CN116769906B - 用于检测α-地中海贫血的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物领域，提供了用于检测α‑地中海贫血的试剂盒。用于检测α‑地中海贫血的试剂盒包括第一引物组，第一引物组包括SEQ ID NO.1‑20中的至少一对引物、SEQ ID NO.21‑40中的至少一对引物、SEQ ID NO.41‑50中的至少一对引物以及SEQ ID NO.51‑70中的至少一对引物。本申请提供的引物试剂盒能够满足同时对于‑α3.7、‑α4.2、‑‑SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα等α‑地中海贫血变异类型准确检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体地，涉及用于检测α-地中海贫血的试剂盒。
背景技术
地中海贫血（地贫）又称为海洋性贫血或珠蛋白合成障碍性贫血，是一种遗传性溶血性贫血病。它最早发现于地中海沿岸国家，因此得名。地贫在全球范围内广泛分布，尤其在我国南方地区较为高发。该疾病的病因是珠蛋白基因的缺失或突变，导致珠蛋白链的合成受阻。
地中海贫血患者的症状程度有所不同，轻度病例可能表现为贫血，而较为严重的患者可能在青少年时期因并发症而死亡，甚至有可能在宫内死亡。此外，地中海贫血还可能引发孕妇的妊高症、产时和产后大出血以及胎盘过早剥离等危险并发症。
在我国常见的α地贫缺失类型主要包括-α3.7、-α4.2和--SEA等，它们是由α珠蛋白基因族中同源序列不等交换的结果形成的。在珠蛋白基因族中，两个高度同源的重复单元包含X、Y和Z同源区。当发生同源Z区的重组交换时，一条染色体会缺失3.7kb，而另一条染色体则形成α珠蛋白基因的αααanti3.7三联体。同样地，同源X区的重组交换会导致一条染色体缺失4.2kb，而另一条染色体则形成α珠蛋白基因的αααanti4.2三联体。
β地贫分为重型、轻型和中间型三种。当β地贫杂合子同时携带α珠蛋白基因的三联体时，会加剧珠蛋白失衡的情况，使患者由无临床症状转变为中间型地贫。
此外，在αααanti3.7和αααanti4.2的基础上，进一步发生非平衡交叉可能产生多种复杂的基因重复序列。HKαα是由-α3.7型缺失和αααanti4.2三联体之间不平等交换重排而形成的一种α珠蛋白基因类型，同时含有-α3.7和anti4.2片段。虽然HKαα携带者同时具有-α3.7和anti4.2片段，但其血液学表型与正常个体无明显异常。
当前尚无理想的地中海贫血治疗方法，因此预防和监测对于控制和降低地贫的发病率至关重要。在孕期进行地贫筛查可以减少重症地贫胎儿的出生，这对于优生优育和降低地贫的发病率具有重要作用。
α-地贫的主要检测方法有：跨越断裂点PCR（Gap-PCR）技术，多重连接依赖性探针扩增（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）技术，Southern印迹杂交法等。
Gap-PCR是一种常用的分子诊断技术，广泛应用于缺失型地贫的检测。它的操作简便，基于引物的设计，通过在缺失区域两端设置一对引物来进行扩增反应。在正常情况下，这对引物会扩增出较长的片段，超出了缺失区域的范围。然而，当存在缺失区域时，由于缺失的存在，引物会特异性地扩增出缺失区域的片段。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR反应的扩增产物进行分析，可以检测到缺失型地贫的存在。
MLPA是一种高通量的核酸检测技术，用于定性和定量分析待测核酸中的靶序列。它的基本原理是利用简单的探针与待测核酸中的靶序列进行杂交，然后通过连接和PCR扩增的过程，生成扩增产物。这些扩增产物经过毛细管电泳分离，并使用相应的数据收集系统进行数据采集。最后，通过分析软件对采集的数据进行处理和解读，得出相应的结论。
Southern印迹杂交法可用于基因大片段缺失与重复的检测。该方法包括基因组DNA的消化、凝胶电泳分离、碱处理使DNA变性、转印到滤膜上，并使用标记的DNA探针与目标DNA进行杂交。通过显示杂交条带，可以观察到正常基因型和患者基因型之间不同大小的两条条带。
目前对α-地贫的检测，通常都只针对常见的缺失以及点突变，如-α3.7、-α4.2、--SEA和αCSα、αWSα、αQSα，对于αααanti3.7，αααanti4.2和HKαα的检测通常需要使用特殊的方法，并且检测难度较高，市面上没有一款针对以上所有突变类型同时检测的试剂盒或方法，并且现有的检测方法也存在一定的问题。Gap-PCR只能对常见的缺失类型进行检测，可能会将HKαα携带者错误诊断为-α3.7型缺失携带者，不能用于非缺失型突变的检测。MLPA检测成本高，操作繁琐，耗时较长，且需要特殊的仪器设备，一般只用于研究使用，不适合筛查方法的推广应用。Southern印迹杂交法操作繁琐，整个流程需要8-10天，且对DNA的用量大，存在潜在的放射性污染。
发明内容
本申请提供了一种二代测序检测α-地中海贫血的试剂盒及使用方法，该试剂盒和方法可以同时对-α3.7、-α4.2、--SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα进行检测，解决了目前不能同时对以上α-地中海贫血变异类型进行检测的问题，从而达到降低检测成本，减少操作复杂度，缩短检测周期的目的。
本申请提供了一种用于检测α-地中海贫血的试剂盒，包括：第一引物组，所述第一引物组包括SEQ ID NO.1-20中的至少一对引物、SEQ ID NO.21-40中的至少一对引物、SEQID NO.41-50中的至少一对引物以及SEQ ID NO.51-70中的至少一对引物。
在一些实施例中，所述第一引物组包括五组引物，所述五组引物均包括SEQ IDNO.1-20中的两对引物、SEQ ID NO.21-40中的两对引物、SEQ ID NO.41-50中的一对引物以及SEQ ID NO.51-70中的两对引物，并且所述五组引物彼此之间不包括相同的引物。如此，五组引物分别对应于5个引物池，可以便利地取用，提高单个位点/区域内覆盖度的准确性。
在一些实施例中，所述五组引物分别放置在不同的容器中。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括第二引物，所述第二引物包括SEQ ID NO.71-78。
本申请提供的引物试剂盒和方法能够满足同时对于-α3.7、-α4.2、--SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα等α-地中海贫血变异类型准确检测的需求。本申请采用巧妙的引物设计，结合二代测序的方法，解决了多种α-地贫复杂变异必须使用非二代测序的特殊检测方式的问题，对于多种α-地贫变异类型的基因检测，无需采用多种不同的检测手段，显著提高了处理样本的效率，节约了运行成本。利用本发明提供过的引物和方法，检测成本低，操作简单，检测周期短，并且分析简单。
附图说明
图1示出了各种地中海贫血类型对应的基因变化情况及引物设计区域。
图2示出了各种地中海贫血类型的判断示意图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在本申请中，除非特别说明，采用的试剂均为常规商购试剂。
本发明基于巧妙的引物设计，结合二代测序和数据分析，同时检测-α3.7、-α4.2、--SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα，并且该方法为常规的扩增子二代测序，成本低、操作简单、检测周期短。
本发明的方法包含主要3个步骤，分别为引物设计、扩增子测序和数据分析。
1.引物设计：在珠蛋白基因族中，两个高度同源的重复单元包含X、Y和Z同源区，其中，HBA2基因和HBA1基因位于Z同源区内，包含3个差异位点，X、Y、Z同源区域之间为特异序列，由于不同的α-地贫除了HBA2基因和HBA1基因在拷贝数上有区别外，也会连同X、Y、Z之间的特异序列一起缺失/重复，因此，引物设计的方法为：1.将二代测序的引物设计在X、Y同源区域之间的特异序列上，分别扩增HBA2和HBA1上游的特异序列；2.将二代测序引物设计在HBA2和HBA1基因内的差异位点上下游，分别扩增HBA2和HBA1基因的差异序列；3.将二代测序引物设计在HBA2和HBA1基因内的同源区域内，同时扩增HBA2和HBA1基因的同源序列；4.引物设计在HBA2和HBA1基因所有外显子区域，以扩增热点突变以及新发突变。
如图1所示，正常人的单倍型包含一个HBA2特异片段、一个HBA2基因、一个HBA1特异片段和一个HBA1基因；-α3.7缺失了从HBA2到HBA1基因之间的序列，形成一个融合的HBA2/HBA1基因，因此，具有一个HBA2特异片段拷贝和一个HBA基因拷贝；-α4.2缺失了HBA2特异片段和HBA2基因，因此，具有一个HBA1特异片段拷贝和一个HBA1基因拷贝；--SEA缺失了所有特异片段和HBA基因，因此没有特异片段和HBA基因拷贝；αααanti3.7增加了从HBA2到HBA1基因之间的序列，因此，具有1个HBA2特异片段拷贝、2个HBA2基因拷贝、2个HBA1特异片段拷贝和1个HBA1基因拷贝；αααanti4.2增加了HBA2特异片段和HBA2基因，因此，具有2个HBA2特异片段拷贝、2个HBA2基因拷贝、1个HBA1特异片段拷贝和1个HBA1基因拷贝；HKαα为-α3.7型缺失和αααanti4.2三联体的融合，因此，具有2个HBA2特异片段拷贝、2个HBA2基因拷贝和1个HBA1基因拷贝。
当不同的单倍型进行组合时，能得到对应的片段拷贝数，从而确定受试者基因型。
2.扩增子测序：以提取的人基因组DNA为模板，以上述设计的PCR引物中的至少一种多重引物组合进行一个或多个引物池的多重PCR平行扩增得到含有HBA2基因和HBA1基因上游X、Y同源区域之间特异序列，HBA2基因和HBA1基因内差异序列，HBA2基因和HBA1基因同源序列，以及全部HBA2基因和HBA1基因外显子区域的PCR产物文库。所述的多重引物上下游5’端均带有通用序列，将一个或多个引物池的扩增产物进行混合后使用磁珠对扩增产物进行纯化，以纯化后的产物为模板，进行第二次PCR扩增，第二次扩增引物为含有上述多重引物5’端的通用序列、测序接头序列以及区分不同样本的标签序列，第二次扩增后的产物再次经过磁珠纯化后得到测序文库。
3.数据分析：通过测序数据分析HBA2基因和HBA1基因上游X、Y同源区域之间特异序列（HBA2 unique和HBA1 unique），HBA2基因和HBA1基因内差异序列（以含有2号内含子2个差异位点区分）以及HBA2基因和HBA1基因同源序列各自的拷贝数，判断样本是否有-α3.7、-α4.2、--SEA、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα的携带（图2），通过分析HBA2基因和HBA1基因外显子区域，判断是否有αCSα、αWSα、αQSα突变或其他新发突变。
下面就结合具体实施例对本申请的技术方案进行详细说明。本申请设计的引物序列如下：
HBA2上游X、Y同源区域之间特异序列引物如表1所示：
表1
| SEQ ID NO. | 正向引物 | SEQ ID NO. | 对应反向引物 |
| 1 | GGAGAGTGTCTCTCTTTCCTGTCT | 11 | GCAGGGGAGACACTTCACTGA |
| 2 | CTGTCTCCTCACACCCACCC | 12 | GCAGGGGAGACACTTCACTGA |
| 3 | CCCAGAAGAGACCAAAATGAAGGG | 13 | ATGAACTGGCTGAAAGGGATGC |
| 4 | AATGAAGGGTTTGGAACTCAGCC | 14 | GGGAGACACTTCACTGAGAATAGGA |
| 5 | CCCATCCCATGCTGAGGGAA | 15 | ATGAACTGGCTGAAAGGGATGC |
| 6 | AGACAGAGTTTCACTGCATTAGCG | 16 | CACAGCACTCTAGCCTGACGA |
| 7 | TCGATCTCCTGACCTCGCATC | 17 | TCCTTTGAACCAGGGAGTTGGA |
| 8 | CTCGCATCTGCCCGCCTC | 18 | TCCTTTGAACCAGGGAGTTGGA |
| 9 | TCCAACTCCCTGGTTCAAAGGA | 19 | GTGATGGTTTGGCCAGGCTC |
| 10 | TCCAACTCCCTGGTTCAAAGGA | 20 | CCCTGCTCATGAAAAGTGATGGT |
HBA1上游X、Y同源区域之间特异序列引物如表2所示：
表2
| SEQ ID NO. | 正向引物 | SEQ ID NO. | 对应反向引物 |
| 21 | CACTCCAGCCTGGAAAACAACA | 31 | TGGGTGTCCAGGAGCAAGC |
| 22 | TTTTCCTTCAGGCTGTGGGC | 32 | TGGGTGTCCAGGAGCAAGC |
| 23 | AGGGAGGGGAAATGAGAAGATCC | 33 | TGCATCAGGTCAGCACCCTT |
| 24 | CGGAGCTACTTCCTTCTCTGC | 34 | TCACTGATAAGTCATTTCCTGGGG |
| 25 | GCCCAAGGCAGCTTACCCT | 35 | ATCACTGATAAGTCATTTCCTGGGG |
| 26 | CCCCAGGAAATGACTTATCAGTGATT | 36 | CCTGCAGGGTGAGGAAGGAA |
| 27 | TGATTTCTCAGGCTGTTTTCTCCTC | 37 | AGATGTTGGGGTGATGAGGCT |
| 28 | TTTCATGCACAGGGATGCACC | 38 | CAGAGGAGACAAGGGCCCTG |
| 29 | CCTTCCTCACCCTGCAGGAG | 39 | GTTAGTCTGAGGGCTTCCTGGA |
| 30 | TCACCCCAACATCTCCCCAC | 40 | AGGGTTAGTCTGAGGGCTTCC |
HBA2和HBA1基因内的差异位点引物如表3所示：
表3
| SEQ ID NO. | 正向引物 | SEQ ID NO. | 对应反向引物 |
| 41 | GGTTAAGGGCCACGGCAAG | 46 | GCCTGCGCTACACCTCCC |
| 42 | GTGGACGACATGCCCAACG | 47 | GCCTGCGCTACACCTCCC |
| 43 | ACCCGGTCAACTTCAAGGTGA | 48 | TTGTCCAGGGAGGCGTGC |
| 44 | CCGGGAGCGATCTGGGT | 49 | TGCTCACAGAAGCCAGGAACT |
| 45 | GCAGAGGATCACGCGGGT | 50 | TGCTCACAGAAGCCAGGAACT |
HBA2和HBA1基因内同源序列引物如表4所示：
表4
| SEQ ID NO. | 正向引物 | SEQ ID NO. | 对应反向引物 |
| 51 | TCCGCGCCAGCCAATGA | 61 | CATACTCGCCAGCGTGCG |
| 52 | CGCCCCAAGCATAAACCCTG | 62 | CAGGGGAGGGAGCCTCAC |
| 53 | ACTCTTCTGGTCCCCACAGAC | 63 | GAGGGTGGCCTGTGGGTC |
| 54 | CCCACAGACTCAGAGAGAACCC | 64 | GGGCCAGGACGGTTGAGG |
| 55 | CTCAGAGAGAACCCACCATG | 65 | GAGGGGTGGGGTTTGGGTC |
| 56 | ACAGGCCACCCTCAAC | 66 | TGCAGGTCGCTCAGGGC |
| 57 | CCCACCCCTCACTCTGCTT | 67 | CCGAAGCTTGTGCGCGTG |
| 58 | ACTCTGCTTCTCCCCGCAG | 68 | AAGTTGACCGGGTCCACCC |
| 59 | TGCACAGCTCCTAAGCCACT | 69 | ACTTTATTCAAAGACCAGGAAGGGC |
| 60 | CTGCTGGTGACCCTGGCC | 70 | ACTTTATTCAAAGACCAGGAAGGGC |
应该理解，针对以上四类引物，均设计了多对引物，然而，针对每类引物仅使用一种即可，即采用四对引物，一对引物为HBA2上游X、Y同源区域之间特异序列引物，一对引物为HBA1上游X、Y同源区域之间特异序列引物，一对引物为HBA2和HBA1基因内的差异位点引物，还有一对引物为HBA2和HBA1基因内同源序列引物。
在一些实施例中，为了提高单个位点/区域内覆盖度的准确性，每类引物可以采用多对引物进行扩增，同时为了避免相同区域内相近的引物之间的互相干扰，将距离相近的引物对放在不同的引物池中进行平行扩增（可以采用2-6个引物池），单管扩增可能由于扩增偏好性或实验因素导致结果不准，引物池过多会导致成本增加，操作复杂度增加。本实施例中将引物池分成5个平行进行反应，例如SEQ ID NO. 1、6、11、16、21、26、31、36、41、46、51、56、61、66在引物池1进行扩增；SEQ ID NO. 2、7、12、17、22、27、32、37、42、47、52、57、62、67在引物池2进行扩增；SEQ ID NO. 3、8、13、18、23、28、33、38、43、48、53、58、63、68在引物池3进行扩增；SEQ ID NO. 4、9、14、19、24、29、34、39、44、49、54、59、64、69在引物池4进行扩增；SEQ ID NO. 5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70在引物池5进行扩增。
在一些实施例中，多重引物5’端通用序列分别为上游：ACGGCCAAGGCGA；下游：TGGGCAGTCGGTGAT。
选取已知的包含正常型、-α3.7、-α4.2、--SEA、αααanti3.7、αααanti4.2、HKαα一种或2种基因型的样本，对样本进行基因组DNA提取。
每个样本每个引物池取10ng人类基因组DNA，分别配制各个样本的反应体系，见表5，其中引物1混合物为一个引物池采用的引物，5个引物池分别对应于上述5个引物1混合物：
表5
| 组分 | 体积（μL） |
| DNA | 6 |
| 引物1混合物Primer 3/ Primer 4 | 4 |
| Taq DNA聚合酶混合物 | 10 |
反应体系配置完成后，将样本放入Bio-Rad T100 Thermal Cycler PCR仪中，进行PCR1反应。程序为:94°C，5min；94°C 15s , 60°C 4min进行15个循环，72°C 10min，4°C保持，见下表6。
表6
PCR1反应结束后将取同样本的5个引物池扩增产物各4μL进行混合，对混合产物进行两步磁珠纯化，一步1.4倍，一步1.8倍，洗脱后的产物取15μL进行PCR2，见下表7。
表7
| 组分 | 体积（μL） |
| PCR 1纯化产物 | 15 |
| 引物2 | 5 |
| Taq DNA聚合酶混合物 | 20 |
引物2的上游引物（F）如表8所示：
表8
| SEQ ID NO.71：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.72：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.73：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.74：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.75：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.76：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACACGGCCAAGGCGA； |
| SEQ ID NO.77：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACACGGCCAAGGCGA。 |
引物2的下游引物（R）：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT（SEQ ID NO.78）。
其中上游引物中的CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG（SEQ ID NO.79）序列为测序接头，ACGGCCAAGGCGA（SEQ ID NO.80）序列为通用序列。下游引物中的CCTCTCTA序列为测序接头，TGGGCAGTCGGTGAT（SEQ ID NO.81）序列为通用序列。
反应体系配置完成后，将样本放入Bio-Rad T100 Thermal Cycler PCR仪中，进行PCR2反应。程序为:94°C，5min；94°C 15s , 58°C 2min进行10个循环，72°C 10min，4°C保持，见下表9。
表9
PCR2反应结束后对产物进行一步1.4倍磁珠纯化，洗脱后的产物使用Qubit荧光计定量，计算投入量后使用Thermo Fisher的Ion Proton进行半导体测序。
结果分析：
测序数据进行多克隆、低质量序列过滤，接头序列拆分后，将序列文件比对到参考基因组(GRCh37/hg19)上的目标区域，计算每个区域对应扩增子的覆盖度，与参考样本进行对比，计算HBA2特异区域，HBA2和HBA1基因拷贝数总和，HBA1特异区域对应的扩增子拷贝数的均值，以及通过HBA2和HBA1基因差异位点计算的比值，得到下表10所示的结果。
表10
| 样本基因型 | HBΑ2特异 | HBΑ1_2总和 | HBΑ1特异 | HBΑ2_1比值 | 结果是否符合 |
| αα/αα | 1.91 | 3.933 | 2.036 | 1.042 | 是 |
| αα/αα | 1.976 | 3.935 | 2.1 | 1.031 | 是 |
| αα/αα | 2.002 | 3.854 | 2.054 | 0.967 | 是 |
| αα/-α4.2 | 0.977 | 2.754 | 2.096 | 0.474 | 是 |
| αα/-α4.2 | 1.008 | 3.111 | 2.024 | 0.501 | 是 |
| αα/-α4.2 | 1.017 | 3.079 | 2.102 | 0.492 | 是 |
| αα/-α3.7 | 2.073 | 2.866 | 0.981 | 0.489 | 是 |
| αα/-α3.7 | 2.161 | 2.883 | 1.085 | 0.509 | 是 |
| αα/-α3.7 | 2.007 | 3.014 | 1.006 | 0.556 | 是 |
| αα/--SEΑ | 0.984 | 2.075 | 1.094 | 1.033 | 是 |
| αα/--SEΑ | 0.964 | 2.188 | 1.038 | 1.046 | 是 |
| αα/--SEΑ | 0.946 | 2.062 | 0.98 | 1.08 | 是 |
| αα/HKαα | 3.054 | 4.053 | 1.007 | 1.052 | 是 |
| αα/HKαα | 2.962 | 4.069 | 1.007 | 0.891 | 是 |
| αα/HKαα | 2.991 | 4.15 | 0.982 | 0.981 | 是 |
| αα/αααanti4.2 | 2.92 | 4.755 | 2.041 | 1.533 | 是 |
| αα/αααanti4.2 | 3.221 | 4.94 | 2.15 | 1.55 | 是 |
| αα/αααanti4.2 | 3.25 | 5.037 | 2.014 | 1.486 | 是 |
| αα/αααanti3.7 | 1.879 | 4.799 | 2.914 | 1.49 | 是 |
| αα/αααanti3.7 | 2.01 | 4.984 | 2.887 | 1.592 | 是 |
| αα/αααanti3.7 | 1.932 | 5.047 | 3.193 | 1.444 | 是 |
| -α4.2/-α3.7 | 1.027 | 1.941 | 0.982 | 0.005 | 是 |
| -α4.2/-α3.7 | 1.007 | 2.001 | 1.009 | 0 | 是 |
| -α4.2/--SEΑ | 0.017 | 1.005 | 0.952 | 0.002 | 是 |
| -α4.2/--SEΑ | 0.012 | 0.933 | 1.069 | 0.003 | 是 |
| -α4.2/--SEΑ | 0.011 | 1.039 | 1.05 | 0.003 | 是 |
| -α4.2/HKαα | 1.95 | 2.838 | 0.991 | 0.5 | 是 |
| -α4.2/αααanti3.7 | 1.02 | 4.063 | 2.992 | 1 | 是 |
| -α3.7/--SEΑ | 0.927 | 1.028 | 0.01 | 0.003 | 是 |
| -α3.7/--SEΑ | 0.943 | 1.004 | 0.01 | 0.004 | 是 |
| -α3.7/HKαα | 3.152 | 2.948 | 0.01 | 0.467 | 是 |
| -α3.7/αααanti4.2 | 2.98 | 3.978 | 0.88 | 1.004 | 是 |
| -α3.7/αααanti4.2 | 2.579 | 3.961 | 1.031 | 0.96 | 是 |
| --SEΑ/HKαα | 2.072 | 1.966 | 0.012 | 1.045 | 是 |
| --SEΑ/HKαα | 1.843 | 1.958 | 0.013 | 0.969 | 是 |
| --SEΑ/αααanti4.2 | 1.868 | 3.171 | 1.083 | 1.814 | 是 |
| --SEΑ/αααanti4.2 | 1.955 | 2.891 | 1.026 | 2.013 | 是 |
| --SEΑ/αααanti3.7 | 0.898 | 2.695 | 2.056 | 1.979 | 是 |
| --SEΑ/αααanti3.7 | 1.07 | 3.288 | 2.073 | 1.948 | 是 |
| HKαα/αααanti4.2 | 3.771 | 5.001 | 1.017 | 1.548 | 是 |
| HKαα/αααanti3.7 | 2.989 | 5.197 | 2.02 | 1.457 | 是 |
| HKαα/αααanti3.7 | 2.9 | 4.785 | 2.124 | 1.519 | 是 |
| αααanti3.7/αααanti4.2 | 2.96 | 5.743 | 3.016 | 1.995 | 是 |
| αααanti3.7/αααanti4.2 | 2.678 | 5.803 | 2.872 | 2.054 | 是 |
由以上结果可知，除受试者基因型为-α3.7/αααanti3.7或-α4.2/αααanti4.2时无法检出外，所有αα、-α3.7、-α4.2、--SEA、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα之间的组合都能被正确检测出来。即，利用本申请提供的引物，采用二代测序的方法能够同时检测-α3.7、-α4.2、--SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα变异。
另外，本申请运用了不同α-地中海贫血变异在不同区域的拷贝数差异，对HBA2基因和HBA1基因上游X、Y同源区域之间特异序列，HBA2基因和HBA1基因内差异序列，HBA2基因和HBA1基因同源序列区域进行引物设计，通过二代测序计算不同区域的拷贝数，实现了对以上α-地中海贫血变异类型的检测。通过全部HBA2基因和HBA1基因外显子的覆盖，实现热点突变及新发突变的检测。此外，为了增加拷贝数定量的准确性，以及实现全部外显子组的覆盖，可以采用多个引物池平行扩增的方法。
本申请提供的引物试剂盒和方法能够满足同时对于-α3.7、-α4.2、--SEA、αCSα、αWSα、αQSα、αααanti3.7、αααanti4.2和HKαα等α-地中海贫血变异类型准确检测的需求。本申请采用巧妙的引物设计，结合二代测序的方法，解决了多种α-地贫复杂变异必须使用非二代测序的特殊检测方式的问题，对于多种α-地贫变异类型的基因检测，无需采用多种不同的检测手段，显著提高了处理样本的效率，节约了运行成本。利用本发明提供过的引物和方法，检测成本低，操作简单，检测周期短，并且分析简单。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
Claims (2)
1.一种用于检测α-地中海贫血的试剂盒，其特征在于，包括：
第一引物组，所述第一引物组包括SEQ ID NO.1-70。
2.根据权利要求1所述的用于检测α-地中海贫血的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二引物，所述第二引物包括SEQ ID NO.71-78。
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