CN110343756A - 一组用于检测地中海贫血的探针及相关试剂盒和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组用于检测地中海贫血的探针,所述探针包括选自如下的序列:SEQ ID NO.1‑80,所述探针还包括选自如下的序列:SEQ ID NO.81‑148。本发明还公开了包括所述探针的试剂盒。以及所述探针或所述试剂盒在制备用于检测地中海贫血的检测试剂中的用途。本发明还提供了一种筛查受试者基因突变的方法。利用本发明的探针和试剂盒,可以实现以较少的探针一次性检测疾病相关致病基因的所有突变,实现对疾病基因诊断的零遗漏,为疾病的治疗和干预提供保障;成本低,一次检测非缺失突变和缺失突变;高深度测序实现对突变检测的准确性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体而言,本发明涉及一组用于检测地中海贫血的探针及试剂盒和应用于NGS领域。
背景技术
地中海贫血属于一种单基因遗传病,位于常染色体上,其发病率呈明显的地域性,在热带、亚热带和中国东南部的发病率高达2.5%-15%。
在临床上,根据珠蛋白链的种类和缺乏程度,通常将地中海贫血分为α、β、γ和δ等4种类型,其中以β和α地中海贫血最多见,也最为严重。每种基因的突变形式及其占比有所不同:α珠蛋白基因的突变形式有点突变、拷贝数变异和大片段缺失等,95%的地中海贫血都是由大片段的缺失引起的。目前在中国发现的α-链缺失突变有17种,最常见的有SEA、4.2kb和3.7kb三种缺失型及CS、WS和QS三种点突变。中国南方地区常见的缺失型分为东亚亚型缺失,其次是右缺失和左缺失。β-珠蛋基因的突变形式主要有点突变、indels,也有大片段的缺失的报道。常见的突变类型为CD41-42(-TCTT)(HBB:c.126_129delCTTT)、CD17(A>T)(HBB:c.52A>T)、IVS-Ⅱ-654(C>T)(HBB:c.316-197C>T)、-28(A>G)(HBB:c.-78A>C)、CD71/72(+A)(HBB:c.216_217insA)、-29(A>G)(HBB:c.-79A>G)和CD26(G>A)(HBB:c.79G>A)等,这些变异占中国人β地中海贫血突变基因总数的90%以上。
因此,研发一种可以高效、精准地检测地中海贫血基因复杂突变类型的NGS检测方法意义重大。
发明内容
发明人结合中国人特有的突变位点信息,来设计探针集对地中海贫血进行基因捕获测序,主要针对于α和β基因的重要调控区,所有的断点进行探针设计,获得了一组用于检测地中海贫血的探针。
因此,在一方面,本发明提供了一组用于检测地中海贫血的探针,所述探针包括选自如下的序列:SEQ ID NO.1-80。
在一个实施方案中,所述探针还包括选自如下的序列:SEQ ID NO.81-148。
在一个实施方案中,所述探针分别还包括这样的探针,所述探针分别还包括这样的探针,即对于探针SEQ ID NO.81-148涉及的点突变位点被突变碱基替换的探针。
在二方面,本发明提供了一种包括本发明第一方面的探针的试剂盒。
在第三方面,本发明提供了本发明第一方面的探针或本发明第二方面的试剂盒在制备用于检测地中海贫血的检测试剂中的用途。
在第四方面,本发明涉及一种利用试剂盒筛查受试者基因突变的方法,所述方法包括:
1)提取所述受试者的基因组DNA,打断至200-300bp的范围;
2)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备;
3)将DNA小片段文库和本发明第一方面的探针进行杂交,进行基因的捕获;
4)对上述捕获后的产物进行扩增,得到扩增产物;
5)对步骤4)中获得的扩增产物进行上机测序,得到所述基因的测序数据;
6)将测序数据与到人类参考基因组进行比对,从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失,即所检测到的基因突变。
在一个实施方案中,所述人类参考基因组是HG19。
在一个实施方案中,在步骤2)中采用Illumina TruSeq DNA librarypreparation试剂盒,进行DNA小片段文库的制备。
本发明的用于检测地中海贫血的探针及相关试剂盒至少有如下优点:
相对于全基因组测序,大大节约了所需要的测序数据量;以较少的探针一次性检测疾病相关致病基因的所有突变,实现对疾病基因诊断的零遗漏,为疾病的治疗和干预提供保障;高深度的测序,实现对基因突变的高准确性检测;成本低,一次检测非缺失突变和缺失突变;高深度测序实现对突变检测的准确性。
具体实施方式
1.探针设计
根据α和β基因族重要的调控区域,外显子和内含子区域进行探针设计,可以检测到点突变、拷贝数变异和大片段缺失等多种突变形式。选取RefSeq、CCDS、GENCODE和UCSCKnown Genes四个数据库中的α基因族和β基因族重要的调控区域,外显子和内含子区域进行探针设计,针对基因上下游1Mb范围内最小等位基因频率均大于0.2的高频多态性位点,去除多聚核苷酸和位点上下游50bp序列中GC含量>70%的多态性位点进和SEA缺失区域作为目标区域进行探针设计。一共80.5K的区域作为探针设计区域。可以检测到点突变、拷贝数变异和大片段缺失等多种突变形式。在地中海贫血中,由于大片段缺失比较常见,因此专门针对α缺失突变和β缺失突变进行了专门设计,α缺失突变270.9K(间隔1K设计一个点,预计增加270个点,30K的覆盖区域,针对不确定断点的区域两段各延伸10K,5个片段,一共增加10K);β缺失突变73.6K优化(间隔1K设计一个点,预计增加75个点左右,覆盖区域增加10K左右),该探针集的覆盖区域大小:80.5K,可以检测到地贫突变的所有突变位点和新的地贫突变基因。
在本发明中,基因组位置是依据(H.sapiens,hg19,GRCh37,February 2009)的版本进行,但本领域技术人员应理解,这样的基因组位置可以对应于其他版本的基因组数据的位置,只要基因的相对位置对应上即可。
2.NGS文库构建
2.1建库,共建500个样品的文库。这500个样品是发明人长期工作过程中积累的样本,单个样本的α和β基因族及其相关序列的突变都经过二代测序进行过检测。
2.1.1打断人类基因组:获取500个人血液样品中的基因组,用Bioruptor Pico打断仪进行打断。
表-1:单个样品制备
成分 | 体积 |
基因组DNA | 量为1μg |
Nuclease-free water | 补足至50μl |
2.1.2末端修复加‘A’
表-2:末端修复加‘A’反应体系
2.1.2.1按如表-2格配置反应体系(此操作在冰盒上进行):
2.1.2.2简短震荡离心,将PCR管放回冰盒上,立即进行下步实验;
2.1.2.3运行PCR仪程序,设置PCR仪参数。热盖温度设置85℃;加热模块设置20℃,时间30min;65℃,时间30min;4℃∞。
2.1.2.4将PCR管放入PCR仪,运行程序;程序运行完成后立即进行下步连接反应。
2.1.3接头连接
表-3:接头连接反应体系
2.1.3.1轻轻吸打混匀6次,避免产生气泡,然后短暂离心;
2.1.3.2运行PCR仪程序(要求无热盖),设置PCR仪参数,加热模块设置20℃,时间15min。将PCR管放入PCR仪,运行程序;
2.1.3.3磁珠纯化
1)将Ampure XP beads拿至室温提前震荡混合均匀,室温孵育30min备用;
2)在step3步骤进行完的PCR管中,按照0.8X体积的纯化磁珠进行实验
3)轻轻吸打混匀6次;
6)室温静置孵育5min,将PCR管置于磁力架上3min;
7)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入40μl缓冲物A,涡旋混匀,放置5min;
4)将PCR管置于磁力架上,3min移除上清,向PCR管内加入200μl,80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清。
5)将PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清。
6)室温静置3-5min,使残留乙醇彻底挥发;
7)加入22ul的重悬NFH2O,把PCR管从磁力架取下,轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡,室温静置5min;
8)将PCR管置于磁力架上2min;
9)用移液器吸取20μl上清液,用于下一步的PCR扩增。
2.1.4Pre-PCR反应
表-4:Pre-PCR反应体系
2.1.4.1使用移液器轻轻吹混匀,然后短暂离心;
2.1.4.2将样品置于PCR仪上,启动PCR程序,如下:
Heat lid 100℃
95℃维持45s
12循环(98℃维持15s;60℃维持30s;72℃维持30s)
72℃维持1min
4℃保持
2.1.4.3PCR扩增后纯化
1)向PCR产物中加入50μl AMPure XP磁珠,用移液器吹打混匀,避免产生气泡;
2)室温孵育5-min,把PCR管置于磁力架上3min;
3)移除上清,PCR管继续放置在磁力架上,向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s;
4)移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%乙醇溶液,静置30s后彻底移除上清。
5)室温静置5min,使残留乙醇彻底挥发;
6)加入25ulNFH2O,将离心管从磁力架取下,使用移液器,轻轻吸打重悬磁珠;
7)室温静置5min,将200μl PCR管置于磁力架上2min;
8)用移液器将上清液转移到新的200μl PCR管中(置于冰盒上),在反应管上标记好样本号,准备下一步反应;
2.2样品、探针杂交
按照以下体系将样品文库与Hyb block混匀标记为B
表-5:杂交体系
2.2.1将准备好的样品和Hyb Block混合物放入真空浓缩离心机,打开PCR管盖,启动离心机,打开真空泵开关,开始浓缩;
2.2.2将抽干的样品重新溶在9ulNFH2O中待用;
2.2.3将Hyb缓冲物置于室温融化,未加热前会有沉淀出现,混匀后置于65℃水浴锅内预热,完全溶解后取20ulHyb缓冲物置于新的200μlPCR管内,盖好管盖,标记为A,继续置于65℃水浴锅内孵育待用;
2.2.4取5ul RNase Block与2ul Probe置于200μlPCR管内,轻轻吸打混匀,短暂离心后置于冰上待用,标记为C;
2.2.4.1设置PCR仪参数,heat lid 100℃,95℃,5min;65℃,保持;
2.2.4.2将PCR管B置于PCR仪上,运行以上程序;
2.2.4.3PCR仪温度降至65℃时,将PCR管A置于PCR仪上孵育,盖上PCR仪热盖;
2.2.4.4 5min后,将C置于PCR上孵育,盖上PCR仪热盖;
2.2.4.5将PCR管C放置入PCR仪2min后,把移液器调至13ul,从PCR管A中吸取13ulHyb缓冲物移至PCR管C中,吸取全部PCR管B中样品移至PCR管C中,轻轻吸打10次,充分混匀,避免产生大量气泡,密封管盖,盖上PCR仪热盖,65℃孵育过夜(8-16h)。
2.2.5捕获磁珠准备
2.2.5.1将磁珠(DynabeadsMyOne Streptavidin T1 magnetic beads)从4℃取出,涡旋震荡重悬;
2.2.5.2取50ul磁珠置于新的PCR管内,置于磁力架上1min,移除上清;
2.2.5.3从磁力架上取下PCR管,加入200μL Binding缓冲物轻轻吸打数次混匀,重悬磁珠;
2.2.5.4置磁力架上1min,移除上清;
2.2.5.5重复步骤3-4两次,共清洗磁珠3次;
2.2.5.6从磁力架上取下PCR管,加入200μL Binding缓冲物轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
2.2.5捕获目标区域DNA文库
2.2.5.1保持杂交产物PCR管C在PCR仪上,将步骤Step8中第6步重悬后的200μLMyOne T1 magnetic beads加入到杂交后的产物PCR管C中,用移液器吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上室温结合30min;
2.2.5.2将PCR管置于磁力架上2min,移除上清液;
2.2.5.3向PCR管C内加入200μL的洗涤缓冲物1,轻轻吸打6次混匀,置于旋转混匀仪上清洗15min,然后短暂离心,将PCR管放于磁力架上2min,移除上清;
2.2.5.4加入200ul的65℃预热的洗涤缓冲物2,涡旋混匀5s,置于ThermoMixer上65℃孵育10min,转速800转/min进行清洗;
2.2.5.5短暂离心,将PCR管放于磁力架上2min,移除上清。重复洗2次清洗,共计3次。最后一次彻底移除除洗涤缓冲物2(可用10ul移液器移除残留);
2.2.5.6PCR管继续置于磁力架上,向PCR管内加入200ul 80%乙醇,静置30s后彻底移除乙醇溶液(可用10ul移液器移除残留),室温晾干2min;
2.2.5.7向PCR管加入20μL Nuclease-free water,从磁力架上取下PCR管,轻轻吸打6次重悬磁珠待用。
2.2.6 PCR后反应
2.2.6.1捕获后需要对DNA文库进行富集,根据下表配制Mix
表-6:Post-PCR反应体系
2.2.6.2将移液器调至35ul,轻轻吸打混匀6次,然后置于PCR仪上。
2.2.6.3运行PCR仪程序:
Heat lid 100℃
95℃维持4min
15循环(98℃维持20s;65℃维持30s;72℃维持30s)
72℃维持5min
12℃保持
2.2.6.4 PCR结束后向样品加入45μl Agencourt AMPure XP磁珠,用移液器轻轻吸打6次混匀;
2.2.6.5室温孵育5min,把PCR管置于磁力架上3min;
2.2.6.6移除上清,PCR管继续置于磁力架上,加入200μl 80%无水乙醇,静置30s;
2.2.6.7移除上清,再向PCR管内加入200μl 80%无水乙醇,静置30后彻底移除上清(可用10ul移液器移除底部残留酒精);
2.2.6.8室温放置5min,使得残留乙醇彻底挥发;
2.2.6.9加入25ul Nuclease-free water,将PCR管从磁力架拿下,轻轻吹打混匀重悬磁珠,室温放置2min;
2.2.6.10将PCR管置于磁力架上2min;
2.2.6.11用移液器吸23μl上清液转移到1.5ml离心管,标记样品信息;
3.NGS上机测序
3.1采用Illumina高通量测序仪Hiseq 4000,对测序文库进行上机测序,得到遗传代谢病相关致病基因的测序数据;
3.2利用BWA MEM软件,将测序数据与到人类参考基因组HG19进行比对,所用的参数为:bwa mem-M-k 40-t 8-R"@RG\tID:Hiseq\tPL:Illumina\tSM:sample",从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失,即所检测到的基因突变。
3.3采用samtools-1.2软件中的samtools stats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值,接着再用软件中的samtools depth工具,计算目标区域每个位置的测序深度;
3.4用比对到目标区域的数据量除以总数据量,获得捕获效率;
3.5根据目标区域每个位置的测序深度,分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量,再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量,从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。
4.实验结果及分析:
对于α和β非缺失型地中海贫血设计探针
按照1-4层探针策略设计探针即针对CDS上同一个碱基位置上有1-4层探针覆盖,除了5‘端和3’端,其它区域是按照2层探针进行设计,下面以2层为例进行探针设计,设计方案如下:这样每紧挨着的两条探针之间都会有探针长度/2=30-70nt,并将这个值叫做overlap。当有一根探针长度的CDS上探针层数都是2,这样设计的结果,保证了该区域除5‘端和3‘端都至少有2根探针,也就是整个CDS上至少有5根探针,对应的CDS长度至少为:探针长度/2*(5-1)+探针长度nt=180-420nt,优选探针的长度为100nt。对于α和β缺失型地中海贫血设计探针,碱基缺失数在30kb-100kb,按照每间隔5kb设置一根探针,碱基缺失数在100kb-300kb,按照每间隔10kb设置一根探针,这样设计不但可以最大限度地检测到缺失突变,而且在很大程度上节约了探针合成的成本。
(1)缺失突变检测探针集
针对α和β缺失型地中海贫血设计探针种类为1500条,为了让检测点突变、拷贝数变异和大片段缺失等探针集更好地相互兼容,更好地对中国人群中常见的这些大片段缺失进行检测,我们筛选出来了这80条探针序列。利用这80条探针,可以与68条非缺失突变的检测探针结合,在实施例中的500例病例中,可以最大程度地检测到SEA、3.7Kb、THAI、FIL、2.7Kb、HW、11.1Kb和2.4Kb缺失型突变。其检测到突变点信息与已确定突变信息的病例一致。
表-7:检测缺失突变的探针集
(2)非缺失突变检测探针集
针对α和β非缺失型地中海贫血设计探针种类为4500条,为了让检测点突变、拷贝数变异和大片段缺失等探针集更好地相互兼容,更好地对中国人群中常见的这些基因突变类型进行检测,我们筛选出来了这68条探针序列。利用这68条探针,可以与80条缺失突变的检测探针结合,在实施例中的500例已知突变信息的病例中,通过设计的组合探针集可以最大程度地检测到HBA1、HBA2、HBB、HBG1、HBG2、HBE1和BCL11A上的非缺失突变,其检测到突变点信息与已确定突变信息的病例一致。对于探针SEQ ID NO.81-148涉及的点突变位点,发明人还设计了被突变碱基替换的探针。这些探针的加入,可以对检测结果有更清晰的比较、判断。
表-8:检测非缺失的探针集
本领域技术人员可以理解,对于所述缺失突变检测探针集和非缺失突变检测探针集,可以根据需要仅选取一部分使用,而不是测定所有所述突变。
相关序列:SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.148的序列。
序列表
<110> 广西识远医学检验实验室有限公司
<120> 一组用于检测地中海贫血的探针及相关试剂盒和应用
<130> CF190747S
<160> 148
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
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cctggggttc acttgggggg cgccttgggg aggttctagc c 101
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<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
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<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
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gctgaggaaa gagtgggacc ttggaggtct ccaaaccctg a 101
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<211> 101
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
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ggagagctgg gggtgtcaca gtgaaccacg acctctaggc c 101
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<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 8
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<211> 101
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<400> 9
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<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 10
gagcaggctg aagggtgctg acctgatgca ctcctcaaag caagatcttc tgccagaccc 60
ccaggaaatg acttatcagt gatttctcag gctgttttct c 101
<210> 11
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 11
tccggggtgc acgagccgac agcgcccgac cccaacgggc cggccccgcc agcgccgcta 60
ccgccctgcc cccgggcgag cgggatgggc gggagtggag t 101
<210> 12
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 12
aataaagtct gagtgggcgg cagcctgtgt gtgcctgagt tttttccctc agcaaacgtg 60
ccaggcatgg gcgtggacag cagctgggac acacatggct a 101
<210> 13
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 13
attgcagcac tttgccaggc ttaggcaggt ggatcacctg aagtcagggg ttcgagacca 60
gcctagccaa catagtgaaa ccctgtctct actaaaaaga c 101
<210> 14
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 14
ataaatgaga aaacagactc gggcaagtgt cacaatagaa tcaagaggca gaataaactg 60
acttccaatg ccaaatccat gccgaaattc agtgctataa t 101
<210> 15
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 15
tcgccgcagc tcctgggcca ctgcctgctg gtaaccctcg cccggcacta ccccggagac 60
ttcagccccg cgctgcaggc gtcgctggac aagttcctga g 101
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 16
atgcttttcc tcagaaatgg tattctcaag gtgacactga ggaaaagtgg acaggccggg 60
cgcggtggct cacgcctgta atcccagcac tccgggaggc c 101
<210> 17
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 17
ctcagactcc tgtaactagg tgtggacacc ctcctgggat tacatctgga gcatcactga 60
aggtggaaga gccagaccgc atcctccctg gagatgtgga g 101
<210> 18
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 18
aaaaaagttc catcctggcc aacgtggttc tggctccagg ctgccacccc tcccccaaag 60
gatgccaccc cagatagggg tcctcggcct gctccagcac c 101
<210> 19
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 19
caggagttcc caagaatatc ctgagcaaca tagtgagacc tgtctccaca aaaacataaa 60
aaattagcca agtgtggtag tgcacaccta tgtcccagtt a 101
<210> 20
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 20
ccagccaatg agcgccgccc ggccgggcgt gcccccgcgc cccaagcata aaccctggcg 60
cgctcgcggg ccggcactct tctggtcccc acagactcag a 101
<210> 21
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 21
aaatctccct ggttgaaccc agttaacata cgctctccat caaaacaaaa cgaaacaaaa 60
caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt g 101
<210> 22
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 22
agagggtggc agacagggag gggaaatgag aagatccaac gggggaagca ttgctaagct 60
ggtcggagct acttccttct ctgcccaagg cagcttaccc t 101
<210> 23
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 23
ccccaggatt gggcgaagcc tcccggctcg cactcgctcg cccgtgtgtt ccccgatccc 60
gctggagtcg atgcgcgtcc agcgcgtgcc aggccggggc g 101
<210> 24
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 24
cacaagcttc gggtggaccc ggtcaacttc aaggtgagcg gcgggccggg agcgatctgg 60
gtcgaggggc gagatggcgc cttcctcgca gggcagagga t 101
<210> 25
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 25
taatacagaa aggtaaagaa attagaatag ccaaagaaat tttgaaaagg aagaataaag 60
cgagaggaat cacattcctc aatttttaac agctctattg a 101
<210> 26
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 26
tactatttcc tgatttcaga acgatcagga cgaagagggg agggatgggc gtctgcgctc 60
actcattcct tcttccattc ctcaatgaaa catttactgg g 101
<210> 27
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 27
ctggacggct tgtggggcac aggctgtgag aggtgcccag gacggcttgt ggggcacagg 60
ctgtgagggt gcccgggacg gcttgtgggg cacaggttgt g 101
<210> 28
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 28
cccccagctc ctgtcccact gcctgctggt caccctggcc gcgcgcttcc ccgccgactt 60
cacggccgag gcccacgccg cctgggccaa gttcctatcg g 101
<210> 29
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 29
ctctgggacc tcctggtgct tctgcttcct gtgctgccag caacttctgg aaacgtccct 60
gtccccggtg ctgaagtcct ggaatccatg ctgggaagtt g 101
<210> 30
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 30
gggcctgagt aagggcctgg ggagacaggg cagggagcag gctgaagggt gctgacctga 60
tgcactcctc aaagcaagat cttctgccag acccccagga a 101
<210> 31
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 31
gctgtcggag attgagcgcg cgcggtcccg ggatctccga cgaggccctg gacccccggg 60
cggcgaagct gcggcgcggc gccccctgga ggccgcggga c 101
<210> 32
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 32
ctcctgggat tacatctgga gcatcactga aggtggaaga gccagaccgc atcctccctg 60
gagatgtgga ggttggaggg agctggccct ggctcaaggg c 101
<210> 33
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 33
tccctatcag atatatgatt tgcaaatatg tttctctcat tctgtgagac atcattcaat 60
tttaagacat cacagagcta tgttaatcaa ggcactgtgg c 101
<210> 34
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 34
ttgacctttg atttgtgtaa atattttaca ttatcaaaaa taaattcagg ctgggcatgg 60
tggctcatac ctgtagtcct agcactttgg gagtccaagg g 101
<210> 35
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 35
cgttgctaac atcctatcgc acgcatccct ctgcctcatg cacccaaccc caaggcctgg 60
tacactgcag gccccaaggt cctgtgcgtc ctttcaatac c 101
<210> 36
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 36
ggtcggtaga ggcggggtct ccgggagctc agggaggtgg agatgagggt tttgggcgcg 60
tgggccgcca acgccatcca aggtccttcg ggtgcggatc c 101
<210> 37
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 37
ctttattttt ttatttttat tattattatt tttttttttt tttttgtgac ggagtctcgc 60
tctgtcaccc aggctggagt gcagtggcac aatctcggct c 101
<210> 38
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 38
aggccggggc gggggtgcgg gctgactttc tccctcgcta gggacgctcc ggcgcccgaa 60
aggaaagggt ggcgctgcgc tccggggtgc acgagccgac a 101
<210> 39
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 39
gccccgggcg gcgggctgcg aggacggccg actctgccca tcccgagggc ggctggcttc 60
gccctcccca ctctgcgccg agcacgcggc ccggacccac c 101
<210> 40
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 40
gataaaggtt attatctcta ctacattaga tctccgggcg gggcatggtg gctcacgcct 60
gtaatcccag cactttggga agcagaggcc ggtagatcac c 101
<210> 41
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 41
tcagagagaa cccaccatgg tgctgtctcc tgccgacaag accaacgtca aggccgcctg 60
gggtaaggtc ggcgcgcacg ctggcgagta tggtgcggag g 101
<210> 42
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 42
catctttacg tttctgggca ctcttgtgcc aagaactggc tggctttctg cctgggacgt 60
cactggtttc ccagaggtcc tcccacatat gggtggtggg t 101
<210> 43
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 43
cacctatggc aggccctctg cctgcgtttg tgatgtcctt cccgcagcct gtgggtacag 60
tatcaactgt caggaagacg gtgtcttcgt tatttcatca g 101
<210> 44
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 44
aggcgtggcg caggcgcaga gacgcacgcc tacgggcggg ggttgggggg gcgtgtgttg 60
caggagcaaa gtcgcacggc gccggcctgg gggcgggggg t 101
<210> 45
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 45
gtctacagag gcaggcaggc ctccttgagc tgtggtgggt tccacccagt tcaagcttcc 60
cagccacttt gtttacctac tcaagcctca gcaatggcgg g 101
<210> 46
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 46
tgtcgtcagc tgcccagact cctgacagtc acatctacca ccttggggaa agagggagac 60
tctgccaaga gccagatgcc cggttcatgg ttcaaattat a 101
<210> 47
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 47
ggctgcagtg agctgggatt gcgttggaac aggaattaaa agaaattaaa gaatgtgtaa 60
gcagaaactc agttgtatgt aagaaaaccc agttcccctg a 101
<210> 48
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 48
ttcaagatga gattagggtg gagacacagc caaaccatat caaacagaaa gaacatactt 60
ttttccttag actcttattt ttattaatct actcatcatt g 101
<210> 49
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 49
gcgctcgcgc gccgagcgaa tgaagctgtg cacctgcggg tcctggcgca tgcagggcga 60
aaacttggcg cccaggtgga tgagggcctc ctgcgggcga gggagacga 109
<210> 50
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 50
ggcctgcttg tgcaacggag gccacccagc cagtgaaagc tacttggaag ggctgggaaa 60
gggtctgagg ccccttcaat ctggcaccac cagactccca t 101
<210> 51
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 51
tgatcagaaa tttgggatgg aaaaggaaac aatgagaaaa gggctgtggg aacctcctct 60
ccagagtggt agttgggccc ccccagtgtg cccccatgga g 101
<210> 52
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 52
ttcccagcac tggagcccag gcagaacctg gctgacctag gccccttgac aaggcctgga 60
gcaaccactc agtcatggcc tggaaaagcc actccgttat c 101
<210> 53
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 53
ccaaacatag caacaccatc ccagtttcct tatttctttc acagtccact ttaaaccatc 60
agcaaatccc atctgctcca cctgcaggga tgtccaaaat c 101
<210> 54
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 54
ttgggttttt ttcggtagag gcaggatttc accatgttgc ccacactgat cctgaattcc 60
cgagctcaag caatctacct gcctcagcct ccctaagtgc t 101
<210> 55
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 55
aaaaaaaaaa cagtcacatt gacttagtgg ctgttcatgg agccctctga ggcagccagc 60
agggtggtag ttagccattg tttatctgag caaatctggc c 101
<210> 56
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 56
tggggtgctg tagcaatttc ttaaaataag acaacaatga cctctgctac atctatcaat 60
ttactcttcc tttcatgaaa gatttctctg tcgtacggga c 101
<210> 57
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 57
ctcccaggtt cacaccattc tcctgcctca gcctccccag tagctgagac tacaggcgcc 60
cgccaccacg tccggctaat ttttttgtat ttttagtaga g 101
<210> 58
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 58
tgaaaataca aaaattagcc agagatgatg ccgggtgcct gtaatcccag ctactcatga 60
ggctgaggca gaagaatcac ttgaaccagg gagtcagagg t 101
<210> 59
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 59
tcatgccacc acactccagt ctgggagaca gagcaagact ccatctcaga aacaaactaa 60
caaacaaaat ttttatatct acctataatt cgtataaatt t 101
<210> 60
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 60
ttccttcccg gtgcctgtca ctcaagcaca ctagtgacta tcgccagagg gaaagggagc 60
tgcaggaagc gaggctggag agcaggaggg gctctgcgca g 101
<210> 61
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 61
cggagcctgc agtgagccaa gattgcgcca ctgcactcca gcctgggcga cagagtgaga 60
ctccgtctca gaaaaaataa aaataaaaat aaaaattagc t 101
<210> 62
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 62
ctgcgctggg acgtgttttg ttttgttttg ttggactgaa tatgctgttt actttttttt 60
tttttttttt tggttgagat ggagtctctg ttgcccaggc t 101
<210> 63
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 63
tatactggac aactgtaaga caggaaaact acatacaatc agaactggtc tcatgtggta 60
tattaaaaac agctttgaaa tgagcccata tatgttgttt t 101
<210> 64
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 64
gctcttgttg cccagactgt agtgcaatct cggctcaccg caacctccgc ctcccaggtt 60
caagcgattc tcctgcctca gcctcccaag gagctggaat t 101
<210> 65
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 65
ctgccagcga cctggagccc acgctgattc cagccctccg ccgactccac agttcgcgga 60
ggggcacgga gccgcggcgc ccgccgggga ggaagtagca g 101
<210> 66
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 66
actaaaatct atccatgctt tcacacacac acacacacac acacacacac accctttttt 60
gtgttactta aagtaggaga gtgtctctct ttcctgtctc c 101
<210> 67
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 67
catcccctca cctacattct gcaaccacag gggccttctc tcccctgtcc tttccctacc 60
cagagccaag tttgtttatc tgtttacaac cag 93
<210> 68
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 68
agaaggtggc cgacgcgctg accaacgccg tggcgcacgt ggacgacatg cccaacgcgc 60
tgtccgccct gagcgacctg cacgcgcaca agcttcgggt g 101
<210> 69
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 69
tttgtaaggt gcattcagaa ctcactgtgt gcccagccct gagctcccag ctaattgccc 60
cacccagggc ctctgggacc tcctggtctt ctgcttcctg t 101
<210> 70
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 70
actcctgcac ctcccaccct tccccagaag tccacccctt ccttcctcac cctgcaggag 60
ctggccagcc tcatcacccc aacatctccc cacctccatt c 101
<210> 71
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 71
aggggaggcc gagcccgccg cccggccccg cgcaggcccc gcccgggact cccctgcggt 60
ccaggccgcg ccccgggctc cgcgccagcc aatgagcgcc g 101
<210> 72
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 72
agtccagctg gaaaaacgct ggaccctaga gtgctttgag gatgcatttg ctctttcccg 60
agttttattc ccagactttt cagattcaat gcaggtttgc t 101
<210> 73
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 73
tactaaaaag acaaaaattg tccaggtgtg atgactcatg cctgtaaacc tggcactttg 60
ggaggcggag gttgtagtga gtcaagatcg cgccatcgca ct 102
<210> 74
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 74
caatagaatc aagaggcaga ataaactgac ttccaatgcc aaatccatgc cgaaattcag 60
tgctataata atgtacatgg ccgggcgcgg tggttcacgc c 101
<210> 75
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 75
tggtaaccct cgcccggcac taccccggag acttcagccc cgcgctgcag gcgtcgctgg 60
acaagttcct gagccacgtt atctcggcgc tggtttccga g 101
<210> 76
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 76
acacgcggca aactgtgtca tgtgtaaaca agaacaggac atggctgtca tatccaagag 60
cacatgtgta acacagacat gccacacaca cacacacaca c 101
<210> 77
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 77
tgaatctgga gccgccccca gcccagcccc gtgctttttg cgtcctggtg tttattcctt 60
cccggtgcct gtcactcaag cacactagtg actatcgcca g 101
<210> 78
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 78
cgcacaagct tcgggtggac ccggtcaact tcaaggtgag cggcgggccg ggagcgatct 60
gggtcgaggg gcgagatggc gccttcctcg cagggcagag g 101
<210> 79
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 79
attgcgactg gagaggagag cggggccaca gaggcctggc tagaaggtcc cttctccctg 60
gtgtgtgttt tctctctgct gagcaggctt gcagtgcctg g 101
<210> 80
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 80
atcagaggga gggttcccgg agctggtagc cataaagccc tggccctcaa ctgataggaa 60
tatcttttat tccctgagcc catgaatcac ccttggtaaa c 101
<210> 81
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 81
aggtggccga cgcgctgacc aacgccgtgg cgcacgtgga cgacatgccc aacgcgctgt 60
ccgccctgag cgacctgcac gcgcacaagc ttcgggtgga c 101
<210> 82
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 82
ctgaccaacg ccgtggcgca cgtggacgac atgcccaacg cgctgtccgc cctgagcgac 60
ctgcacgcgc acaagcttcg ggtggacccg gtcaacttca a 101
<210> 83
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 83
gccctcggcc ccactgaccc tcttctctgc acagctccta agccactgcc tgctggtgac 60
cctggccgcc cacctccccg ccgagttcac ccctgcggtg c 101
<210> 84
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 84
tcttctggtc cccacagact cagagagaac ccaccatggt gctgtctcct gccgacaaga 60
ccaacgtcaa ggccgcctgg ggtaaggtcg gcgcgcacgc t 101
<210> 85
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 85
tcaaggccgc ctggggtaag gtcggcgcgc acgctggcga gtatggtgcg gaggccctgg 60
agaggtgagg ctccctcccc tgctccgacc cgggctcctc g 101
<210> 86
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 86
ctggcgagta tggtgcggag gccctggaga ggtgaggctc cctcccctgc tccgacccgg 60
gctcctcgcc cgcccggacc cacaggccac cctcaaccgt c 101
<210> 87
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 87
ccctcaaccg tcctggcccc ggacccaaac cccacccctc actctgcttc tccccgcagg 60
atgttcctgt ccttccccac caccaagacc tacttcccgc a 101
<210> 88
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 88
acttcccgca cttcgacctg agccacggct ctgcccaggt taagggccac ggcaagaagg 60
tggccgacgc gctgaccaac gccgtggcgc acgtggacga c 101
<210> 89
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 89
tgagccacgg ctctgcccag gttaagggcc acggcaagaa ggtggccgac gcgctgacca 60
acgccgtggc gcacgtggac gacatgccca acgcgctgtc c 101
<210> 90
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 90
ctcctaagcc actgcctgct ggtgaccctg gccgcccacc tccccgccga gttcacccct 60
gcggtgcacg cctccctgga caagttcctg gcttctgtga g 101
<210> 91
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 91
gcccacctcc ccgccgagtt cacccctgcg gtgcacgcct ccctggacaa gttcctggct 60
tctgtgagca ccgtgctgac ctccaaatac cgttaagctg g 101
<210> 92
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 92
gggaaagaaa acatcaagcg tcccatagac tcaccctgaa gttctcagga tccacgtgca 60
gcttgtcaca gtgcagctca ctcagtgtgg caaaggtgcc c 101
<210> 93
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 93
tcaccctgaa gttctcagga tccacgtgca gcttgtcaca gtgcagctca ctcagtgtgg 60
caaaggtgcc cttgaggttg tccaggtgag ccaggccatc a 101
<210> 94
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 94
gaggttgtcc aggtgagcca ggccatcact aaaggcaccg agcactttct tgccatgagc 60
cttcacctta gggttgccca taacagcatc aggagtggac a 101
<210> 95
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 95
cagatcccca aaggactcaa agaacctctg ggtccaaggg tagaccacca gcagcctaag 60
ggtgggaaaa tagaccaata ggcagagaga gtcagtgcct a 101
<210> 96
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 96
gggtccaagg gtagaccacc agcagcctaa gggtgggaaa atagaccaat aggcagagag 60
agtcagtgcc tatcagaaac ccaagagtct tctctgtctc c 101
<210> 97
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 97
ccacatgccc agtttctatt ggtctcctta aacctgtctt gtaaccttga taccaacctg 60
cccagggcct caccaccaac ttcatccacg ttcaccttgc c 101
<210> 98
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 98
cccagggcct caccaccaac ttcatccacg ttcaccttgc cccacagggc agtaacggca 60
gacttctcct caggagtcag atgcaccatg gtgtctgttt g 101
<210> 99
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 99
tgtttgaggt tgctagtgaa cacagttgtg tcagaagcaa atgtaagcaa tagatggctc 60
tgccctgact tttatgccca gccctggctc ctgccctccc t 101
<210> 100
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 100
tcaccatctt ctgccaggaa gcctgcacct caggggtgaa ttctttgccg aaatggattg 60
ccaaaacggt caccagcaca tttcccagga gctgttgaga t 101
<210> 101
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 101
tgggcaaagg tgcccttgag atcatccagg tgctttgtgg catctcccaa ggaagtcagc 60
accttcttgc catgtgcctt gactttgggg ttgcccatga t 101
<210> 102
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 102
cctcccttgt cctggtcacc agagcctacc ttcccagggt ttctcctcca gcatcttcca 60
cattcacctt gccccacagg cttgtgatag tagccttgtc c 101
<210> 103
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 103
ctggactttt gccaggcaca gggtccttcc ttccctccct tgtcctggtc accagagcct 60
accttcccag ggtttctcct ccagcatctt ccacattcac c 101
<210> 104
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 104
ccttgcccca caggcttgtg atagtagcct tgtcctcctc tgtgaaatga cccatggcgt 60
ctggactagg agcttattga taacctcaga cgttccagaa g 101
<210> 105
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 105
ctcactggat actctaagac tattggtcaa gtttgccttg tcaaggctat tggtcaaggc 60
aaggctggcc aacccatggg tggagtttag ccagggaccg t 101
<210> 106
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 106
gccagccgcc ggcccctggc ctcactggat actctaagac tattggtcaa gtttgccttg 60
tcaaggctat tggtcaaggc aaggctggcc aacccatggg t 101
<210> 107
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 107
ctggcctcac tggatactct aagactattg gtcaagtttg ccttgtcaag gctattggtc 60
aaggcaaggc tggccaaccc atgggtggag tttagccagg g 101
<210> 108
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 108
ggctggccaa cccatgggtg gagtttagcc agggaccgtt tcagacagat atttgcattg 60
agatagtgtg gggaaggggc ccccaagagg atactgctaa t 101
<210> 109
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 109
gagtttagcc agggaccgtt tcagacagat atttgcattg agatagtgtg gggaaggggc 60
ccccaagagg atactgctaa ttttttttat agcctttgcc t 101
<210> 110
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 110
cagacagata tttgcattga gatagtgtgg ggaaggggcc cccaagagga tactgctaat 60
tttttttata gcctttgcct tgttccgatt cagtcattcc a 101
<210> 111
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 111
gtttagccag ggaccgtttc agacagatat ttgcattgag atagtgtggg gaaggggccc 60
ccaagaggat actgctaatt ttttttatag cctttgcctt g 101
<210> 112
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 112
ttagccaggg accgtttcag acagatattt gcattgagat agtgtgggga aggggccccc 60
aagaggatac tgctaatttt ttttatagcc tttgccttgt t 101
<210> 113
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 113
gcaaggctgg ccaacccatg ggtggagttt agccagggac cgtttcagac agatatttgc 60
attgagatag tgtggggaag gggcccccaa gaggatactg c 101
<210> 114
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 114
actgctaatt ttttttatag cctttgcctt gttccgattc agtcattcca gtttttctct 60
aatttattct tccctttagc tagtttcctt ctcccatcat a 101
<210> 115
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 115
ggctattggt caaggcaagg ctggccaacc catgggtgga gtttagccag ggaccgtttc 60
agacagatat ttgcattgag atagtgtggg gaaggggccc c 101
<210> 116
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 116
tcagtggtat ctggaggaca gggcactggc cactccagtc accatcttct gccaggaagc 60
ctgcacctca ggggtgaatt ctttgccgaa atggattgcc a 101
<210> 117
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 117
caaaacggtc accagcacat ttcccaggag ctgttgagat gaaaggagac aataaagatg 60
aacccatagt gagctgagag ctccagcctg gcctccagat a 101
<210> 118
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 118
gttgtctaag ttgcctcgag actaaaggca acagtgctga aacatctcct ggactcacct 60
tgaagttctc aggatccaca tgcagcttgt cacagtgcag t 101
<210> 119
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 119
gtgctgaaac atctcctgga ctcaccttga agttctcagg atccacatgc agcttgtcac 60
agtgcagttc actcagctgg gcaaaggtgc ccttgagatc a 101
<210> 120
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 120
tcaaagaacc tctgggtcca tgggtagaca accaggagcc tgtgagattg acaagaacag 60
tttgacagtc agaaggtgcc acaaatcctg agaagcgacc t 101
<210> 121
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 121
acagtgctga aacatctcct ggactcacct tgaagttctc aggatccaca tgcagcttgt 60
cacagtgcag ttcactcagc tgggcaaagg tgcccttgag a 101
<210> 122
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 122
atctcctgga ctcaccttga agttctcagg atccacatgc agcttgtcac agtgcagttc 60
actcagctgg gcaaaggtgc ccttgagatc atccaggtgc t 101
<210> 123
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 123
tcctggactc accttgaagt tctcaggatc cacatgcagc ttgtcacagt gcagttcact 60
cagctgggca aaggtgccct tgagatcatc caggtgcttt a 101
<210> 124
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 124
cagcttgtca cagtgcagtt cactcagctg ggcaaaggtg cccttgagat catccaggtg 60
ctttatggca tctcccaagg aagtcagcac cttcttgcca t 101
<210> 125
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 125
cttgtcacag tgcagttcac tcagctgggc aaaggtgccc ttgagatcat ccaggtgctt 60
tatggcatct cccaaggaag tcagcacctt cttgccatgt g 101
<210> 126
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 126
gcagttcact cagctgggca aaggtgccct tgagatcatc caggtgcttt atggcatctc 60
ccaaggaagt cagcaccttc ttgccatgtg ccttgacttt g 101
<210> 127
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 127
gcccttgaga tcatccaggt gctttatggc atctcccaag gaagtcagca ccttcttgcc 60
atgtgccttg actttggggt tgcccatgat ggcagaggca g 101
<210> 128
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 128
gatcatccag gtgctttatg gcatctccca aggaagtcag caccttcttg ccatgtgcct 60
tgactttggg gttgcccatg atggcagagg cagaggacag g 101
<210> 129
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 129
catccaggtg ctttatggca tctcccaagg aagtcagcac cttcttgcca tgtgccttga 60
ctttggggtt gcccatgatg gcagaggcag aggacaggtt g 101
<210> 130
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 130
agggtccttc cttccctccc ttgtcctggt caccagagcc taccttccca gggtttctcc 60
tccagcatct tccacattca ccttgcccca caggcttgtg a 101
<210> 131
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 131
tcctggtcac cagagcctac cttcccaggg tttctcctcc agcatcttcc acattcacct 60
tgccccacag gcttgtgata gtagccttgt cctcctctgt g 101
<210> 132
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 132
ctggtcacca gagcctacct tcccagggtt tctcctccag catcttccac attcaccttg 60
ccccacaggc ttgtgatagt agccttgtcc tcctctgtga a 101
<210> 133
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 133
taggagctta ttgataacct cagacgttcc agaagcgagt gtgtggaact gctgaagggt 60
gcttcctttt attcttcatc cctagccagc cgccggcccc t 101
<210> 134
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 134
gcttattgat aacctcagac gttccagaag cgagtgtgtg gaactgctga agggtgcttc 60
cttttattct tcatccctag ccagccgccg gcccctggcc t 101
<210> 135
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 135
gctattggtc aaggcaaggc tggccaaccc atgggtggag tttagccagg gaccgtttca 60
gacagatatt tgcattgaga tagtgtgggg aaggggcccc c 101
<210> 136
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 136
attggtcaag gcaaggctgg ccaacccatg ggtggagttt agccagggac cgtttcagac 60
agatatttgc attgagatag tgtggggaag gggcccccaa g 101
<210> 137
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 137
ggctggccaa cccatgggtg gagtttagcc agggaccgtt tcagacagat atttgcattg 60
agatagtgtg gggaaggggc ccccaagagg atactgctgc t 101
<210> 138
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 138
agtttagcca gggaccgttt cagacagata tttgcattga gatagtgtgg ggaaggggcc 60
cccaagagga tactgctgct taattttttt tatagccttt g 101
<210> 139
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 139
tgtcagccgt ttttcacctt cttgtctgta gctccagtga ggcctgtagt ttaaagttaa 60
agcatgtacc aatttttgaa aagttcaggg attgtgaaat g 101
<210> 140
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 140
agaagtgcta tacttatctt tgaatatact ctctgtggtt ttaggccatt atctcttaag 60
ttctcattag tgtagtgaaa aatcctataa agcaacagtt t 101
<210> 141
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 141
agaaggcttt ctctcaaggc caagcccagt ccccatgtgc agaaggaggg tgtcagggtc 60
acaggaacac ctgcaaactg gaagagaact cagtggtact t 101
<210> 142
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 142
gctccccggg cggtgtggag aagcgcaaac tcccgttctc cgaggagtgc tccgacgagg 60
aggcaaaagg cgattgtctg gagtctccga agctaaggaa g 101
<210> 143
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 143
tcccgttctc cgaggagtgc tccgacgagg aggcaaaagg cgattgtctg gagtctccga 60
agctaaggaa gggatctttg agctgcctgg aggccgcgta g 101
<210> 144
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 144
ggggagcagc cgcggccatt aacagtgcca tcgtctatgc ggtccgactc gccggccacc 60
gagtcttcgt cgcaagtgtc cctgtggccc tcggcctcgg c 101
<210> 145
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 145
gcgccccgcg agctgttctc gtggtggcgc gccgcctcca ggctcagccc gaagccgtag 60
tccaccctct cgctctccgt cagctcctcc tcctcctctt c 101
<210> 146
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 146
cgctgcccac caagtcgctg gtgccgggtt ccggggagct ggcggtggag agaccgtcgt 60
cggacttgac cgtcatgggg gacgatttgt gcatgtgcgt c 101
<210> 147
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 147
ggcgctctat gcggtggggg tccaagtgat gtctcggtgg tggactaaac agggggggag 60
tgggtggaaa gcgcccttct gccaggccgg aagcctctct c 101
<210> 148
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(synthetic sequnce)
<400> 148
atgagtgttc tgtgcgtgtt gcaagagaaa ccatgcactg gtgaatggct gtttgcaagt 60
tgtacatgtg tagctgctgg gctcatcttt acctgcaaaa t 101
Claims (8)
1.一组用于检测地中海贫血的探针,所述探针包括选自如下的序列:SEQ ID NO.1-80。
2.根据权利要求1的探针,所述探针还包括选自如下的序列:SEQ ID NO.81-148。
3.根据权利要求1或2的探针,所述探针分别还包括这样的探针,即对于探针SEQ IDNO.81-148涉及的点突变位点被突变碱基替换的探针。
4.一种试剂盒,所述试剂盒包括根据权利要求1-3任一项的探针。
5.根据权利要求1-3任一项的探针或根据权利要求4的试剂盒在制备用于检测地中海贫血的检测试剂中的用途。
6.一种筛查受试者基因突变的方法,所述方法包括:
1)提取所述受试者的基因组DNA,打断至200-300bp的范围;
2)对上述打碎的基因组DNA进行DNA小片段文库的制备;
3)将DNA小片段文库和根据权利要求1-3任一项的探针进行杂交,进行基因的捕获;
4)对上述捕获后的产物进行扩增,得到扩增产物;
5)对步骤4)中获得的扩增产物进行上机测序,得到所述基因的测序数据;
6)将测序数据与到人类参考基因组进行比对,从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失,即所检测到的基因突变。
7.根据权利要求6的方法,所述人类参考基因组是HG19。
8.根据权利要求6或7的方法,在步骤2)中采用Illumina TruSeq DNA librarypreparation试剂盒,进行DNA小片段文库的制备。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910552541.8A CN110343756B (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 一组用于检测地中海贫血的探针及相关试剂盒和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910552541.8A CN110343756B (zh) | 2019-06-25 | 2019-06-25 | 一组用于检测地中海贫血的探针及相关试剂盒和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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