CN116350651A - Bclaf1在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中的应用 - Google Patents

Bclaf1在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种BCLAF1抑制剂在制备治疗逆转肝癌细胞度伐利尤单抗耐药药物中的应用，属于生物医学领域，本发明采用生物信息学分析和免疫组化分析肝癌标本及癌旁组织中BCLAF1的表达，并分析BCLAF1及预后关系，再采用CRISPR‑Cas9和质粒转染技术，将稳定敲除BCLAF1的质粒sgBCLAF1导入肝癌细胞，实现在肝癌细胞中BCLAF1的敲低，最后利用人CD3/CD28T细胞激活剂激活Jurkat T细胞后与肝癌细进行共培养，加入PD‑L1阻断剂度伐利尤单抗，并通过流式细胞术和ELISA分别检测Jurkat T细胞的凋亡、细胞周期和细胞因子水平，证明sgBCLAF1可用于提高肝癌细胞对度伐利尤单抗的敏感性，逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药性。

Description

BCLAF1在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及BCLAF1在制备治疗逆转肝癌细胞度伐利尤单抗耐药药物中的应用，更具体地，涉及一种BCL-2相关转录因子1在制备治疗逆转肝癌细胞对PD-L1阻断剂度伐利尤单抗耐药药物中的应用。
背景技术
近年来，一种免疫检查点抑制剂——度伐利尤单抗(durvalumab)在实体恶性肿瘤的临床试验中取得了令人瞩目的研究成果，它是一种选择性的、高亲和力的人IgG1单克隆抗体，可阻断PD-L1与PD-1和CD80的结合，使T细胞能够识别并杀死肿瘤细胞，对肺癌、乳腺癌、胆道癌等众多肿瘤都有明显疗效。但是，有研究发现肝癌细胞对durvalumab具有耐药性，使durvalumab在肝癌中的临床应用大大受限，然而其机制尚不清楚。
综上所述，研究开发一种逆转肿瘤细胞对durvalumab耐药的药物，将为肿瘤靶向治疗药物研发提供思路和解决方法，同时具有巨大的社会效益和经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对肝癌治疗药物度伐利尤单抗在治疗过程中常产生耐药进而导致免疫治疗失败甚至疾病复发的问题，提供一种逆转肝癌细胞度伐利尤单抗耐药性的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种BCLAF1抑制剂在制备治疗逆转肝癌细胞度伐利尤单抗耐药药物中的应用，所述BCLAF1抑制剂为降低肝癌细胞中BCLAF1表达水平的分子或制剂，BCLAF1，即为BCL-2相关转录因子1，BCLAF1位于染色体6q23.3上，包括18个外显子，可编码920个氨基酸。BCLAF1结构的显著特征包括富含精氨酸-丝氨酸(RS)的结构域、位于RS结构域内的碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构域和MYB DNA结合结构域，研究表明，BCLAF1主要通过调控以HIF-1α为代表的多种信号通路机促进肝癌的发生、发展。
优选地，所述降低肝癌细胞中BCLAF1表达水平的分子或制剂包括基因敲除RNA，所述基因敲除RNA为sgBCLAF1。
优选地，所述sg BCLAF1具有如下干扰序列：
正义链：5’-ACGAAGTGAACCGCTCGTTTGTTTTAGAGCTAGAAAT AGCAAGTTAA-3’，
反义链：5’-ACAAACGAGCGGTTCACTTCGTCAAACAAGGCTTTTC TCCAAGG-3’。
进一步地，本发明还提供一种靶向敲除BCLAF1的sgRNA，其正义链的序列如SEQ IDNo.1所示，其反义链的序列如SEQ ID No.2所示。
进一步地，本发明还提供一种验证sg BCLAF1逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药的方法，其特征在于，包括如下技术手段：
(1)：采用生物信息学分析和免疫组化分析肝癌标本及癌旁组织中BCLAF1的表达，并分析BCLAF1及预后关系；
(2)：采用CRISPR-Cas9和质粒转染技术，将阴性对照、过表达和稳定敲除BCLAF1的质粒导入肝癌细胞，实现在肝癌细胞中BCLAF1的过表达和敲低；
(3)：利用人CD3/CD28T细胞激活剂激活Jurkat T细胞后与肝癌细进行共培养，加入PD-L1阻断剂度伐利尤单抗，并通过流式细胞术和ELISA分别检测Jurkat T细胞的凋亡、细胞周期和细胞因子水平。
优选地，所述肝癌细胞为HepG2和SK-Hep1细胞。
优选地，所述过表达BCLAF1的质粒为OEBCLAF1，所述OEBCLAF1质粒中BCLAF1的序列如SEQ ID No.3所示。
优选地，所述稳定敲除BCLAF1的质粒为cas9-BCLAF1，所述cas9-BCLAF1的正义链的序列如SEQ ID No.1所示，所述cas9-BCLAF1的反义链的序列如SEQ ID No.2所示
本发明具备的有益效果：本发明的方法为度伐利尤单抗作为肿瘤的免疫治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤提供新的免疫治疗依据，为进一步提高肿瘤的免疫治疗提供新科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例2中来源于TCGA和CPTAC数据库的BCLAF1在肝癌组织及癌旁组织中表达情况的可视图；
图2为本发明实施例2中针对105对新鲜原发性肝癌患者新鲜组织的免疫组化染色和免疫组化结果；
图3为本发明实施例2基于TCGA数据库和CPTAC数据库的BCLAF1表达与肝癌患者总生存期的生存曲线图；
图4为本发明实施例4中肝癌细胞干扰和过表达BCLAF1后，蛋白表达水平提示干扰和过表达成功；
图5为本发明实施例4中肝癌细胞HepG2干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养后流式细胞术和细胞凋亡水平变化的实验结果图；
图6为本发明实施例4中肝癌细胞SK-Hep1干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养后流式细胞术和细胞凋亡水平变化的实验结果图；
图7为本发明实施例4中肝癌细胞HepG2干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的细胞周期变化实验结果图。
图8为本发明实施例4中肝癌细胞SK-Hep1干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的细胞周期变化实验结果图。
图9为本发明实施例4中肝癌细胞HepG2和SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞分泌的细胞因子水平变化实验结果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细的说明。需要说明的是，以下各实施例仅用于说明本发明的实施方法和典型参数，而不用于限定本发明所述的参数范围，由此引申出的合理变化，仍处于本发明权利要求的保护范围内。
需要说明的是，在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如背景技术所述，度伐利尤单抗虽然对肝癌、乳腺癌、肠道癌等众多肿瘤具有显著疗效，但这些癌症细胞均可能对度伐利尤单抗产生耐药性，使得度伐利尤单抗的临床使用大大受限，因此，有必要开发一种逆转肝癌细胞度伐利尤单抗耐药性的新型药物以提升度伐利尤单抗的治疗效果。
为使本发明浅显易懂，在本发明的具体实施例中，BCLAF1敲除用BCLAF1-KO表示，BCLAF1过表达用BCLAF1-OE表示。
实施例1
肝癌组织标本收集和肝癌免疫组织化学染色
肝癌组织标本收集
本实施例中肝癌组织标本收集来源：纳入研究的105对人肝癌组织样本源自2021年01月01日至2022年8月31日宁波市临床病理诊断中心确诊为肝癌。其中50对福尔马林固定的人肝癌组织标本来源于宁波市临床病理诊断中心，55对人新鲜肝癌组织标本来源于宁波市医疗中心李惠利医院。
a.新鲜人肝癌组织标本的采集、处理与保存：在符合纳入标准、不影响病理诊断取材的前提下，由专人在标本离体30min内，取肝癌组织及癌旁组织(癌组织旁1-3cm以内)，切成小块(0.5×0.5×0.4cm)，用生理盐水冲洗标本上残留的血液，将标本放入标本瓶中，旋紧瓶盖，备注患者信息及收集日期等信息，将标本瓶立即放入液氮保存。
b.福尔马林固定肝癌组织标本的采集、处理与保存：福尔马林标本为肝切除术经病理诊断后剩余肝脏组织，常温条件下放于足量10％中性福尔马林溶液中固定。收标本前在1.8mL标本管中加入适量4％多聚甲醛固定液，由专业病理医师在每个样本上取肝癌与癌旁组织各一块(0.5×0.5×1cm)，分别放入1.8mL标本管，液体浸没标本，旋紧盖子，置于4℃冰箱中保存备用，定期更换4％多聚甲醛固定液。
本实施例中肝癌组织标本的纳入标准：1.样本病理诊断明确，确诊为原发性肝细胞肝癌；2.患者未接受术前放、化疗治疗；3.患者既往无其他系统的恶性肿瘤。排除标准为：1.合并其他系统恶性肿瘤；2.术前曾接受过射频消融毁损治疗的患者；3.有梅毒艾滋等传染性疾病者。所有患者经肝切除术治疗，标本经患者签署知情同意术后取得。本实施例涉及的所有人体组织标本，均经课题组申请，在宁波大学医学院人体伦理委员会同意的条件下，只限实验室研究。
肝癌免疫组织化学染色
本实施例所使用的肝癌组织标本均为前述实验收集的样本，具体步骤如下：
a.肝癌组织固定：将福尔马林固定肝癌组织样本用镊子夹到摊开的保鲜膜上，用无菌刀片切成0.5×0.5×0.2cm大小的组织块，浸泡于4％多聚甲醛溶液中24小时以上。
b.冲洗：组织包埋盒分别用长度一致的白色棉线串起来，用无菌镊子将固定组织置于组织包埋盒中，盖紧包埋盒，在包埋盒上用铅笔标注样本相关信息，将包埋盒放在泡沫箱中，置于流动自来水下冲洗5min，沥干水分。
c.脱水：将组织包埋盒依次放入提前备好的装有不同浓度乙醇的玻璃缸中梯度脱水，包埋盒放入玻璃缸后立即盖上玻璃缸盖子，棉线置于玻璃缸外以方便换缸。于75％乙醇溶液浸泡1h×2次；80％乙醇溶液浸泡1h×2次；95％乙醇溶液浸泡1h×2次；100％乙醇溶液浸泡1h×2次，最后沥干包埋盒上的乙醇溶液。
d.透明：将组织包埋盒放入二甲苯溶液中浸泡40min×2次。
e.浸蜡：将装有熔点58～60℃切片石蜡的蜡缸提前放入60℃烘箱熔化，将组织包埋盒依次放入烘箱中的三个蜡缸，每个蜡缸内浸泡至少1h，包埋盒需充分浸没在液体石蜡中。
f.包埋：提前预热包埋机使机器中的石蜡熔化，待石蜡全部熔化，将包埋用的铁盒放入包埋机左侧蜡缸，将烘箱蜡缸中的包埋盒取出放入包埋机右侧蜡缸。去掉包埋盒，将组织放入包埋铁盒正中，用镊子固定组织，向包埋铁盒中灌注液态石蜡使之浸没组织块，将塑料包埋盒的盖子取下，轻轻盖在包埋铁盒上，置于4℃冷冻台上冷却成固体蜡块，弃去包埋铁盒，将蜡块置于密封袋中，4℃冰箱保存备用。
g.切片：使用石蜡切片机对组织进行10μm粗切以除去不含组织的石蜡，并将蜡块表面打磨光滑。将组织蜡块切成4μm薄片，放入40℃水浴锅中展片，挑选组织完整、形状规则的薄片，用带正电荷的载玻片将组织切片捞起使之贴附在载玻片上，在载波片末端用铅笔标注标本相关信息。
h.烤片：将附有组织的载玻片置于已预热65℃的烤片机上进行烤片，烘烤2h。
i.脱蜡与复水：将满载切片的玻片架依次放入二甲苯中浸泡20min；无水乙醇溶液中浸泡5min×2次；95％乙醇溶液中浸泡5min×1次；75％乙醇溶液中浸泡5min×1次；最后将玻片架置于去离子水中洗涤5min。
j.抗原修复：将50×的柠檬酸钠抗原修复液用去离子水稀释到1×并摇晃均匀，将1×柠檬酸钠抗原修复液倒进高压锅中，合上锅盖，待锅内液体沸腾，将装有切片的玻片架置于高压锅中，使柠檬酸钠抗原修复液完全浸没切片，旋紧锅盖，待高压锅气阀开始均匀冒气后开始计时，8min后关闭电磁炉电源，结束加热。将高压锅置于流动自来水下降温，打开锅盖，使石蜡切片冷却至室温。
k洗涤：首先使用去离子水充分洗涤切片5min，接着用PBS缓冲液洗涤切片3min，重复洗涤3次。
l.封闭内源性过氧化物酶：将10％过氧化氢水溶液用去离子水稀释至3％浓度，每次现配现用，将石蜡切片放于湿盒内，在载玻片上组织所在位置滴加适量3％过氧化氢水溶液，合上湿盒的盖子，37℃封闭10min。
g.洗涤：用PBS磷酸盐缓冲液洗涤切片3min×3次，甩掉载玻片上的液体。
m.血清封闭：洗涤后的切片摆放于湿盒内，每张切片上滴加适量10％驴血清封闭液，室温下封闭15min后，甩掉切片上的封闭液。
n.一抗孵育：擦净组织周围的封闭液，用免疫组织化学染色专用疏水笔围绕组织画圈，将切片置于湿盒内，滴加适当浓度的INF2抗体稀释液，使抗体稀释液浸没组织，合上湿盒盖子，置于4℃冰箱过夜。
o.洗涤：用PBS磷酸盐缓冲液洗涤切片3min×3次。
p.二抗孵育：擦干组织周围的液体，在组织上滴加适当浓度的HRP标记驴二抗，使抗体完全覆盖组织，合上湿盒盖子，37℃孵育1h。
q.洗涤：用PBS磷酸盐缓冲液洗涤切片3min×3次。
m.DAB显色：将DAB显色液滴加到载玻片上组织所在位置，将载玻片置于倒置显微镜上观察组织染色情况，待染色强度达到最佳时甩掉显色液，使用去离子水洗涤3min×3次。
r.苏木素复染：在载玻片上组织所在位置滴加适量改良Lillie-Mayer苏木素染液，染色2min，甩掉染色液，将装有载玻片的玻片架置于流动自来水下洗涤10min以返蓝。
s.脱水：将装有切片的玻片架依次浸泡于75％乙醇溶液5min×1次；95％乙醇溶液中浸泡5min×1次；无水乙醇溶液中浸泡5min×3次。
t.透明：将切片置于二甲苯溶液中浸泡5min×2次。
u.封片：在载玻片上组织所在位置滴加适量中性树胶，用镊子夹取一张盖玻片轻轻覆盖在载玻片上，置于通风橱中晾干成片。
v.评分：将切片置于倒置显微镜上，依次在低倍镜、高倍镜下观察组织形态、细胞核染色、目的蛋白质染色情况。
实施例2
检测肝癌细胞中BCLAF1的表达及预后关系
从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov)下载并整理TCGA-LIHC(肝细胞肝癌)项目STAR流程的RNAseq数据并提取TPM格式的数据以及临床数据。从CPTAC数据库(https://cptac-data-portal.georgetown.edu/)下载并整理肝细胞肝蛋白质表达数据及临床数据。使用survival包进行比例风险假设检验并进行拟合生存回归，结果用survminer包以及ggplot2包进行可视化，结果如图1、图2、图3所示。
根据BCLAF1在肝癌组织中免疫组化的评分分为3组，Negative(0分)、Low-positive和High-positive。利用SPSS26.0分别统计分析3组内的各个患者的临床病理特征。P<0.05有统计学意义，具体结果如表1所示。
表1免疫组化相关性分析
Figure SMS_1
Figure SMS_2
由表1基于105对肝癌组织免疫组化结果对BCLAF1表达与肝癌患者临床病理特征的相关性分析可知：BCLAF1高表达的肝癌患者有着更高级别的微血管侵袭(Microvascularinvasion)。
实施例3
BCLAF1干扰和过表达
细胞培养
人肝癌细胞HepG2和SK-Hep1在含10％vol胎牛血清的DMEM高糖培养基中，并于5％CO2、37℃细胞培养箱中培养。
过表达和干扰
采用CRISPR-Cas9和质粒转染技术，将阴性对照、过表达和稳定敲除BCLAF1的质粒分别导入肝细胞癌细胞HepG2及SK-Hep1，48小时后裂解细胞并提取蛋白，其中阴性对照质粒为CD513B-cas9空载体，过表达质粒为采用pEnter载体连接SEQ ID No.3中的序列制成的重组质粒，稳定敲除BCLAF1的质粒为CD513B-cas9载体连接SEQ ID No.1中的正义链和SEQID No.2中的反义链制成的重组质粒。利用蛋白质免疫印迹技术检测Hep G2和SK-Hep1细胞中的BCLAF1蛋白水平，具体步骤如下：
a.总蛋白提取：铺板后待细胞汇合度至80％时收取细胞，PBS清洗2次，胰酶消化后再次使用PBS清洗，并行细胞计数，并以30ul lysis buffer(1MTris(PH7.4)，10％ Triton-100，1M NaCl，0.5M EDTA and dd H2O)提取1*106个细胞中的总蛋白，于旋转摇床上4℃裂解15min，12000rpm/min离心10min，取上清。
b.电泳：配制10％的分离胶后水封，配制分离胶，凝固30min后于电泳液中拔出梳子，取5ul上样，先用20mA恒流电泳至marker开始分离后再用恒流40mA进行电泳，直至目的条带分开。
c.转膜：将负极板、海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、正极板按次序放置，连接电源，恒流220mA转膜。
d.封闭及孵育一抗：使用5％脱脂牛奶室温摇床封闭1h，4℃孵育BCLAF1一抗过夜。
e.洗膜及孵育二抗：室温使用TBST洗膜4次，5min/次，室温摇床孵育辣根过氧化物酶标记的二抗2h。再次用TBST洗膜4次，5min/次，滴加ECL发光液，并在暗室内进行胶片曝光。
实施例4
细胞共培养
a.HepG2，SK-Hep1细胞铺板到6孔板，1天后待细胞密度融合至70％-80％左右将OEBCLAF1或cas9-BCLAF1质粒转染至肝癌细胞48小时。
b.接下来，用人CD3/CD28 T细胞激活剂(Proteintech公司，#KMS310)激活JurkatT细胞，并以Jurkat T：肝癌细胞＝5：1的比例将Jurkat T细胞加入到肝癌细胞中进行共培养。
c.共培养48小时后收集Jurkat T细胞和上清液。用流式细胞仪检测不同组别的Jurkat T细胞的凋亡和细胞周期，并用ELISA试剂盒测定Jurkat T细胞在上清液中分泌的细胞因子浓度。
d.对于细胞凋亡，使用含有荧光染料Phycoerythrin(PE)标记的Annexin V+核酸染料Aminoactinomycin D(7-AAD)以及含有荧光染料5-异硫氰酸荧光剂(FITC)标记的Annexin V+核酸染料碘化丙啶(PI)的凋亡试剂盒对细胞进行磷脂酰丝氨酸(PS)和DNA染色。使用FlowJo软件(v10.8.1)进行进一步的数据分析及作图。
e.对于细胞周期，使用细胞周期试剂盒进行DNA的PI染色。使用贝克曼Cytoflex流式细胞仪对染色的细胞进行分析，并使用FlowJo软件(v10.8.1)进行进一步的数据分析及作图，实验结果如图4～图9所示。
本发明附图对应的技术结果如下：
图1中A、B、C、D是来源于TCGA和CPTAC数据库的BCLAF1在肝癌组织及癌旁组织中表达情况的可视图，表示BCLAF1 mRNA和蛋白质在肝癌中表达显著高于癌旁组织；
图2中的A是105对新鲜原发性肝癌患者新鲜组织的免疫组化染色代表图，图2中的B是105对新鲜原发性肝癌患者新鲜组织中BCLAF1表达的免疫组化结果，表示BCLAF1蛋白在肝细胞癌中表达显著高于癌旁组织；
图3中的A基于TCGA数据库的BCLAF1表达与肝癌患者总生存期的生存曲线图，如3中的B是基于CPTAC数据库的BCLAF1表达与肝癌患者总生存期的生存曲线图，表示BCLAF1高表达的肝癌患者有着更低的总生存期；
图4中的A是肝癌细胞HepG2中，干扰和过表达BCLAF1后，蛋白表达水平提示干扰和过表达成功，图4中的B是肝癌细胞SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后，蛋白表达水平提示干扰和过表达成功；
图5中的A是肝癌细胞HepG2中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养后流式细胞术实验结果图，图5中的B是肝癌细胞HepG2中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的凋亡水平变化；
图6中的A是肝癌细胞SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养后流式细胞术实验结果图，图6中的B是肝癌细胞SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的凋亡水平变化；
图7中的A和图7中的B是肝癌细胞HepG2中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的细胞周期变化实验结果图；
图8中的A和图8中的B是肝癌细胞SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞的细胞周期变化实验结果图；
图9是肝癌细胞HepG2和SK-Hep1中，干扰和过表达BCLAF1后与Jurkat T细胞共培养，加或不加度伐利尤单抗后检测Jurkat T细胞分泌的细胞因子水平变化，其中图9中的A为白介素2(IL-2)水平，图9中的B为白介素4(IL-4)水平，图9中的C为白介素10(IL-10)水平，图9中的D为干扰素γ(IFN-γ)水平。
本发明的具体实施方式发现：针对肝细胞癌中高表达的BCLAF1基因与度伐利尤单抗耐药密切相关；BCLAF1过表达抑制了与肝癌细胞共培养的T细胞活性，相比于BCLAF1过表达组，BCLAF1过表达+加药组逆转了BCLAF1过表达对T细胞活性的抑制作用。这说明BCLAF1是通过拮抗杜伐利尤单抗来抑制T细胞的活性，可认为BCLAF1过表达的细胞对度伐利尤单抗具有耐药性。使用BCLAF1抑制剂sgBCLAF1特异地抑制BCLAF1基因表达，能够极大的抑制与肝癌细胞共培养的Jurkat T细胞的活性和功能；能够有效的增强肝癌细胞对度伐利尤单抗的敏感性，从而显著提升度伐利尤单抗药物的疗效，降低耐药性。而特异的过表达BCLAF1基因后观察到了相反的结果。
因此，在上述研究的基础上，本发明提出BCLAF1抑制剂sgBCLAF1。这种抑制剂可以实现在降低BCLAF1表达水平后，显著提升肝癌细胞对度伐利尤单抗的敏感性。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种BCLAF1抑制剂在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中的应用，其特征在于，所述BCLAF1抑制剂为降低肝癌细胞中BCLAF1表达水平的分子或制剂。
2.如权利要求1所述的BCLAF1抑制剂在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中的应用，其特征在于，所述降低肝癌细胞中BCLAF1表达水平的分子或制剂包括基因敲除RNA，所述基因敲除RNA为sgBCLAF1。
3.如权利要求2所述的BCLAF1抑制剂在制备治疗逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药药物中的应用，其特征在于，所述sg BCLAF1具有如下干扰序列：
正义链：5’-ACGAAGTGAACCGCTCGTTTGTTTTAGAGCTAGAAAT AGCAAGTTAA-3’，
反义链：5’-ACAAACGAGCGGTTCACTTCGTCAAACAAGGCTTTTC TCCAAGG-3’。
4.一种靶向敲除BCLAF1的sgRNA，其特征在于，其正义链的序列如SEQ ID No.1所示，其反义链的序列如SEQ ID No.2所示。
5.一种验证sg BCLAF1逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药的方法，其特征在于，包括如下技术手段：
(1)：采用生物信息学分析和免疫组化分析肝癌标本及癌旁组织中BCLAF1的表达，并分析BCLAF1及预后关系；
(2)：采用CRISPR-Cas9和质粒转染技术，将阴性对照、过表达和稳定敲除BCLAF1的质粒导入肝癌细胞，实现在肝癌细胞中BCLAF1的过表达和敲低；
(3)：利用人CD3/CD28T细胞激活剂激活Jurkat T细胞后与肝癌细进行共培养，加入PD-L1阻断剂度伐利尤单抗，并通过流式细胞术和ELISA分别检测Jurkat T细胞的凋亡、细胞周期和细胞因子水平。
6.如权利要求5所述的验证sg BCLAF1逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药的方法，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2和SK-Hep1细胞。
7.如权利要求5所述的验证sg BCLAF1逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药的方法，其特征在于，所述过表达BCLAF1的质粒为OEBCLAF1，所述OEBCLAF1质粒中BCLAF1的序列如SEQID No.3所示。
8.如权利要求5所述的验证sg BCLAF1逆转肝癌细胞对度伐利尤单抗耐药的方法，其特征在于，所述稳定敲除BCLAF1的质粒为cas9-BCLAF1，所述cas9-BCLAF1的正义链的序列如SEQ ID No.1所示，所述cas9-BCLAF1的反义链的序列如SEQ ID No.2所示。
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