CN110835648B - NSrp70基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，涉及NSrp70基因的新应用，特别NSrp70基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用。本发明对乳腺癌细胞进行了核蛋白定量蛋白组学分析，结果显示，核散斑蛋白NSrp70在具有高转移潜能的乳腺癌细胞呈现低表达，体内外实验证实干扰NSrp70能够显著促进细胞的转移能力，而过表达该基因则显著抑制细胞的转移能力；NSrp70能通过抑制TGFβ信号通路，抑制细胞EMT最终抑制乳腺癌转移；NSrp70可作为乳腺癌转移程中新的分子靶点以及分子标志物用于制备乳腺癌癌症转移相关药剂中的应用，包括制备检测癌症转移的检测试剂盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物。本发明将有助于预防和抑制乳腺癌的转移，造福癌症患者。

Description

NSrp70基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，涉及NSrp70基因的新应用，特别NSrp70基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用。
背景技术
资料公开，目前乳腺癌已成为严重影响全球女性身心健康的疾病，且发病率和死亡 率逐年攀升。有研究显示乳腺癌转移是乳腺肿瘤致死的主要原因，临床实践发现乳腺癌可转移向多个脏器，包括肺、骨、肝、胸膜、软组织等；其中软组织和骨转移者的中位 生存时间是22～26个月，肺和胸膜转移为10～12个月，肝和脑转移是4～6个月。乳腺癌转移一旦发生则极少治愈，预后不佳，显著降低了患者的生存质量并增加治疗成本。
目前，临床对转移性乳腺癌的治疗分为放化疗和靶向治疗两大类；相比Luminal和HER2+的乳腺癌，TNBC由于ER、HER2均不表达，无法采用常规的内分泌治疗和靶向治疗， 化疗也受耐药性的限制，患者的预后普遍较差，临床上亟需有效的治疗方案。
由上可见，乳腺癌转移的治疗仍然存在很大的提高空间。因此，加强乳腺癌转移标志物的筛查，积极寻找乳腺癌转移的早期诊断标志物及预后的潜在靶点，将其应用于乳 腺癌的相关药物开发应用方面，可造福乳腺癌患者，延长其生命，提高生活质量。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供NSrp70基因的新用途，特别是NSrp70 基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用。
发明内容
本发明的目的在于基于现有技术的现状，提供NSrp70基因新的药物用途，特别是NSrp70基因在制备用于肿瘤尤其是恶性肿瘤(亦称癌症)转移相关药物制剂中的应用， 包括用于制备检测癌症转移的检测试剂盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相 关信号通路的药物中的应用，上述应用有助于实现临床上对癌症转移的早期发现和不良 预后。
本发明利用iTRAQ定量蛋白质组学，对乳腺癌细胞MDA-MB-231(亲本细胞系)及其衍生的高转移细胞MDA-MB-231HM(肺高转)和MDA-MB-231Bo(骨高转)进行核蛋白定量 蛋白组学分析，结果显示，核散斑蛋白NSrp70在具有高转移潜能的乳腺癌细胞呈现低表 达，其次，通过体内外实验，进一步证实干扰NSrp70能够显著促进细胞的转移能力，而 过表达该基因则显著抑制细胞的转移能力。进而发现NSrp70能通过抑制TGFβ信号通路， 抑制细胞EMT最终抑制乳腺癌转移；本发明进行了乳腺癌临床标本检测，显示了NSrp70 的高表达提示有较好的预后；经实验研究表明，NSrp70可作为乳腺癌转移程中新的分子 靶点，可作为分子标志物用于临床前期筛查、预防、筛选具有潜在转移风险的人群，使 更多的乳腺癌患者从中获益。
本发明提供了NSrp70基因的新应用，即NSrp70基因或者其片段在制备乳腺癌癌症转 移相关药剂中的应用，包括将NSrp70基因或者其片段用于制备检测癌症转移的检测试剂 盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物。
本发明所述的NSrp70是指编码所述的核散斑蛋白NSrp70(又名CCDC55；HSPC095,NCBI网站Gene ID:84081)的基因。
在本发明中，NSrp70基因片段是指编码具有人NSrp70蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如NCBI登录号为NM_032141的序列中38-1714位核苷酸序列及其简并序列；该简并 序列是指，该序列的编码框38-1714位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸 的简并密码子所取代后而产生的序列；由于密码子的简并性，所以与38-1714位核苷酸序 列同源性低至约70％的简并序列也能编码出相同的多肽；还包括能在中度严紧条件下，更 佳地在高度严紧条件下，与该序列中从核苷酸38-1714位核苷酸序列杂交的核苷酸序列； 还包括与该序列从核苷酸38-1714位核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更 佳地至少90％的核苷酸序列。
所述的NSrp70基因片段还包括能编码具有与人NSrp70相同功能的蛋白的、NSrp70基因序列的变异形式，这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地 1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/ 或3'端添加数个核苷酸；本发明的编码序列可以是DNA或RNA，可以是单链或双链。
所述的NSrp70基因或者其片段是乳腺癌癌症转移药剂的主要活性成分。
本发明所述的NSrp70基因新应用，包括将NSrp70基因或者其片段用于制备检测癌症 转移的检测试剂盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物。
所述的癌症转移包括癌症细胞成分的转移、侵袭和迁移。
所述的癌症转移药物包括抑制癌症转移、侵袭、迁移的药物。
所述的药剂包括抑制与癌症转移相关信号通路的药物，例如，在本发明的一个优选 实施例中，沉默NSrp70能够激活TGF-β信号通路并导致的乳腺癌或者其癌症转移。
本发明中，NSrp70基因或者其片段可用于制备乳腺癌预后的检测试剂盒。
NSrp70基因或者其片段可作为癌症转移试剂盒的活性成分。
本发明提供了一种癌症转移试剂盒，其包括NSrp70基因或者其片段，或者它们编码 的多肽。
本发明所述的试剂盒，也可以包括扩增NSrp70基因的特异性引物或者针对NSrp70蛋 白的特异性抗体。
本发明所述的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照或者说明书。
本发明的NSrp70基因及其表达产物可以作为抑制癌症转移药物的主要活性成分。
本发明蛋白及其抗体、抑制剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果；通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性 载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化；配制的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包 括(但并不限于)：肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人NSrp70蛋白为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用；这类 药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但 并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方 式相匹配。本发明的人NSrp70蛋白可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖 和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活 性成分的给药量是治疗有效量。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的人NSrp70蛋白多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于哺 乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提供了NSrp70在制备癌症转移相关药物制剂方面的应用，包括用于制备检测癌症转移的检测试剂盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物中的应用，通过一系列的方法和技术检测NSrp70的含量和表达情况。进一步，上述应用有助于实现临床上对癌症转移的早期发现和不良预后。
附图说明
图1是核散斑蛋白NSrp70的质谱结果；
图2是蛋白质组学显示NSrp70在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo细胞系中 差异表达的结果图；
图3是Western blot验证NSrp70在乳腺癌不同细胞系中表达情况的结果图；
图4是Western blot验证干扰表达NSrp70在乳腺癌细胞中的效果的结果图；
图5是Western blot验证过表达NSrp70在乳腺癌细胞中的效果的结果图；
图6是Transwell验证在MDA-MB-231中干扰NSrp70表达后对侵袭和迁移的影响的结果 图，其中，上部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的柱状统计图；
图7是Transwell验证在BT549中干扰NSrp70表达后对侵袭和迁移的影响的结果图， 其中，上部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的柱状统计图；
图8是Transwell验证在Hs578T中过表达NSrp70后对侵袭的影响的结果图，其中，上 部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的柱状统计图；
图9是Transwell验证在MDA-MB-231HM中过表达NSrp70后对侵袭的影响的结果图，其 中，上部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的柱状统计图；
图10是划痕实验验证在MDA-MB-231中干扰NSrp70表达后对细胞愈合能力影响的结果 图，其中，上部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的线性统计图；
图11是划痕实验验证在BT549中干扰NSrp70表达后对细胞愈合能力影响的结果图，其 中，上部是实验结果的代表性图片，下部是实验结果的线性统计图；
图12是小鼠活体成像结果图。上部是PCDS的结果，下部是NSrp70的相关结果。
图13是Western Blot检测NSrp70干扰MDA-MB-231后EMT相关指标的变化。
图14是Western Blot检测NSrp70过表达后EMT相关指标的变化。
图15是Western Blot检测NSrp70干扰BT549后EMT相关指标的变化及TGFβ信号通路 抑制剂GW788388处理后EMT相关指标的变化。
图16是TGFβ信号通路抑制剂GW788388处理NSrp70干扰MDA-MB-231后体外迁移结果。
图17临床标本中检测NSrp70与患者预后的相关性。
图18是临床标本中检测NSrp70与患者的淋巴结转移状态的结果图。
具体实施方式
本发明实施方式中，包括：
材料和方法
1材料
1.1.细胞系
永生化人乳腺上皮细胞系MCF10A，同一病人来源的转移乳腺癌细胞系MCF10-Ca1a，常 用的人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、BT-549、Hs-578T、MCF-7、SK-BR-3、T47D、Bcap-37、 MDA-MB-468、ZR-75-30、ZR-75-1购自中科院细胞库(上海)。肺高转移潜能细胞系 MDA-MB-231HM由本实验前期建立，经四次小鼠尾静脉注射后分离鉴定并获得专利，在本实验 室已多次用于发表文章。骨高转细胞MDA-MB-231Bo由Dr.Toshiyuki Yoneda(The Universityof Texas,Houston)惠赠。肺高转高转细胞系MDA-MB-231LM2由Joan Massagué(MemorialSloan-Kettering Cancer Center)惠赠。
1.2裸鼠来源，品系和品种
体内转移实验选用6-8周龄BALB/c(nu/nu)雌裸鼠进行实验，裸鼠购买并培养于上海 斯莱克实验动物责任有限公司实验动物部的SPF级动物房。
1.3临床资料
该部分所有临床标本均来源于复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科于2002年至2006年收集 的病例，被取样者均知情同意。由于乳腺癌存在不同的分子分型，而不同分型的乳腺癌其治 疗及预后都存在差异。因此，在选择制作组织芯片的样本时，我们从大量病例中首先根据分 子分型分类，在从不同分型中随机抽取250例浸润性导管癌标本，其中含Luminal A分型50 例、Luminal B分型50例、Her2阳性50例、三阴性乳腺癌100例。这些病例均具有完整的 病理诊断资料和随访记录，组织学分级为1-3级。其中临床资料包括年龄、月经状态、组织 学分级、肿瘤大小、淋巴结状态、ER、PR、HER2状态、复发或转移时间及总生存时间等。随 访信息截止日期为2013年8月，中位随访时间为98个月。
1.4主要试剂及耗材
1.4.1细胞培养相关试剂与耗材
DMEM及RPMI-l640培养基购于Hyclone公司、DMEM/F12、胎牛血清(FBS)、马血清、0.25％胰蛋白酶、0.05％胰蛋白酶及胰岛素均购自于Gibco公司；青霉素链霉素双抗(源培)霍乱毒素及DMSO(二甲基亚砜)购于Sigma公司；EGF(细胞上皮生长因子)购于Millipore 生物公司；75cm培养瓶、10cm、6cm培养皿、各种规格的细胞培养板、3mL及10mL无 菌吸管从Corning公司采购。
1.4.2蛋白提取定量及Western blot相关试剂与耗材
蛋白提取及定量：
组织蛋白裂解液T-PER(Pierce)、100×蛋白酶抑制剂(APExBIO)、100×磷酸酶抑制 剂(APExBIO)、BCA蛋白定量试剂盒(索来宝)。
WB所需试剂及仪器：
30％丙烯酰胺(29％丙烯酰胺：1％N,N-亚甲双丙烯酰胺)(索来宝)、十二烷基硫酸钠 (sodium lauryl sulfate，SDS，Sigma)、过硫酸氨(Ammonium persulfate，Sigma)、TEMED (Sigma)PVDF膜(Millipore)、一抗稀释液(碧云天)、ECL电化学发光底物(Millipore)、聚山梨醇酯(Tween-20，Milliore)、NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4(国药)、脱脂牛奶(BD)、 20×DTT(Fermentas)、5×loading buffer(Fermentas)、PageRulerTM预染蛋白质Marker (Fermentas)、转膜用三层滤纸(Bio-rad，美国)、配胶玻璃及梳子(Bio-Rad，美国)。
1.4.3构建载体所需试剂与耗材
pCDH载体pCDH-CMV-MCV-EF1-Puro(SBI)、Taq酶(Fermentas)、dNTP(Takara)、BamHI和EcoRI(NEB)、DH5α感受态细胞(Takara)、质粒小抽试剂盒(Tiangen)、普通 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen)、普通DNA产物纯化试剂盒(Tiangen)、DL2000DNA Marker(Takara)、1kb DNA梯度marker(Fermentas)、T4DNA ligase(Fermentas)、胰 蛋白胨(oxoid，英国)、酵母提取物(oxoid，英国)、NaCl、琼脂(碧云天)、氨苄青霉 素(Sigma)、质粒大抽试剂盒(天根)；
NSrp70基因CDS过表达引物合成(金唯智)，具体序列如下：
Forward primer:5’-CCGgaattc GCCACC ATG GAC TAC AAG GAC GAT GAT GACAAG CTC GAT GGA GGA ATGGCGATTCCGGGCAGGCA-3’(SEQ ID NO 1)；Reverse primer:5’-CGCggatcc TCAATCATCTTCTTTCTCAA-3’(SEQ ID NO 2)
NSrp70干扰采用crispr/cas9双质粒系统，载体为gRNA，NSrp70敲除载体构建引物如 下：
Crispr#1:Forward primer:5’-CACCGAATGCAGCTTTCGTGAAGCC-3’(SEQ ID NO 3)
Reverse primer:5’-AAACGGCTTCACGAAAGCTGCATTC-3’(SEQ ID NO 4)
Crispr#2:Forward primer:5’-CACCGTAAGAAGCAGGCCATGAAAC-3’(SEQ ID NO 5)
Reverse primer:5’-AAACTAAGAAGCAGGCCATGAAACC-3’(SEQ ID NO 6)
1.4.4病毒包装及感染所需试剂
线性化聚乙烯亚胺(Polyethylenimine Linear,PEI)(Polyscience)、0.9％NaCl(国 药)、Polybrene(溴化己二甲铵，Sigma)、PsPAX2、pMD2G、目的基因质粒(实验室保存质粒)、注射器(上海金塔)、滤器(Millipore)、细胞培养瓶(Corning)、EP管(Invitrogen)、 细胞培养基(Corning)。
1.4.5细胞功能试验所需试剂耗材
0.8μm的24孔transwell小室(BD)；Matrigel预制24孔transwell小室(BD)；
划痕专用96孔板(Essen)。
1.4.6免疫组化所需试剂耗材
NSrp70抗体(Sigma公司)、一抗二抗稀释缓冲液(Thermo fisher)、鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(DAB显色、REAL EnVision)、EDTA缓冲液：50×EDTA(pH＝9.0、DAKO 公司)、0.01M柠檬酸缓冲液(Solarbio公司)、苏木素(索莱宝)、免疫组化用隔水笔(GT PenMini)、不同规格的Tips头(Axygen公司)、盖玻片、冲洗瓶(福建迈新公司)、孵 育湿盒(Leica公司)、24片塑料染色架、耐高温抗原修复盒(上海化科实验器材有限公司)。
1.5主要仪器
生物安全柜(Thermo Fisher)；
37℃CO2恒温培养箱(Thermo Fisher)；
光学显微镜BX51(Olympus)；
垂直电泳槽(Bio-Rad公司)；
电泳转移槽(Bio-Rad公司)；
Mettler PE-160型电子天平(Mettler)；
低温高速离心机(Eppendoff)；
常温离心机Centrifuge 5810R(Eppendorf)；
MultiSKAN MK3酶标仪(Thermo)；
制冰机(SIM-F140，SANYO)；
pH计(Mettler-Toledo)；
涡旋振荡器(IKA-MS)；
恒温水浴锅(上海生工生物技术工程有限公司)；
超纯化水机(Milli-Q)；
微量移液枪(Eppendorf)；
摇床SCS-24(上海市离心机械研究所)；
-20℃冰箱(Haier)；
-80℃冰箱(Thermo Revco Scientific)；
电子天平(Mettler-Toledo)。
高压蒸汽锅(三申)；
DNA电泳仪和水平电泳槽(Bio-Rad)；
DNA凝胶成像仪(Tanon)；
凝胶成像仪(WB)(Bio-Rad)；
Incucyte活细胞工作站(Essen)；
细胞计数仪(Beckman)；
小动物活体成像仪(Bruker)；
常规切片机(Leica)；
组织芯片仪(Beecher instrument)；
电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.6培养基及常用溶液配制
细胞培养相关：
DMEM、RPMI-l640及L15培养基使用前加入双抗、10％FBS，4度冰箱保存；MCF10A培养 基：DMEM/F12、5％马血清、霍乱毒素、胰岛素(100×)、氢化可的松、表皮生长因子(100ng/mL)、 双抗(100×)。
细胞冻存液:DMSO:FBS：培养基按体积比为1:2:7混合匀，现配现用或存放于4℃冰箱避 光保存。
10×PBS缓冲液：NaCl 80g、KCl 2g、Na2HO4 14.4g、KH2PO4 2.4g。
PBST：将10×PBS用双蒸水稀释至1×的工作浓度后，加以0.1％浓度的Tween-20并充分摇匀。
Western blotting相关试剂的配置：
Protein loading buffer Pack(5×Loading buffer，20×Reducing agent，Fermentas)；
电泳缓冲液(25mM Tris-HCl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)；
1.0M Tris-HCl(pH6.8)；1.5M Tris-HCl(pH8.8)；10％(W/V)过硫酸铵；
封闭液：0.1M PBS(pH7.4)配制的5％脱脂奶粉或者5％小牛血清蛋白(BSA)；
20×转膜缓冲液，使用时用去离子水稀释至1×并另加20％甲醇；
丙烯酰胺凝胶配方：
LB培养基的配制：
液体LB高压灭菌后4℃保存；固体LB高压灭菌后待温度降至50-60℃左右(以不烫手 背为宜)，加入合适的抗生素(如氨苄青霉素100mg/mL)混匀后倒入培养皿中，约10-15mL， 待冷却后封口保存于4℃冰箱。
Transwell染色用结晶紫配方：0.445g结晶紫
71.2mL甲醇
106.8mL PBS
经三层滤纸过滤后避光常温保存。
小鼠活体成像底物D-luciferin钾盐配方：
20mg/mL溶于DPBS，经0.22μm滤膜过滤后避光保存，现配现用。
(5)DPBS的配方：
试剂 质量(g) 摩尔浓度(mM) 体积(L)
NaCl 8 137 -
KCl 20 2.7 -
Na2HPO4·7H2O 2.16 8.1 -
KH2PO4 0.20 1.1 -
H2O - - 1
2方法
2.1细胞株的培养
MCF10A用其专用配方；其它乳腺癌细胞系根据ATCC推荐使用相应的培养基。培养于 37℃、5％CO2和饱和湿度条件下。
2.2蛋白提取
(1)贴壁细胞：丢弃培养液，用预冷PBS清洗细胞两次并吸净，将细胞培养皿或瓶置于冰上，加上适量蛋白裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，用细胞刮刀将细胞刮下；胰酶消化后收集的细胞沉淀：用预冷的PBS洗两遍后，弃上清，直接加裂解液；
(2)将细胞裂解液收集到1.5mL的EP管，先用超声仪辅助破碎细胞膜(10s超声、10s停止、共计4个循环)，再4℃冰浴裂解40min，期间可多次震荡以保证细胞充分裂解；
(3)12000rpm 4℃离心15min后，将上清转移至新的1.5mL EP管，弃沉淀；
(4)取5μL用于测定蛋白浓度，蛋白浓度测定(BCA法)：20μL PBS+5μL样品/5 μLPBS(空白对照)+200μL BCA混合液(A:B＝200:4)，37℃水浴30min，酶标仪测定 A562的OD值，根据标准曲线求蛋白浓度；
(5)其余蛋白上清添加5×loading buffer和20×DTT，沸水浴10min变性。
2.3Western blotting
(1)配置凝胶：分别配制不同浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离胶、5％的浓缩胶；
(2)蛋白上样：用1×loading buffer稀释已变性的蛋白样品成同样浓度，按30μg上样，蛋白marker 5μL；
(3)电泳：70V电泳30min待溴酚蓝进入浓缩胶后，再120V电泳1-1.5h，待溴酚 蓝即将离开凝胶底端时停止电泳；
(4)转膜：电泳结束后，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜，转膜条件：220mA恒流50-90min，根据分子量及凝胶厚度做适当调整；
(5)封闭：将PVDF膜在PBST(PBS pH＝7.4，0.1％Tween 20)中漂洗一次，浸入5％脱脂牛奶(或者5％的BSA)封闭液中，在水平摇床上室温缓慢孵育1h；
(6)一抗孵育：用一抗稀释液将一抗稀释至工作浓度，将抗体孵育盒置于摇床缓慢摇 动，孵育膜4℃过夜；
(7)二抗孵育：一抗孵育结束后，PBST洗膜4次，每次8min；以脱脂牛奶(或者BSA)稀释二抗，室温孵育1-2h；
(8)底物显色：二抗孵育结束后，以PBST洗膜4次，每次8min；取相同体积的显色 液A和B液，混匀后加至PVDF膜正面，于成像分析系统显影拍照。
所有蛋白印迹实验均以GAPDH作为上样内参。
2.4重组野生型NSrp70表达载体构建
乳腺癌细胞系MDA-MB-231的cDNA作为模板，利用PCR扩增获取完整的CDS序列，经酶 切后与载体连接，挑取单克隆测序验证即可。具体步骤如下：
2.4.1PCR扩增NSrp70CDS全长
步骤如下：首先，根据载体上的多克隆位点选择酶切位点，设计扩增NSrp70CDS区所 需引物，并用去离子水将引物稀释至工作浓度10μM；其次，将已反转录为cDNA的模板按1:10稀释后备用；按如下反应配置反应体系，根据上下游引物的Tm值确定退火温度范围，进行退火温度梯度PCR，寻找最佳退火温度后扩大体系至200μL(50μL×4管)，PCR 结束后，胶纯化获取片段即可。
PCR反应体系如下：
PCR反应条件如下：
2.4.2琼脂糖凝胶纯化PCR产物
(1)配置琼脂糖凝胶：NSrp70CDS区大小为1677bp左右，配置1％琼脂糖凝胶即可；
(2)加样品：PCR产物与6×loading buffer混匀后小心加到上样孔中，并加5μLDNA ladder 2000；
(5)电泳:以100V恒压电泳，待溴酚蓝指示剂电泳至凝胶的三分之二左右，停止电泳；
(6)拍照或切胶：在DNA成像仪中拍照保存后，用手术刀片将目的条带小心切下，并尽量修去周围凝胶；
(7)溶胶：将凝胶切成数块小段，装入EP管，称重。加入等体积的凝胶重量的溶胶液(0.1g的凝胶加入100μL的溶胶液)，50℃水浴溶解凝胶5-10min。期间上下温和的颠 倒数次，保证全部凝胶溶解；
(8)柱平衡：将吸附柱放入收集管中，加入500μL的平衡液，在常温下12,000rpm 离心30s，弃废液；
(9)吸附目的片段：将步骤7)中混匀后的反应液加入步骤8)的吸附柱中，室温静置2min后12,000rpm离心1min，弃掉废液，可分批离心将全部样品加入；
(10)洗涤：加入洗涤液600μL，室温静置3-5min后12,000rpm离心1min，弃废 液。重复该步骤一次；
(11)去洗液：将吸附柱12,000rpm离心3min，最大限度去除洗液；
(12)洗脱：将吸附柱放入新的EP管内，开盖室温静置4-5min以保证酒精挥发完全。随后向柱内加入洗脱液50μL，室温静置2min后12,000rpm离心3min，收集EP管中液 体，Nanodrop 2000测浓度，-20保存备用。
2.4.3目的片段及pCDH载体双酶切
酶切条件：37℃水浴锅过夜
体系如下：
2.4.4纯化酶切产物
载体DNA片段，切胶取酶切后的大片段后纯化，实验步骤参考2.2.2。
目的片段的酶切产物纯化用普通PCR产物纯化试剂盒。
具体步骤如下：
(1)柱平衡：将吸附柱放入收集管中，加入500μL的平衡液，在常温下12,000rpm 离心30s，弃废液；
(2)样品与结合液混匀：加入5倍体积结合液到PCR反应液中，充分混匀；
(3)DNA吸附：将混匀后的反应液加入步骤1)中的吸附柱中，室温静置2min后12,000 rpm离心1min，弃掉废液，可分批离心将全部样品加入；
(4)洗涤-去洗涤液-洗脱-测浓度：与2.3.2中的步骤(10)-(12)相同。
2.4.5目的片段与载体连接重组克隆
载体取50ng，根据摩尔比(目的片段：载体片段＝7:1)计算片段的质量后按如下体系 配制反应液：
反应条件：PCR仪22℃，60min
2.4.6连接产物转化
(1)将连接产物和DH5α感受态细胞插入冰中，约4-6min后待感受态融化后，将全部连接产物加入感受态中，混匀后冰上放置30min；
(2)于42℃水浴锅热激感受态90s，立即置于冰上2-3min；
(3)加入900μL LB培养基(不添加抗生素)混匀后，置于37℃摇床培养45-60min；
(4)室温4000rpm离心2min，留约100μL菌液重悬后，均匀涂到含氨卞抗性的LB 平板上，倒置放入37℃细菌培养箱中培养过夜。
2.4.7挑单克隆送测鉴定
次日，待菌落大小适合时，再超净台中挑取单克隆菌落，置于装有5mL含氨苄青霉素 的LB摇菌管中，标志好后放置到37℃摇床上，220rpm培养过夜。
利用质粒小抽试剂盒提取重组质粒，经双酶切后琼脂糖凝胶电泳，将酶切后目的片段大 小正确的质粒送测序，结果用Vector NTI进行比对(碱基100％匹配或者突变点为同义突变)。
质粒小抽步骤如下：
(1)细菌收集：将过夜培养的菌液，于室温4000rpm离心10min后，吸尽上清；
(2)细菌重悬：每个样品中加入250μL的P1液体，利用涡旋振荡器充分悬浮细菌；
(3)细菌裂解：加入250μL溶液P2，缓慢颠倒混匀；
(4)蛋白等沉淀：加入350μL的P3溶液，立即颠倒温和混匀后室温12000rpm离心15min；
(5)柱平衡：将吸附柱放入收集管中，加入平衡液500μL，室温12000rpm离心1min，弃废液；
(6)质粒吸附：将步骤5)中的上清小心吸出，加入到6)的吸附柱中，静置2min后，室温12000rpm离心2min，弃废液；
(7)洗涤-去洗涤液-洗脱：步骤同2.3.2的10)-12)，洗脱液体积可80-100μL。
2.5NSrp70敲除片段载体构建
2.5.1载体酶切和回收
所用内切酶为BsmbI，切下后选取大小为8kd的片段回收，具体见2.4.3载体酶切和2.4.4 纯化酶切产物
2.5.2引物退火
条件：95℃4min；70℃10min；PCR关火。
其余步骤与过表达载体构建同。
2.6包装病毒和细胞感染
(1)接种细胞：将293T培养至密度为80-90％左右，按1:9接种细胞至60mm的培养皿中，过夜待细胞贴壁，贴壁后密度约为70-80％；
(2)配制质粒与转染试剂混合液：目的质粒：4μg；包装质粒(psPAX2：3μg；
pMD2G：1.2μg)；0.9％NaCl 200μl；转染试剂PEI 24μL；将以上全部试剂混匀后震荡8s，室温静置10min；
(3)转染细胞：将293T细胞换新鲜无双抗及FBS的配液3mL后，将2)中液体缓慢滴加至培液中，轻柔十字摇匀后放入细胞培养箱；
(4)换液：6-8h后，将细胞更换新鲜培养基(含双抗、10％FBS)；
(5)收集病毒上清：转染后48h收集上清，用0.45μm滤器过滤后，1mL每管分装 至无菌EP管中，直接感染细胞或-80℃冰箱保存。
(6)将病毒液与新鲜培养液按1:1～1:3加入到细胞密度为50～60％的细胞中，并加入 终浓度为8ug/ml的Polybrane，过夜后换新鲜培养液。根据载体抗体选择抗生素筛选约1周 后即可获得稳定转染细胞系。
2.7细胞迁移、侵袭及划痕检测实验
2.7.1细胞伤口愈合能力检测
(1)接种细胞：细胞计数后以约3.6×104细胞/孔/100μL接种到Essen 96孔板中(约90％汇合度)，过夜贴壁；
(2)划痕：次日，将96孔板中空白孔用100μL PBS补齐，随后将96孔板开盖后放 置于划痕器中固定好，将划痕器用75％的乙醇消毒后进行划痕；
(3)去除脱落的细胞：用200μL PBS洗两遍，将划痕后脱落的细胞去除，每孔加入200μL新鲜培养液；
(4)扫描：将96孔板放置于Incucyte活细胞工作站中，每4h扫描一次，共60h；
(5)分析结果：待扫描结束后，应用软件程序分析结果，以相对划痕密度(relativewound density)为参数作图，并将0、24、48h代表性图片导出。
2.7.2细胞迁移和侵袭(Transwell小室法)
(1)细胞计数：将细胞消化、用完全培养基重悬，用不含FBS的DMEM洗两遍后用重悬， 经细胞计数后，调整细胞浓度为2.5×105/mL(迁移)和5×105/mL(侵袭)；
(2)细胞接种：将24孔培养板中加入600μL的含20％FBS的DMEM培养基，确保无气泡后，将Transwell小室(无预制胶和有预制胶)置于预先加入培养液的孔中，将(1)中的 细胞悬液吹匀后滴加200μL于Transwell小室中，放入细胞培养箱中培养15-24h；
(3)细胞染色：待细胞培养至特定时间，取出小室，放入结晶紫染色液中固定染色30min， 用蒸馏水洗净多余的染色液，将小室内的细胞用棉签擦拭干净后，倒置晾干；
(4)拍照并计数：于倒置显微镜下选4倍和20倍物镜拍摄照片，每个样品至少3个视野拍照后计数，统计分析。
2.8动物实验
利用PWPXL-GFP-Luciferse质粒，包装慢病毒后，感染所需目的细胞，并经流式细胞仪 分选GFP阳性的细胞后，再进行目的基因的病毒感染，经puromycin筛选和WB验证干扰和过 表达效果。
将细胞消化计数后重悬于无FBS的DMEM中，浓度为3×106细胞/mL；经小鼠乳尾静脉 接种3×105细胞/100μL，每三天记录一次小鼠体重；大约4-6周左右，将小鼠经乙醚麻醉，尾静脉注射100μL D-luciferin钾盐(20mg/mL)后经活体成像仪观察小鼠体内转移 情况。
2.9免疫组化染色
(1)脱蜡、水化：将芯片从冰箱提前取出，恢复至室温后，于60℃温箱中烘烤过夜；次日，将烘烤后的芯片置于染色架上，依次浸入二甲苯I、Ⅱ、Ⅲ各10min(二甲苯三次)； 取出芯片依次置于100％无水乙醇I、Ⅱ(无水乙醇两次)、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇中各放置5min；随后取出，用PBS冲洗三次，每次3min。(脱蜡和水化在通风橱中进行)
(2)抗原修复：先将装有柠檬酸缓冲液的抗原修复盒置于高压锅内，打开电源，待锅 内水煮沸后，放气开盖；将已放置好芯片的染色架放置到预先煮沸的抗原修复盒中，继续煮 沸10min，关闭电源，保温5min后，将整个修复盒取出待自然冷却至室温。将冷却后的芯 片用PBS冲洗5min，重复三次。
(3)非特异性阻断：取出芯片，轻甩去除多余水分，擦干组织周围的残余液体，用隔水笔在组织周围画一圈后，在组织上缓慢滴加适量非特异性阻断剂，室温避光孵育10min。随后PBS冲洗3次，每次5min。取出切片，轻柔甩去多余液体并小心拭去组织周围的液体， 需避免组织过于干燥。
(4)一抗孵育：将芯片置于孵育湿盒中，在组织上轻柔滴加600μL稀释好的一抗工作液，4℃孵育过夜。次日，将芯片放入37℃培养箱复温45min。随后，用PBS冲洗芯片3 次，每次5min，取出芯片，去除组织周围的液体(组织不能过于干燥)。
(5)二抗孵育：在组织上滴加600μL二抗工作液，于37℃孵育30min后，将芯片放 入PBS中，冲洗3次，每次5min，取出芯片，擦干组织周围多余液体并保证组织湿润。
(6)DAB显色：将新鲜配制的显色液和底物按照1:50混匀后，滴加600μL于组织上，室温孵育并在显微镜下观察，控制显色时间1-5min，待显色完全后，用自来水冲洗以终止显色。
(7)苏木素返蓝：将DAB显色后的芯片先以自来水冲洗5min后，轻轻拭去组织周围多余液体，加入600μL苏木素室温染色2min后，自来水冲洗10min，注意调整水流速度， 冲洗芯片反面。
(8)脱水和透明：将芯片分别置于不同浓度酒精中(75％、85％、95％、100％)，每个浓 度梯度5min，最后置入二甲苯I、Ⅱ、Ⅲ中各5min。(脱水和透明在通风橱中进行)
(9)封片：芯片经过脱水，透明处理后，用常规中性树脂封片，置于通风橱中干燥。
(10)免疫组化染色等级判断标准：NSrp70评分标准取决于阳性细胞染色的强度及分布。 染色强度分级如下：无阳性染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。染色的比例分级从0～4级：染色比例为<5％为0、5％-25％为1、25％-50％为2、50％-75％为3、>75％ 为4。染色的比例及染色强度相乘的结果：0～3分为低表达，4～12分为高表达。在组织芯片上，每个病例二个重复，取二者平均值为最终得分；若缺失其中一个重复，则取其重复孔 评分代替总分；若芯片上两重复均缺失，则该病例不计入最后统计数据。
(11)3统计学处理
本部分的数据均采用SPSS22.0进行统计分析，采用χ2检验比较临床相关参数的组间差 异。采用Kaplan-Meier分析生存曲线，采用Cox分析检验进行单多因素分析，计数资料的组 间相关性采用Spearman相关分析，以p<0.05为存在统计学差异。
实施例1NSrp70在乳腺癌高转移潜能细胞中相对低表达
将MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo三株细胞系抽提核蛋白，进行iTRAQ定量蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白，结果显示，NSrp70的表达水平在高转移潜能 细胞系MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo中显著下调，附图1为NSrp70的iTRAQ质谱结果图；附图2为iTRAQ质谱中NSrp70在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo细胞 系中差异表达的结果图；
进一步，提取常用乳腺癌细胞系蛋白进行Western Blot验证，结果显示，NSrp70在转移能力较强的细胞系(如Hs578T、MDA-MB-231LM2、MDA-MB-231Bo)中的表达水平 显著低于转移能力较弱的细胞系(如MCF-7、ZR-75-30)，结果显示NSrp70在常用乳腺 癌细胞系中的表达与质谱结果一致，附图3为Western blot验证NSrp70在不同乳腺癌 细胞系中表达情况的结果图。
实施例2NSrp70抑制肿瘤细胞体外迁移侵袭
为了进一步明确NSrp70对转移的影响，本实施例选取乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549 进行NSrp70干扰，MDA-MB-231LM2和Hs578T作为NSrp70过表达细胞模型，经WesternBlot 验证，NSrp70干扰以及过表达均成功，附图4和5为Western blot检测NSrp70干扰和过表 达在乳腺癌细胞中的效果；
进一步进行体外Transwell小室迁移和侵袭实验，结果显示，在NSrp70干扰的MDA-MB-231和BT549中，NSrp70下调能显著增加细胞的迁移和侵袭能力，相反地，NSrp70 过表达显著抑制MDA-MB-231LM2和Hs578T的转移能力，图6是Transwell验证在MDA-MB-231 中干扰NSrp70后对侵袭和迁移的影响的结果图，其中，图6上为实验结果的代表性图片，图 6下为实验结果的柱状统计图；图7是Transwell验证在BT549中干扰NSrp70表达后对侵袭 和迁移的影响的结果图，其中，图7上为实验结果的代表性图片，图7下为实验结果的柱状 统计图；图8是Transwell验证在Hs578T中过表达NSrp70后对侵袭的影响的结果图，其中， 图8上为实验结果的代表性图片，图8下为实验结果的柱状统计图；图9是Transwell验证 在MDA-MB-231LM2中过表达NSrp70后对侵袭的影响的结果图，其中，图9上为实验结果的代 表性图片，图9下为实验结果的柱状统计图；
同时通过细胞划痕实验进一步验证了NSrp70能影响细胞的伤口愈合能力，在MDA-MB-231 以及BT549细胞中干扰NSrp70后，细胞的愈合能力增强，图10上和图11上是实验结果的代 表性图片，图10下和图11下是实验结果的线性统计图。
实施例3NSrp70抑制乳腺癌细胞体内转移能力
为了进一步明确NSrp70在体内调控乳腺癌细胞转移的能力，将MDA-MB-231LM2标记 Luciference荧光质粒后，再构建MDA-MB-231LM2pCDH、MDA-MB-231LM2NSrp70稳定转染细 胞，以2×105细胞/只给予BALB/c裸小鼠尾静脉注射，4周后进行裸小鼠活体成像，结果显 示，NSrp70过表达组小鼠的肺部转移灶明显少于对照组，结果表明，NSrp70对于乳腺癌细胞体内转移有明显的抑制作用，图12是小鼠活体成像结果图。
实施例4沉默NSrp70可以激活乳腺癌细胞的TGF-β信号通路
检测TGF-β/SMAD信号通路中的重要节点，结果显示，沉默NSrp70可以激活MDA-MB-231 细胞TGF-β信号通路，上调p-smad3的表达，而过表达NSrp70可以抑制Hs578T细胞TGF-β信号通路的激活，在外源TGF-β的刺激下这种变化更加显著；图13是Western Blot检测NSrp70干扰MDA-MB-231后TGF-β信号通路的变化，图14是Western Blot检测NSrp70过 表达Hs578T的实验结果图；
TGFβ信号通路激活后通常能诱导细胞发生EMT来促进肿瘤转移，因此，本实施例中利 用Western Blot检测EMT的相关指标变化，结果显示，在MDA-MB-231中干扰NSrp70后能显 著Vimentin、FN-1的表达，抑制E-cadherin的表达；在Hs578T细胞株过表达NSrp70则显著抑制Vimentin、FN-1、N-cadherin的表达水平，促进E-cadherin的表达；利用TGFβ信 号通路抑制剂GW788388处理BT549细胞后，能显著逆转NSrp70干扰诱导的细胞EMT和p-smad3 的上调，并且逆转细胞的体外转移能力，结果表明，NSrp70能通过抑制TGFβ信号通路抑制 细胞发生EMT。图13显示了Western Blot检测NSrp70干扰MDA-MB-231后EMT相关指标的 变化，图14显示了Western Blot检测NSrp70过表达后EMT相关指标的变化，图15显示了 WesternBlot检测NSrp70干扰BT549后EMT相关指标的变化及TGFβ信号通路抑制剂 GW788388处理后EMT相关指标的变化，图16显示了TGFβ信号通路抑制剂GW788388处理 NSrp70干扰MDA-MB-231后体外迁移结果。
实施例5NSrp70的表达对乳腺癌患者预后、肿瘤分期、淋巴结转移的影响
采用临床标本进一步验证上述结论，根据NSrp70表达情况，将248例标本分为高表达 组和低表达组，Kaplan-Meier分析结果显示：NSrp70低表达患者更容易复发(P<0.001)；进行Spearman相关分析显示：NSrp70的表达与淋巴结转移呈负相关(P<0.001)；上述结果提示NSrp70可作为乳腺癌患者独立预后因素；图17显示了临床标本中检测NSrp70与患者预后的相关性；图18是临床标本中检测NSrp70与患者的淋巴结转移状态的结果图。
序列表
<110> 复旦大学附属肿瘤医院
<120> NSrp70基因在制备用于肿瘤转移相关药物制剂中的应用
<130> 20180804
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ccggaattcg ccaccatgga ctacaaggac gatgatgaca agctcgatgg aggaatggcg 60
attccgggca ggca 74
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
cgcggatcct caatcatctt ctttctcaa 29
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
caccgaatgc agctttcgtg aagcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
aaacggcttc acgaaagctg cattc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
caccgtaaga agcaggccat gaaac 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
aaactaagaa gcaggccatg aaacc 25

Claims (3)

1.人源的NSrp70基因在制备抑制人乳腺癌癌症转移药物制剂中的应用；所述的NSrp70抑制与人乳腺癌癌症转移相关TGF-β信号通路。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，人源的NSrp70基因作为人乳腺癌癌症转移药物制剂的主要活性成分。
3.检测人源的NSrp70基因的试剂在制备人乳腺癌预后诊断的基因检测试剂盒中的应用。
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