CN110951877A

CN110951877A - 用于检测mn1基因相对表达量的引物，探针

Info

Publication number: CN110951877A
Application number: CN201911326791.6A
Authority: CN
Inventors: 裘振亚; 李允章; 王淑一
Original assignee: JINAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Current assignee: JINAN ADICON CLINICAL LABORATORIES Inc
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明公开了用于检测样本中MN1基因相对表达量的引物和探针，包括：检测MN1基因相对表达量的引物MN1‑F、MN1‑R，探针MN1‑Probe，检测内参基因ABL的引物ABL‑F，ABL‑R，探针ABL‑Probe。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。MN1基因表达水平检测可以有助于探讨其与AML的预后转归。

Description

用于检测MN1基因相对表达量的引物，探针

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测MN1基因相对表达量的引物和探针，采用探针实时荧光定量PCR技术，预测AML预后，MN1基因表达水平检测可以有助于探讨其与AML的预后转归。

背景技术

白血病(1eukemia)是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，其白血病细胞增殖失控、分化障碍、凋亡受阻，从而停滞在细胞发育的不同阶段。白血病细胞在骨髓中恶性增殖，并广泛浸润肝、脾、淋巴结等各器官，抑制正常造血功能，红细胞、白细胞和血小板生成减少，从而导致贫血、感染、出血、浸润等临床表现，严重危害患者生命。在我国，白血病的发病率约为2.76/10万，急性白血病比慢性白血病多见(约5：5：1)，其中又以急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML)最多见(发病率约1.62/10万)。急性髓系白血病的细胞分化停滞在较早阶段，多为原始细胞及早期幼稚细胞，病情发展迅速，自然病程仅为几个月。目前治疗急性髓系白血病主要有两种方法：化疗和骨髓移植，均显著延长了患者的生存期，甚至部分患者得到治愈。然而，化疗耐药、化疗缓解后复发，以及大部分患者无法找到合适供者或不适合做移植仍是目前白血病治疗中的突出难题。所以临床上亟待寻找治疗白血病的新策略。我国学者在急性早幼粒细胞白血病融合基因的结构、功能和应用诱导分化剂全反式维甲酸治疗的研究中取得重大突破，提示针对白血病基因的靶向治疗有可能成为今后白血病治疗乃至所有肿瘤治疗最主要的途径之一。而寻找诱发白血病的关键的异常基因靶点成了目前的研究白血病发生机制和白血病治疗的热点。其中脑膜瘤1(meningioma1，MN1) 基因和微小RNA(microRNA，miRNA)在AML患者中异常表达。脑膜瘤MN1基因位于人类染色体22q11，编码分子量为136KD的核蛋白，该蛋白可间接地与 RAR/RXR或维生素D受体结合，调节靶基因的转录，从而影响髓系的分化。最初发现于脑膜瘤患者，新近研究表明它与白血病，尤其是AML的关系甚为密切。本研究采用半定量RT—PcR方法，对白血病细胞中MN1的表达水平进行了检测，旨在探讨其在AML发生发展中的意义。

发明内容

鉴于现有技术中检测MN1基因的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术检测WT1两种基因相对表达量。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳。

用于检测MN1基因相对表达量的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括：

(1)检测MN1基因的引物MN1-F、MN1-R，探针MN1-Probe，其中，

MN1-F：TGGGAGAAGGCCAAACC

MN1-R：GCAGTGGACAGACAGGCAC

MN1-Probe：FAM-CCAACAGCAAAGAAGCCCACGA-TAMRA

(2)检测内参基因ABL的引物ABL-F，ABL-R，探针ABL-Probe；其中，

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

进一步地，MN1上游引物、下游引物和探针的摩尔比为1:1:1。 ABL-F:ABL-R:ABL-Probe的摩尔比为1:1:1。

本发明的有益效果：本发明将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因ABL和目的基因MN1的定量标准曲线，检测受测者体内MN1的相对于内参基因的表达水平。相比于以往的免疫组化方法和现今的△△CT法，具有精度高，结果便于判读等优点。加之将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。综上所述，MN1基因表达水平检测可以有助于探讨其与AML 的预后意义。

附图说明

图1：MN1阳性结果示意图。

图2：MN1阴性结果示意图。

具体实施方式

实施例1

用于检测白血病患者体内MN1基因表达水平的试剂盒，包括：

RNA提取试剂：RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒(TIANGEN 公司)

RNA反转录试剂：Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒(TOYOBO)。

检测体系PCR反应液：THUNDERBIRD Probe qPCR Mix试剂盒 (TOYOBO)。检测体系PCR反应液包括检测MN1基因的上游引物MN1-F、下游引物MN1-R和探针MN1-Probe，与检测内参基因ABL的上游引物ABL-F、下游引物ABL-R和探针ABL-Probe，

其中：

MN1-F：TGGGAGAAGGCCAAACC

MN1-R：GCAGTGGACAGACAGGCAC

MN1-Probe：FAM-CCAACAGCAAAGAAGCCCACGA-TAMRA

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

阳性对照品：含MN1基因组溶液；阴性对照品：不含MN1基因组溶液。

实施例2

(1)参考TIANGEN公司的RNAsimple Total RNA Kit总RNA提取试剂盒说明书，提取出血液中的RNA。

(2)参考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA。

(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各X ul，每人份23ul 分装，如表1所示：

X＝23ul反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；

表1MN1反应体系

其中Forward Primer、Reverse Primer和TagMan Probe分别选自MN1-F、MN1-R 和MN1-Probe，或者ABL-F、ABL-R和ABL-Probe。

(4)加样：将(3)中配制的检测体系PCR反应液和步骤(2)中制备出的cDNA 2μl加入到96孔板的孔或者反应管中；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。每个样本也需要2个重复以确保结果的稳定。

(5)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器:ABI 7500。反应条件： 95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec 40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。

(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。

1)内参阳性时，检测结果才认为有效；

2)阳性判断标准：Ct<36，为阳性；36≤Ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；Ct＞38，为阴性。

实施例3

检测临床血液样本

取送检的外周血样本数22例，按实施例2所述方法提取样本RNA、配制试剂并检测。每例样本加入检测体系PCR反应液中2ul。同时做阳性、阴性和空白对照，内参基因/目的基因的标准曲线各一份。每个样本2个重复以确保结果的稳定。通过对24例正常人(MN1表达量/ABL内参表达量)比值的统计分析，MN1和内参 ABL均有扩增(具体浓度值见表2)，得到正常人的表达范围。(排除无效样本4例) 由此得结果：当0<MN1/ABL<0.07时，为低表达；当0.07<MN1/ABL<0.37时，为中表达；当MN1/ABL>0.37时，为高表达。

表2检测正常人MN1相对表达量

实施例4

采用本发明的方法检测白血病患者外周血样本。

取送检的白血病患者外周血样本22例，按实施例2所述方法提取RNA、进行逆转录、配制试剂并进行荧光定量PCR检测。

对每份样本而言，取2μL经逆转录获得的cDNA，加入到检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性、空白对照各一份，内参基因/目的基因的标准曲线各两份。一台96孔的荧光PCR仪可同时检测16份样本，每份样本重复2次，一份阳性对照品，一份阴性对照品和一份空白对照品。

检测结果如表3所示，与实施例3的正常对照样本结果相比，P<0.05,所以这批AML临床样本的MN1表达量明显降低，从临床意义来说，MN1表达量降低，提示预后良好！

表3检测白血病患者MN1相对表达量

本发明可快速检测样本中MN1基因表达量的多少。利用本发明完成的检测结果准确且灵敏，MN1基因表达水平检测可以有助于探讨其与人类急性髓系白血病(AcuteMyeloid Leukemia，AML)的预后转归。

序列表

<120> 用于检测MN1基因相对表达量的引物，探针

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgggagaagg ccaaacc 17

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagtggaca gacaggcac 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccaacagcaa agaagcccac ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gatacgaagg gagggtgtac ca 22

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcggccagg gtgttgaa 18

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcttctgat ggcaagctct acgtctcct 29

Claims

1.用于检测MN1基因相对表达量的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针包括：

(1)检测MN1基因的引物MN1-F、MN1-R，探针MN1-Probe，其中，

MN1-F：TGGGAGAAGGCCAAACC

MN1-R：GCAGTGGACAGACAGGCAC

MN1-Probe：FAM-CCAACAGCAAAGAAGCCCACGA-TAMRA

(2)检测内参基因ABL的引物ABL-F，ABL-R，探针ABL-Probe；其中，

ABL-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA

ABL-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA

ABL-Probe：FAM-TGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于MN1上游引物、下游引物和探针的摩尔比为1:1:1。

3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于ABL-F：ABL-R:ABL-Probe的摩尔比为1:1:1。