글로빈 생산에 영향을 주는 중요한 게놈 영역을 표적으로 한다: (a) Bcl11a 코딩 영역 또는 Bcl11a 유전자 조절 영역의 교란; (b) HbF 침묵화 DNA 조절 엘리먼트 또는 경로, 예컨대 Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역의 교란; (c) γ-글로빈 유전자의 증가된 발현을 달성하기 위한 하나 이상의 γ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화; (d) δ-글로빈 유전자의 증가된 발현을 달성하기 위한 하나 이상의 δ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화; 및/또는 (e) 하나 이상의 β-글로빈 유전자 돌연변이(들)의 정정. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증의 치료에 이용될 수 있다.

본원에 기재된 엔도뉴클레아제 코딩 서열은 DNA 결합 도메인 코딩 서열, 예컨대 TAL 효과기 (TALE) 코딩 서열 또는 뉴클레아제 코딩 서열, 예컨대 3 프라임 수리 엑소뉴클레아제 2 (TREX2) 코딩 서열과 조합되거나 또는 그와 융합되어 발현될 수 있다. 하나 이상의 TALE-HE 융합 단백질(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 TALE-HE 융합 단백질이 본원에 예시된다.

진핵세포에서 표적화된 유전자 개질 및 교란을 달성하기 위한 4 가지 단백질 스캐폴드가 공지되어 있다: RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN), TAL 효과기 뉴클레아제 (TALEN), 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 및 Cas9 엔도뉴클레아제. 본 발명의 개시내용은 TAL 효과기 뉴클레아제, 귀소성 엔도뉴클레아제 및/또는 Cas9 엔도뉴클레아제를 단독으로 또는 조합하여 채용한다. TAL 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제에 비해 더욱 간결한 모듈 디자인 및 더욱 높은 DNA 인식 특이성을 제공하는 한편, 귀소성 엔도뉴클레아제, 예컨대 LAGLIDADG 귀소성 엔도뉴클레아제 (LHE) 가 더욱더 특이적인 절단 프로파일, 더욱더 컴팩트한 구조를 제공하는데, 이는 ZFN 및 TALEN 가 이량체화를 필요로 하는 것과 대비되어 그들이 이량체화를 필요로 하지 않고, 복합다중 조합에 이용될 능력이 있는 컴팩트한 단량체 단백질이기 때문이다. 따라서, HE 및 CRISPR 엔도뉴클레아제 (즉, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 Cas9 엔도뉴클레아제) 는 유전자 교란 중재에서 극히 효율적이다. Stoddard 의 상기 참고문헌, 및 상기 참고문헌 [Mali et al., Science (2013)] 참조.

본 발명의 개시내용의 일부분으로서, HbF 기능을 억제하는 β-글로빈 좌 내 중요한 영역이 밝혀졌다. 상기 영역은 HE- 및 Cas9-중재 절단을 위한 여러 표적들을 제공한다. 특이적으로 고안된 뉴클레아제는 인식 표적 부위에 대한 활성 및 임의의 근접하게 관련된 게놈 표적에 대한 표적을 벗어난 활성에 대해 시험될 수 있다. 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 그러한 HE 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 문헌 [Stoddard, Structure 19: 7-15 (2011)] 및 [Mali et al, Science (2013)] 에 기재된 방법을 이용해 표적을 벗어난 게놈 절단을 피하도록 조작될 수 있다. 본원에 개시된 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용되는 HE 및 Cas9 엔도뉴클레아제는 γ- 및 δ-프로모터를 직접적으로 표적화하고, 대부분의 지중해성 빈혈 돌연변이 뿐만 아니라 HbS 돌연변이에까지 걸쳐지는 606 bp 영역 (SEQ ID NO: 14) 을 치환할 수 있다.

HbF 침묵화 영역 또는 그의 부분집합에 걸쳐 대규모 결실 생성을 촉진하기 위해서는, 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드와 병용하여 하나 이상의 HE 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제가, 엔도뉴클레아제 절단 부위로부터 표적 영역의 말단까지 걸쳐져 있는 가교 올리고뉴클레오티드를 이용해 공동-형질도입될 수 있다. 참고문헌은, [Chen et al., Nat. Methods 8(9): 753-5 (2011)]. 더 높은 빈도의 게놈 편집은 표적 영역의 각 측면에 있는 서열에 결합하여 절단하는 하나 이상의 HE 를 채용하여 달성될 수 있다. 유사하게, HE 및 올리고뉴클레오티드의 돌연변이화가 이용되어 프로모터 영역 돌연변이를 도입하여, 감마 또는 델타 유전자의 상승된 발현을 유도할 수도 있다.

본 발명에서 개시된 HE 는 적혈구세포로 분화하도록 유도되는 인간 CD34+ 세포 및 적혈구생성 세포주에서 우선 평가하여 글로빈 유전자 발현을 변경하는 능력을 확인할 수 있다. 고려하는 정확한 적용에 따라서는, 1, 2, 3 개 또는 그 이상의 HE 가 전달되어 더욱 대규모의 결실을 촉진할 수도 있다. 개별 HE 의 적합성은 다능성 및 증량 잠재성과 타협함없이 HSC 를 표적으로 하는 그의 능력을 평가하고, 이상혈색소증 모델에서 임상적 유익을 평가하기 위해 추가적인 배양 및 동물 모델 검정에서 평가될 수 있다. 하나 이상의 HE 및 하나 이상의 엑소뉴클레아제, 예컨대 TREX2 엑소뉴클레아제 또는 TAL 효과기 엑소뉴클레아제는 HbF 에 대한 중요한 영역에서 표적화된 유전자 결실의 유도를 위해 CD34+ HSC 에 전달될 수 있다.

개별 뉴클레아제는 반복 엘리먼트의 가장자리에서 시작하여 HbF 침묵화 영역 내 Bcl11a 점유 영역를 교란하는 것으로 공지된 업스트림 French HPFH 파괴지점을 통해 펼쳐져 있으며, GATA-1 결합 모티프를 포함하는 영역에 의해 정해지는 350 bp 영역 (SEQ ID NO: 2) 내 일련의 표적들에 대해 시험될 수 있다. 초기의 분석은 해당 영역을 통틀어 고르게 분포되어 있으며, 분리되어 서열분석한 고활성 엔도뉴클레아제 변이체의 집단에 대한 DNA 서열 모듈을 포함하는 7 개의 표적들을 밝혀냈다. 특히, 1 개의 표적은 잠재적인 Bcl11a 결합 모티프와 중첩되며, GATA-1 모티프에 근접하게 존재한다. 표적 영역의 연속하는 더 큰 결실은 2, 3 개 또는 그 이상의 HE 에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, Bcl11a 유전자를 교란하기 위한 다중 표적들이 유전자의 5'-말단에서 밝혀져, 유전자 기능의 제거를 확신시켜 준다. 유사하게, Cas9/RNA 가이드 중재 교란에 대한 여러 최적 표적들은 단독으로 또는 더 큰 결실을 유도하는 조합으로 사용될 수 있는 영역을 통해 밝혀졌다.

개별 HE 들은 통합된 게놈 리포터를 이용해 형질주입된 인간 세포주에서 시험될 수 있으며, 나아가 Stoddard 의 상기 문헌에 기재된 프로토콜을 이용해 절단 및 유전자 변환 활성을 추가로 최적화할 추가적인 선별 단계들을 추가로 채용할 수 있다. 글로빈 좌 내 표적들에 대해 활성인 개별 표적화된 HE 의 평가 및 전달에는 발현 시스템에서의 뉴클레아제의 벡터화가 후속될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제, 예컨대 TALEN 및/또는 TREX 엑소뉴클레아제의 공동발현을 위한 각 HE 를 연결하는 발현 시스템이 채용되어, 형질도입된 세포에서 매우 강화된 유전자 교란 효율성을 달성하게 될 수 있다.

본 발명의 개시내용은 또한 원하는 표적 부위, 예컨대 글로빈 좌 내에서 TALE 및 HE 스캐폴들에 의한 인접 DNA 표적들의 상승작용적 인식을 통한 조작된 HE 의 유인의 제한 및 활성의 원하는 특징을 나타내는 TALE-HE 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 그러한 TALE-HE 융합물들은 전통적인 TALEN 또는 징크 핑커 뉴클레아제 (ZFN) 와 연관되어 있는 비특이적인 뉴클레아제 활성을 감소시키면서, 각 스캐폴드 (즉, HE 의 TALE 및 뉴클레아제 특이성의 모듈 어셈블리) 의 가장 선호하는 특성을 조합하게 된다.

고해상도 결정 구조는 10 가지 구분되는 LAGLIDADG 귀소성 엔도뉴클레아제 (LHE) 에 대해 그의 인식 DNA 표적 부위를 가진 복합체에서 결정되었다. 문헌 [Stoddard, Structure 19: 7-15 (2011)] 및 [Takeuchi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108: 13077-13082 (2011)]. 그러한 LHE 의 키메라성 '하이브리드' 는 유전자-특이적 적용을 위한 광범위한 LHE 표적화를 집합적으로 제공하도록 구축되었다. 참고문헌은, [Baxter et al, Nucl. Acids Res. 40(16): 7985-8000 (2012)].

적합한 표적 서열 특이성을 지닌 HE 는 원하는 DNA 절단 특이성에 대한 고속 세포 분류와 조합된 효모 표면 디스플레이 전략에 의해 밝혀질 수 있다. 전체 표적 부위를 가로질러 펼쳐지는 연쇄적인 접촉 포켓에 해당하는 일련의 단백질-DNA '모듈' 이 별개의 라이브러리들에서 조직적으로 무작위로 존재되어 있다. 이어서, 각 라이브러리는 각 모듈 내 각각의 가능한 DNA 변이체를 특이적으로 절단할 수 있는 효소들의 집단에 대해 조직적으로 분류될 수 있으며, 각 분류된 집단은 심화하여 서열분석되며 (deep-sequenced), 후속 효소 어셈블리 및 디자인에 대해 기록보관된다. 본 발명의 개시내용의 조성물 및 방법에 적합하게 채용될 수 있는 HE 는 시판되어 입수가능하다 (Pregenen, Seattle, WA).

특정 국면에서, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 예를 들어, 하나 이상의 LHE 를 포함하는 하나 이상의 HE 의 TREX2 3' 엑소뉴클레아제와의 공동발현을 채용할 수 있다. ZFN 및 TALEN 의 현재 버젼에 의해 남겨진 5' 오버행과는 대조적으로, HE 들은 표적화된 이중-가닥 파괴 부위에 3' 오버행을 생성하여, 그 결과 후속 HE 절단을 종결 프로세싱하는 속도를 강화하게 된다. 초대 세포들에서 이중 가닥 파괴 부위의 거의 완전한 개질은 HE/TREX2 공동발현을 통해 달성될 수 있다. HE/TREX2 공동발현이 파괴 프로세싱에 영향을 주는 방식 때문에, 그러한 조합이 1 개 영역 내 다중 표적화된 결실을 달성하게 되며, 파괴 지속성을 줄이고 대안적인 종결 종합 경로를 통해 중재되는 대형 스케일 전좌 잠재성을 줄임으로써 뉴클레아제-유도성 표적화된 유전자 교란의 안전성을 증가시킨다.

TAL 효과기 (PthXol) 의 DNA 표적 부위에 결합되어 있는 결정 구조가 최근 결정되었다. 참고문헌 [Mak et al, Science 335(6069): 716-9 2012; e-pub 05Janl2 PubMed PMID: 22223736]. 그러한 결정 구조 데이터는 DNA 인식 영역 경계를 정확하게 정의하도록 하며, 얌전한 (well-behaved) TALEN-HE, 또는 다양한 복합적인 게놈 취급 달성에 적용될 수 있는 여타 TALEN-뉴클레아제 융합 구축물의 창출을 위한 전략을 돕게 된다.

Bcl11a 유전자 발현에 대한 게놈 교란

겸형 세포 마우스 모델에서의 Bcl11a 의 넉아웃은 그러한 경로의 임상적인 타당성을 뒷받침해 준다. 참고문헌 [Xu et al, Science 334: 993-6 (2011)]. 추가로, 인간 β-글로빈 좌에 걸쳐 있는 YAC 트랜스진을 포함하고 있는 마우스가 HbF 의 Bcl11a 중재성 침묵화에서의 모델 섭동에 이용된다. 그러한 마우스에서의 내생성 Bcl11a 유전자의 이형접합성 및 동형접합성 넉아웃은, 각각 전체 β-형 mRNA 의 20 및 76% 를 포함하는 γ-글로빈 mRNA 을 제공하는 결과를 가져오는데, 이는 대조군이 0.24% 를 포함하는 것과 비교될 수 있다. 참고문헌 [Sankaran et al, Nature 460: 1093-7 (2009)]. 이는 Bcl11a 가 HbF 억제 정도를 조절하는 저항기로서 작용한다는 점을 시사한다. 이를 고려하면, Bcl11a 에서의 관능성 돌연변이의 감소는 상승된 수준의 HbF 및 임상적 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈 표현형의 약화를 결과를 초래한다. 참고문헌 [Galanello et al, Blood 114: 3935-7 (2009)].

특정 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) (HE), 예컨대 하나 이상의 I-HjeMI 귀소성 엔도뉴클레아제(들), I-CpaMI 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제(들) 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제(들) 을 포함하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제(들)을 포함하는 조성물 및 방법을 제공하여, Bcl11a 또는 그의 중요 조절 서열을 인코딩하는 서열의 교란을 달성하게 된다. 본원에 더욱 상세하게 기재되어 설명된 바와 같이, 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제를 포함하는 조성물 및 방법은 추가로 하나 이상의 Bcl11a 유전자-특이적 RNA 가이드 스트랜드를 포함하여, Cas9 엔도뉴클레아제의 Bcl11a 유전자 서열에 대한 표적화를 중재하게 된다.

Bcl11a 유전자는 1OO kb 상에 걸쳐져 있는 여러 엑손을 지니고 있어서, 상이한 활성과 연관되어 있는 단백질들을 유도하는 여러 스플라이스 변이체를 결과로서 제공하게 된다. 본 발명의 개시내용의 일부로서, 여러 Bcl11a 스플라이스 변이체로 전사될 여러 DNA 표적들이 밝혀졌다. 전부 장형 (L) 및 초장형 (extra-long) (XL) 형태를 교란하는데, 이들은 최대 HbF 침묵화 활성과 연관되어 있는 한편, 한가지가 Bcl11a 의 모든 형태를 교란한다. 그러한 표적들은 고활성 엔도뉴클레아제 변이체의 집단이 분리 및 서열분석되는 DNA 서열 모듈을 포함한다. 인간 Bcl11a cDNA 서열 (CCDS1862.1) 은 본원에서 SEQ ID NO: 24 (도 10) 로 제시된다.

따라서, 특정 국면에서, 본 발명의 개시내용은 HbF 의 치료 수준 달성을 위한 조성물을 제공하며, 그 조성물은 1.3 kb 영역 내 뉴클레오티드 서열의 교란을 중재할 수 있는 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써, Bcl11a 의 결합 및 해당하는 억제성 복합체의 형성을 방해하고, γ-글로빈 발현을 억제하게 된다.

HbF 의 Bcl11a-중재된 침묵화를 차단하는 게놈 교란

상기 요약된 바와 같이, 특정 구현예에서 본 발명의 개시내용은 유전 질환, 예컨대 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증을 치료 및/또는 경감시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 그러한 구현예들의 특정 국면은 β-글로빈 유전자 좌 또는 δ-글로빈 유전자 좌 내 HbF 침묵화 엘리먼트 또는 경로를 교란하는 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일시적 발현을 포함함으로써, 내생성 유전자, 예컨대 γ- 또는 δ-글로빈 유전자를 발현하는 치료 수준을 증가시키게 된다.

본원에 개시된 조성물은 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들) (HE) 및/또는 하나 이상의 Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드 및 임의로는 하나 이상의 전사 활성화제형 (TAL) 효과기(들)과 조합하여 포함해, β-글로빈 유전자 좌 내 중요 조절 서열들의 표적화된 교란을 달성하게 된다. 더 구체적으로는, 본원에 개시된 조성물 및 방법은 γ-글로빈 유전자 발현에서의 증가, 및 β-글로빈 유전자 좌 내 HbF 침묵화 영역(들)에 대한 Bcl11a 결합을 위한 핵심적인 엘리먼트의 제거에 의한 결과로서의 HbF 단백질 생산을 달성하게 된다.

정상적인 발생 동안, 배아 β-형 유전자 (ε-글로빈) 의 발현은 태아에서의 γ-글로빈 유전자 쌍 및 성인에서의 δ- 및 β-글로빈 유전자로 순차적으로 치환된다. 성인 적혈구생성 조직에서, 징크 핑거 단백질 Bcl11a 은 β-글로빈 유전자 좌 내 γ-글로빈 및 δ-글로빈 유전자 사이의 영역에 결합함으로써, HbF 의 생성을 침묵화한다. HbF 의 Bcl11a-중재성 침묵화의 중요성은 인간 CD34 세포에서의 Bcl11a mRNA 의 넉다운에 의해 뒷받침되는데, 이는 HbF 수준을 전체 β-형 단백질의 24 내지 36% 까지 증가시킨다. 참고문헌은 [Sankaran et al, Science 322: 1839-42 (2008)]. HPFH 의 결실 형태에서 상기 영역의 제거 뿐만 아니라 Bcl11a 의 넉다운은 , blocks Bcl11a-중재성 HbF 침묵화를 차단하여, 성인 적혈구생성 조직에서의 γ-글로빈 유전자 발현 및 HbF 단백질 생산의 상승된 수준을 제공하게 된다 (Sankaran et al, N. Engl. J. Med. 365: 807-14 (2011)).

여러 메커니즘이 HbF 단백질 수준에서의 상승에 기여하지만, 3.6 kb 영역이 HbF 침묵화를 위한 중요한 부분인 것으로 나타났다 (SEQ ID NO: 1). 참고문헌은 [Sankaran et al, N. Engl. J. Med. 365: 807-14 (2011)]. β-글로빈 좌에서 Bcl11a 풍부화의 여러 정점들이 있지만, Bcl11a 와 억제성 복합체를 형성하는 것으로 공지된 단백질들 (GATA-1 및 HDAC-1) 이 해당 영역에 결합되어 있으며, 염색질이 라이신 27 상의 히스톤 H3 의 억제성 히스톤 마크 트리메틸화에 대해 풍부화되어 있기에 3.6 kb HbF 침묵화 영역에서의 단일 정점이 두드러진다.

특히, 그러한 3.6 kb 영역은 γ-유전자의 Bcl11a 결합 다운스트림의 단일 정점을 포함한다. γ-글로빈 프로모터 이형접합체로서 20 내지 30% 의 HbF 수준을 초래하게 되며, 그 결과 지중해성 빈혈 및 SCD 를 완화하게 되는 여러 점 돌연변이들이 그 영역에서 밝혀진 바 있다. 그러한 점 돌연변이들은 γ-캡 부위의 200 bp 내에 전부 3 개의 영역으로 클러스터를 형성한다: (1) -200, SP1 및 단계 특이적 단백질 복합체에 의해 결합되어 있는 GC-풍부 영역; (2) -175, GATA-1 에 의해 결합되어 있음; 및 (3) 여러 부가 인자에 의해 결합되어 있는 -177 에서의 Oct1 및 CCAAT 모티프. 참고문헌은 [Forget, Ann. NY Acad. Sci. 850: 38-44 (1998)].

그러한 세 영역 내 돌연변이는 성인 적혈구생성 세포에서 억제성 복합의 결합을 차단한다. 결과적으로, 그러한 영역들은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 의한 HE-중재되는 교란 및 표적화된 돌연변이에 대한 적합한 표적이다. 그러한 영역들의 교란은 억제성 복합체에서의 감소를 유도하며, 이는 상승된 수준의 γ-글로빈 유전자 발현 및 HbF 단백질 생산에서 β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증의 치료 방법에서 치료 효능을 발휘하기에 충분한 수준으로의 상응하는 증가를 결과로서 제공하게 된다.

Bcl11a 점유의 단일 정점은 3.6 kb HbF 침묵화 영역 내에 존재한다 (Sankaran et al, N. Engl. J. Med. 365: 807-14 (2011)) ((SEQ ID NO: 1). Bcl11a 점유의 그러한 영역은 French HPFH 의 업스트림 파괴에 의해 교란된다 [Sankaran et al, N. Engl. J. Med. 365: 807-14 (2011)]. 반복 엘리먼트의 경계로부터 시작하여, HbF 침묵화 영역 내 Bcl11a 점유 영역을 교란하는 것으로 공지된 업스트림 French HPFH 파괴지점에 걸쳐 있으며, GATA-1 결합 모티프를 포함하는 350 bp 영역이 본원에 기재되어 있다 (SEQ ID NO: 2). 업스트림 French HPFH 결실 전의 염기는 HG18 chrl 1:5,214,023 이다. GATA-1 모티프는 chrl 1:5,214,200-5,214,206 에 걸쳐 있다. 이론에 구애됨 없이, GATA-1 및 HDAC-1 은 Bcl11a 이 그러한 350 bp 영역 내에 결합되어 있을 때 Bcl11a 와 억제성 복합체를 형성하며, 이것이 γ-글로빈 유전자의 발현을 억제하는 억제성 복합체의 형성을 유도함으로써, HbF 단백질의 세포내 수준을 감소시키는 것으로 여겨진다.

본원에 개시된 조성물 및 방법에 의해 달성되는 HE-중재되는 교란은 높은 효율성으로 발생된다. 당업계에 공지되어 있는 shRNA 넉다운 접근법과는 달리, 본원에 개시된 귀소성 엔도뉴클레아제에 의해 중재되는 HbF 침묵화 영역의 고도로 서열 특이적인 교란은 게놈 내 여타 Bcl11a 결합 부위에서는 표적 유효성을 회피하며, 여타 세포 유형에서, 특히 Bcl11a 결합을 필요로 하는 B-세포에서는 정상적인 발생이 획득된다.

따라서, 본원에 기재된 귀소성 엔도뉴클레아제는 통상적 유전자 표적화 뉴클레아제를 능가하는 독보적 장점을 나타낸다. 그들이 유전자형과 무관하게 광범위하게 효능적이기 때문에, 본원에 기재된 귀소성 엔도뉴클레아제는 환자 특이적이지 않으며, 이형접합 상태에서 임상적 유익을 제공한다.

지중해성 빈혈 또는 겸형 적혈구 빈혈 돌연변이 정정을 위한 유전자 개질의 재현

여타 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 임상적 유익을 제공하기 위해 환자의 게놈 내에 하나 이상의 자연-발생 돌연변이(들)을 게놈 편집을 통해 재현시키는 방법을 제공한다. 더 구체적으로, 본 발명의 개시내용은 게놈 편집을 통해 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈 (SCD) 의 직접적인 정정을 달성하는 조성물 및 방법을 제공한다.

본원에 개시된 조성물 및 방법은 정정 템플레이트 및 환자의 게놈 내 상응하는 돌연변이화된 서열 사이의 상동 재조합 (HR) 비율을 강화함으로써, 지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 포함하는 이상혈색소증을 완화하기 위한 유전자 편집 및 정정을 달성하는 정정 템플레이트를 채용한다. 근본이 되는 β-글로빈 돌연변이를 정정하여, 벡터 서열의 삽입을 피하면서도 이형접합성 상태에서 임상적 유익을 제공하는 조성물 및 방법이 본원에 예시된다. 그러한 조성물 및 방법은 Bcl11a-중재되는 유전자 침묵화의 교란을 위한 상기 기재된 조성물 및 방법과는 독립적으로 또는 그와 병용하여 사용될 수 있다.

본 발명의 개시내용은 선행기술에서 이용가능했던 대안적 플랫폼과 비교하여, HE 의 장점을 발휘하는 게놈 편집을 위한 기법의 강건한 설정을 제공한다. 그러한 HE 는 TAL 효과기 모듈의 DNA 결합 플랫폼과 병용되어, 추가적인 치료 장점을 달성할 수 있다.

게놈 편집을 위한 상동 재조합 (HR) 이 강력한 반면, 충분하지 않다. 개질해야 할 영역에서의 이중 가닥진 파괴의 도입은 HR 효율에서 엄청난 증가를 가져온다. HE 및 정정 템플레이트를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 동시적인 도입에서, 정정 템플레이트가 100 bp 의 적은 인접 측면 상동성을 포함하는데, 이것이 HR 의 증가된 빈도를 허용하게 되며, 이로써 올바른 템플레이트가 도입되는 게놈 편집을 허용하게 된다.

짧은 합성된 정정 템플레이트를 이용한 세포의 형질도입이 또한 정해진 단일 염기쌍 돌연변이의 효율적인 도입을 위해 채용될 수 있다. 그러한 접근법은 전형적으로는 단일 HE 을 이용하게 된다. 대안적으로, 개질 표적이 되는 영역 측면에 있는 HE 가 형질도입될 수 있다. 정정 템플레이트는 본원에 기재된 최적화된 방법에 의해 형질도입될 수 있다. HE 의 고안, 형질도입 및 평가는 하기에 논의되는 바와 같이, 문헌 [Certo et ah, Nat Methods 8: 671-6 (201 1) 및 Jarjour et al, Nucleic Acids Res 37: 6871-80 (2009)] 에 기재된 방법론에 따라 실시될 수 있다.

그러한 구현예의 특정 국면에서, 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제(들)이 하나 이상의 β-형 글로빈 유전자(들)의 편집 및/또는 수리를 허용하는 정상적 또는 야생형 폴리뉴클레오티드 서열과 병용하여 채용된다. 예를 들어, 본 발명의 개시내용은 이상혈색소증의 치료를 위한 조성물 및 방법을 개시하는데, 그러한 조성물 및 방법은 하나 이상의 자연 발생 돌연변이(들)을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일시적 발현을 통해 인간 β-글로빈 유전자 좌에 의한 본원에 예시되는, 유전자 좌 내의 중요 조절 및/또는 코딩 서열의 개질을 허용한다.

더 구체적으로는, 본 발명의 개시내용은, 예를 들어 조혈모세포 (HSC), 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 를 포함하는 줄기 세포 내 자연-발생 돌연변이들을 재현시키는 돌연변이 생성에 채용될 수 있는 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 자가유래 HSC 및 iPSC 를 포함하는 게놈 편집된 HSC, ES 및 iPSC 는 하나 이상의 이상혈색소증, 예컨대 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈의 치료를 위해 환자에 이식될 수 있다. 본원에 개시된 조성물 및 방법은 성숙형 적혈구 생성 세포 및 환자 세포에서 생체내 이상혈색소증 완화를 달성하기 위해, 외인성 유전자의 지속적 발현 또는 삽입의 필요없이, HSC, ES 및 iPSC 의 효율적 개질을 허용한다.

그러한 치료 방법들은 트랜스진의 통합 및/또는 지속적 발현을 필요로 하지 않기 때문에, 현재 이용가능한 유전자 치료요법과 관련된 안전성 문제를 피하게 된다. 그러한 구현예의 특정 국면에서, 조성물 및 방법이 HbF 의 Bcl11a-중재되는 침묵화의 표적화된 교란을 위한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 채용한다.

HbF (HPFH)의 유전적 지속성에 원인을 제공하는 하나 이상의 HbF 침묵화 영역(들) 내에 유전자 개질의 재현을 허용하는 조성물 및 방법이 본원에 예시된다. 그러한 유전자 개질은 치료 유효 유전자의 증대된 발현을 유도하기 때문에, 치료 효능 달성을 위해서는 재현된 유전자 개질이 이형접합체로서만 존재할 필요가 있다.

본원에 개시된 지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈을 완화하기 위한 조성물 및 방법은 하나 이상의 증대된 HbF 및/또는 HbA₂ 및/또는 HbA 단백질 생산을 초래하는 하나 이상의 돌연변이의 도입에 의해 치료 효능을 달성하게 된다. β-글로빈 유전자 및/또는 영역들의 하나 이상의 자연-발생 결실(들)을 재현하여, γ-글로빈 유전자 발현을 활성화하고, 이로써 태아 헤모글로빈의 수준을 증가시키는 조성물 및 방법이 본원에 예시된다. HbF 및/또는 HbA₂ 단백질 생산에서의 중간 정도의 중가는 그러한 질환 표현형 완화에 충분하기 때문에, 이형접합성 돌연변이는 실질적 치료 유익을 달성하는데 충분하다.

특정 국면에서, 정정 템플레이트의 전달은 선별가능한 마커 유전자의 전달과 함께 실시될 수 있으며 이로써 그러한 접근법이 선별가능한 마커 유전자의 통합을 통해 장기간 발현을 필요로 하지만, 생체외 및 생체내 정정된 세포의 선별을 가능하게 해 준다. 참고문헌은, [Beard et al, J. Clin. Invest. 120: 2345-54 (2010) and Munoz et al, Nucleic Acids Res. 39(2):729-743 (2011)].

성인 조직에서의 β-글로빈 발현의 활성화는 그의 프로모터 내 CACCC 박스에서의 KLF-1 의 결합에 좌우된다. δ-글로빈 프로모터에는 온전한 CACCC 박스가 결여되어 있으며, KLF-1 는 결합되어 있지 않고, 발현은 β-글로빈의 2% 로 제한된다. 예를 들어 온전한 CACCC 박스 도입에 의해 β-글로빈 프로모터를 재현시키는 δ-프로모터의 돌연변이들은 KLF-1 결합을 허용하게 되며, 그 결과 δ-글로빈 발현에서 치료 효능 증가를 제공하게 된다.

그러한 구현예들의 특정 국면에서, 무-결실 HPFH γ-글로빈 프로모터 돌연변이가 생성될 수 있다. 효능 달성을 위해서는 오직 단일 염기쌍만이 개질되어야 한다. 예를 들어, -175 T→C 돌연변이 (SEQ ID NO: 21) 는 HbF 의 수준을 최대화하기 위해 재현될 수 있다. 임의의 네가지 γ-글로빈 유전자의 돌연변이는 유익을 제공할 것이며, 이에 따라 잠재적 표적들이 증가될 것이다.

귀소성 엔도뉴클레아제, Cas9 엔도뉴클레아제, TAL 효과기 뉴클레아제 및 TREX2 엑소뉴클레아제의 전달.

추가 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 본원에 기재된 하나 이상의 HE, Cas9, TALEN, 및/또는 TREX2 뉴클레아제의 전달을 위한 시스템, 특히 무-통합 벡터 시스템을 제공한다. 조혈모세포 (HSC) 의 치료용 유전자 편집에 대해 세가지 주된 도전과제가 있다: (1) 뉴클레아제 시약은 HSC 에 반드시 일시적으로 전달되어야 함; (2) 뉴클레아제를 수용하는 세포에서 유전자 편집 효율은 높아야만 함; 및 (3) 유전자-편집된 HSC 는 치료 유효성에 충분한 수준으로 접목되어야 함.

HSC 에 대한 효율적 유전자 전달을 위해 본원에서는 구균을 모사한 유형의 (cocal pseudotyped) 렌티바이러스 벡터 및 포오미 (foamy) 바이러스 벡터가 예시된다. 참고문헌은, [Trobridge et al, Mol Ther 18:725-33 (2008)]. 대안적으로, 아데노바이러스 벡터는 HSC 에 대한 유전자 전달에 이용하기 위해 선행기술에 기재된 바와 같이 개질될 수 있다. 참고문헌은, [Wang et al, Exp. Hematol. 36:823-31 (2008) and Wang et al, Nat. Med. 17:96-104 (2011)]. 그러한 구현예들의 여타 국면에서, AAV-기반의 벡터 시스템이 HE, Cas9 (및/또는 RNA 가이드 스트랜드), TALE-HE, TALEN 및/또는 TREX2 뉴클레아제의 전달을 위해 채용될 수 있다.

AAV6-혈청형 재조합체 AAV 벡터는 소형 재조합 템플레이트에 추가하여 프로모터-HE-엑소뉴클레아제 또는 프로모터-TAL-HE 융합-엑소뉴클레아제 카셋트를 전달하기에 충분한 4.5 kb 페이로드 (payload) 를 제공한다. 대안적으로, 그것은 소형 Cas9 폴리펩티드 및 가이드 RNA 를 보유할 수 있다. AAV6 는 모든 공지된 AAV 캡시드의 인간 CD34+ 배꼽 제대혈 세포의 충분한 형질도입을 제공하고, HSC 에서 충분한 수준의 일시적 유전자 발현을 중재할 수 있다. 자체-상보성의 단일 가닥진 AAV6 벡터는 세포주 및 초대 CD34+ 세포 및 세포주에서의 HSC 에서 유전자 넉아웃 및 재조합-기반의 유전자 편집의 두가지 모두에 채용될 수 있다.

하이브리드 캡시드가 있는 아데노바이러스 벡터는 CD34+ 세포를 포함한 수많은 유형의 조혈 세포를 충분히 형질도입할 수 있다. 개선된 형질도입은 조혈 세포의 충분한 형질도입을 위해 혈청형 35 섬유 (Ad5-F35) 및 혈청형 11 섬유 (Ad5-Fl 1) 를 이용해 키메라성 아데노바이러스 벡터를 이용해 달성될 수 있다. 헬퍼-의존형 아데노바이러스 벡터는 HSC 에서의 일시적 유전자 발현과 함께 30 kb 까지의 페이로드를 제공하며, 여러 HE/엑소뉴클레아제 카셋트, HE-TAL 융합체 뿐만 아니라 매우 큰 재조합 템플레이트를 전달하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 이는 소형 Cas9 폴리펩티드 및 가이드 RNA 를 보유할 수 있다. 따라서, 그러한 개질된 키메라성 아데노바이러스 벡터는 HSC 에서 유전자 넉아웃 및 재조합-기반의 유전자 편집의 두가지 모두에 채용될 수 있다.

통합-결핍성 렌티바이러스 및 포오미바이러스 벡터 (IDLV 및 IDFV) 는 6 kb (IDLV) 내지 9 kb (IDFV) 페이로드를 제공하며, 인간 HSC 을 형질도입하는 능력은 문헌들에서 많이 다루었다. 특정 국면에서, IDLV 및 IDFV 벡터의 두가지 모두는 HSC 에서 유전자 넉아웃 및 재조합-기반의 유전자 편집에 채용될 수 있다. 대안적인 프로모터 GFP 카셋트가 있는 IDLV 는 CD34+ HSC 에서 충분한 높은 수준의 발현을 제공한다. 높은 역가 스톡 (stocks) 은 TFF 정제 단계를 이용해 달성될 수 있다. 프로모터/GFP 카셋트의 셋트가 있는 벡터는 CD34+ HSC 에서 충분하고 높은 수준의 HE 발현을 제공하는데 이용될 수 있으며, 개별 HE, HE/Trex2, 다중복합-HE (즉, 공동발현되는 2, 3 또는 4 개의 HE), 및 다중복합-HE/TREX2 조합들을 발현하기 위해 생성될 수 있다. 다중복합 HE 발현은, 정확한 적용에 따라서는 증가된 HbF 억제를 제공하는 것이 바람직할 수 있는, 중요한 영역 내 여러 절단 이벤트를 허용한다. 그러한 다중복합 전략은 LHE 를 이용하여 실현가능한데, 이는 그들이 자체적으로 기능하며, 폐쇄적으로 표적화되는 이중 가닥 파괴의 매우 효율적이며 동시발생적인 프로세싱을 허용하는 TREX2 공동발현과 조합하여 만족스럽게 채용될 수 있다. 대안적으로, 이는 소형 Cas9 폴리펩티드 및 가이드 RNA 를 보유할 수 있다.

유전자 표적화의 효율, 개별 표적화된 세포에서의 글로빈 유전자 발현 수준 뿐만 아니라 그의 자손에서 세포의 모집단밀도, 적혈구생성 및 줄기 세포 기능을 표적으로 하는 유효성 및 혈액학적 파라미터 및 장기 기능이 모델 유기체에서 확인될 수 있다.

형질도입에는 RNA 및 단백질 수준에서의 β-형 유전자의 개질 효율 및 발현의 단일-세포 및 벌크 집단 평가가 후속될 수 있다. 인자 결합 및 염색질 구조에서의 변화가 평가될 수 있을 뿐만 아니라, 형태, 유효하지 않은 적혈구생성 정도 및 아폽토시스도 평가될 수 있다. 초기 스크리닝에서 좋은 결과를 제공하는 후보자들은 HSC 다능성 및 시험관내 및 생체내에서 질환 특이적 표현형을 경감시키는 능력에 대해 추가로 평가할 수 있다.

HE 후보물질들 및 전달 시스템의 초기 스크리닝은 표적화된 돌연변이 효율 및 글로빈 유전자 발현을 평가하려는 목적으로, 단일한 온전한 인간 11 번 염색체 (N-MEL) 및 임상 등급 CD34+ 정상 인간 HSC 를 포함하는 마우스 적혈구백혈병 세포주에서 실시될 수 있다. 두 세포 유형 모두 β-형 유전자의 발현이 β- 대 γ- 및 δ- 비율이 높게 유도되는 적혈구 형성 경로를 따라 분화하도록 유도될 수 있으며, 이는 단일 세포 및 집단 수준에서 글로빈 유전자 조절 효과의 정량적 평가가 가능하도록 한다. 두번째 수준 평가는 형질유도된 CD34+ 세포의 다능성 및 적혈구생성의 분석을 포함할 수 있다. 적합한 검정 시스템은 장기간 증식 잠재성을 평가하기 위한 배양, 클론 분석을 위한 골수 및 적혈구 콜로니들의 분석 및 NOD SCID 감마 (NSG) 마우스로의 이식에 후속하는 1 차 및 2 차 수용자의 다중계열 접종의 평가를 포함할 수 있다. 임상적 유효성은 시험관내에서 그리고 생체내에서 동시에 평가될 수 있다.

쥐과동물 Bcl11a 의 넉아웃은 인간 β-글로빈 좌를 포함하는 마우스에서 γ-글로빈에서의 엄청난 투여량-의존형 증가를 유도하고, 인간화된 마우스 모델에서 겸형 표현형을 완화한다. 두 시스템 모두 글로빈 유전자 발현 분석을 가능케 하는 한편, 겸형 마우스는 혈액학적 파라미터, 간 및 폐 병리, 신장 기능 및 비장 크기에 대해 특별히 주의를 기울인 그들 마우스에서 표현형의 개선 평가를 가능하게 한다. 표현형의 개선은 HbF 포함 세포의 수, HbF/HbS 비율 및 단일 세포 검정에서의 발현 패턴과 상관관계가 있을 수 있다.

추가로, 적혈구 수명 및 형태는 이상혈색소증 환자 유래의 인간 CD34+ HSC 를 형질도입하여 평가될 수 있다. 배양된 지중해빈혈 세포들은 최소한의 증량, 헤모글로빈 형성의 결여, 유효하지 않은 적혈구생성의 증거 및 정상에 비해 증가된 아폽토시스를 나타낸다. 그러한 특징은 발현 수준의 정량적 평가 및 적혈구생성 표적화 등급 평가를 가능케 해 준다. 저산소 조건 하의 CD34+ 세포들의 적혈구생성 후손들의 겸형 정도를 또한 평가할 수 있다. 부모 유래의 CD34+ 세포들은 NSG 마우스에 이식될 수 있으며, 이후 비정상적 적혈구형성의 몇가지 특징들이 재현되어, 표적화된 돌연변이생성의 유효성을 평가할 수 있게 한다.

자가유래 HSC, ES 및 iPSC-유도된 HSC 의 증식

추가 구면예에서, 본 발명의 개시내용은 스크리닝 및 임상 적용을 위한 정정된 세포의 효율적 접종 및 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 의 이용을 가능케 하는 개질된 조혈모세포 (HSC) 의 생체외 증량을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 그러한 구현예들의 특정 국면에서는 자가유래 HSC, 자가유래 유전자-개질된 HSC, ES 및 iPSC-유도된 HSC 의 효율적 증량을 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 정상 공여자로부터 수득된 동원된 말초혈 CD34+ 을 이용하는 조혈 생장 인자가 보충된 무혈청 배지에 Delta 1 을 이용하는 제대혈 증량 방법이 채용될 수 있다. 그러한 조성물 및 방법은 조혈 줄기 세포/간세포의 생존 및 증식을 강화하는 하나 이상의 추가적인 시약과 병용하여 사용될 수 있다. 여타 국면에서, 그러한 조성물 및 방법은 정정된 iPSC-유도된 HSC 를 포함하는 장기간 재생 세포의 강화된 증량을 위한 내피 세포 공동배양을 채용할 수 있다.

본 발명에서 개시된 유전자 정정 전략의 유효한 임상적 이행을 위해, 본 발명의 개시내용은 절대적인 갯수의 정정된 자가유래 HSC 의 생체외 증량을 위한 방법을 제공한다. 유전자 정정 과정은 일반적으로 더 작은 규모로 실시되는 경우 더욱 효율적이며, 정정을 위해 종종 오직 제한된 갯수의 HSC 가 이용가능하다. 이에 따라, 본 발명의 개시내용에서는 증량 방법이 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 로부터 유도되는 정정된 HSC, ES 및/또는 HSC 의 임상적으로 실현가능한 생체외 증량을 허용하도록 채용될 수 있음이 고려될 수 있다. 특정 국면에서, 본 발명의 개시내용은 줄기 세포 운명 결정에 있어서 Notch 신호전달의 역할을 이용함으로써 치료 적용을 위해 조혈 줄기 세포/간세포 증량 방법을 제공한다. 참고문헌은 [Dahlberg et al, Blood 117: 6083-90 (2010); Delaney et al, Nat Med 16:232-6 (2010); and Varnum-Finney etal, Nat Med 6: 1278-81 (2000)].

그러한 방법들은 제대혈 줄기세포/간세포의 임상적으로 관련있는 생체외 증식, 및 가장 먼저 부분적으로 HLA-적합성인 신선한 생산품 (수합된 배양 후 바로 주입) 의 이용에 의해 및/또는 규격화 비-HLA 적합성 세포 치료요법으로서 예비 증량되고 냉동보존된 생산품의 이용해 의해 제대혈 이식 중인 환자에서 골수억제의 치료를 위한 증량된 세포 치료요법을 허용한다.

유전자-정정된 자가유래 HSC 생체외 증량은 신속한 재생을 가능케할 더 많은 갯수의 적절히 정정된 재생 세포의 이식을 허용함으로써 HSC-기반의 유전자 치료요법의 안전성 및 유효성을 강화하며, 생체내 유전자-정정된 세포의 우세함을 보장하게 된다. 따라서, 본 발명의 개시내용은 제 3 의 집단인, 비 HLA-적합성의 공여자 생체외 증량 줄기세포/간세포를 통한 지원 케어를 위한 조성물 및 방법을 제공하며, 이는 골수제거성 T 세포 감손 자가유래 이식 후 관찰되는 감염에 후속하는 조기 이식 관련 사망을 줄이는데 핵심적인, 신속하지만 일시적인 골수 회복을 제공할 수 있게 된다. 참고문헌은 [Delaney et al, Nat Med 16: 232-6 (2010)].

분화를 저해하는 시약 (예를 들어, Notch 리간드) 는 조기 줄기세포/간세포의 분화 및 생존을 강화함으로써 개선된 Notch-중재된 생체외 증식을 달성하는 조성물 및 방법과 병용될 수 있다. 제대혈 줄기세포/간세포의 강화된 증식은 Notch 리간드, Delta1 를 아릴 탄화수소 수용체 저해제 (SRI) (Boitano et al, Science 329: 1345-8 (2011)) 또는 HoxB4 (Watts et al, Blood 116: 5859-66 (2010) and Zhang et al, PLo SMed 3:e173 (2006)) 와 병용하여 달성될 수 있어 조혈 전구체의 증식 및 자체갱신을 강화하게 되며, 안지오포이에틴형 1 와 병용하면 그들의 생존을 강화하게 된다. 유전자 치료요법의 임상적 적용에 중요한 것은 정정된 세포 그라프트의 장수를 보장하는 장기간 재생 세포의 증식하는 능력이다.

Akt-활성화된 내피 세포들이 유전자-정정된 세포의 증량을 확인하기 위해 공동배양에 채용될 수 있다. 참고문헌은, [Butler et al, Cell Stem Cell 6:251-64 (2011)]. 유전자-정정된 세포의 증량은 조혈 전구체에서의 Notch 신호전달의 내피 세포-유도성 활성화에 좌우된다. 임상적 적용을 위한 두번째로 중요한 국면은 그들의 정상적인 카운터파트와 비교해 생체내에서의 적절한 거동 및 발암 잠재성의 결핍을 보장해 줄 유도되는 세포의 유전자적 및 후생적 충실성이다. 중요한 점은, 증량된 제대혈 줄기세포/간세포의 게놈-수준범위의 평가에서 초대 단리된 CD34+ 세포와 비교해 전사물, 염색체 구조 및 DNA 메틸화물의 충실성이 나타났다는 점이다.

정상적인 CD34+ 세포에서의 증량 전략은 이상혈색소증이 있는 환자 유래의 CD34+ 세포를 이용하는 정의된 방법과 병용하여 채용될 수 있다. 제대혈 증량 방법은 정상적인 공여자로부터 수득된 동원된 말초혈 CD34+ 을 이용한 조혈 생장 인자를 보충한 무혈청 배지에서 Delta 1 을 이용할 수 있다. 확립된 시험관내 검정 (면역표현형, 생장 등) 및 생체내 재생 능력을 이용한 최적화된 생체된 증량 조건은 NSG 마우스 모델을 이용해 평가될 수 있다. 최적화된 조건은 조기 줄기세포/간세포의 증식 및 생존을 강화하는 SRI (아릴 탄화수소 수용체 저해제), Hox 단백질 또는 안지오포이에틴을 포함하는 조성물과 병용하여 이용될 수 있다. 유망한 조합들은 시험관 검정에서의 간세포에서 그리고 면역결핍 마우스 모델 (NSG 마우스) 에서 평가된 후, 정상적인 개인 유래의 CD34+ 의 증량으로부터 증량되어, 지중해성 빈혈 (및 여타 이상혈색소증) 이 있는 환자 유래의 CD34+ 세포의 증량을 위한 그러한 방법이 평가될 수 있다.

그들의 정상적인 카운터파트 HSC 를 지닌 증량된 세포와의 전사적, 유전자적 및 후생적 충실성은 생성된 세포의 발암 잠재성을 평가하는 게놈 범위의 접근법을 이용해 평가될 수 있다. (주입 후) 생체내 생장 후, 세포는 임의의 영향받은 클론(들)의 생체내 생장을 강화하여, 기능적으로 유의한 일탈이 있는지 여부를 결정하기 위해 이용될 수 있으며, 이로써 희귀 세포의 선별적 증량 및 검출을 가능케 한다.

이식 후 호중성 백혈구 감소증을 없에고, 유전자-정정된 자가유래 HSC 의 이 식 후 결과를 개선하기 위한 세포 치료요법

또다른 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 지원 케어를 제공하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는데, 그 조성물 및 방법은 이식 후 호중성 백혈구 감소증을 없에고, 유전자-정정된 자가유래 HSC 의 이식 후 결과를 개선하는 규격화 세포 치료요법을 포함한다. 생체외 증량된, 냉동보존된 제대혈 (CB) 줄기세포/간세포는 예를 들어 지원 케어의 수단으로서 자가유래 CD34+ 유전자 정정된 세포를 이용한 골수제거성 HCT 중인 지중해성 빈혈 및/또는 겸형 적혈구 빈혈이 있는 환자에게 투여될 수 있다.

신속한 중성구 회복을 제공할 수 있는 간세포의 경제적으로 실현가능한 "규격화" 공급원의 개발을 목표로 하는 연구에서, 예비증량된, 냉동보존된 조혈 줄기세포/간세포 생산품의 뱅크가 생성되었으며, 각각은 장래 임상적 사용을 위해 저장될 수 있는 단일 CB 유닛으로부터 유도되었다.

그러한 "규격화" 비-HLA 적합성 생산품을 성인에게 투여하는 안전성은 즉시 후속하는 재발/악화 AML 에 대한 첫번째 샐비지 크로마토그래피에서 뿐만 아니라 혈액학적 종양이 있는 소아 및 성인 환자에서의 골수제거성 CBT 설정에서 증명되었다.

T 세포를 제거한 그러한 증량된 세포 생산품이, 신속하지만 일시적인 골수 접종을 제공하고, 자가유래 유전자-정정된 줄기 세포를 이용한 골수제거성 HCT 중인 환자에서 자가유래 조혈 회복을 잠재적으로 촉진하기 위해 규격화 세포 치료요법으로서 주입될 수 있고, 그에 따라 감염 합병증 및 사망 위험을 줄일 수 있다는 가설을 세우게 되었다.

T 세포를 제거한 "규격화" 비-HLA 적합성 생산품의 안전한 주입을 위해 HLA-적합성이 필요한지 여부는 중요하다.

HLA 적합성에 맞지 않더라도, 신선한 CB 유닛이 증각적인 생체외 증량 및 장래의 사용을 위해 수집될 수 있으며, 사용이 필요한 장래를 위해 최종 생산품이 냉동보존될 수 있다. 환자의 HLA 유형, 민족/인종 또는 지역과 무관하게 모든 증량된 생산품 뱅크가 임의의 해당 환자에게 잠재적으로 이용가능하기 때문에, 규격화 증량된 CB 생산품에 대한 환자 접근성이 크게 강화된다.

나아가, 규격화 범용 공여자 증량 세포 치료요법을 만들어내는 능력은 중증 호중성 백혈구 감소증 후 HCT 의 기간을 줄이는데 유망할 뿐만 아니라, 예를 들어 화학요법으로 유도된 중증 호중성 백혈구 감소증, 임의의 후천적인 중증 호중성 백혈구 감소증 또는 사고로 인한 방사선 노출의 치료를 위한 일시적인 골수 접종을 제공하는 수단으로서 줄기 세포 이식 이외의 광범위한 연구조사 영역을 강화할 것이다.

생체외 증량은 지연되는 조혈의 회복에 의해 CBT 의 위험을 없에며, 전체적인 생존에서 유의한 개선이 결과로서 제공된다. 이중 CBT 중인 환자에서 재발 위험 감소가 관찰되었으며, 매우 부적합 그라프트임에도 만성 GVHD 는 더 낮았다. 조기 이식 관련 사망 위험은 조혈 회복을 강화하는 생체외 증량된 제대혈 간세포의 주입에 의해 감소될 수 있으며, 마찬가지로 통상적인 비인척 공여자를 이용해도 전반적인 생존이 월등하다.

추가 구현예에서, 본 발명의 개시내용은 이식 후 호중성 백혈구 감소증을 없에고, 유전자-정정된 자가유래 HSC 에 후속하는 결과를 개선하는 세포 치료요법을 제공한다. 자가유래 유전자 정정된 세포를 이용해 골수제거성 HCT 중인 지중해성 빈혈 환자는 주입된 그라프트 내 CD34+ 세포수 제한으로 인해 감염 및 사망 증가 위험에 처하게 된다 (그러한 유전자 정정된 세포의 임상적으로 실현가능한 갯수까지의 생체외 증량이 달성될 때까지). 규격화 지원 케어 척도로서 미리 증량되고 냉동보관된 제대혈 간세포 생산품의 주입이 채용되어, 장기간 그라프트가 조혈 회복을 제공할 때까지 조기에 그러나 일시적인 골수 회복을 제공함으로써 사망 위험을 줄이는데 채용될 수 있다.

골수제거성 HCT 중인 환자들은 컨디셔닝 요법 (conditioning regimen) 의 직접적인 결과로서 심각한 범혈구감소증을 겪는데, 모든 환자들은 그 기간 동안 감염 및 출혈의 위험 증가에 놓이게 된다. 조혈 (중성구 및 혈소판) 회복 기간은 CD34+ 세포 투여량에 의해 직접 영향받으며, 따라서, 줄기 세포 투여량이 통상적인 공여자 그라프트의 1/10 인 배꼽 제대혈을 이용하거나, 또는 자가유래 CD34 풍부화 세포 저투여량 그라프트를 이용하는 골수제거성 HCT 중인 환자들에 대해서는, 지연된 조혈의 회복으로 인한 이식 관련 사망의 위험이 훨씬 더 크다.

그러한 위험을 극복하고, 그러한 HCT 접근법의 안전성을 증대시키기 위해, 지속되는 범혈구감소증을 없에고, 더욱 신속한 조혈 회복을 촉진할 수 있는 신규한 치료요법이 필요하다. 상기 논의된 바와 같이, 골수 재생 제대혈 (CB) 조혈 줄기세포/간세포 (HSPC) 의 절대적인 갯수가 Notch 리간드 델타 1 와의 배양에 의해 증가될 수 있는 전략이 개발되었다. 그러한 부분적으로 HLA-적합성인 생체외 증량된 CB 세포의 제대혈 이식 (CBT) 중인 아동 또는 성인에 대한 주입은 안전한 것으로 증명되었으며, 26 내지 11 일 내에 초기의 절대적 중성구 계수가 500 에 도달하여, 증량된 세포에 의해 신속한 골수 접종이 제공되는 것으로 증명되었다.

신속한 중성구 회복을 제공할 수 있는 간세포의 경제적으로 실현가능한 "규격화" 공급원을 개발하고자 하는 목적의 더욱 최근의 연구에서는, 각각 장래 임상 용도를 위해 비축될 수 있는 단일 CB 유닛으로부터 유도되는, 예비증량된 냉동보존 조혈 줄기세포/간세포 생산품의 뱅크를 만들어낸 바 있다. 그러한 "규격화된" 비-HLA 적합 생성물을 성인에게 투여하는 안전성을 재발/면역 (relapsed/refractory) AML 에 대한 첫번째 샐비지 크로마토그래피 (salvage chemotherapy) 직후 뿐만 아니라 혈액학적 암이 있는 소아 및 성인 환자에서의 골수제거성 CBT 셋팅에서 증명했다. T 세포를 제거한 그렇게 증량된 세포 생산품이, 신속하지만 일시적인 골수 접종을 제공하며, 자가유래 유전자-정정된 줄기 세포 그라프트를 이용해 골수제거성 HCT 중의 환자에서 자가유래 조혈 회복을 잠재적으로 촉진하는 규격화 세포 치료요법으로서 주입될 수 있어, 그에 따라 감염 합병증 및 사망 위험을 줄일 수 있다는 가설을 세우게 되었다.

생체외 증량된 제대혈 줄기세포/간세포의 생성을 위해 정의된 최선의 방법을 이용하여, 규격화 증량된 세포 생산품의 뱅크가 자가유래 유전자-정정된 HCT 에서 지원 케어로서의 그러한 세포 주입의 안전성을 결정하기 위해 채용될 수 있다.

본 발명의 개시내용은 하기의 비제한성의 실시예를 통해 가장 잘 이해될 수 있을 것이다.

실시예

실시예 1

시험관내 구획화 (In vitro Compartmentalization (IVC)) 를 이용한, I- HjeMI, I-CpaMI 및 I-Onul 를 기반으로 한 귀소성 엔도뉴클레아제를 표적으로 하는 Bcl11a 유전자의 선별

대장균에서의 발현에 최적화된 코돈인 부모 LAGLIDADG 귀소성 엔도뉴클레아제 (LHE) 의 오픈 리딩 프레임 (ORF), I-HjeMI (도 14; SEQ ID NO: 28; Jacoby et al, Nucl. Acids Res. 40(11):4954-4964 (2012); Taylor et al, Nucl. Acids Res. 40 (웹 서버 발행): W1110-6 (2012)) 를 pET21-a(+) (도 11; EMD Millipore (Novagen) Merck KGaA 사의 계열사) 의 Ncol 및 Notl 제한효소 부위에 클로닝했다. I-HjeMI 의 ORF 에 부위-지정 포화 돌연변이유발을 도입하기 위해, 양측 측면 절편과 중복되는 영역의 약 20 염기쌍에 그의 일부 ORF 를 포함하는 DNA 단편을 축퇴성 코돈 5'-NNK-3' (20 개의 아미노산을 전부 코딩) 을 포함하는 프라이머를 이용해 PCR-증폭했다. 그러한 PCR 프라이머를 이용해 돌연변이화된 아미노산 잔기들을 표 2 에 제시한다. PCR 산물들은 아가로스 겔로부터 추출해 정제하고, 선별할 변이체 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위들을 2 카피 포함하는 서열을 이용한 PCR 의 후속 가동에서 조립되었다. 성공적으로 조립된 DNA 단편들은 다시 겔 추출에 의해 정제하고, 시험관내 구획화 (IVC) 에서 라이브러리로 이용했다.

변경된 특이성을 가진 변이체 뉴클레아제 유전자를 풍부화하기 위해 부위-자정 포화 돌연변이유발의 각 가동 후 IVC 를 3 회씩 실시했다. 오일-계면활성제 혼합물 (2% ABIL EM 90 (Evonik Industries AG Personal Care, Essen, North Rhine- Westphalia, 독일), 라이트 미네랄 오일 중 0.05% Triton X-100) 를 포화 완충액 (100 mM 칼륨 글루타메이트 (pH 7.5), 10 mM 마그네슘 아세테이트 (pH 7.5), 1 mM 디티오트레이톨 및 5 mg/ml 소 혈청 알부민) 과 함께 완전히 혼합시키고, 37℃ 에서 20 분간 인큐베이션하고, 4℃ 에서 6,000 x g 로 15 분간 원심분리했다. 상부의 상 500 마이크로리터를 이용해 얼음에서의 3.5 분 동안의 1,400 r.p.m. 에서의 일정한 교반에 의해 30 ㎕ 의 시험관내 단백질 합성 혼합물 (25 ㎕ 의 PURExpress (New England Biolabs, Ipswich, MA), 20 유닛의 RNase 저해제, 1 mg/ml 소 혈청 알부민 및 8 ng 의 DNA 라이브러리를 에멀전화했다. 에멀전을 30℃ 에서 4 시간 동안 인큐베이션한 후, 75℃ 에서 15 분간 가열했다. 에멀전화된 액적을 4℃ 에서 16,000 x g 로 15 분간 원심분리하여 수집하고, 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올의 첨가로 파괴했다. 핵산을 에탄올 석출로 회수하고, RNase 칵테일 (Life Technologies Corporation (Invitrogen), Grand Island, New York) 로 처리했다. QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen, Hilden, Germany) 를 이용한 정제 후, DNA 라이브러리를 에멀전화된 액적 중에 발현된 엔도뉴클레아제 변이체에 의한 표적 부위의 화합적 (cohesive) 말단에 상보적인 4-염기 3' 오버행 서열을 이용해 DNA 어댑터에 라이게이션시키고, 절단되는 표적 부위에 연결되는 변이체 엔도뉴클레아제의 유전자를 풍부화하고자 라이게이션되는 DNA 어댑터에 특이적인 것을 포함하는 한 쌍의 프라이머를 포함하는 PCR 혼합물에 첨가했다. PCR 앰플리콘을 겔-정제하고, 변이체 유전자들의 ORF 는 추가로 PCR-증폭하여, IVC 의 후속 가동에 사용할 DNA 라이브러리를 제작했다.

IVC 의 두번째 가동에서, 1 ng 의 재건 라이브러리가 있는 에멀전을 만들고, 42℃ 에서 75 분간 인큐베이션 후, 75℃ 에서 가열함으로써 시험관내 전사/번역 반응을 켄칭했다. DNA 라이브러리를 회수하고, 활성 엔도뉴클레아제 유전자들을 PCR 로 특이적으로 풍부화한 후, 상기 기재된 바와 같이 DNA 어댑터를 이용해 라이게이션했다.

IVC 의 세번째 가동에서, 0.5 ng 의 라이브러리 단편을 포함하고 있는 시험관내 단백질 합성 혼합물을 4.5% Span 80/0.5 %Triton X-100/라이트 미네랄 오일 중에 에멀전화했다. 반응은 42℃ 에서 45 분간 진행시키고, 75℃ 에서 가열-불활성화했다. 에멀전으로부터 추출 후, 절단된 표적 부위-회합된 엔도뉴클레아제 유전자들을 PCR-증폭시키고, 후속 부위-지정 돌연변이유발 가동에 적용시켰다.

BCL11A 유전자 표적의 (-) 및 (+) 절반 부위 (half site) 를 인식하는 I-HjeMI 변이체를 다시 고안하기 위해, 각각 부위-지정 포화 돌연변이유발의 4 및 2 회 가동을 실시했다 (도 13). 전자인 절반-부위를 표적으로 하는 변이체 뉴클레아제의 집단 (pool) 을 단백질-DNA 접면에 반대편인 표면 상에서의 돌연변이 유발의 추가적인 (다섯번째) 가동에 적용한 후, IVC 의 3 회 가동에 적용했다 (표 2).

표 2

*밑줄친 뉴클레오티드들은 부모 LHE I-HjeMI 에 대한 표적 부위에 있는 것과 상이함

BCL11A 유전자 표적의 (-) 및 (+) 절반 부위들에 원인을 제공하는 I-HjeMI 변이체 엔도뉴클레아제의 N-말단 및 C-말단 하프-도메인을 인코딩하는 DNA 단편들을 조립하고, 전장 BCL11A 유전자 표적 부위를 절단하는 뉴클레아제의 집단을 IVC 의 3 회 가동을 통해 선별했다 (도 13).

표 3 은 예시 BCL11a 표적 서열들을 제시하는데, 여기서 고도로 활성인 엔도뉴클레아제 변이체의 집단 (귀소성 엔도뉴클레아제 I-CpaMI 및 I-Onul 를 기준으로함) 을 분리하고, 그의 서열을 결정했다.

표 3

실시예 2

박테리아에서 2-플라스미드 유전자 제거 절단 검정을 이용한 BCL11A 유전자- 표적화 I-HjeMI 변이체 활성의 최적화

IVC 디스플레이 선별 (상기 실시예 1 에 개시됨) 을 이용한 선별에서 수득된 I-HjeMI 변이체의 활성은 문헌 [Doyon et al, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477-2484 (2006)] 의 방법에 따라 박테리아 세포에서 2-플라스미드 선별 시스템을 이용해 최적화했다. 엔도뉴클레아제 유전자들의 ORF 는 pENDO 발현 플라스미드의 NcoI 및 NotI 부위 사이에 삽입했다 (도 12, Doyon et al., J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477-2484 (2006)). 4 카피의 BCL11A 유전자 표적을 포함하고 있는 pCcdB 리포터 플라스미드 (도 31, Doyon et al, J. Am. Chem. Soc. 128(7):2477-2484 (2006); Takeuchi et al, Nucl. Acids Res. 37(3):877-890 (2009); 및 Takeuchi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 10.1073/pnas.1107719108 (2011)) 를 보유하고 있는 NovaXGF (EMD Millipore (Novagen)) 컴피턴트 세포를 I-HjeMI 변이체를 인코딩하는 pEndo 플라스미드의 집단을 이용해 형질전환했다. 형질전환체를 2 x YT 배지 (16 g/L 트립톤, 10 g/L 효모 추출물 및 5 g/L NaCl) 에서 37℃ 로 30 분간 배양한 후, 100 ㎍/mL 카르베니실린 및 0.02 % L-아라비노오스 (I-HjeMI 변이체의 발현을 예비유도하기 위함) 을 보충한 2 x YT 배지를 이용해 10-배 희석했다. 배양물을 30℃ 에서 15 시간 동안 배양한 후, 세포를 수합하고, 멸균수에 재현탁시키고, 비선별성 (1 x M9 염, 1 % 글리세롤, 0.8 % 트립톤, 1 mM MgS0₄, 1 mM CaCl₂, 2 ㎍/mL 티아민 및 100 ㎍/mL 카르베니실린) 및 선별성 플레이트 (즉, 독성 CcdB 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.02% L-아라비노오스 및 0.4 mM IPTG 을 보충한 비선별성 플레이트) 에 스프레드했다. 30℃ 에서 30 내지 40 시간 동안 인큐베이션 후, pEndo 플라스미드를 선별성 플레이트 상의 생존 콜로니로부터 추출했다.

활성 I-HjeMI 변이체를 코딩하는 ORF 는 Gene Morph II Random Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 를 이용하는 오류발생이 쉬운 (error-prone) PCR 을 통해 증폭했다. NcoI, NotI 및 DpnI 을 이용한 소화 후, 결과물로 수득한 단편을 다시 pEndo 벡터에 클로닝했다. 플라스미드를 변이체 엔도뉴클레아제가 30℃ 에서 4 시간 동안 발현되는 조건 하의 2 회 선별에 적용한 후 플레이팅했다. 선별된 유전자들의 N-말단 절반 및 C-말단 절반 도메인을 오버랩핑 PCR 을 이용해 셔플링하고, 다시 pEndo 벡터에 클로닝했다. pEndo 플라스미드 및 pCcdB 리포터의 두가지 모두를 보유하고 있는 형질전환된 세포들을 0.02 % L-아라비노오스를 포함하고 있는 2 x YT 배지에서 37℃ 로 1 시간 동안 배양한 후, 선별성 플레이트 상에 37℃ 에서 16 내지 20 시간 동안 스프레딩했다. 동일한 수준의 엄격성에서의 2 회 선별 후, pEndo 플라스미드를 선별성 플레이트 상의 생존 콜로니들로부터 추출하고, 플라스미드가 보유한 변이체 유전자들의 ORF 를 서열분석했다.

실시예 3

2-플라스미드 절단 검정에서 시험한 BCLUA 유전자-표적화 엔도뉴클레아제의 활성

예시 BCL11A 유전자-표적화 엔도뉴클레아제 (BCL11ahje; 도 17, SEQ ID NO: 31) 의 활성, 그의 촉매적으로 불활성인 변이체 (BCL11ahje D18N), 및 그의 부모 LHE I-HjeMI (도 14, SEQ ID NO: 28) 의 활성을, I-HjeMI 에 대한 표적 부위 (I-HjeMI 표적) 또는 BCL11A 유전자 표적 (TCCAAGTGATGTCTCGGTGGTG (SEQ ID NO: 39; 밑줄친 뉴클레오티가 부모 LHE I-HjeMI 에 대한 표적 부위에서의 것과 상이함) 의 4 카피를 포함하고 있는 pCcdB 리포터 플라스미드 (Doyon et al, J. Am. Chem. Soc. 128￡7):2477-2484 (2006)) 를 보유하는 박테리아 세포에서 측정했다. pCcdB 리포터 플라스미드는 "세포 사멸의 제어 B (control of cell death B)" ("ccdB", 박테리아에서의 독소 단백질로, IPTG 의 첨가로 유도가능함) 을 인코딩한다. 리포터 플라스미드에서 표적 부위의 절단은 IPTG 를 함유하는 선별성 배지 상의 리포터 플라스미드의 RecBCD-중재성 분해 및 대응하는 세포 생존을 유도한다. 생존율은 선별성 플레이트 상의 콜로니의 갯수를 비선별성 플레이트 상의 콜로니 갯수로 나누어 결정된다. 오차 바아는 3 회의 독립적인 실험의 ± S.D.를 나타낸다.

실시예 4

내생성 인간 BCL11A 유전자에서의 표적화된 돌연변이유발의 검출

HEK 293T 세포 (1.6 x 10⁵) 를 12-웰 플레이트에서 형질주입하기 24 시간 전에 시딩하고, 0.5 ㎍ 의 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제 및 TREX2 을 위한 각 발현 플라스미드를 이용해 형질주입했다. 형질주입 48 시간 후, 형질주입된 세포를 세포용해시키고, 게놈 DNA 를 Quick-gDNA MiniPrep 키트 (Zymo Research) 를 이용해 추출했다. 약 500-bp 단편에 걸쳐있는 BCL11A 유전자 표적을 50 ng 의 추출된 게놈으로부터 하기의 프라이머쌍을 이용해 PCR-증폭했다: BCL11A_up1, 5'- GCT GGA ATG GTT GCA GTA AC -3' (SEQ ID NO: 66); BCL11A_down1, 5'- CAA ACA GCC ATT CAC CAG TG -3' (SEQ ID NO: 67). PCR 앰플리콘을, 1 x NEB 완충액 4 에, 0.5 μM 의 재조합 단백질을 과발현하는 대장균으로부터 정제된 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제 존재 또는 부재 하의 1 x BSA (New England Biolabs) 를 보충한 것을 더한 것에서 37℃ 에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 5 x Stop 용액 (50 mM Tris-HCl (pH7.5), 5 mM EDTA, 0.5 % SDS, 25 % 글리세롤, 0.1 orange G 및 0.5 mg/mL 프로테이나아제 K) 을 첨가하여 반응을 종료했다. 실온에서 15 분간 인큐베이션 후, 각 시료의 절반을 TAE 중에 에티듐 브로마이드를 함유하는 1.6 % 아가로스 겔 상에서 분리했다 (상단 패널). 각 시료의 나머지 절반을 DNA Clean & Concentrator-5 키트 (Zymo Research) 를 이용해 정제하여, 하기 프라이머쌍을 이용한 PCR 의 두번째 가동에서 템플레이트로 이용했다: BCL11A_up2, 5'- CTG CCA GCT CTC TAA GTC TCC -3' (SEQ ID NO: 68); BCL11A_down2, 5'- TGC AAC ACG CAC AGA ACA CTC -3' (SEQ ID NO: 69). PCR 산물을 다시 상기 기재된 조건 하에 BCL11A 유전자 표적화 뉴클레아제를 이용해 소화시키고, 1.6 % 아가로스 겔 상에서 분석했다 (하단 패널) (도 30 참조).

실시예 5

시험관내 구획화를 이용한 I-Onul 를 근거로 한 태아 헤모글로빈 침묵화 영 역 표적화 엔도뉴클레아제의 선별

French HPFH 결실에서 교란되어 있는 성인 적혈구생성 세포 내 HbF 침묵화 영역 내에 Bcl11a 점유의 영역을 포함하는 350 bp 영역 (SEQ ID NO: 2) 을 통틀어 고르게 분포하고 있는 예시 귀소성 엔도뉴클레아제 (HE) 표적 서열들을 표 4 에 제시한다. 그러한 표적 서열들은 매우 활성인 엔도뉴클레아제 변이체들의 집단이 분리 및 서열분석된 DNA 서열 모듈을 포함하고 있다.

표 4

표 5 는 Aγ- 및 Gy-글로빈 유전자에 대해 모두 동일하며, 수많은 무-결실 HPFH 돌연변이들을 포함하고 있는 글로빈 유전자의 -100 bp 내지 210 bp 업스트림의 영역을 제시한다. 그러한 돌연변이들을 제공하게 되는 유전자 편집은 억제 감소 및 그에 따른 감마 유전자의 활성화를 유도하여, HbF 증대를 초래한다.

표 5

표 6 은 인간 태아 글로빈 침묵화 영역에 대해 표적으로 하는 귀소성 엔도뉴클레아제를 만들기 위한 IVC 에서의 포화 돌연변이생성 (상기 실시예 1 에 기재됨) 에 적용된 부모 LHE I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제 (도 22A, SEQ ID NO: 34) 내 아미노산 위치를 제시한다.

표 6

인간 태아 글로빈 침묵화 영역에 대해 표적으로 되는 귀소성 엔도뉴클레아제 를 만들기 위한 IVC 에서의 포화 돌연변이생성에 적용된 아미노산 위치들

* 밑줄친 뉴클레오티드는 부모 LHE I-Onul 에 대한 표적 부위의 것과 상이함.

도 23 은 인간 태아 글로빈 침묵화 영역 유래의 "절반 표적" 을 이용한 절단 검정의 결과를 제시한다. 증폭된 밴드는 절단된 절반-부위 (상보적인 이중 올리고뉴클레오티드 및 상응하는 오버행 중인 ssDNA 를 이용한 라이게이션에 의해 포획) 및 절단된 DNA 산물의 생성에 원인을 제공하는 효소 변이체들의 서열을 모두 포함한다. '절반-부위' 엔도뉴클레아제 라이브러리의 풍부화 완료시 최종 단계는 gGlobin 침묵화 영역 표적의 좌측 (L) 및 우측 (R) 절반 부위를 담당하고 있는 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제의 N-말단 및 C-말단 절반 도메인을 인코딩하는 DNA 단편의 조립을 포함한다. 활성 I-Onul 엔도뉴클레아제는 전장 인간 태아 글로빈 침묵화 영역 표적을 절단하는 집단으로부터 선택된다.

실시예 6

유전자-표적화된 엔도뉴클레아제의 특이성 및 활성을 증가시키는 TAL 앵커의 N-말단 융합이 있는 MegaTAL 귀소성 엔도뉴클레아제

TAL 앵커의 N-말단 융합은 하나 이상의 귀소성 엔도뉴클레아제, 예컨대 하나 이상의 I-HjeMI, I-CpaMI 및 I-Onul 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전자-표적화 엔도뉴클레아제의 특이성 및 활성을 증가시키기 위해 채용될 수 있다. MegaTAL 는 문헌 [Cermak et al, Nucl. Acids Res. 39:e82-e82 (2011)] 에 기재된 Golden Gaate 어셈블리 전략을 이용해, RVD 플라스미드 라이브러리 및 목적 벡터 (MegaTAL:5.5 RVD + Y21-AniI 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대해서는, 도 24, SEQ ID NO: 35 및 도 25, SEQ ID NO: 36 참조) 를 이용하여 구축되었다.

플라스미드는 1.5 내지 10.5 개의 TAL 반복체 및 그의 해당하는 RVD ('반복체 가변 이중잔기들 (Repeat Variable Diresidues)', 이는 표적 부위의 5' 영역에서 연속적인 DNA 염기와 접하여, 그 영역 내 인식 DNA 서열을 정하게 됨) 를 포함하고 있는 TAL 효과기의 조립이 가능하도록 개질했다. pthXOl 목적 벡터는 NLS 의 다운스트림에 바로 헤마글루티닌 (HA) 태그를 포함하여, 최종 '절반 TAL 반복부 (half TAL repeat)' 서열 상에서 (야생형 PthXol TAL 효과기에 대하여) 잔기 154 에서 시작하여 잔기 63 에서 종료되는 TALEN 스캐폴드를 제공하도록 개질했다.

TAL 효과기는 하기의 RVD 를 이용하여 각각의 특이적 뉴클레오티드를 표적으로 하게 구축되었다: A - NI, C - HD, G - NN 및 T - NG. TAL 효과기 반복부를 목적 벡터에 클로닝한 후, 개별 단백질 링커 ('Zn4'; VGGS) 및 조작된 귀소성 엔도뉴클레아제 변이체들을, FokI 뉴클레아제 촉매 도메인 대신에, 조작된 Xba-I 및 Sal-I 제한효소 부위 사이에 클로닝했다.

이는 '모델 테스트 사례 (model test case)' MegaTAL 이다 (단일 단백질 사슬의 N-말단 말단부의 TAL 효과기의, 유연성 링커 (flexible linker) 를 통해 야생형 Y2 I-Anil 귀소성 엔도뉴클레아제에 융합되어 있는 융합체, 본래 문헌 [Takeuchi et al., Nucl. Acids Res. 37(3): 877-890 (2009)] 에 기재되어 있음).

실시예 7

Bcl11a -조절되는 태아 헤모글로빈 (HbF) 침묵화 영역 교란을 위한 Cas9-기반 의 엔도뉴클레아제 시스템

최근에 메커니즘을 이해하게 된, 적응 면역계에 대한 박테리아 사용이 포유류 세포의 게놈 편집을 가능케 하는 강력한 도구의 개발을 유도하는 클러스터를 형성하는, 규칙적으로 간격을 둔 짧은 회귀성 반복부 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)) 시스템이 있는데, 이는 다음과 같은 목적으로 본원에 개시된 이상혈색소증 치료용 조성물 및 방법에 채용될 수 있다: (a) Bcl11a 코딩 영역의 교란; (b) HbF 침묵화 DNA 조절 엘리먼트 또는 경로, 예컨대 Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역의 교란; (c) 하나 이상의 γ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화에 의한 γ-글로빈 유전자의 발현 증대 달성; (d) 하나 이상의 δ-글로빈 유전자 프로모터(들)의 돌연변이화에 의한 δ-글로빈 유전자의 발현 증대; 및/또는 (e) 하나 이상의 β-글로빈 유전자 돌연변이(들)의 정정. 박테리아의 CRISPR 시스템은 문헌 [Jinek et al, Science 337: 816-821 (2013); Cong et al, Science (Jan. 3, 2013) (인쇄판에 앞서 전자출판됨); 및 Mali et al., Science (Jan. 3, 2013) (인쇄판에 앞서 전자출판됨)] 에 기재되어 있다.

Cas9 단백질은 RNA 가이드 서열에 의해 결정되는 위치의 특정 부위에 이중 가닥 파괴를 생성한다. 모든 가이드 RNA 는 Cas9 에 결합하는 동일한 스캐폴드 서열 뿐만 아니라 구조 G-N₂₀-GG 를 가진, Cas9-RNA 복합체 절단 특이성을 제공하는 가변 표적화 서열을 포함한다. Cas9 단백질 및 가이드 RNA 의 공동발현은 인간 게놈 내에서 효율적 절단 및 서열-특이적 위치에서의 교란을 제공하게 되는데, 여기서 서열-특이적 절단은 가이드 RNA 서열에 의해 정해지게 된다. Cas9 및 여러 표적들에 특이적인 가이드 RNA 의 공동발현은 표적 부위들 사이에 개입하는 영역의 효율적 결실을 유도한다.

따라서, 본 발명의 특정 국면에서, 다음과 같은 목적으로 Cas9-중재되는 게놈 편집이 채용된다: (1) HbF 침묵화 영역 내 Bcl11a 결합 부위의 교란, (2) Bcl11a 유전자 기능의 교란, 및 (3) 전체 HbF 침묵화 영역의 결실. 표적 영역을 밝혀내고, 가이드 RNA 를 고안하여, 최적의 가이드 RNA 표적 서열의 고안을 바탕으로 생성했다. 본원에 예시되는 것은 HbF 침묵화 영역 내 Bcl11a 결합 영역 및 단일 GATA-1 결합 모티프를 표적으로 하는 가이드 RNA 이다. 그러한 가이드 RNA 는 단독으로 또는 조합하여 사용되어 HbF 침묵화 영역의 표적화된 교란을 달성하게 된다. 점유의 Bcl11a 정점에 대응하는 HbF 침묵화 영역 내 추가적인 영역에 대한 가이드 RNA 가 있는 Cas9 가 또한 단독으로 그리고 조합하여 사용된다. Bcl11a 결합 부위 및 GATA-1 모티프 측면의 여러 가이드 RNA 쌍 뿐만 아니라 전체 풋프린트 (footprint) 가 또한 HbF 침묵화 영역 내 결실 생성을 위해 Cas9 와 공동발현될 수 있다.

문헌 [Mali et al, Science (Jan. 3, 2013)] 에서의 인간 코돈 최적화된 Cas9 의 서열을 도 26, SEQ ID NO: 37 에 제시한다. 가이드 RNA 의 포괄적 서열 (Mali et al) 을 도 27, SEQ ID NO: 38 에 제시하며, 그의 중요 서열은 표 7 에 제시한다. 인간 태아 헤모글로빈 (HbF) 침묵화 영역에 표적-특이적 결합하고 절단하는 예시 Cas9 가이드 RNA 서열 (도 6, SEQ ID NO: 1 및 도 7, SEQ ID NO: 2) 을 표 8 에 제시한다.

표 7

포괄적 Cas9 가이드 RNA 의 서열 엘리먼트

표 8

예시 Cas9 가이드 RNA 에 대한 표적-특이적 서열

실시예 8

엔도뉴클레아제 발현을 위한 벡터 시스템

NSG 에 대해, 겸형 세포 및 지중해성 빈혈 마우스 모델, 인간 CD34 세포 또는 마우스 골수 유핵 세포를 이식 전 세포의 유세포분석-기반 풍부화를 허용하는 형광 마커를 이용해 형질도입했다.

적합한 형질도입 방법은 하기를 포함한다:

AAV6 벡터. AAV6-혈청형 재조합체 AAV 벡터는 소형 재조합 템플레이트에 추가하여 프로모터-HE-엑소뉴클레아제 또는 프로모터-TAL-HE 융합-엑소뉴클레아제 카셋트를 전달하기에 충분한 4.5 페이로드 (payload) 를 제공한다.

대안적으로, 이들은 Cas9 및 가이드 RNA 를 보유할 수 있다. 추가로, 모든 공지된 AAV 캡시드 (capsid) 의 인간 CD34+ 배꼽 제대혈 세포의 가장 효율적인 형질도입을 제공하며, HSC 에서 상당한 수준의 일시적 유전자 발현을 중재할 수 있다는 것을 보여주는 예비 데이터를 수득했다.

개질된 아데노바이러스 벡터. 하이브리드 캡시드 (hybrid capsid) 가 있는 아데노바이러스 벡터는 CD34+ 세포를 포함하는 수많은 유형의 조혈 세포를 효율적으로 형질도입할 수 있다. 혈청형 35 섬유 (Ad5-F35) 를 이용하여 개선된 키메라성 벡터를 이용한 형질도입은 Rawlings (SCH) 이 증명한 바 있고, 더욱 최근의 데이터는 혈청형 11 섬유 (Ad5-Fl 1) 가 조혈 세포에서 더욱더 효율적일 수 있다는 점을 제안했다. 헬퍼-의존형 (Helper-dependent) 아데노바이러스 벡터는 HSC 에서의 일시적 유전자 발현과 함께 30 kb 까지의 페이로드를 제공하며, 다중 HE/엑소뉴클레아제 카셋트, HE-TAL 융합 뿐만 아니라 매우 큰 재조합 템플레이트 또는 Cas9 발현 카셋트 및 여러 가이드 RNA 를 전달하기 위해 이용될 수 있다.

통합-결핍성 렌티바이러스 및 포아미바이러스 벡터 (IDLV 및 IDFV). 이들 벡터들은 6 kb (IDLV) 내지 9kb (IDFV) 페이로드를 제공하며, 인간 HSC 를 형질도입하는 능력에 대한 문헌이 매우 많다. IDLV 및 IDFV 벡터는 모두 HSC 에서의 재조합-기반의 유전자 편집 및 유전자 넉아웃에 이용될 수 있다. Rawlings (SCH) 및 Kiem (FHCRC) 는 대안적인 프로모터 GFP 카셋트를 이용해 일련의 IDLV 를 제작 및 평가한 바 있으며, CD34+ HSC 에서 효율적이고 높은 수준의 발현을 제공하는 구축물을 결정한 바 있다.

플라스미드 및 mRNA 의 직접적인 뉴클레오펙션. N-MEL 및 CD34 세포의 효율적인 형질도입을 위한 조건은 Amaxa 뉴클레오펙션 시스템을 이용해 정했다. 장점에는, 통합의 결여, 및 다중 발현 플라스미드를 형질도입하거나 또는 RNA 종류들을 동시에 형질도입하는 능력이 포함된다.

동시에, 분류 및 미분류 세포를 구분되는 마우스에 이식했다. 후자의 이식물은 적은 수의 개질된 세포를 포함할 수 있는 반면, 이식후 키메라 (이식 후 chimeras) 의 인간 연구는 그러한 세포들이 선별적인 생존 장점을 갖게 되며, 주변 (periphery) 에서도 풍부화된다는 것을 시사한다. 무관하게, 단일 망상적혈구 RNA 및 F-Cell 분석은 심지어 적게 존재할지라도 세포에서의 유전자 교란의 평가를 가능케 한다.

제 2 의 수준 평가에서는 형질도입된 CD34+ 세포의 다능성 및 적혈구형성을 주시했다. 평가는 장기간의 증식 잠재성을 평가하기 위한 배양, 클론 분석을 위한 골수 및 적혈구형성 콜로니의 분석 및 NOD 중증복합 면역결핍 감마 마우스 (NOD scid gamma (NSG) mice) 로의 이식 후 1 차 및 2 차 수용자의 다중-계열 접종의 평가를 포함할 수 있을 것이다.

전형적으로는, 줄기 세포가 전신 조사 (NSG 마우스에 대해서는 275 rads 또는 C57 마우스에 대해서는 1000 rads) 후 꼬리 정맥 주입을 통해 주입된다. 효율적이기도 하지만, 줄기 세포를 마우스 대퇴골로 직접 주입한 대부분의 연구에서 50 배 더 적은 세포가 필요했기 때문에, 갯수가 잠재적으로 제한되어 있는 유세포 분석 분류 및/또는 개질 세포를 이용한 연구에서 이상적이다. 마취 및 국소적인 통각상실을 제공하고, 해부학적 불변계측점을 정한 후, 오십만 내지 백만개의 세포를 직접 대퇴골 골수 공간에 주입했다.

실시예 9

효율적인 유전자 표적화를 위한 귀소성 및 Cas9 엔도뉴클레아제의 특징분석

임상적 영향력에 대해, 효율적 유전자 표적화는 개별 표적화된 세포 및 세포 집단에서의 글로빈 유전자 발현 수준, 적혈구형성 및 줄기 세포 기능에 대한 표적화의 유효성 및 혈액학적 파라미터에 대한 영향 및 모델 유기체에서의 장기 기능을을 평가하여 증명했다.

형질도입에 이어, RNA 및 단백질 수준에서 모든 β-형 유전자의 발현 및 유전자 표적화 효율의 단일 세포 및 벌크 집단 평가를 후속했다. 세포 형태 및 유효하지 않은 적혈구형성 및 아폽토시스의 정도와 같은, 인자 결합 및 염색체 구조에서의 변화를 평가했다. 최초의 스크리닝에서 좋은 기록을 남긴 후보자 엔도뉴클레아제들은 HSC 다능성 및 시험관내 및 생체내에서의 질환 특이적 표현형을 경감시키는 능력에 대해 추가로 평가했다.

표적화된 돌연변이 효율 및 글로빈 유전자 발현을 평가하려는 목적으로, 엔도뉴클레아제 후보물질 및 전달 시스템의 최초 스크리닝을 단일한 온전한 인간 11 번 염색체를 포함하는 마우스 적혈구백혈병 세포주 (N-MEL) 및 임상 등급의 CD34+ 정상 인간 HSC 에서 실시했다. 두 세포 유형 모두, 낮은 γ-글로빈 /γ- + β글로빈 RNA 비율을 가진 β-형 유전자의 발현이 많이 유도되는 적혈구형성 경로를 따라 분화하도록 유도될 수 있다. HbF 특이적 항체를 이용하여, "F-세포" 의 백분율이 정량될 수 있다. 그러한 낮은 비율은, 그 시스템이 단일 세포 및 집단 수준에서 γ-글로빈 mRNA 뿐만 아니라 HbF 발현에서의 작은 증가라도 검출 및 정량함에 있어서 민감하기 때문에 이상적이다.

N-MEL 세포는 β-글로빈 좌를 포함하는 단일한 온전한 인간 11 번 염색체를 포함하는 쥐과동물 적백혈병 세포의 유도체이다. 그러한 혈구형성 세포주는 보통 낮은 수준의 마우스 및 인간 β-형 글로빈 유전자를 발현하나, 글로빈 발현이 크게 증가되는 시기에 분화하도록 유도될 수 있다.

N-MEL 세포들은 Amaxa 뉴클레오펙틴 시스템 (nucleofection system) 을 이용해 효율적으로 형질도입되었다. 2 ㎍ 의 플라스미드 DNA, Kit "L" 및 프로그램 A20 를 이용하여 세포의 25% 를 형질도입했다. Bcl11a 유전자를 교란하도록 고안된 귀소성 엔도뉴클레아제를 포함하는 RSCS-MCS-PG-WZ 기반의 렌티바이러스 벡터를 이용한 감염다중도 (multiplicity of infection (MOI)) 20 의 감염은 N-MEL 세포의 약 40% 가 형질도입되는 결과를 가져왔다.

표적화된 교란의 효율은 Cel-1 검정을 이용해 검정했다. 표적 영역은 PCR 로 증폭했고, 가열로 변성시켰으며, 다시 어닐링하고, 미스매치된 영역 뿐 아니라 1 개의 염기쌍으로부터의 버블을 효율적으로 제거하는 효소 Cel-1 에 노출시켰다. 표적화된 영역이 임의의 방식으로 돌연변이화되었다면, 야생형 및 돌연변이 가닥들의 이종성이중구조 (heteroduplex) 가 절단되어 겔 전기영동으로 검출된다. 그러한 검정법은 돌연변이의 효율을 가늠하기 위한 세포의 벌크 집단 상에 이용될 수 있거나, 또는 여러 세포들의 분석이 돌연변이 빈도의 정확한 평가를 제공하게 되는 유세포분석 분류 개별 세포들에 이용될 수 있다.

세포의 벌크 집단 유래의 RNA 에 대한 일상적인 정량적 Taqman RT-PCR (qRT-PCR) 검정을 이용하면, β-글로빈 발현은 γ-글로빈/γ- + β글로빈 비율이 0.1% 가 되면서 분화함과 함께 11-배 유도된다. Bcl11a 넉다운 벡터를 이용한 감염 후, 그 비율에서의 30-배 증가가 수득될 수 있어서, 상기 세포 배양 시스템이 BCL 11a 중재된 HbF 침묵화 경로 교란의 정확한 검독을 제공함을 증명했다.

Bcl11a 경로 변경이 γ-글로빈 RNA 에서 상대적인 증가를 유도하지만, 글로빈 유전자 발현에서는 감소를 유도할 수 있음을 고려하여, 유세포분석을 이용해 세포용해시킨 세포들의 1,000 개 세포 집단을 분류하고, 상기 qRT-PCR 검정을 실시할 수 있다. RNA 는 동일한 갯수의 세포와 직접 비교되기 때문에, 글로빈 RNA 의 양에서의 임의의 축소는 Ct 에서의 증가로 반영되며, 이는 β- 및 γ- 의 발현 수준 뿐만 아니라, γ-글로빈 /γ - + β글로빈 의 비율의 직접적인 측정을 제공한다.

취급 후 변경된 γ-글로빈/γ- + β-글로빈 비율을 보여주는 백분율을 결정하고, 관찰된 발현에서의 변화 범위를 결정하기 위해, 단일 세포 검정을 실시했다. 유세포분석으로 분류한 개별 세포들을 γ- 및 β-글로빈 RNA 의 동시적인 여러 싸이클 동안의 일상적인 RT-PCR 에 적용하고, 시료의 정확한 분열을 허용하는 적절한 물질이 일단 존재하게 되면, 상기와 같이 qRT-PCR 에 의해 γ- 및 β-글로빈을 평가했다.

궁극적으로, 그것은 치료용인 RNA 가 아닌 HbF 단백질의 수준이며, 따라서 단일 세포 및 벌크 세포 HbF 검정법을 실시했다. 세포의 벌크 집단을 세포용해 및 헤모글로빈-전용 컬럼 상의 용리 후 HPLC 를 이용해 검정하고, HbF 대 HbA 및 HbA2 의 비율을 결정했다. HbF 를 발현하는 세포의 갯수를 글루테르알데히드 고정 세포를 이용한 형질도입 전후에 비교하고, 계면활성제를 이용해 삼투화작용하고, HbF 특이적 항체를 첨가한 후, 유세포분석으로 정량했다.

돌연변이의 유효성은 유세포분석에 의한 단일 세포의 분리 후 개질된 클로닝된 세포에서 평가했다. 상기 검정을 실시했다. 추가로, 표적화된 돌연변이들이 Bcl11a 억제성 복합체의 결합을 교란하는 것을 보여주기 위해, 세포를 포름알데히드에서 고정시키고, 염색체를 분리하고, 초음파처리로 전단처리했다. 시판하여 입수가능한 Bcl11a, GATA-1 및 HDAC-1 에 대한 항체들을 이용해 염색체 면역-침강 (Chromatin immune-precipitation (ChIP)) 을 실시했다. N-MEL 세포 뿐 아니라 적혈구-분화된 CD34 세포에서의 표적 영역에 대한 상기 단백질들의 결합을 하기에 기재했다. 결합의 결핍은 표적화한 교란 후 평가했다.

실시예 10

임상 등급의 CD34+ 조혈모세포

정상 인간 공여자 유래의 CD34+ 를 피브로넥틴 펩티드 CH-296 가 있는 배양 디쉬에 결합시키고, 20 의 MOI 로 2 회 감염시켰다. 8 시간 간격을 두고, G-CSF, SCF, IL-3, IL-6, FLT-3 및 TPO 을 함유하는 배지에서, 상기 기재된 RSCS-MCS-3 027459 PG-WZ 기반의 렌티바이러스 벡터를 이용해 감염시켰다. 이는 세포의 약 80% 가 감염되는 결과를 가져왔다. 형질전환된 세포들은 문헌 [Douy. Giarratana et al, Nat. Biotechnol 23(1):69-74 (2005)] 의 프로토콜을 이용해 적혈구세포로 분화되었다. 상기 qRT-PCR 검정은 γ-글로빈/γ- + β-글로빈 비율이 4% 임을 밝혀냈다. 그러한 낮은 비율은 게놈 편집에 후속하는 증가의 민감한 검출을 가능하게 한다.

분화 상태에서의 변경을 평가하기 위해, CD34, CD71 및 글리코포린을 포함한 여러가지 세포 표면 마커를 이용한 유세포분석 뿐만 아니라, 세포 생장 및 Wright-Giemsa 염색 후 싸이토스핀의 형태 평가를 실시했다. 상기와 같은 벌크 집단 (bulk populations) 및 단일 세포에 대한 Cel-1 검정에 의해 교란 효율을 평가했다. 글로빈 유전자 발현 및 HbF 의 추가적인 평가는 1,OOO 개 세포 집단 및 개별 세포에서 qRT-PCR 를 이용해 상기와 같이 실시했을 뿐만 아니라, HPLC 및 F-세포 검정도 실시했다. ChIP 을 채용하여 Bcl11a, GATA-1 및 HDAC-1 의 표적 영역에 대한 결합을 평가했다.

인간 세포 CD34+에서의 임상적 유효성을 평가하기 위해, 이상혈색소증 환자 유래의 인간 HSC 를 동일한 방법을 이용해 형질도입하고 배양했다. 정상적인 세포에 대한 일상적인 분석에 추가하여, 추가적인 질환-특이적 평가를 실시했다. 배양된 지중해성 빈혈 세포는 정상적인 세포에 비해 최소화된 증량, 헤모글로빈 형성의 결핍, 유효하지 않은 적혈구형성의 증거 및 증가된 아폽토시스를 나타냈다. 이는 발현 및 적혈구형성 후 표적화에서의 개선에 대한 정량적 평가를 가능하게 한다. 유사하게, 저산소 조건 하의 CD34 세포의 적혈구형성 자손의 겸형화 정도를 평가했다. 이상혈색소증 환자 유래의 그러한 형질도입된 CD34+ 세포들을 NSG 마우스로 이식한 후, 비정상적 적혈구형성의 몇가지 특징들을 재현해, 표적화된 돌연변이생성의 평가를 가능하게 했다.

임상적인 유효성은 이상혈색소증의 마우스 모델에서 생체내 평가했다. 쥐과동물 Bcl11a 의 넉아웃은 트랜스진 상에 인간 β-글로빈 좌를 포함하고 있는 마우스에서 γ-글로빈에 있어서 극적인 투여량-의존적 증가를 유도하며, 인간화된 마우스 모델에서 겸형 표현형을 경감시켰다. 두 시스템이 모두 글로빈 유전자 발현의 분석을 가능케 하는 한편, 겸형세포 마우스는 적혈구형성 파라미터, 특히 헤마크릿, 간 및 폐 병리, 신장 기능 및 비장 크기에 대해 특별히 주의를 기울여 그러한 마우스에서의 표현형의 개선 평가를 가능하게 한다. 이는 상기와 유사한 단일 세포 검정에서 HbF 포함 세포의 갯수, HbF/S 비율 및 발현 패턴과 상관이 있을 수 있다.

RNA 분석을 위해 전혈을 이용했는데, 이는 그것이 분석에 충분한 망상적혈구를 함유하고 있기 때문이다. 단일 세포 분석을 위해서는, 혈액을 티아졸 오렌지로 염색하고, 적혈구 세포의 전방 및 측방 분산 프로파일을 이용해 RNA 함유 세포를 수집했다. 겸형 적혈구 세포 마우스에서는 적혈구 수명이 현저히 줄어들었고, 100% 의 RBC 에 표지를 한 NHS-바이오틴의 복강 주사 후 수명 개선을 평가했다. 각 시점에서, 1 마이크로리터의 혈액을 FITC 로 염색하고, 표지된 RBC 의 잔여 백분율을 유세포분석으로 평가했다. 이는 본 출원인의 BERK 겸형 적혈구 세포 마우스 출신인 마우스를 이용해 실시했다 [Paszty et al, Science 278(5339): 876-878 (1997)]. 추가로, γ-글로빈/γ- + β-글로빈 비율은 A25 및 A85 인간 β-글로빈 YAC 을 포함하고 있는 마우스에서 평가했다 [Porcu et al, Blood 90(11):4602-4609 (1997)].

두가지 지중해성 빈혈증 모델을 평가했는데, 그것은 Th-3 마우스 이형접합체 (Yang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92(25): 1608-11612 (1995)) 및 LCR 의 결실에 대한 마우스 이형접합체 (Bender et al, Mol Cell. 5(2):387-393 (2000)) 였다. 각 경우, 지중해성 빈혈증에 대한 분석 초점은 헤마토크릿 (hematocrit), 유효하지 않은 적혈구생성의 평가, 비장 크기, 철분 과다 및 장기의 형태가 될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Bender, Michael A. M.D., Ph.D. Groudine, Mark T. M.D., Ph.D. Stoddard, Barry L. Ph.D. Takeuchi, Ryo Ph.D. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES <130> 54428.0006WOU1 <140> TBD <141> 2013-02-22 <150> US 61/603,231 <151> 2012-02-24 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ccagtgagca ggttggttta agataagcag ggtttcatta gtttgtgaga atgaaaaatg 60 aaccttcatt ccactattcc cttaacttgc cctgagattg gctgttctgt catgtgtgtc 120 ttgactcaga aaccctgttc tcctctacat atctccccac cgcatctctt tcagcagttg 180 tttctaaaaa tatcctccta gtttcatttt tgcagaagtg ttttaggcta atatagtgga 240 atgtatctta gagtttaact tatttgtttc tgtcacttta tactaagaaa acttatctaa 300 aagcagatgt tttaacaagt tgactcaata taaagttctt ctttgcctct agagattttt 360 gtctccaagg gaattttgag aggttggaat ggacaaatct attgctgcag tttaaacttg 420 cttgcttcct ccttcttttg gtaaattctt cctataataa aactctaatt ttttattata 480 ttgaaataaa tatccattaa aagaatattt aaaaaatgaa tagtgtttat ttaccagtta 540 ttgaaatagg ttctggaaac atgaatttta aggttaacat tttaatgaca gataaaatca 600 aatattatat acaaatattt 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Glu Leu Gly Phe Gln Ile Thr 35 40 45 Leu His Asn Lys Asp Lys Ser Ile Leu Glu Asn Ile Gln Ser Thr Trp 50 55 60 Lys Val Gly Val Ile Ala Asn Ser Gly Asp Asn Ala Val Ser Leu Lys 65 70 75 80 Val Thr Arg Phe Glu Asp Leu Lys Val Ile Ile Asp His Phe Glu Lys 85 90 95 Tyr Pro Leu Ile Thr Gln Lys Leu Gly Asp Tyr Met Leu Phe Lys Gln 100 105 110 Ala Phe Cys Val Met Glu Asn Lys Glu His Leu Lys Ile Asn Gly Ile 115 120 125 Lys Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Lys Leu Asn Trp Gly Leu Thr Asp 130 135 140 Glu Leu Lys Lys Ala Phe Pro Glu Ile Ile Ser Lys Glu Arg Ser Leu 145 150 155 160 Ile Asn Lys Asn Ile Pro Asn Phe Lys Trp Leu Ala Gly Phe Thr Ser 165 170 175 Gly Glu Gly Cys Phe Phe Val Asn Leu Ile Lys Ser Lys Ser Lys Leu 180 185 190 Gly Val Gln Val Gln Leu Val Phe Ser Ile Thr Gln His Ile Lys Asp 195 200 205 Lys Asn Leu Met Asn Ser Leu Ile Thr Tyr Leu Gly Cys Gly Tyr Ile 210 215 220 Lys Glu Lys Asn Lys Ser Glu Phe Ser Trp Leu Asp Phe Val Val Thr 225 230 235 240 Lys Phe Ser Asp Ile Asn Asp Lys Ile Ile Pro Val Phe Gln Glu Asn 245 250 255 Thr Leu Ile Gly Val Lys Leu Glu Asp Phe Glu Asp Trp Cys Lys Val 260 265 270 Ala Lys Leu Ile Glu Glu Lys Lys His Leu Thr Glu Ser Gly Leu Asp 275 280 285 Glu Ile Lys Lys Ile Lys Leu Asn Met Asn Lys Gly Arg Val Phe 290 295 300 <210> 16 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 17 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 tgggggcgcc ttccccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 18 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaacatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 19 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgactaata gccttgacaa 110 <210> 20 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tgggggcccc ttctccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 21 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaacatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 22 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttaaccaata gccttgacaa 110 <210> 23 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tgggggcccc ttccccacac tatctcaatg caaatatctg tctgaaacgg tccctggcta 60 aactccaccc atgggttggc cagccttgcc ttgaccaata gccttgacaa 110 <210> 24 <211> 2508 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atgtctcgcc gcaagcaagg caaaccccag cacttaagca aacgggaatt ctcgcccgag 60 cctcttgaag ccattcttac agatgatgaa ccagaccacg gcccgttggg agctccagaa 120 ggggatcatg acctcctcac ctgtgggcag tgccagatga acttcccatt gggggacatt 180 cttattttta tcgagcacaa acggaaacaa tgcaatggca gcctctgctt agaaaaagct 240 gtggataagc caccttcccc ttcaccaatc gagatgaaaa aagcatccaa tcccgtggag 300 gttggcatcc aggtcacgcc agaggatgac gattgtttat caacgtcatc tagaggaatt 360 tgccccaaac aggaacacat agcagataaa cttctgcact ggaggggcct ctcctcccct 420 cgttctgcac atggagctct aatccccacg cctgggatga gtgcagaata tgccccgcag 480 ggtatttgta aagatgagcc cagcagctac acatgtacaa cttgcaaaca gccattcacc 540 agtgcatggt ttctcttgca acacgcacag aacactcatg gattaagaat ctacttagaa 600 agcgaacacg gaagtcccct gaccccgcgg gttggtatcc cttcaggact aggtgcagaa 660 tgtccttccc agccacctct ccatgggatt catattgcag acaataaccc ctttaacctg 720 ctaagaatac caggatcagt atcgagagag gcttccggcc tggcagaagg gcgctttcca 780 cccactcccc ccctgtttag tccaccaccg agacatcact tggaccccca ccgcatagag 840 cgcctggggg cggaagagat ggccctggcc acccatcacc cgagtgcctt tgacagggtg 900 ctgcggttga atccaatggc tatggagcct cccgccatgg atttctctag gagacttaga 960 gagctggcag ggaacacgtc tagcccaccg ctgtccccag gccggcccag ccctatgcaa 1020 aggttactgc aaccattcca gccaggtagc aagccgccct tcctggcgac gccccccctc 1080 cctcctctgc aatccgcccc tcctccctcc cagcccccgg tcaagtccaa gtcatgcgag 1140 ttctgcggca agacgttcaa atttcagagc aacctggtgg tgcaccggcg cagccacacg 1200 ggcgagaagc cctacaagtg caacctgtgc gaccacgcgt gcacccaggc cagcaagctg 1260 aagcgccaca tgaagacgca catgcacaaa tcgtccccca tgacggtcaa gtccgacgac 1320 ggtctctcca ccgccagctc cccggaaccc ggcaccagcg acttggtggg cagcgccagc 1380 agcgcgctca agtccgtggt ggccaagttc aagagcgaga acgaccccaa cctgatcccg 1440 gagaacgggg acgaggagga agaggaggac gacgaggaag aggaagaaga ggaggaagag 1500 gaggaggagg agctgacgga gagcgagagg gtggactacg gcttcgggct gagcctggag 1560 gcggcgcgcc accacgagaa cagctcgcgg ggcgcggtcg tgggcgtggg cgacgagagc 1620 cgcgccctgc ccgacgtcat gcagggcatg gtgctcagct ccatgcagca cttcagcgag 1680 gccttccacc aggtcctggg cgagaagcat aagcgcggcc acctggccga ggccgagggc 1740 cacagggaca cttgcgacga agactcggtg gccggcgagt cggaccgcat agacgatggc 1800 actgttaatg gccgcggctg ctccccgggc gagtcggcct cggggggcct gtccaaaaag 1860 ctgctgctgg gcagccccag ctcgctgagc cccttctcta agcgcatcaa gctcgagaag 1920 gagttcgacc tgcccccggc cgcgatgccc aacacggaga acgtgtactc gcagtggctc 1980 gccggctacg cggcctccag gcagctcaaa gatcccttcc ttagcttcgg agactccaga 2040 caatcgcctt ttgcctcctc gtcggagcac tcctcggaga acgggagttt gcgcttctcc 2100 acaccgcccg gggagctgga cggagggatc tcggggcgca gcggcacggg aagtggaggg 2160 agcacgcccc atattagtgg tccgggcccg ggcaggccca gctcaaaaga gggcagacgc 2220 agcgacactt gtgagtactg tgggaaagtc ttcaagaact gtagcaatct cactgtccac 2280 aggagaagcc acacgggcga aaggccttat aaatgcgagc tgtgcaacta tgcctgtgcc 2340 cagagtagca agctcaccag gcacatgaaa acgcatggcc aggtggggaa ggacgtttac 2400 aaatgtgaaa tttgtaagat gccttttagc gtgtacagta ccctggagaa acacatgaaa 2460 aaatggcaca gtgatcgagt gttgaataat gatataaaaa ctgaatag 2508 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 atgggattca tattgcagac aa 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 agccattgga ttcaaccgca gc 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 caaacagcca ttcaccagtg ca 22 <210> 28 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of I-HjeMI, Codon Optimized for Expression in E. coli <400> 28 atgggatccc acatggacct gacctacgct tacctggttg gtctgttcga aggtgacggt 60 tacttctcta tcaccaaaaa gggtaaatac ctgacctacg aactgggtat cgaactgtct 120 atcaaagacg ttcagctgat ctacaaaatc aaagacatcc tgggtgttgg taaagtttct 180 ttccgtaaac gtaacgaaat cgaaatggtt tctctgcgta tccgtgacaa gaatcacctg 240 aaaaacttca tcctgccgat cttcgacaaa tacccgatgc tgtctaacaa gcagtacgac 300 tacctgcgtt tcaaagacgc tctcctgtct aacattatct actctgacga tctgccggaa 360 tacgctcgtt ctaacgaatc tatcaactct gttgactcta ttatcaacac ctcttacttc 420 tctgcttggc tggttggttt catcgaagct gaaggttgct tctctaccta caaactgaac 480 aaagatgacg attacctgat cgcttctttc gacatcgctc agaaagacgg tgacatcctg 540 atctctgcta tccacaaata cctgtctttc accacgaaaa tctacctgga caaaaccaac 600 tgctctcgtc tgaaagtgac cggtgtacgt tctgttaaaa acgtggttaa attcatccag 660 ggtgctccgg ttaaactgct cggtaacaag aaactgcagt acaaactgtg gatcaaacag 720 ctgcgtaaaa tctctcgtta ctctgaaaaa atccagctgc cgtctaacta c 771 <210> 29 <211> 771 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of I-HjeMI, Codon Optimized for Expression in Mammals <400> 29 atgggcagcc acatggacct gacctacgcc tatctggtcg gcctgttcga gggcgacggc 60 tattttagca taaccaagaa gggcaagtat ctgacgtatg aactgggcat cgagctctcc 120 atcaaggacg tgcagctcat ctacaagatc aaggacatcc tcggcgtggg caaagtgtct 180 tttaggaaga ggaacgagat cgagatggtc agcctgcgaa tcagggacaa aaaccacctg 240 aagaacttca tcctgcccat cttcgacaag taccccatgc tgagcaacaa gcagtacgac 300 tatctccgat tcaaggatgc cctcctgtcc aacatcatct atagcgacga cctgcccgag 360 tacgccagga gcaacgagtc aatcaatagc gtggacagca tcatcaacac ctcatacttc 420 agcgcctggc tggttggctt catcgaggcc gagggctgct tcagcaccta caagctcaac 480 aaggacgacg attatttgat cgcgagcttc gatatagccc agaaggacgg cgacattctc 540 atctccgcga tccacaaata cctgagcttc acgaccaaaa tctacctgga caagaccaac 600 tgtagcaggc tcaaggtcac cggcgtgagg agcgtcaaga acgtggttaa gttcatccag 660 ggtgcgccgg tcaagttgct gggtaacaag aagctgcagt acaaactttg gataaagcag 720 ctgcgcaaga tctcccgata cagcgagaaa atccagctgc ccagtaacta c 771 <210> 30 <211> 254 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 30 Met Gly Asp Leu Thr Tyr Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Gly Asp 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Ser Ile Thr Lys Lys Gly Lys Tyr Leu Thr Tyr Glu Leu 20 25 30 Gly Ile Glu Leu Ser Ile Lys Asp Val Gln Leu Ile Tyr Lys Ile Lys 35 40 45 Asp Ile Leu Gly Val Gly Lys Val Ser Phe Arg Lys Arg Asn Glu Ile 50 55 60 Glu Met Val Ser Leu Arg Ile Arg Asp Lys Asn His Leu Lys Asn Phe 65 70 75 80 Ile Leu Pro Ile Phe Asp Lys Tyr Pro Met Leu Ser Asn Lys Gln Tyr 85 90 95 Asp Tyr Leu Arg Phe Lys Asp Ala Leu Leu Ser Asn Ile Ile Tyr Ser 100 105 110 Asp Asp Leu Pro Glu Tyr Ala Arg Ser Asn Glu Ser Ile Asn Ser Val 115 120 125 Asp Ser Ile Ile Asn Thr Ser Tyr Phe Ser Ala Trp Leu Val Gly Phe 130 135 140 Ile Glu Ala Glu Gly Cys Phe Ser Thr Tyr Lys Leu Asn Lys Asp Asp 145 150 155 160 Asp Tyr Leu Ile Ala Ser Phe Asp Ile Ala Gln Lys Asp Gly Asp Ile 165 170 175 Leu Ile Ser Ala Ile His Lys Tyr Leu Ser Phe Thr Thr Lys Ile Tyr 180 185 190 Leu Asp Lys Thr Asn Cys Ser Arg Leu Lys Val Thr Gly Val Arg Ser 195 200 205 Val Lys Asn Val Val Lys Phe Ile Gln Gly Ala Pro Val Lys Leu Leu 210 215 220 Gly Asn Lys Lys Leu Gln Tyr Lys Leu Trp Ile Lys Gln Leu Arg Lys 225 230 235 240 Ile Ser Arg Tyr Ser Glu Lys Ile Gln Leu Pro Ser Asn Tyr 245 250 <210> 31 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence for a BCL11A Gene Targeting Nuclease Based on the Homing Endonuclease I-HjeMI; Codon Optimized for Expression in E. coli and Obtained through Directed Evolution in IVC and in Bacteria <400> 31 atgggatccc acatggacct gacctacgct tacctggttg gtctgttcga aggtgacggt 60 tacttcacta tcgctaaagc gggtaagtac ctgaattacg agctgggtat cacgctgtct 120 atcaaagacg ctcagctgat ctacaaaatc aaagacatcc tgggtgttgg taatgtttat 180 ttccggaaat ataggcagca tgaaatggtt tctctgcgga tccaggacaa gaatcacctg 240 aaaaacttca tcctgccgat cttcgacaaa tacccgatgc tgtctaacaa gcagtacgac 300 tacctgcgtt tcaaagacgc tctcctgtct aacattatct actctgacga tctgccggaa 360 tacgctcgtt ctaacgaatc tatcaactct gttgactcta ttatcaacac ctcttacttc 420 tctgcttggc tggttggttt catcgaagct gaaggttgct tcacgaccta caaagcgagt 480 aaagataagt acctgacggc tgggttcagt atcgctcaga aagacggtga catcctgatc 540 tctgctatcc acaaatacct gtctttcacc acgaaaccgt acaaggacaa aaccaactgc 600 tctcatctga aggtgaccgg tgtacgttct gttaacaacg tggttaaatt catccagggt 660 gctccggtta aactgctcgg taacaagaaa ctgcagtaca aactgtggat caaacagctg 720 cgtaaaatct ctcgttactc tgaaaaaatc cagctgccgt ctaactac 768 <210> 32 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of a BCL11A Gene Targeting Nuclease Based on the Homing Endonuclease I-HjeMI; Codon Optimized for Expression in Mammals and Obtained through Directed Evolution in IVC and in Bacteria <400> 32 atgggcagcc acatggacct gacctacgcc tatctggtcg gcctgttcga gggcgacggc 60 tattttacaa tagctaaggc cggcaagtat ctgaactacg agctgggcat cacactctcc 120 atcaaggacg ctcagctcat ctacaagatc aaggacatcc tcggcgtggg caacgtgtac 180 tttaggaagt acaggcaaca tgagatggtc agcctgcgaa tccaggacaa aaaccacctg 240 aagaacttca tcctgcccat cttcgacaag taccccatgc tgagcaacaa gcagtacgac 300 tacctgcgat tcaaggatgc cctcctgtcc aacatcatct atagcgacga cctgcccgag 360 tacgccagga gcaacgagtc aatcaatagc gtggacagca tcatcaacac ctcatacttc 420 agcgcctggc tggttggctt catcgaggcc gagggctgct tcaccaccta caaggcatcc 480 aaggacaagt acctgacagc gggcttctcc atagcccaga aggacggcga cattctcatc 540 tccgcgatcc acaaatacct gagcttcacg accaaaccct acaaagacaa gaccaactgt 600 agccacctca aggtcaccgg cgtgaggagc gtcaataacg tggttaagtt catccagggt 660 gcgccggtca agctgctggg taacaagaag ctgcagtaca aactttggat aaagcagctg 720 cgcaagatct cccgatacag cgagaaaatc cagctgccca gtaactac 768 <210> 33 <211> 256 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of a BCL11A Gene Targeting Nuclease Based on the Homing Endonuclease I-HjeMI <400> 33 Met Gly Ser His Met Asp Leu Thr Tyr Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe 1 5 10 15 Glu Gly Asp Gly Tyr Phe Thr Ile Ala Lys Ala Gly Lys Tyr Leu Asn 20 25 30 Tyr Glu Leu Gly Ile Thr Leu Ser Ile Lys Asp Ala Gln Leu Ile Tyr 35 40 45 Lys Ile Lys Asp Ile Leu Gly Val Gly Asn Val Tyr Phe Arg Lys Tyr 50 55 60 Arg Gln His Glu Met Val Ser Leu Arg Ile Gln Asp Lys Asn His Leu 65 70 75 80 Lys Asn Phe Ile Leu Pro Ile Phe Asp Lys Tyr Pro Met Leu Ser Asn 85 90 95 Lys Gln Tyr Asp Tyr Leu Arg Phe Lys Asp Ala Leu Leu Ser Asn Ile 100 105 110 Ile Tyr Ser Asp Asp Leu Pro Glu Tyr Ala Arg Ser Asn Glu Ser Ile 115 120 125 Asn Ser Val Asp Ser Ile Ile Asn Thr Ser Tyr Phe Ser Ala Trp Leu 130 135 140 Val Gly Phe Ile Glu Ala Glu Gly Cys Phe Thr Thr Tyr Lys Ala Ser 145 150 155 160 Lys Asp Lys Tyr Leu Thr Ala Gly Phe Ser Ile Ala Gln Lys Asp Gly 165 170 175 Asp Ile Leu Ile Ser Ala Ile His Lys Tyr Leu Ser Phe Thr Thr Lys 180 185 190 Pro Tyr Lys Asp Lys Thr Asn Cys Ser His Leu Lys Val Thr Gly Val 195 200 205 Arg Ser Val Asn Asn Val Val Lys Phe Ile Gln Gly Ala Pro Val Lys 210 215 220 Leu Leu Gly Asn Lys Lys Leu Gln Tyr Lys Leu Trp Ile Lys Gln Leu 225 230 235 240 Arg Lys Ile Ser Arg Tyr Ser Glu Lys Ile Gln Leu Pro Ser Asn Tyr 245 250 255 <210> 34 <211> 912 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of I-OnuI, Codon Optimized for Expression in E. coli <400> 34 atgtccgcct acatgtcccg tcgcgagtcc attaacccgt ggattctcac cggtttcgcc 60 gacgcggaag gctccttttt gctgcgcatc cgcaacaaca acaagtccag cgtcggctac 120 tccactgagc tcggcttcca aattacactt cataacaagg acaagagcat tcttgagaac 180 atccagtcaa catggaaggt gggcgtgatc gccaacagcg gtgacaacgc cgtgtcgctg 240 aaggtcacgc gttttgagga cctgaaggtc attatcgacc attttgaaaa atacccactg 300 attacgcaga agctcggtga ctacatgctg tttaagcagg cgttttgcgt catggagaac 360 aaggagcatt tgaagattaa tggtatcaag gagctggtgc gcattaaggc aaagctcaat 420 tggggtctga cggatgagct gaagaaggcc tttccggaga tcatctcgaa ggagcgctcc 480 ctcatcaaca agaacatccc taatttcaag tggctggcgg gttttacctc gggcgagggt 540 tgcttctttg ttaacctgat caagtcaaag tcgaagctag gtgtccaggt gcagctggtg 600 ttcagcatta cccaacacat caaggataag aacctcatga actctctgat tacctacttg 660 ggctgcggct acattaagga gaaaaacaag agtgagttct cctggcttga cttcgtcgtc 720 acgaaattct ccgacatcaa cgacaagatc attccggtct ttcaggaaaa cacgctcatc 780 ggcgtgaagc tcgaggactt cgaggattgg tgtaaggtcg ctaagctgat cgaggagaaa 840 aagcacctga cagaaagtgg cctggacgag atcaagaaga ttaagctgaa catgaacaag 900 ggcagagtat tc 912 <210> 35 <211> 1998 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of MegaTAL:5.5 RVD + Y2 I-AniI <400> 35 gtggatctac gcacgctcgg ctacagtcag cagcagcaag agaagatcaa accgaaggtg 60 cgttcgacag tggcgcagca ccacgaggca ctggtgggcc atgggtttac acacgcgcac 120 atcgttgcgc tcagccaaca cccggcagcg ttagggaccg tcgctgtcac gtatcagcac 180 ataatcacgg cgttgccaga ggcgacacac gaagacatcg ttggcgtcgg caaacagtgg 240 tccggcgcac gcgccctgga ggccttgctc acggatgcgg gggagttgag aggtccgccg 300 ttacagttgg acacaggcca acttgtgaag attgcaaaac gtggcggcgt gaccgcaatg 360 gaggcagtgc atgcatcgcg caatgcactg acgggtgccc ccctgaacct gaccccggac 420 caagtggtgg ctatcgccag caacaatggc ggcaagcaag cgctcgaaac ggtgcagcgg 480 ctgttgccgg tgctgtgcca ggaccatggc ctgactccgg accaagtggt ggctatcgcc 540 agccacgatg gcggcaagca agcgctcgaa acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc 600 caggaccatg gcctgacccc ggaccaagtg gtggctatcg ccagcaacat tggcggcaag 660 caagcgctcg aaacggtgca gcggctgttg ccggtgctgt gccaggacca tggcctgacc 720 ccggaccaag tggtggctat cgccagcaac aatggcggca agcaagcgct cgaaacggtg 780 cagcggctgt tgccggtgct gtgccaggac catggcctga ctccggacca agtggtggct 840 atcgccagcc acgatggcgg caagcaagcg ctcgaaacgg tgcagcggct gttgccggtg 900 ctgtgccagg accatggcct gaccccggac caagtggtgg ctatcgccag caacggtggc 960 ggcaagcaag cgctcgaaag cattgtggcc cagctgagcc ggcctgatcc ggcgttggcc 1020 gcgttgacca acgaccacct cgtcgccttg gcctgcctcg gcggacgtcc tgccatggat 1080 gcagtgaaaa agggattgcc gcacgcgccg gaattgatca gaagagtcaa tcgccgtatt 1140 ggcgaacgca cgtcccatcg cgttgcgata tctagagtgg gaggaagcga tcttacgtac 1200 gcgtatttag ttggtctcta cgaaggggat ggatacttta gtatcaccaa gaaaggcaag 1260 tacttgactt atgaattagg tattgagctg agcatcaaag acgtccaatt gatttacaag 1320 atcaagaaaa tcctaggtat tggcatcgta agcttcagga agagaaacga gattgaaatg 1380 gttgcattga ggatccgtga taagaatcat ctaaaatcta agatattgcc tatatttgag 1440 aagtatccaa tgttttccaa caaacagtac gactatttaa gattcaggaa tgcattgtta 1500 tctggcatta tatacctaga agacttgcct gattacacta gaagtgacga accattgaat 1560 tctatagaat ccattatcaa cacatcatac ttctccgcct ggctagttgg atttatagaa 1620 gctgagggct gtttcagtgt gtacaagctg aacaaagacg atgactactt gattgcttca 1680 ttcgacattg cccaaagaga tggtgatatc ttgatttcag caattaggaa gtacttaagt 1740 ttcactacta aggtttacct agacaagact aattgtagca aattgaaggt cactagtgtt 1800 agatccgtcg agaacatcat taagtttctg cagaatgctc ctgtcaaatt gttaggcaac 1860 aagaaactgc aatacaagtt gtggttgaaa caactaagga agatttctag gtattccgag 1920 aagatcaaga ttccatcaaa ctacgtcgac cgagcatctt accgccattt atacccatat 1980 ttgttctgtt tttcttga 1998 <210> 36 <211> 665 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino Acid Sequence of MegaTAL:5.5 RVD + Y2 I-AniI <400> 36 Val Asp Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ser Gln Gln Gln Gln Glu Lys Ile 1 5 10 15 Lys Pro Lys Val Arg Ser Thr Val Ala Gln His His Glu Ala Leu Val 20 25 30 Gly His Gly Phe Thr His Ala His Ile Val Ala Leu Ser Gln His Pro 35 40 45 Ala Ala Leu Gly Thr Val Ala Val Thr Tyr Gln His Ile Ile Thr Ala 50 55 60 Leu Pro Glu Ala Thr His Glu Asp Ile Val Gly Val Gly Lys Gln Trp 65 70 75 80 Ser Gly Ala Arg Ala Leu Glu Ala Leu Leu Thr Asp Ala Gly Glu Leu 85 90 95 Arg Gly Pro Pro Leu Gln Leu Asp Thr Gly Gln Leu Val Lys Ile Ala 100 105 110 Lys Arg Gly Gly Val Thr Ala Met Glu Ala Val His Ala Ser Arg Asn 115 120 125 Ala Leu Thr Gly Ala Pro Leu Asn Leu Thr Pro Asp Gln Val Val Ala 130 135 140 Ile Ala Ser Asn Asn Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg 145 150 155 160 Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp Gln Val 165 170 175 Val Ala Ile Ala Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val 180 185 190 Gln Arg Leu Leu Pro Val Leu Cys Gln Asp His Gly Leu Thr Pro Asp 195 200 205 Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 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tatccaactg gttcagactt acaatcagct tttcgaagag 600 aacccgatca acgcatccgg agttgacgcc aaagcaatcc tgagcgctag gctgtccaaa 660 tcccggcggc tcgaaaacct catcgcacag ctccctgggg agaagaagaa cggcctgttt 720 ggtaatctta tcgccctgtc actcgggctg acccccaact ttaaatctaa cttcgacctg 780 gccgaagatg ccaagcttca actgagcaaa gacacctacg atgatgatct cgacaatctg 840 ctggcccaga tcggcgacca gtacgcagac ctttttttgg cggcaaagaa cctgtcagac 900 gccattctgc tgagtgatat tctgcgagtg aacacggaga tcaccaaagc tccgctgagc 960 gctagtatga tcaagcgcta tgatgagcac caccaagact tgactttgct gaaggccctt 1020 gtcagacagc aactgcctga gaagtacaag gaaattttct tcgatcagtc taaaaatggc 1080 tacgccggat acattgacgg cggagcaagc caggaggaat tttacaaatt tattaagccc 1140 atcttggaaa aaatggacgg caccgaggag ctgctggtaa agcttaacag agaagatctg 1200 ttgcgcaaac agcgcacttt cgacaatgga agcatccccc accagattca cctgggcgaa 1260 ctgcacgcta tcctcaggcg gcaagaggat ttctacccct ttttgaaaga taacagggaa 1320 aagattgaga aaatcctcac atttcggata ccctactatg taggccccct cgcccgggga 1380 aattccagat tcgcgtggat gactcgcaaa tcagaagaga ccatcactcc ctggaacttc 1440 gaggaagtcg tggataaggg ggcctctgcc cagtccttca tcgaaaggat gactaacttt 1500 gataaaaatc tgcctaacga aaaggtgctt cctaaacact ctctgctgta cgagtacttc 1560 acagtttata acgagctcac caaggtcaaa tacgtcacag aagggatgag aaagccagca 1620 ttcctgtctg gagagcagaa gaaagctatc gtggacctcc tcttcaagac gaaccggaaa 1680 gttaccgtga aacagctcaa agaagactat ttcaaaaaga ttgaatgttt cgactctgtt 1740 gaaatcagcg gagtggagga tcgcttcaac gcatccctgg gaacgtatca cgatctcctg 1800 aaaatcatta aagacaagga cttcctggac aatgaggaga acgaggacat tcttgaggac 1860 attgtcctca cccttacgtt gtttgaagat agggagatga ttgaagaacg cttgaaaact 1920 tacgctcatc tcttcgacga caaagtcatg aaacagctca agaggcgccg atatacagga 1980 tgggggcggc tgtcaagaaa actgatcaat gggatccgag acaagcagag tggaaagaca 2040 atcctggatt ttcttaagtc cgatggattt gccaaccgga acttcatgca gttgatccat 2100 gatgactctc tcacctttaa ggaggacatc cagaaagcac aagtttctgg ccagggggac 2160 agtcttcacg agcacatcgc taatcttgca ggtagcccag ctatcaaaaa gggaatactg 2220 cagaccgtta aggtcgtgga tgaactcgtc aaagtaatgg gaaggcataa gcccgagaat 2280 atcgttatcg agatggcccg agagaaccaa actacccaga agggacagaa gaacagtagg 2340 gaaaggatga agaggattga agagggtata aaagaactgg ggtcccaaat ccttaaggaa 2400 cacccagttg aaaacaccca gcttcagaat gagaagctct acctgtacta cctgcagaac 2460 ggcagggaca tgtacgtgga tcaggaactg gacatcaatc ggctctccga ctacgacgtg 2520 gatcatatcg tgccccagtc ttttctcaaa gatgattcta ttgataataa agtgttgaca 2580 agatccgata aaaatagagg gaagagtgat aacgtcccct cagaagaagt tgtcaagaaa 2640 atgaaaaatt attggcggca gctgctgaac gccaaactga tcacacaacg gaagttcgat 2700 aatctgacta aggctgaacg aggtggcctg tctgagttgg ataaagccgg cttcatcaaa 2760 aggcagcttg ttgagacacg ccagatcacc aagcacgtgg cccaaattct cgattcacgc 2820 atgaacacca agtacgatga aaatgacaaa ctgattcgag aggtgaaagt tattactctg 2880 aagtctaagc tggtctcaga tttcagaaag gactttcagt tttataaggt gagagagatc 2940 aacaattacc accatgcgca tgatgcctac ctgaatgcag tggtaggcac tgcacttatc 3000 aaaaaatatc ccaagcttga atctgaattt gtttacggag actataaagt gtacgatgtt 3060 aggaaaatga tcgcaaagtc tgagcaggaa ataggcaagg ccaccgctaa gtacttcttt 3120 tacagcaata ttatgaattt tttcaagacc gagattacac tggccaatgg agagattcgg 3180 aagcgaccac ttatcgaaac aaacggagaa acaggagaaa tcgtgtggga caagggtagg 3240 gatttcgcga cagtccggaa ggtcctgtcc atgccgcagg tgaacatcgt taaaaagacc 3300 gaagtacaga ccggaggctt ctccaaggaa agtatcctcc cgaaaaggaa cagcgacaag 3360 ctgatcgcac gcaaaaaaga ttgggacccc aagaaatacg gcggattcga ttctcctaca 3420 gtcgcttaca gtgtactggt tgtggccaaa gtggagaaag ggaagtctaa aaaactcaaa 3480 agcgtcaagg aactgctggg catcacaatc atggagcgat caagcttcga aaaaaacccc 3540 atcgactttc tcgaggcgaa aggatataaa gaggtcaaaa aagacctcat cattaagctt 3600 cccaagtact ctctctttga gcttgaaaac ggccggaaac gaatgctcgc tagtgcgggc 3660 gagctgcaga aaggtaacga gctggcactg ccctctaaat acgttaattt cttgtatctg 3720 gccagccact atgaaaagct caaagggtct cccgaagata atgagcagaa gcagctgttc 3780 gtggaacaac acaaacacta ccttgatgag atcatcgagc aaataagcga attctccaaa 3840 agagtgatcc tcgccgacgc taacctcgat aaggtgcttt ctgcttacaa taagcacagg 3900 gataagccca tcagggagca ggcagaaaac attatccact tgtttactct gaccaacttg 3960 ggcgcgcctg cagccttcaa gtacttcgac accaccatag acagaaagcg gtacacctct 4020 acaaaggagg tcctggacgc cacactgatt catcagtcaa ttacggggct ctatgaaaca 4080 agaatcgacc tctctcagct cggtggagac agcagggctg accccaagaa gaagaggaag 4140 gtgtga 4146 <210> 38 <211> 455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide Sequence of RNA Guide Strand for use with Cas9 Endonuclease <220> <221> misc_feature <222> (320)..(338) <223> n is a, c, g, or t <400> 38 tgtacaaaaa agcaggcttt aaaggaacca attcagtcga ctggatccgg taccaaggtc 60 gggcaggaag agggcctatt tcccatgatt ccttcatatt tgcatatacg atacaaggct 120 gttagagaga taattagaat taatttgact gtaaacacaa agatattagt acaaaatacg 180 tgacgtagaa agtaataatt tcttgggtag tttgcagttt taaaattatg ttttaaaatg 240 gactatcata tgcttaccgt aacttgaaag tatttcgatt tcttggcttt atatatcttg 300 tggaaaggac gaaacaccgn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt tttagagcta gaaatagcaa 360 gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgctttttt 420 tctagaccca gctttcttgt acaaagttgg catta 455 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCL11A gene target site <400> 39 tccaagtgat gtctcggtgg tg 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Targeted Homing Endonuclease Target Site <400> 40 tttccaatta ttcaaccttt ta 22 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Targeted Homing Endonuclease Target Site <400> 41 tcttgaatta ttcaaccttt ta 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Targeted Homing Endonuclease Target Site <400> 42 tttccattta ttcaatattt ta 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Targeted Homing Endonuclease Target Site <400> 43 tttccattta ttcaatatct tt 22 <210> 44 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 Promoter Sequence of a Generic Cas9 Guide RNA <400> 44 ggacgaaaca cc 12 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Generic Target-specific Sequence of a Generic Cas9 Guide RNA <220> <221> 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accccctggt aaccgccaag 300 tgggccgact acaccctctt taagaaggcc ctggacgtaa ttctgttgaa ggagcacctg 360 agccagaagg gcctgcttaa actggtaggc attaaggcga gcctgaatct cgggttgaac 420 ggcagcctca aggaggcgtt cccgaactgg gaagaactgc agatcgacag gccgagctac 480 gtgttcaagg gcatccccga ccccaactgg atcagcggct tcgcgtcagg cgatagcagc 540 tttaatgtga aaatcagcaa ctcccccacg tcactgctca ataaaagggt gcagctgagg 600 ttcggcatcg gactgaacat cagagagaaa gcccttatcc aatacctggt ggcctacttt 660 gacctgtcag acaacctgaa gaacatctac ttcgacctga acagcgcacg gttcgaggtg 720 gtgaagttca gcgacatcac cgacaagatc atccccttct tcgacaagta cagcatacaa 780 ggcaagaaga gcctggacta catcaacttc aaggaagtgg ccgacattat caagagcaag 840 aaccatctta ctagcgaggg cttccaggaa atcttggaca tcaaagccag tatgaacaag 900 <210> 63 <211> 300 <212> PRT <213> Cryphonectria parasitica <400> 63 Met Asn Thr Ser Ser Ser Phe Asn Pro Trp Phe Leu Thr Gly Phe Ser 1 5 10 15 Asp Ala Glu Cys Ser Phe Ser Ile Leu Ile Gln Ala Asn Ser Lys Tyr 20 25 30 Ser Thr Gly Trp Arg Ile Lys Pro Val Phe Ala Ile Gly Leu His Lys 35 40 45 Lys Asp Leu Glu Leu Leu Lys Arg Ile Gln Ser Tyr Leu Gly Val Gly 50 55 60 Lys Ile His Ile His Gly Lys Asp Ser Ile Gln Phe Arg Ile Asp Ser 65 70 75 80 Pro Lys Glu Leu Glu Val Ile Ile Asn His Phe Glu Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Val Thr Ala Lys Trp Ala Asp Tyr Thr Leu Phe Lys Lys Ala Leu Asp 100 105 110 Val Ile Leu Leu Lys Glu His Leu Ser Gln Lys Gly Leu Leu Lys Leu 115 120 125 Val Gly Ile Lys Ala Ser Leu Asn Leu Gly Leu Asn Gly Ser Leu Lys 130 135 140 Glu Ala Phe Pro Asn Trp Glu Glu Leu Gln Ile Asp Arg Pro Ser Tyr 145 150 155 160 Val Phe Lys Gly Ile Pro Asp Pro Asn Trp Ile Ser Gly Phe Ala Ser 165 170 175 Gly Asp Ser Ser Phe Asn Val Lys Ile Ser Asn Ser Pro Thr Ser Leu 180 185 190 Leu Asn Lys Arg Val Gln Leu Arg Phe Gly Ile Gly Leu Asn Ile Arg 195 200 205 Glu Lys Ala Leu Ile Gln Tyr Leu Val Ala Tyr Phe Asp Leu Ser Asp 210 215 220 Asn Leu Lys Asn Ile Tyr Phe Asp Leu Asn Ser Ala Arg Phe Glu Val 225 230 235 240 Val Lys Phe Ser Asp Ile Thr Asp Lys Ile Ile Pro Phe Phe Asp Lys 245 250 255 Tyr Ser Ile Gln Gly Lys Lys Ser Leu Asp Tyr Ile Asn Phe Lys Glu 260 265 270 Val Ala Asp Ile Ile Lys Ser Lys Asn His Leu Thr Ser Glu Gly Phe 275 280 285 Gln Glu Ile Leu Asp Ile Lys Ala Ser Met Asn Lys 290 295 300 <210> 64 <211> 5264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of BCL11A gene targeting nuclease-encoding plasmid pExodusBCL11Ahje <400> 64 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttggta ccgagctcgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 960 aggtacgttg acgccgccac catgggatat ccatacgatg tcccagatta tgcgccacct 1020 aagaagaaac gcaaagtccc cgggggcagc cacatggacc tgacctacgc ctatctggtc 1080 ggcctgttcg agggcgacgg ctattttaca atagctaagg ccggcaagta tctgaactac 1140 gagctgggca tcacactctc catcaaggac gctcagctca tctacaagat caaggacatc 1200 ctcggcgtgg gcaacgtgta ctttaggaag tacaggcaac atgagatggt cagcctgcga 1260 atccaggaca aaaaccacct gaagaacttc atcctgccca tcttcgacaa gtaccccatg 1320 ctgagcaaca agcagtacga ctacctgcga ttcaaggatg ccctcctgtc caacatcatc 1380 tatagcgacg acctgcccga gtacgccagg agcaacgagt caatcaatag cgtggacagc 1440 atcatcaaca cctcatactt cagcgcctgg ctggttggct tcatcgaggc cgagggctgc 1500 ttcaccacct acaaggcatc caaggacaag tacctgacag cgggcttctc catagcccag 1560 aaggacggcg acattctcat ctccgcgatc cacaaatacc tgagcttcac gaccaaaccc 1620 tacaaagaca agaccaactg tagccacctc aaggtcaccg gcgtgaggag cgtcaataac 1680 gtggttaagt tcatccaggg tgcgccggtc aagctgctgg gtaacaagaa gctgcagtac 1740 aaactttgga taaagcagct gcgcaagatc tcccgataca gcgagaaaat ccagctgccc 1800 agtaactact aatctagagg gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct 1860 agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc 1920 actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt 1980 cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat 2040 agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg 2100 ggctctaggg ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 2160 gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 2220 ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 2280 cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 2340 gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 2400 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 2460 gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 2520 ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg 2580 gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag cctatcagga catagcgttg 2640 gctacccgtg atattgctga agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 2700 tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 2760 ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac 2820 gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg 2880 acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccca 2940 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 3000 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 3060 atcatgtctg tataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt 3120 ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa 3180 agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac 3240 tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg 3300 cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc 3360 gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat 3420 ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca 3480 ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc 3540 atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 3600 aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg 3660 gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta 3720 ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg 3780 ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac 3840 acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag 3900 gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga agaacagtat 3960 ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat 4020 ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 4080 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 4140 acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 4200 tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 4260 ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 4320 catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 4380 ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 4440 caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 4500 ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 4560 tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 4620 cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 4680 aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 4740 tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 4800 gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 4860 cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 4920 aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 4980 tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5040 tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 5100 gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 5160 atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 5220 taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 5264 <210> 65 <211> 5100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of TREX2-encoding plasmid pExodus CMV.Trex2 <400> 65 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 atgtctgagc cacctcgggc tgagaccttt gtattcctgg acctagaagc cactgggctc 960 ccaaacatgg accctgagat tgcagagata tccctttttg ctgttcaccg ctcttccctg 1020 gagaacccag aacgggatga ttctggttcc ttggtgctgc cccgtgttct ggacaagctc 1080 acactgtgca tgtgcccgga gcgccccttt actgccaagg ccagtgagat tactggtttg 1140 agcagcgaaa gcctgatgca ctgcgggaag gctggtttca atggcgctgt ggtaaggaca 1200 ctgcagggct tcctaagccg ccaggagggc cccatctgcc ttgtggccca caatggcttc 1260 gattatgact tcccactgct gtgcacggag ctacaacgtc tgggtgccca tctgccccaa 1320 gacactgtct gcctggacac actgcctgca ttgcggggcc tggaccgtgc tcacagccac 1380 ggcaccaggg ctcaaggccg caaaagctac agcctggcca gtctcttcca ccgctacttc 1440 caggctgaac ccagtgctgc ccattcagca gaaggtgatg tgcacaccct gcttctgatc 1500 ttcctgcatc gtgctcctga gctgctcgcc tgggcagatg agcaggcccg cagctgggct 1560 catattgagc ccatgtacgt gccacctgat ggtccaagcc tcgaagcctg aattctgcag 1620 atatccagca cagtggcggc cgctcgagtc tagagggccc gtttaaaccc gctgatcagc 1680 ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1740 gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1800 ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga 1860 ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc 1920 ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tccccacgcg ccctgtagcg gcgcattaag 1980 cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 2040 cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 2100 tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 2160 aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg 2220 ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 2280 actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta 2340 ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg 2400 tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagccta 2460 tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 2520 ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 2580 ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg 2640 cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 2700 ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 2760 ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 2820 atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 2880 ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtata ccgtcgacct ctagctagag cttggcgtaa 2940 tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata 3000 cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta 3060 attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa 3120 tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 3180 ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 3240 gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 3300 ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 3360 cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 3420 ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 3480 accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 3540 catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 3600 gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 3660 tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 3720 agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 3780 actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 3840 gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtttttt tgtttgcaag 3900 cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg 3960 tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa 4020 aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata 4080 tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg 4140 atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata 4200 cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg 4260 gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct 4320 gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt 4380 tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 4440 tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 4500 tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 4560 aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 4620 atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 4680 tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca 4740 catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 4800 aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 4860 tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 4920 gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 4980 tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 5040 tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 5100 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 66 gctggaatgg ttgcagtaac 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 67 caaacagcca ttcaccagtg 20 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 68 ctgccagctc tctaagtctc c 21 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 69 tgcaacacgc acagaacact c 21

Claims (33)

1. Cas9 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
2. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
3. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 벡터 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NOs : 48-54에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 하기를 포함하는 조성물:
   (a) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
   (b) SEQ ID NO: 49 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
   (c) SEQ ID NO: 50 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
   (d) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 49-53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
   (e) SEQ ID NO: 51 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
   (f) SEQ ID NO: 52 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
   (g) SEQ ID NO: 53 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
   (h) SEQ ID NO: 54 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 51 내지 53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 1 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 2 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
8. Cas9 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 이상혈색소증 치료용 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
9. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 이상혈색소증 치료용 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
10. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 벡터 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 이상혈색소증 치료용 조성물로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 이상혈색소증이 β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
12. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NOs : 48-54에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물.
13. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 하기를 포함하는 조성물:
    (a) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (b) SEQ ID NO: 49 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (c) SEQ ID NO: 50 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (d) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 49-53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (e) SEQ ID NO: 51 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (g) SEQ ID NO: 53 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 54 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 51 내지 53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열.
14. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 1 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
15. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 2 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 조성물.
16. Cas9 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 세포로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 세포.
17. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 세포로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 세포.
18. Cas9 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 하나 이상의 벡터 및 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 세포로서, 각각의 하나 이상의 가이드 RNA가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 세포.
19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 조혈모세포 (HSC), 조혈 간세포, 및 적혈구 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된 세포.
20. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NOs : 48-54에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포.
21. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 하기를 포함하는 세포:
    (a) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (b) SEQ ID NO: 49 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (c) SEQ ID NO: 50 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열;
    (d) SEQ ID NO: 48 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 49-53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (e) SEQ ID NO: 51 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (f) SEQ ID NO: 52 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열;
    (g) SEQ ID NO: 53 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 48 또는 54 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열; 또는
    (h) SEQ ID NO: 54 에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NOs: 51 내지 53 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열.
22. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 1 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 세포.
23. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가이드 RNA가 SEQ ID NO : 2 에서 제시된 태아 헤모글로빈 침묵화 영역 내의 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 세포.
24. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 이상혈색소증이 있는 대상에게 투여하기 위해 형성된 세포.
25. 제 24 항에 있어서, 이상혈색소증이 β-지중해성 빈혈 및 겸형 적혈구 빈혈로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포.
26. RNA 가이드 스트랜드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, RNA 가이드 스트랜드는 Cas9 엔도뉴클레아제가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위에 결합하는 것을 매개하는 폴리뉴클레오티드.
27. 제 26 항에 있어서, 상기 RNA 가이드 스트랜드는 Cas9 엔도뉴클레아제가 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역에 특이적으로 결합하는 것을 매개하는 폴리뉴클레오티드.
28. 제 27 항에 있어서, 상기 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역이 SEQ ID NO : 1 또는 SEQ ID NO : 2 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
29. 제 28 항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드가 SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, 및 SEQ ID NO : 54 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
30. RNA 가이드 스트랜드를 인코딩하는 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, RNA 가이드 스트랜드는 Cas9 엔도뉴클레아제가 Bcl11a 코딩 영역, Bcl11a 유전자 조절 영역, 성인 인간 β-글로빈 좌, 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역, Bcl11a-조절되는 HbF 침묵화 영역, γ-글로빈 유전자 프로모터, δ-글로빈 유전자 프로모터, 및 β-글로빈 유전자 돌연변이 부위로 이루어지는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 결합하는 것을 매개하는 벡터 시스템.
31. 제 30 항에 있어서, 성인 인간 β-글로빈 좌 내의 뉴클레오티드 서열이 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역인 벡터 시스템.
32. 제 31 항에 있어서, 상기 태아 헤모글로빈(HbF) 침묵화 영역이 SEQ ID NO : 1 또는 SEQ ID NO : 2 의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 시스템.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNA 가이드 스트랜드가 SEQ ID NO : 48, SEQ ID NO : 49, SEQ ID NO : 50, SEQ ID NO : 51, SEQ ID NO : 52, SEQ ID NO : 53, 및 SEQ ID NO : 54 로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 시스템.

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