CN103173559A - 实时荧光pcr中目的基因的表达量的校正方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，本方法主要是通过看家基因模板和已有cDNA按照一定比例的混合以后作为模板进行荧光定量，根据混合的比例所导致的Ct值的差异来计算得到看家基因在各个样本中的表达量，通过这个定量结果来对目的基因的表达量进行校正。

Description

实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法

技术领域：

本发明涉及实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，属于分子生物学领域。

背景技术：

核酸扩增和检测技术是当今生物学研究的重要手段之一。包括基础科学、生物技术、医学研究、法医学、诊断学等在内的各领域的科学家们用这种方法进行广泛的应用研究^[5]。对于某些应用，核酸定性检测就可以满足需求；而另外一些应用，要求进行定量分析。常规PCR中，扩增产物(扩增子)是通过终点法来分析检测，即PCR反应结束后，DNA通过琼脂糖凝胶电泳，然后进行成像分析。而荧光定量PCR可以在反应进行过程中进行累积扩增产物的分析和检测，即“实时”。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异引物或探针；专门的热循环仪配备荧光检测模块，用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反映了每个循环扩增产物的量。

相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即q-PCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。

1996年荧光PCR技术首次由美国AppliedBiosystems公司推出，它是在总结PCR技术的的基础上发展起来的实时定量技术。主要运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针和cDNA结合，然后利用DNA聚合酶的5’-3’的外切活性将探针切断，使探针由于能量传递结构的破坏而发出荧光。相对常规PCR而言，荧光定量PCR的主要优点是准确地确定初始模板拷贝数和宽的动态范围内和高的灵敏度。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一段序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即qPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间，提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。

实时定量PCR(q-PCR)是基因表达分析中一种最常用的技术，能同时测定基因在不同组织中的表达量，而且只需要微量的初始样本量。然而采用荧光定量技术研究基因的表达量需要对初始数据进行标准化，因为不同样本间TotalRNA的初始含量是不同的(特别是在活体的组织中)，这是由于在RNA提取和cDNA合成过程中大量的误差造成的。为了控制这些不是实验设计造成的变异，看家基因被广泛的使用。理想的看家基因是在不同的组织不同的阶段能够持续恒定的表达，且不受实验处理的影响和在同样的基因定量分析数据过程中能够产生同样的效应(即具有可重复操作性)。在之前试验中看家基因的选择往往是凭借经验进行的，所选择的看家基因在不同的组织或者不同的条件下能否稳定地表达并没有经过验证，容易造成最后分析结果的不准确，目前对mRNA的看家基因相关方面的评估已经引起关注和重视，已有大量的文章对此进行报道，其中包括猪的。由此可见，选择一组可靠的看家基因数据对标准化定量数据至关重要的，如果选择不正确会造成定量分析中的结论不准确。

在实时荧光PCR中，模板的定量有两种方法：相对定量和绝对定量。相对定量指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。绝对定量指用已知的标准曲线来推算未知的样本量。

绝对定量是通过样品的CT值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。绝对定量中，未知样本的量(即拷贝数或单位数量)可以通过从已知量的标准品范围中推算得出。为了建立标准曲线，需要已知浓度的模板。模板稀释后，用这些稀释样品作为标准样品，将未知的待测样本和标准样置于同一次实验中进行反应，用稀释的标准样品构建标准曲线，通过推算来确定未知样本中目的基因的量。这与用分子量标记来判定琼脂糖凝胶上未知DNA条带分子量大小的原理相似。

相对定量分为两种。一是以质量单位作为标准进行相对定量，用质量单位(如细胞数目或核酸的微克数)而不用参照基因作为标准的优点是，实验设计概念简单，数据数学分析处理简单易学。无论细胞数目或核酸质量是否作为标准，这个方法要求准确地量化初始材料。当用相对定量法比较多个样本时，选择一个样本作为校验样本(Calibrator，即我们常说的对照)，所有其它样本目标基因的表达都以对照为标准上调或下调。通常用未处理或基准样本作为对照。

二是以参照基因作为标准进行相对定量，用参照基因(如GAPDH或β-actin)而不用质量单位作为标准的优点是，这个方法能准确量化初始材料的载量，尤其当初始材料量常常受限时，进行相对基因表达分析实验十分方便，缺点是这个方法要求得到一个或多个在所有测试样本中恒定表达的已知参照基因，而且表达水平不受研究条件下处理方式的影响。确定这样的参照基因十分重要，最近有报道提出在大多数研究实验中，使用多个参照基因对于准确定量是必须的。以参照基因作为标准的相对定量又分为：(a)Livak法，即众所周知的2^-ΔΔCT法；(b)用参照基因的2^-ΔCT法；(c)Pfaffl法。

2^-ΔΔCT法是现在最常用的基因相对表达量分析方法，其具体推导方法如下：

PCR指数扩增的公式是：

X_n＝X₀×(1+E_x)ⁿ，     [1]

X_n是第n个循环后目标分子数；

X₀是初始目标分子数；

E_x是目标分子扩增效率；

n是循环数；

C_T代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：

$X_T=X_0\×{(1+E_X)}^{C_{T.X}}=K_X---\left[2\right]$

XT是目标分子达到设定的阈值时的分子数；

CT，X是目标分子扩增达到阈值时的循环数；

Kx是一个常数。对于内参反应而言，也有同样的公式：

$R_T=R_0\×{(1+E_R)}^{C_{T.R}}=K_R,---\left[3\right]$

用XT除以RT得到：

$\frac{X_T}{R_T}=\frac{X_0\×{(1+E_X)}^{C_{T.X}}}{R_0\×{(1+E_R)}^{C_{T.R}}}=\frac{K_X}{K_R}=K.---\left(4\right)$

对于使用Taqman探针的实时扩增而言，XT和RT的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以及荧光阈值的设定。因此常数K并不一定等于1。

假设目标序列与内参序列扩增效率相同：

E_X＝E_R＝E，

$\frac{X_0}{R_0}\×{(1+E)}^{C_{T.X}-C_{T.R}}=K,---\left[5\right]$

或：

$X_N\×{(1+E)}^{{\mathrm{\ΔC}}_T}=K,---\left[6\right]$

XN代表经过均一化处理过的初始目标分子量；ΔCT表示目标基因和内标基因CT值的差异(CT，X-CT，R)

整理上式得：

$X_N=K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_T}.---\left[7\right]$

最后用任一样本q的XN除以参照因子(calibrator，cb)的XN得到：

$\frac{X_{N.q}}{X_{N.\mathrm{cb}}}=\frac{K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_{T.q}}}{K\×{(1+E)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_{T.\mathrm{cb}}}}={(1+E)}^{-\mathrm{\Δ\Δ}{C}_T}.---\left[8\right]$

在这里-ΔΔC_T＝-(ΔC_T.q-ΔC_T.cb).

对于一个少于150bp的扩增片断而言，如果Mg2+浓度、引物都进行了适当的优化，扩增效率接近于1。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是：

$\mathrm{amount\; of\; t}\arg \mathrm{et}=2^{-\mathrm{\Δ\Δ}{C}_T}.---\left[9\right]$

针对看家基因而言，根据上述过程得到相对表达量后再根据所选看家基因的数目不同以相对表达量(单个看家基因)或者相对表达量的几何平均数(多个看家基因)作为校正系数对目的基因的表达量进行校正。

现有的看家基因对基因表达量进行校正的方法(根据2^-ΔΔCT法、参照基因的2^-ΔCT法、Pfaffl法所得相对表达量或者相对表达量的几何平均数)都是基于看家基因在各个组织中的表达稳定一致的基础上，通过看家基因来建立标尺来对基因的表达量进行校正的。但是由于组织之间代谢方式等的不同，必然导致看家基因在组织之间的差异性表达，现有方法不能根据基因在不同组织的表达量不同进行不同的校正，不能体现组织之间的差异。

实时荧光定量(qRT-PCR)：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法^[2]。

Ct：也称循环阈值，c代表Cycle，.代表threshold。其含义是：在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct值取决于阈值。经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数(dRn)成反比^[3]。

反转录：反转录是以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程，是DNA生物合成的一种特殊方式。

看家基因：管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。

2^-ΔΔCT法：根据荧光定量所得Ct值，进行2^(-Ct)将Ct值转化为线性关系，计算得到基因相对表达量的方法。

通过内标RNA可以对加入RNA的量的差异进行校正。

方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR实验的一部分数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始RNA量的时候：例如，在能得到的RNA量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用PCR实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA合成的RNA量，然后将相同的RNA反转录产生的cDNA用于PCR定量反应。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，目标基因和内标合二为一。在这个例子中，公式[2]不被公式[3]除，公式[5]变成：

$X_0\×{(1+E_X)}^{C_{T.X}}=K_X.---\left[10\right]$

整理得：

$X_0=K_X\×{(1+E_X)}^{-C_{T.X}}.---\left[11\right]$

任一样品X 0，q除以参照品X 0，cb得：

$\frac{X_{0.q}}{X_{0.\mathrm{cb}}}=\frac{K_X\×{(1+E_X)}^{-C_{T.q}}}{K_X\×{(1+E_X)}^{-C_{T.\mathrm{cb}}}}={(1+E_X)}^{-\mathrm{\Δ}{C}_T},---\left[12\right]$

在这里ΔCT’＝C T，q-C T，cb。ΔC T’与前面计算中用的ΔC T(用目标基因C T值减去参照基因C T值)相互区别。

就象在2^-ΔΔCT的推导部分部分所描述的，如果条件优化较好，效率接近于1，内标相对于参照因子为：

$2^{-\mathrm{\Δ}{C}_T}.---\left[13\right]$

Pfaffl法：用于相对定量荧光定量PCR的数据处理方法。目标基因与内标基因扩增效率相差较大，特别适用于国内习惯于将内标与目标分开扩增。不需要标准曲线，结果比delta-delta-Ct法更加精确。需要知道在Ct值处的扩增效率。

推导过程为：

设：M01：处理1目标基因初始拷贝数，Mn1：处理1目标基因n次循环后拷贝数；

M02：处理2目标基因初始拷贝数，Mn2：处理2目标基因n次循环后拷贝数；

N01：处理1内标基因初始拷贝数，Nn1：处理1目标基因n次循环后拷贝数；

N02：处理2内标基因初始拷贝数，Nn2：处理1目标基因n次循环后拷贝数；

E_M：目标基因扩增效率，E_N：内标基因扩增效率；

CtM2：处理2目标基因的Ct值，CtM1：处理1目标基因的Ct值；

CtN2：处理2内标基因的Ct值，CtM1：处理1内标基因的Ct值。

目标基因扩增结果：

Mn2＝M02(1+E_M)ⁿ

Mn1＝M01(1+E_M)ⁿ

将Ct带入：

Mct2＝M02(1+E_M)^CtM2＝A(域值)

Mct1＝M01(1+E_M)^CtM1＝A(域值)

两式相除得：

M02/M01＝(1+E_M)^CtM2-CtM1          1

同理得：

N02/N01＝(1+E_N)^CtN2-CtN1          2

两个处理的目标基因相对表达量为：(利用1式和2式)

(M02/N02)∶(M01/N01)＝(1+E_M)^CtM2-CtM1/(1+E_N)^CtN2-CtN1

发明内容：

针对现在看家基因对基因表达量进行校正的方法(2^-ΔΔCT法、参照基因的2^-ΔCT法、Pfaffl法)都是基于看家基因在各个组织中的表达稳定一致的基础，通过看家基因建立标尺来对基因的表达量进行校正的，但是由于组织之间代谢方式等的不同，看家基因在组织之间的差异性表达，不能根据基因在不同组织的表达量不同进行不同的校正，不能体现组织之间的差异。本方法主要是通过看家基因模板和已有cDNA按照一定比例的混合以后作为模板进行荧光定量，根据混合的比例所导致的Ct值的差异来计算得到看家基因在各个样本中的表达量，通过这个定量结果来对目的基因的表达量进行校正。

1)按照设定的体积比将反转录产物的试验样品和参照模板混合作为模板cDNA进行荧光定量PCR反应，并针对每一个不同的样本分别重复以上步骤得到Ct_{(1。。。。n)}；

2)在进行实时荧光定量PCR反应增加以参照模板为样本的反应孔，体积总量与步骤(1)，得到Ct₀；

3)按照2^-ΔCT法、2^-ΔΔCT法或者Pfaffl法得到基因的相对表达量；

4)根据步骤1)的混合比例得到方程一：ax+by＝2^(-Ct_n)，根据步骤2)得到方程二：(a+b)y＝2^(-Ct₀)，联解方程组可以得到各个样本看家基因的相对表达量X；

5)以根据方程组联解得到的看家基因相对表达量来对目的基因表达量进行校正。

在本发明的一个优选实施方式中，所述n为1。

附图说明：

图1：实时荧光PCR中看家基因表达量的校正方法。

具体实施方式：

下面结合附图1详细介绍本发明的具体实施方式，其中图1中cDNA模板为实验样品反转录所得cDNA；产物稀释物为参照cDNA模板，可以利用PCR反应产物的稀释物代替(可以通过单独添加的几孔以该cDNA为样品的荧光定量对其相对含量进行测定)；

a和b为cDNA模板与产物稀释物的混合比例，总量以具体反应体系中对模板的要求为准；

Ct_n是以cDNA模板与产物稀释物的混合物(混合比例我a：b)为模板进行实时荧光定量反应所得到的Ct值；

Ct₀是以产物稀释物为模板进行实时荧光定量反应所得到的Ct值；

x_n为看家基因在各个样本中的相对表达量。

以25微升体系为例，具体操作为：

1.对温度梯度(或其他该基因的PCR产物)的产物进行稀释以后作为参照cDNA；

2.以参照基因cDNA为模板(模板加入2微升)进行荧光定量检测，得到Ct₀；

3.将反转录得到的试验样品(n)的cDNA和参照cDNA按照a：b的比例(总体积为2微升)进行混合以后作为模板进行荧光定量，得到Ct_n；

4.每一个实验样品cDNA都按照3的操作进行，得到各自的Ct值(Ct_n)；

5.根据Ct₀可以计算得到参照cDNA的相对量(y)；

6.根据Ct_n值计算得到混合模板的相对总浓度(2^(-Ct_n))；

7.再根据已得y值、2^(-Ct_n)和公式ax_n+by＝2^(-Ct_n)可以计算得到看家基因在实验样品中的相对浓度。

应当理解的是，上述具体实施方式仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.实时荧光PCR中目的基因的表达量的校正方法，其特征在于包括如下步骤：

1)按照设定的体积比a：b将反转录产物的试验样品和参照模板混合作为模板cDNA进行荧光定量PCR反应，并针对每一个不同的样本分别重复以上步骤得到Ct_{(1。。。。n)}；

2)在进行实时荧光定量PCR反应时增加以参照模板为样本的反应孔，体积总量与步骤(1)相同，得到Ct₀；

3)按照2^-ΔCT法、2^-ΔΔCT法或者Pfaffl法得到基因的相对表达量；

4)根据步骤1)的混合比例得到方程一：ax+by＝2^(-Ct_n)，根据步骤2)得到方程二：(a+b)y＝2^(-Ct₀)，联解方程组可以得到各个样本看家基因的相对表达量x；

5)以根据方程组联解得到的看家基因相对表达量来对目的基因表达量进行校正。

2.根据权利要求1所述的校正方法，其特征在于所述的2^-ΔΔCT法法是指根据荧光定量所得Ct值，进行2^(-Ct)将Ct值转化为线性关系，计算得到基因相对表达量的方法。

3.根据权利要求1所述的校正方法，其特征在于所述的2^-ΔCT法是指根据荧光定量所得Ct值，进行2^(-Ct)将Ct值转化为线性关系，计算得到基因相对表达量的方法。

4.根据权利要求1所述的校正方法，其特征在于所述的Pfaffl法是指用于相对定量荧光定量PCR的数据处理方法。

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