CN113884678A - Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用 - Google Patents

Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113884678A
CN113884678A CN202111081703.8A CN202111081703A CN113884678A CN 113884678 A CN113884678 A CN 113884678A CN 202111081703 A CN202111081703 A CN 202111081703A CN 113884678 A CN113884678 A CN 113884678A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
medulloblastoma
5min
pbs
slices
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111081703.8A
Other languages
English (en)
Inventor
蓝茜
王艳霞
党微旗
缪静雅
周红
向东方
崔有宏
卞修武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanfang Hospital
First Affiliated Hospital of Army Medical University
Original Assignee
First Affiliated Hospital of Army Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by First Affiliated Hospital of Army Medical University filed Critical First Affiliated Hospital of Army Medical University
Priority to CN202111081703.8A priority Critical patent/CN113884678A/zh
Publication of CN113884678A publication Critical patent/CN113884678A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用。本发明对于WNT/SHH髓母细胞瘤的诊断、治疗和预防具有重要临床应用价值。

Description

Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂 或药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用。
背景技术
髓母细胞瘤(MB)是儿童期中枢神经系统最常见的胚胎恶性脑肿瘤，约占所有儿童颅内肿瘤的25％左右。目前，髓母细胞瘤的治疗策略为手术联合全脑脊髓放疗和放疗后辅助化疗。根据危险因素进行分层治疗，现阶段，标危型髓母细胞瘤五年无复发生存率约为70％-80％，高危型髓母细胞瘤五年无复发生存率约为60％(孙晓非，甄子俊.儿童髓母细胞瘤多学科诊疗专家共识(CCCG-MB-2017)[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2018,23(4))。
然而，因放疗的副作用，髓母细胞幸存者往往存在认知功能下降、智力下降、生长发育迟缓、内分泌功能紊乱、不孕不育及激发第二肿瘤等情况(孙晓非，甄子俊.儿童髓母细胞瘤多学科诊疗专家共识(CCCG-MB-2017)[J].中国小儿血液与肿瘤杂志，2018，23(4))。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供内向整流钾离子通道2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
内向整流钾离子通道2.1(英文简称为Kir2.1)作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤(英文简称MB)的试剂或药物中的应用。
进一步，所述试剂或药物是指调控或检测内向整流钾离子通道2.1的表达水平的试剂或药物。
进一步，所述药物是抑制内向整流钾离子通道2.1活性的药物。
进一步，所述髓母细胞瘤是指非WNT/SHH髓母细胞瘤(即髓母细胞瘤Group 3和Group 4亚型)。
本发明的目的还在于保护靶向内向整流钾离子通道2.1的抑制剂在制备治疗或预防髓母细胞瘤的药物中的应用。
进一步，所述髓母细胞瘤是指非WNT/SHH髓母细胞瘤。
本发明的有益效果在于：
本发明将Kir2.1作为靶点，制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物，对于WNT/SHH髓母细胞瘤的诊断、治疗和预防具有重要临床应用价值。
附图说明
图1为实施例1的检测结果图，其中，a为不同亚型的髓母细胞瘤样本中Kir2.1的代表性免疫组化图像，b为免疫组化评分显示3/4组Kir2.1表达高于WNT和SHH分型的髓母细胞瘤样本，c为癌和癌旁细胞中Kir2.1的免疫组化图，d为Kir2.1在癌组织中比癌旁组织高表达的免疫组化图的统计图，e为GEO数据库中Kir2.1在非WNT/SHH亚型中高表达统计图，f为Kir2.1在Group3/4型中表达高于WNT和SHH亚型，g为不同亚型中Kir2.1的表达水平与患者预后的关系，其中Group3/4中Kir2.1的表达与患者预后相关，G3/4表示通过聚类算法定义的组3和组4髓母细胞瘤亚群，SHH表示以SHH通路的超激活为特征的髓母细胞瘤亚群，WNT表示以WNT通路的超激活为特征的髓母细胞瘤亚群，β-catenin表示β-链蛋白，GAB1表示生长因子受体相关结合蛋白1，ns表示无显著性差异，expression为表达水平，IDO/Area为单位面积内的积分光密度，Tumor表示肿瘤，Incisal margin表示切缘(配对的癌和癌旁)，Normal表示癌旁正常组织，MB表示髓母细胞瘤，GSE28245表示GEO数据库的髓母细胞瘤数据子集，共64例，GSE37418表示GEO数据库中的髓母细胞瘤数据子集，共73例，percentage ofKir1.2high cases表示Kir2.1高表达病例的百分比，subgroup为亚型，overall survivalpercent为总生存期百分比，days after surgury为术后天数，下图相同；
图2为实施例2的检测结果图，其中，a为Kir2.1敲低和过表达细胞体外迁移实验结果， b为Kir2.1细胞体外侵袭实验结果，c为小鼠原位注射过表达Kir2.1细胞后活体成像结果及其统计图，d为小鼠原位注射敲低Kir2.1细胞后活体成像结果及其统计图；e为老鼠原位肿瘤的HE染色，f为荷瘤小鼠的生存期统计图，g为敲低Kir2.1和过表达Kir2.1对髓母细胞瘤细胞Vimentin、E-cadeherin和Slug表达水平的影响，mock为敲低组的对照，shKir2.1为敲低的Kir2.1，ctrl为过表达组的对照，ov-Kir2.1为过表达的Kir2.1，MB428为本实验室建立的原代髓母细胞瘤、MB913为本实验室建立的原代髓母细胞瘤photo flu为荧光强度，E-Cadherin为上皮细胞钙粘蛋白，Vimentin为波形蛋白，Slug为锌指转录因子，β-actin为β肌动蛋白；
图3为实施例3的结果图，其中，a为免疫共沉淀-质谱检测实验之后筛选出的前五个与 Kir2.1的相互作用的蛋白，b为免疫共沉淀验证Kir2.1与5个蛋白的相互作用，c为在MB428 和MB913过表达细胞中Kir2.1和Notch2的相互作用，Notch2为Notch信号通路，HMGB1为高迁移率族蛋白，HDGF为肝癌衍生生长因子，RALA为Ras相关蛋白Ral-A，TBX2为 T-box转录因子，FLAG为一种标记，IB显示目的蛋白，IP纯化目的蛋白，input为阳性对照，IgG为阴性对照，elution为洗脱液；
图4为实施例4的结果图，其中a为Kir2.1与N2ICD的共定位情况，b为流式细胞仪检测 Kir2.1的敲低过表达对N2ECD分布量的影响，c为敲低/过表达Kir2.1之后对N2ICD入核的影响，d和e图都是Kir2.1的表达变化对Notch2靶蛋白的表达影响，f为再过表达Kir2.1细胞中沉默Notch2后Notch2的靶蛋白表达情况，g为沉默Notch2后侵袭实验结果，其中N2ICD为Notch2胞内区域，DAPI为4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，Merge为组合图，Counts是计数，cytoplasm为细胞质，nuclear为细胞核，LaminB1 为核内参抗体，GAPDH为膜内参抗体，c-Myc为Notch2下游靶基因，Hes1为Notch2下游靶基因；
图5为实施例5的结果图；a为使用S2/S3抑制剂对膜/核中Notch2表达量的影响，b为流式检测流式检测GI254023X对细胞膜表面Notch2表达量的影响，c为Kir2.1与S2/S3剪切酶的相互作用，d为GI254023X对Kir2.1过表达细胞侵袭作用的影响，e为Kir2.1促进髓母细胞侵袭转移的分子机制模式图，其中GI254023X为S2剪切抑制剂，RO4929579为S3 剪切抑制剂，mNotch2-FL为Notch2全长，mN2ICD为Notch2膜上部分，nN2ICD为，Notch2 核内部分。
图6为实施例6的结果图；a和b为Kir2.1/Notch2在non-WNT/SHH型髓母中表达的情况，c为non-WNT/SHH型髓母中kir2.1/Notch2表达与预后的关系。d为non-WNT/SHH MB 中Kir2.1high/nN2ICDhigh亚型和non-Kir2.1high/nN2ICDhigh亚型与临床预后的关系。Kir2.1low为低表达的Kir2.1，nN2ICDlow为低表达的nNotch2，Kir2.1high为高表达的Kir2.1，nN2ICDhigh为高表达的nNotch2。
图7为实施例7的结果图，a为阻断Notch2信号通路抑制了Kir2.1过表达髓母细胞形成的移植瘤的生长和转移的荷瘤小鼠的活体成像图，b为a的统计图，c为GI254023X明显抑制原位移植瘤的侵袭转移，d为GI254023X明显延长过表达Kir2.1的MB428细胞形成的移植瘤的小鼠的生存时间。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
通过免疫组化和数据分析，结果如图1所示。
免疫组织化学染色
1.切片：所有的石蜡标本统一编号后，放入-20℃冰箱预冷冻、接着进行切片、摊片及风干等步骤。切片的厚度均为3μm。
2.脱蜡：将石蜡切片放置到铁架子上，于60℃烤箱内烘烤45min，随后迅速放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一缸二甲苯内浸泡15min。然后依次放入100％酒精浸泡10min，95％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min，75％酒精浸泡5min，自来水浸泡5min，PBS浸泡5min。
3.抗原修复：PBS润洗3次，每次5min。将切片放于装有修复液的高压锅中，加热至100℃后盖上盖子，高压作用2min30s。接着自来水冲洗降温高压锅，取出架子装入盛有修复液的修复盒中，自然冷却到室温。
4.内源性过氧化氢酶的灭活：取出浸泡在修复液中的切片，PBS润洗3次，每次5min，加入3％H2O2，37℃下作用30min。
5.封闭：取出灭活的切片，PBS润洗3次，每次5min。取出切片放于湿盒中，切片组织上滴加山羊封闭血清，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
6.一抗孵育：切片轻轻地甩掉封闭血清，在组织切片上滴加稀释好的抗体，盖上湿盒盖， 4℃冰箱内孵育过夜。
7.二抗孵育：取出湿盒放于37℃烤箱中复温15min。将切片放于修复盒中PBS润洗3次，每次5min。而后取出切片放于湿盒中，切片上滴加辣根过氧化物酶(3,3’-diaminobenzidine, DAB)标记的二抗，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
8.显色：取出湿盒，将切片放于修复盒中PBS浸洗3次，每次5min。而后取出切片放于显微镜下，滴加DAB显色液。当显色到合适的程度立刻放到水中终止反应。
9.复染：自来水润洗3次，将切片浸入苏木精溶液内染色20s，然后用自来水充分漂洗，再浸入盐酸酒精分化液内作用1s后取出，在流动的自来水中浸泡返蓝。
10.脱水、透明及封固：将复染的切片依次放入75％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min， 95％酒精浸泡5min，100％酒精浸泡10min。随后放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一罐二甲苯内浸泡15min。取出切片，放于通风橱中自然风干，随后滴加中性树胶50μL，用盖玻片封片，37℃烤箱中除去气泡后扫描保存。
免疫组织评分
为了减少人为判读的干扰因素，免疫组化的评分方法采用Image-pro plus 5.0软件进行。
具体的操作如下：
1.图片采集
所有的图片采集都在同一台显微镜、同一个亮度、同样的放大倍数及同样的软件参数设定下进行。每一个样本的切片都在调至清晰视野下随机采集五张图片。
2.软件分析
(1)校正图片光密度：点击Files按钮打开要计算的图片，在Measure按钮下点击Calibration，在Intensity窗口里点new，然后选择std option density。Options里更改Incident level 为230，不要关闭窗口。
(2)选色：在Measure中选择Count/size，点击Select colors，使用HSI模式，将H值设定为0-30，S值设定为0-255，I值设定为0-230，然后点file-save，保存这个选色设置，以后计算每张图片的评分都加载这个选色设置文件。
(3)选择测量参数：Count/size界面点击Measure，选择select measurement，选择IOD 和Area这两个参数。
(4)测定：用irregular工具画出测量区域，点count按纽。在view statistics窗口中读取测量数据IOD SUM数值，作为这张照片的累积光密度值。再次点击Edit下的covertAOI (s)to Obiect(s)，再点count按纽，在view statistics窗口中读取测量数据Area SUM数值，作为这张照片的面积值。
(5)计算：每张照片的相对光密度为IOD SUM除以Area SUM的值，5个相对光密度的平均值即为这例标本的免疫组化评分值。
GEO数据库的使用
基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库是隶属于美国国立卫生研究院(NCBI)，其中有当今最大、最全面的公共基因表达数据资。我们通过检索GEO数据库得为了进一步验证Kir2.1在髓母组织中的表达情况。具体操作如下：
1.数据集的寻找
进入NCBI的GEO网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，以Medulloblastoma为关键词检索，选择GEO Dadaset，物种设定为Homo sapiens,Attribute设定为Tissue。得到一系列的结果，逐条进行查看，找到具有髓母的数据集。
2.下载分析数据
(1)下载数据:进入GES网页下点击Download family下的Series Matri Files文件进行下载，得到的是原始的数据文件。点击Platforms下的GPL页面下的Download，可以下载到该数据集的平台信息文件。
(2)分析数据：在平台信息文件中查找KCNJ2对应的基因编号。根据编号在数据文件中找到数据，即为KCNJ2的表达数据，同时找到病人及其病理资料，一并复制到新的excel表格中。在新的表格中分析样本之间的KCNJ2的表达差异。
由图1c和1d中可知，Kir2.1在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁组织。
由图1a、1b、1e和1f可知，Kir2.1在non-WNT/SHH亚型中的表达明显高于WNT和 SHH亚型，且Kir2.1的表达水平与170例病人肿瘤的分子亚型呈显著正相关，
由图1g可知，Kir2.1的高表达与non-WNT/SHH亚型的MB患者的不良预后相关。
实施例2
进行侵袭迁移和Western Blot实验，结果如图2可知。
髓母细胞培养
本实验用髓母细胞均培养在含10％FBS的DMED培养基中，保持细胞孵育箱CO2含量5％、温度37℃、湿度95％的条件。细胞生长汇合度达80％-90％时，用胰蛋白酶细胞消化液消化传代培养，MB428和MB913细胞都采用1传3进行传代。每种细胞传至第2代时冻存一半细胞，取第3代至第5代的细胞进行实验。
稳定沉默Kir2.1的髓母细胞株的建立
1.Kir2.1-shRNA干扰慢病毒及无义序列对照慢病毒Santa Cruze公司提供。
2.处于对数生长期的髓母细胞，PBS润洗和消化后，3mL含10％FBS的RPMI 1640 培养基重悬细胞，细胞计数后，按照每孔5×104个细胞接种于6孔板中，培养过夜。
3.将慢病毒加入到细胞培养孔中，培养24h后进行换液。
4.继续培养，待细胞扩增到2皿后用4μg/mL的嘌呤霉素筛选出耐药细胞。
5.采用qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平鉴定干扰效率用于后续试验。
稳定过表达Kir2.1的髓母细胞株的建立
1.Kir2.1过表达慢病毒由上海吉玛基因公司构建、测序、抽屉质粒并作病毒包装。
2.取处于对数生长期的髓母细胞，PBS润洗和消化后，3mL含10％FBS的DMEM培养基重悬细胞，细胞计数后，按照每孔5×104个细胞接种于6孔板中，培养过夜。
3.将稀释好的慢病毒加入到细胞培养孔中，培养24h后进行换液。
4.继续培养，待细胞扩增到3皿后用10μg/mL的嘌呤霉素筛选出耐药细胞。
5.采用qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平鉴定过表达效率。
髓母细胞体外Matrigel-Transwell侵袭实验
采用Matrigel-Transwell模型检测敲低和过表达Kir2.1后细胞的侵袭能力变化，具体操作如下：
1.取Matrigel 40μL与无血清DMEM培养基80μL于1.5mL EP管中混合后放置于冰上备用。
2.将10μL的混合液均匀地涂抹到24孔板用8μm的Transwell小室中膜上，37℃培养箱中孵育直至液体干透。
3.细胞经PBS润洗后用胰酶消化液消化至细胞变圆，2mL含10％FBS DMEM培养基重悬细胞终止反应并重悬，转移至15mL离心管中，800rpm，离心5min。PBS洗涤细胞3 次，进行细胞计数。
4.取1×105个髓母细胞重悬于无FBS的200μL的DMEM培养基中，加入到Transwell小室的上室，小室置于孔板中，并在下室加入500μL的含10％FBS DMEM培养基，37℃， 5％CO2孵箱中静置培养。
5.分别于18h和24h后取出Transwell小室，吸去培养基，PBS润洗3次。
6.将24孔板置于37℃细胞培养箱培养24h后，用PBS润洗小室2次然后用4％多聚甲醛溶液室温固定20min。
7.结晶紫染液染色，用棉签轻轻擦去膜上面的细胞，洗净干燥后置于显微镜下随机选取 5个视野照相并计数细胞，进行统计分析。
髓母细胞体外迁移能力实验
1.细胞铺板：前一天消化待检测细胞，每个6孔板中加入5×105个细胞，培养箱中过夜培养。
2.观察细胞，待长满后，用10μl小枪头在孔板底部垂直划一条平滑的直线。
3.用PBS洗细胞2次，除去多余的细胞，加入无血清DMEM培养基。
4.放入培养箱中继续培养，24h后取出照相，计算每种细胞的迁移率。
Western blot实验
1.样品处理
(1)细胞样品弃去培养基，使用预冷的PBS冲洗3次，直接用预冷的PBS洗涤3次，离心去除PBS留下细胞沉淀，放置于冰上备用。
(2)加入适量细胞裂解液并充分混匀，放置于冰上，每10min后吹打一次，作用30min， 4℃，14000×g离心15min，吸取上清液至新的EP离心管中。
(3)BCA蛋白浓度检测试剂盒测定样品浓度，加入适量蛋白上样缓冲液将所有的样品调至相同的浓度，100℃放置5min使蛋白充分变性，冷却至室温，离心备用。
2.电泳
(1)使用微量注射器上样，每个泳道上样总蛋白为20μg，蛋白Marker与1×loadingbuffer 混合后等样品体积加入相应的孔中。
(2)以溴酚蓝为指示，恒压电泳，蛋白样本在上层胶时使用80V电压，当蛋白样本被压缩得很细并到达下层胶时，调整电压为120V，当溴酚蓝电泳到胶底端时结束电泳。
3.电转湿转：取大小合适的PVDF膜，甲醇活化后转移至转膜缓冲液中。按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序放置，充分去除气泡，将所有转膜转备置于冰水中，200mA恒流转膜2 h。
4.封闭：电转结束后，取出膜放入已配好的封闭液中，室温封闭2h。
5.一抗孵育：封闭结束后，用镊子小心夹出PVDF膜，剪去多余的边角，放置于配置好的一抗中，4℃孵育过夜。
6.洗膜及二抗孵育：第二天取出PVDF膜，PBST摇床上晃动洗涤3次，每次15min。将膜转移至相应种属的二抗液体中，PBST摇床上晃动孵育2h，然后使用PBST洗涤3次，每次15min。
7.图像采集：使用Thermo公司显影液显影。
髓母原位移植瘤小鼠模型的建立
1.实验动物：4-6周龄雄性NOD/SCID小鼠购自湖南斯莱克景达，接种移植瘤后继续饲养于该中心，采用标准无病原菌条件。
2.动物麻醉：使用0.8％的水合氯醛溶液，按50mg/kg体重腹腔注射麻醉NOD/SCID小鼠。
3.接种的细胞数量为每只NOD/SCID小鼠接种5×104个细胞，用10μl无血清的DMEM基础培养基重悬；每组各10只。
4.颅内移植瘤接种方法：选择前囟点右侧2mm，冠状缝之前0.5mm作为进针点，用75％酒精消毒，充分暴露进针部位。使用灭菌的20μl进样器进行注射进针深度约1mm-2mm并有突破感，缓慢间歇推注，注射时长为1min；完成注射后，进样器停留1min后缓慢退出；用75％乙醇溶液消毒进针口。
5.接种颅内原位移植瘤后，每天观察动物生长情况1次直至注射后3个月；发现动物死亡后，及时切取脑组织和脊髓，并固定切片观察成瘤情况。
移植瘤小鼠小脑和脊髓的苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,H&E)
1.脱水、包埋及切片：将移植瘤小鼠小脑和脊髓从福尔马林中取出，做好标记后放置于脱水盒中进行脱水。过夜后取出标本放入包埋机中包埋。然后把石蜡块进行切片，切片厚度为3μm，于温水中适度展片后摊片，烘干保存。
2.脱蜡：将切片放置于60℃烤箱内烘烤30min，随后迅速放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一罐二甲苯内浸泡15min。而后依次放入100％酒精浸泡5min，95％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min，75％酒精浸泡5min，自来水浸泡5min，PBS浸泡5min。
3.苏木精染色：将切片浸入苏木精染液内，染色5min，自来水漂洗3次后浸入盐酸酒精溶液内分化2s，取出后自来水充分漂洗，再将切片浸入自来水中返蓝10min。
4.伊红染色：将切片浸入含伊红染料的梯度酒精溶液内，浓度由低及高分别为75％， 85％，95％和100％，每个浓度的酒精内浸泡5min。
5.透明、封固：将切片转入二甲苯溶液内浸泡2次，每次1min，而后通风橱内自然风干，每张切片滴加50μl中性树胶封片。
6.观察：将切片置于光学显微镜载物台，观察标本组织学形态并拍照。
由图2a和2b可知，Kir2.1高表达后能够明显增强细胞的侵袭能力，敲低之后能降低细胞的侵袭能力。由图2e可知，Kir2.1过表达后小鼠肿瘤更大且有更多的转移灶，生存期也更短；由图2d可知，Kir2.1过表达后有更明显的侵袭边缘和转移灶；由图2f可知，Kir2.1参与了EMT的过程。
实施例3
进行免疫共沉淀实验，结果如图3所示。
免疫共沉淀
免疫共沉淀实验采用Thermo公司的Co-IP试剂盒，具体操作步骤如下：
1.抗体与树脂交联
(1)取交联树脂轻轻混匀，吸取80μL加入层析柱中，1000×g离心1min，Couplingbuffer洗涤2次。
(2)10μg一抗或对应的IgG、10μL氰基硼氢化钠和适量体积的Coupling buffer混合为200μL的抗体交联混合液，封闭层析柱底部，将混合液加到层析柱中，4℃旋转交联2-4h：
2.细胞的收集、裂解及预清除
(1)髓母过表达Kir2.1的细胞培养至汇合度达进行80％时，去除培养基，用预冷PBS 润洗3次，细胞刮收集细胞于15mL离心管中，1000×g离心5min，随后将细胞转移至1.5mL 的EP管中，离心后去除多余的PBS。
(2)收集的细胞中加入含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液，充分吹散细胞，至沉淀消失，放置冰上裂解30min，每10min吹打一次。
(3)吸取80μL对照用交联树脂加入层析柱中，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤2次。
(4)细胞裂解液经过16000×g离心15min后取上清加入到预清除的离心柱中，4℃涡旋混合1h。
3.抗体第二次交联
(1)移除离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤1次，淬灭缓冲液洗涤2次。
(2)10μL氰基硼氢化钠与200μL的淬灭缓冲液混合，加入到离心柱中，封闭底部， 4℃涡旋混合15min。
4.抗体与蛋白交联
(1)移除抗体交联离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤2次， Wash buffer洗涤6次，裂解液2次，封闭底部。
(2)移除蛋白离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，收集流出液加入到抗体交联离心柱中，4℃涡旋混合过夜。
5.蛋白洗脱及变性
(1)移除离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，裂解液洗涤5次，Wash buffer洗涤6次，细胞裂解液洗涤2次。
(2)更换收集管，加入200μL elution buffer，100×g离心1min，再加入50μLelution buffer，作用5min，1000×g离心1min。将50μL的收集液再加入到离心管中作用5min， 1000×g离心1min。
(3)加入50μL的5×上样缓冲液，100℃煮5min，马上放冰上，12000rpm离心2min，随后进行Western blot实验。
质谱分析
1.样本准备
质谱分析的样本来源是免疫沉淀实验，离心管不进行洗脱的操作，直接用Washbuffer 洗涤后1000×g离心1min，封闭上下的开口，冰上保存。
2.质谱分析
本实验的质谱主要由陆军军医大学生物医学分析测试中心完成。制备的样本冰上运输至生物医学分析测试中心，填好相关信息表格。
由图3可知，表明Kir2.1仅与Notch2存在相互作用(如图3b和3c所示)。
实施例4
进行荧光共聚焦实验，结果如图4所示。
细胞免疫荧光
1.取1×105个细胞种植于transwell小室中，37℃，5％CO2培养过夜。PBS润洗3次，4％多聚甲醛室温固定15min，用PBS润洗3次，每次5min。
2. 0.3％Triton X-100孵育15min进行细胞破膜，PBS润洗3次，每次5min，
3.使用10％山羊血清37℃封闭30min。
4.加入稀释好的Kir2.1(1:200稀释)和Notch2(1:100稀释)抗体混合液4℃孵育过夜。
5.PBS润洗3次，每次5min，加入稀释好的647标记的(1:500)和488标记的(1:500)的荧光二抗混合液，37℃孵育30min。
6.PBS润洗3次，每次5min，加入DAPI染核，37℃孵育15min。
7.PBS润洗3次，每次5min，用抗荧光淬灭的封片剂进行封片，4℃保存于避光的湿盒中。
8.激光共聚焦显微镜观察并采集图像
流式检测
1.待检测细胞用胰酶消化，500×g离心5min，去掉多余上清。
2.沉淀用适量无钙镁的PBS重悬。
3.待检测细胞中加入Notch2-APC和IgG-APC抗体，冰上孵育1h，用无钙镁的PBS
洗一次，500g离心5分钟，重悬。
4.重悬后使用BD Aria II流式细胞分选仪器进行检测。
5. 1.5.4胞浆胞核蛋白提取
1.贴壁细胞胰酶消化后，500×g，离心5min收集细胞。
2.收集好的细胞用PBS洗两次。
3.将5×106的细胞转移到收集管中，500×g离心2-3min，去掉多余上清。
4.加入冷的CER I到细胞沉淀中，以最高速度剧烈的重悬细胞沉淀，在冰上放置10min
5.加入预冷的CER II到裂解液中。
6.剧烈涡旋离心管5s，在冰上放置1min，以最高速度剧烈涡旋5s，紧接着16000×g离心5min。
7.立即转移胞浆蛋白到新的离心管中，备用。
8.用预冷的NER裂解液重悬上一步的细胞沉淀。
9.剧烈涡旋细胞核沉淀，每次15s，然后将样品放置冰上10min，接着重复此步骤四次，充分裂解细胞核，16,000×g离心10min。
10.立即转移上清到新的预冷离心管中，测浓度，Western-blot备用。
细胞膜蛋白提取
1.用细胞刮棒将细胞从平板表面刮下，将5×106个细胞重悬在生长培养基中。将得到的细胞悬液以300×g的速度离心5分钟。
2.用3mL细胞清洗液清洗细胞沉淀，300×g离心5分钟。
3.小心移除并丢弃上清液。将细胞重悬在1.5mL的细胞清洗液中并转移到2mL的离心管中。300×g离心5分钟并丢弃上清液。
4.加入0.75mL透化缓冲液到细胞沉淀中。短暂涡旋以获得均质的细胞悬液。在持续混匀条件下在4℃孵育10分钟。
5.将透化后的细胞以16000×g的速度离心15分钟。小心去掉含有胞质蛋白的上清液并转移到一个新的离心管中。
6.加0.5mL的增溶缓冲液到沉淀中并用移液管上下抽吸进行重悬。在持续混匀条件下在4℃孵育30分钟。
7.在4℃下，以16000×g的速度将管子离心15分钟。将含有可溶性膜蛋白和膜相关蛋白的上清液转移到一个新的离心管中。
8.继续进行下游应用。在冰上的胞浆组分和膜组分可以立即使用或者分装后储存在-80℃条件下以备将来使用
由图4a可知，Kir2.1过表达后，Notch2入核增多；由图4b可知，过表达Kir2.1后，细胞膜表面的N2ECD分布量相比对照明显减少；而在敲低Kir2.1后细胞膜表面的N2ECD相比对照明显增多；由图4c可知，过表达Kir2.1可明显增加细胞浆和细胞核中的N2ICD的量，而沉默Kir2.1明显降低细胞浆和细胞核中的N2ICD的量；由图4d可知，敲低Kir2.1可明显降低Notch2靶基因的表达，过表达Kir2.1或Kir2.1-M可明显增加这些蛋白的表达；由图4e 可知，随着Kir2.1的梯度增加，N2ICD的表达量也在随趋势增加，Notch2信号通路的靶蛋白的表达也呈梯度递增的趋势；由图4f和g可知，过表达Kir2.1后敲低Notch2后靶蛋白 C-Myc,Hes1的表达明显降低，沉默Notch2后Kir2.1促进细胞的侵袭能力明显降低。
实施例5
分别用S2酶切抑制剂G1254023X和S3酶切抑制剂RO4929597抑制过表达后的Kir2.1 细胞，结果如图5所示。
Western blot实验
1.样品裂解
(1)细胞样品弃去培养基，使用预冷的PBS冲洗3次，直接用预冷的PBS洗涤3次，离心去除PBS留下细胞沉淀，放置于冰上备用。
(2)加入适量细胞裂解液并充分混匀，放置于冰上，每10min后吹打一次，作用30min， 4℃，14000×g离心15min，吸取上清液至新的EP离心管中。
(3)BCA蛋白浓度检测试剂盒测定样品浓度，加入适量蛋白上样缓冲液将所有的样品调至相同的浓度，100℃放置5min使蛋白充分变性，冷却至室温，离心备用。
2.电泳检测
(1)使用微量注射器上样，每个泳道上样总蛋白为20μg，蛋白Marker与1×loadingbuffer 混合后等样品体积加入相应的孔中。
(2)以溴酚蓝为指示，恒压电泳，蛋白样本在上层胶时使用80V电压，当蛋白样本被压缩得很细并到达下层胶时，调整电压为120V，当溴酚蓝电泳到胶底端时结束电泳。
3.电转湿转：取大小合适的PVDF膜，甲醇活化后转移至转膜缓冲液中。按照滤纸、膜、胶、滤纸的顺序放置，充分去除气泡，将所有转膜转备置于冰水中，200mA恒流转膜2 h。
4.封闭：电转结束后，取出膜放入已配好的封闭液中，室温封闭2h。
5.一抗孵育：封闭结束后，用镊子小心夹出PVDF膜，剪去多余的边角，放置于配置好的一抗中，4℃孵育过夜。
6.洗膜及二抗孵育：第二天取出PVDF膜，PBST摇床上晃动洗涤3次，每次15min。将膜转移至相应种属的二抗液体中，PBST摇床上晃动孵育2h，然后使用PBST洗涤3次，每次15min。
7.图像采集：使用Thermo公司显影液显影。
免疫共沉淀
免疫共沉淀实验采用Thermo公司的Co-IP试剂盒，具体操作步骤如下：
1.抗体与树脂交联
(1)取交联树脂轻轻混匀，吸取80μL加入层析柱中，1000×g离心1min，Couplingbuffer洗涤2次。
(2)10μg一抗或对应的IgG、10μL氰基硼氢化钠和适量体积的Coupling buffer混合为200μL的抗体交联混合液，封闭层析柱底部，将混合液加到层析柱中，4℃旋转交联2-4h：
2.细胞的收集、裂解及预清除
(1)髓母过表达Kir2.1的细胞培养至汇合度达进行80％时，去除培养基，用预冷PBS 润洗3次，细胞刮收集细胞于15mL离心管中，1000×g离心5min，随后将细胞转移至1.5mL 的EP管中，离心后去除多余的PBS。
(2)收集的细胞中加入含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液，充分吹散细胞，至沉淀消失，放置冰上裂解30min，每10min吹打一次。
(3)吸取80μL对照用交联树脂加入层析柱中，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤2次。
(4)细胞裂解液经过16000×g离心15min后取上清加入到预清除的离心柱中，4℃涡旋混合1h。
3.抗体第二次交联
(1)移除离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤1次，淬灭缓冲液洗涤2次。
(2)10μL氰基硼氢化钠与200μL的淬灭缓冲液混合，加入到离心柱中，封闭底部， 4℃涡旋混合15min。
4.抗体与蛋白交联
(1)移除抗体交联离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，Coupling buffer洗涤2次， Wash buffer洗涤6次，裂解液2次，封闭底部。
(2)移除蛋白离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，收集流出液加入到抗体交联离心柱中，4℃涡旋混合过夜。
5.蛋白洗脱及变性
(1)移除离心柱底部的塞子，1000×g离心1min，裂解液洗涤5次，Wash buffer洗涤6次，细胞裂解液洗涤2次。
(2)更换收集管，加入200μL elution buffer，100×g离心1min，再加入50μLelution buffer，作用5min，1000×g离心1min。将50μL的收集液再加入到离心管中作用5min， 1000×g离心1min。
(3)加入50μL的5×上样缓冲液，100℃煮5min，马上放冰上，12000rpm离心2min，随后进行Western blot实验。
流式检测
1.待检测细胞用胰酶消化，500×g离心5min，去掉多余上清。
2.沉淀用适量无钙镁的PBS重悬。
3.待检测细胞中加入Notch2-APC和IgG-APC抗体，冰上孵育1h，用无钙镁的PBS
洗一次，500g离心5分钟，重悬。
4.重悬后使用BD Aria II流式细胞分选仪器进行检测。
由图5a可知，过表达Kir2.1显著降低了膜上全长Notch2(mNotch2-FL)和膜上N2ICD (mN2ICD)的表达量，但是增加了核中N2ICD(nN2ICD)的表达量。GI254023X处理过表达Kir2.1的髓母细胞后显著降低了Kir2.1引起的效应，mNotch2-FL和mN2ICD的表达量明显增加，nN2ICD的表达量明显降低。由图5c可知，Kir2.1与Adam10的存在相互作用；由图5b可知，过表达Kir2.1后，细胞膜表面的Notch2显著减少，当在过表达Kir2.1的细胞中使用抑制剂GI254023X后，这种效应就消失了,表达Kir2.1促进髓母细胞的侵袭，在使用抑制剂GI254023X处理后，这种促细胞侵袭的能力明显降低。由图5e可知，Kir2.1通过与Adam10相互作用促进Notch2的剪切，促进其成熟并入核后激活此信号通路。
实施例6
对非WNT/SHH MB肿瘤进行免疫组化染色，结果如图6a所示；进行生存分析，结果图6c和6d所示。
免疫组织化学染色
1.切片：所有的石蜡标本统一编号后，放入-20℃冰箱预冷冻、接着进行切片、摊片及风干等步骤。切片的厚度均为3μm。
2.脱蜡：将石蜡切片放置到铁架子上，于60℃烤箱内烘烤45min，随后迅速放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一缸二甲苯内浸泡15min。然后依次放入100％酒精浸泡10min，95％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min，75％酒精浸泡5min，自来水浸泡5min，PBS浸泡5min。
3.抗原修复：PBS润洗3次，每次5min。将切片放于装有修复液的高压锅中，加热至100℃后盖上盖子，高压作用2min30s。接着自来水冲洗降温高压锅，取出架子装入盛有修复液的修复盒中，自然冷却到室温。
4.内源性过氧化氢酶的灭活：取出浸泡在修复液中的切片，PBS润洗3次，每次5min，加入3％H2O2，37℃作用30min。
5.封闭：取出灭活的切片，PBS润洗3次，每次5min。取出切片放于湿盒中，切片组织上滴加山羊封闭血清，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
6.一抗孵育：切片轻轻地甩掉封闭血清，在组织切片上滴加稀释好的抗体，盖上湿盒盖， 4℃冰箱内孵育过夜。
7.二抗孵育：取出湿盒放于37℃烤箱中复温15min。将切片放于修复盒中PBS润洗3次，每次5min。而后取出切片放于湿盒中，切片上滴加辣根过氧化物酶(3,3’-diaminobenzidine, DAB)标记的二抗，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
8.显色：取出湿盒，将切片放于修复盒中PBS浸洗3次，每次5min。而后取出切片放于显微镜下，滴加DAB显色液。当显色到合适的程度立刻放到水中终止反应。
9.复染：自来水润洗3次，将切片浸入苏木精溶液内染色20s，然后用自来水充分漂洗，再浸入盐酸酒精分化液内作用1s后取出，在流动的自来水中浸泡返蓝。
10.脱水、透明及封固：将复染的切片依次放入75％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min， 95％酒精浸泡5min，100％酒精浸泡10min。随后放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一罐二甲苯内浸泡15min。取出切片，放于通风橱中自然风干，随后滴加中性树胶50μL，用盖玻片封片，37℃烤箱中除去气泡后扫描保存。
采用SPSS 20.0统计学软件分析所有数据，使用Kaplan-Meier方法估计Kir2.1表达水平与髓母患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)的关系。p<0.05被认为具有统计学差异。
由图6a可知，Kir2.1和nN2ICD的表达情况并不完全一致。由图6c和6d可知，Kir2.1和nN2ICD均高表达的患者生存期最短。
实施例7
在小鼠体内移植来自Kir2.1过表达的原位肿瘤细胞及其对照细胞，用S2酶切的抑制剂 G1254023X治疗，结果如图7a所示；进一步进行生存分析，结果如图7d所示。
髓母原位移植瘤小鼠模型的建立
1.实验动物：4-6周龄雄性NOD/SCID小鼠购自湖南斯莱克景达，接种移植瘤后继续饲养于该中心，采用标准无病原菌条件。
2.动物麻醉：使用0.8％的水合氯醛溶液，按50mg/kg体重腹腔注射麻醉NOD/SCID小鼠。
3.接种的细胞数量为每只NOD/SCID小鼠接种5×104个细胞，用10μl无血清的DMEM基础培养基重悬；每组各10只。
4.颅内移植瘤接种方法：选择前囟点右侧2mm，冠状缝之前0.5mm作为进针点，用75％酒精消毒，充分暴露进针部位。使用灭菌的20μl进样器进行注射进针深度约1mm-2mm并有突破感，缓慢间歇推注，注射时长为1min；完成注射后，进样器停留1min后缓慢退出；用75％乙醇溶液消毒进针口。
5.将NOD/SCID小鼠分组为：对照组、对照-GI254023X给药组、Kir2.1过表达组、Kir2.1 过表达组-GI254023X给药组。自移植瘤种植7后开始给药，对照-GI254023X给药组和过表达组-GI254023X给药组的给药GI254023X(将GI254023X溶于0.1M Na2CO3溶液里)，剂量为100mg/kg/day，对照组和Kir2.1过表达组给予相应剂量安慰剂(0.1M Na2CO3溶液)，每星期连续给药5天，持续两个星期。
6.于移植瘤种植第7天、14天和21天进行小动物活体成像，即每只小鼠腹腔注射200 μl荧光素酶底物，使用异氟烷麻醉后于IVIS活体成像仪中进行拍照观察；
7.NOD-SCID小鼠出现较重神经系统症状后，对其进行安乐死并统计生存期。
免疫组织化学染色
1.切片：所有的石蜡标本统一编号后，放入-20℃冰箱预冷冻、接着进行切片、摊片及风干等步骤。切片的厚度均为3μm。
2.脱蜡：将石蜡切片放置到铁架子上，于60℃烤箱内烘烤45min，随后迅速放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一缸二甲苯内浸泡15min。然后依次放入100％酒精浸泡10min，95％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min，75％酒精浸泡5min，自来水浸泡5min，PBS浸泡5min。
3.抗原修复：PBS润洗3次，每次5min。将切片放于装有修复液的高压锅中，加热至100℃后盖上盖子，高压作用2min30s。接着自来水冲洗降温高压锅，取出架子装入盛有修复液的修复盒中，自然冷却到室温。
4.内源性过氧化氢酶的灭活：取出浸泡在修复液中的切片，PBS润洗3次，每次5min，加入3％H2O2，37℃作用30min。
5.封闭：取出灭活的切片，PBS润洗3次，每次5min。取出切片放于湿盒中，切片组织上滴加山羊封闭血清，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
6.一抗孵育：切片轻轻地甩掉封闭血清，在组织切片上滴加稀释好的抗体，盖上湿盒盖， 4℃冰箱内孵育过夜。
7.二抗孵育：取出湿盒放于37℃烤箱中复温15min。将切片放于修复盒中PBS润洗3次，每次5min。而后取出切片放于湿盒中，切片上滴加辣根过氧化物酶(3,3’-diaminobenzidine, DAB)标记的二抗，盖上湿盒盖。37℃烤箱中作用30min。
8.显色：取出湿盒，将切片放于修复盒中PBS浸洗3次，每次5min。而后取出切片放于显微镜下，滴加DAB显色液。当显色到合适的程度立刻放到水中终止反应。
9.复染：自来水润洗3次，将切片浸入苏木精溶液内染色20s，然后用自来水充分漂洗，再浸入盐酸酒精分化液内作用1s后取出，在流动的自来水中浸泡返蓝。
10.脱水、透明及封固：将复染的切片依次放入75％酒精浸泡5min，85％酒精浸泡5min， 95％酒精浸泡5min，100％酒精浸泡10min。随后放于二甲苯内浸泡15min。再放于另一罐二甲苯内浸泡15min。取出切片，放于通风橱中自然风干，随后滴加中性树胶50μL，用盖玻片封片，37℃烤箱中除去气泡后扫描保存。
采用SPSS 20.0统计学软件分析所有数据，使用Kaplan-Meier方法估计Kir2.1表达水平与髓母患者的总生存期(OS)和无进展生存期(PFS)的关系。p<0.05被认为具有统计学差异。
由图7a和b可知，GI254023X处理后，能明显抑制移植瘤的生长，且对过表达Kir2.1的MB428细胞形成的移植瘤的抑制效果明显高于对照组细胞形成的移植瘤，由图7c可知，GI254023X处理后可明显抑制nN2ICD入核。由图7可知，移植瘤小鼠经GI254023X处理后能明显延长其生存期。
综上，Kir2.1/Notch2是髓母患者的独立预后因素，抑制Notch2信号通路可以作为Kir2.1high/nN2ICDhigh型髓母病人的治疗靶点。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.内向整流钾离子通道2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂或药物是指调控或检测内向整流钾离子通道2.1的表达水平的试剂或药物。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物是抑制内向整流钾离子通道2.1活性的药物。
4.如权要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述髓母细胞瘤是指非WNT/SHH髓母细胞瘤。
5.靶向内向整流钾离子通道2.1的抑制剂在制备治疗或预防髓母细胞瘤的药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述髓母细胞瘤是指非WNT/SHH髓母细胞瘤。
CN202111081703.8A 2021-09-15 2021-09-15 Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用 Pending CN113884678A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111081703.8A CN113884678A (zh) 2021-09-15 2021-09-15 Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111081703.8A CN113884678A (zh) 2021-09-15 2021-09-15 Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113884678A true CN113884678A (zh) 2022-01-04

Family

ID=79009427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111081703.8A Pending CN113884678A (zh) 2021-09-15 2021-09-15 Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113884678A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110609136A (zh) * 2019-09-18 2019-12-24 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 Zyx斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断及治疗中的应用
US20200262877A1 (en) * 2017-10-09 2020-08-20 Blaze Bioscience, Inc. Ion channel-binding peptides and methods of use thereof
CN114225036A (zh) * 2021-12-08 2022-03-25 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 Atxn1蛋白作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的药物或试剂盒中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200262877A1 (en) * 2017-10-09 2020-08-20 Blaze Bioscience, Inc. Ion channel-binding peptides and methods of use thereof
CN110609136A (zh) * 2019-09-18 2019-12-24 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 Zyx斑联蛋白在恶性脑胶质母细胞瘤诊断及治疗中的应用
CN114225036A (zh) * 2021-12-08 2022-03-25 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 Atxn1蛋白作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的药物或试剂盒中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCESCA VALDORA ET AL.,: "Abstract 1424: KCNJ2 comprises a marker of poor prognosis and a therapeutic target in non-WNT/non-SHH medulloblastoma", CANCER RES (2012) 72 (8_SUPPLEMENT), 15 April 2012 (2012-04-15) *
WANG YANXIA: "elevated kir2.1/nuclear N2ICD defines a highly malignant subtype of non-WNT/SHH medulloblastomas", SIGNAL TRANSDUCTION AND TARGETED THERAPY, 11 March 2022 (2022-03-11) *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11344601B2 (en) Tumor microenvironment-related target TAK1 and application thereof in inhibition of tumor
CN105368853B (zh) 一种与非小细胞肺癌辅助诊断相关的标志物及其应用
JP6281873B2 (ja) 新規癌マーカーおよびその利用
CN110302382A (zh) 一种靶向肿瘤细胞的药物
CN113908283A (zh) Prmt5抑制剂及其与pd-l1抗体阻断剂联合在治疗肺癌上的应用
CN111621567A (zh) 用于诊断肝癌的标志物及其检测试剂和应用
CN108203732A (zh) Trim24在胶质瘤诊断中的应用
Wei et al. Orthotopic xenograft mouse model of cervical cancer for studying the role of MicroRNA-21 in promoting lymph node metastasis
CN110927389B (zh) 一种癌症生物标志物、用途
CN114225036B (zh) Atxn1蛋白作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的药物或试剂盒中的应用
CN113884678A (zh) Kir2.1作为靶点在制备治疗、预防或诊断髓母细胞瘤的试剂或药物中的应用
CN111826442B (zh) 预防肺癌靶标plekhn1及其应用
CN113265463B (zh) Fam84b在制备食管鳞癌预后评估试剂以及在靶向治疗食管鳞癌药物的筛选中的应用
CN114480631B (zh) Inpp5f用于制备肝癌组织肿瘤预后、诊断或防治的药物的用途
CN105193806B (zh) 石蒜碱作为hmgb1蛋白抑制剂的新用途
CN113855675A (zh) 基于胆囊癌标志物的试剂盒及药物
CN115837079A (zh) Igf2bp1高表达在食管癌检测和治疗中的应用
CN112980948A (zh) Nfat3作为治疗靶点在筛选或制备头颈部鳞状细胞癌药物中的应用
CN112656805A (zh) 抑制ythdf1活性的物质在制备预防或治疗胃癌产品中的应用
CN110742899A (zh) miR-140在制备抑制乳腺癌增殖和迁移药物中的用途
CN109295101A (zh) 过表达miR-125a-5p慢性病毒载体构建方法及其应用
CN114075600B (zh) Orm2基因及蛋白在作为肿瘤治疗靶点中的应用
CN115976203B (zh) Hap1在制备诊断、预防和/或治疗胃癌的产品中的应用
CN114774547B (zh) 一种与人骨肉瘤相关的分子标记物usp13及其应用
CN110951875B (zh) Pafah1b3在制备骨肉瘤的诊断标记物和治疗骨肉瘤药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination